ITRM20060020A1 - Metodo per la coltura di cellule - Google Patents
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Classifications
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Description
Descrizione dell'invenzione industriale dal titolo:
“Metodo per la coltura di cellule"
CAMPO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione si riferisce al campo della biologia cellulare, ed in particolare ad un nuovo metodo di coltura per cellule che crescono adese su superfici, ad esempio sulle pareti dei contenitori di coltura, in grado di facilitare il distacco ed il recupero delle cellule una volta che esse siano giunte ad un particolare stadio di crescita o a confluenza, semplificando notevolmente le fasi di coltura.
STATO DELL'ARTE
In campo biomedico e di ricerca vengono largamente impiegate colture in vitro di cellule umane e/o animali (primarie, tumorali, staminali, ecc.), per la produzione di proteine ricombinanti che richiedano modifiche post-trascrizionali e non ottenibili da altri ospiti quali ad esempio procarioti, per prove di tossicità e trasfezione di materiale genetico da applicare in terapia genica, oppure per complesse valutazioni di biochimica cellulare (marcatori di cellule staminali, ecc.).
Le colture cellulari manipolate in condizioni di sterilità, possono dar luogo a due tipologie diverse di coltura, quelle in cui le cellule crescono in sospensione (come ad esempio nelle colture di linfociti) e quelle in cui le cellule crescono adese su di un substrato (come ad esempio nelle colture di glia, epatociti, cellule epiteliali, cartilaginee, ossee, ecc.)- Nel secondo caso, le cellule si espandono generalmente sulla superficie interna del contenitore fino a formare un “tappeto cellulare" monostrato. Le cellule mantenute in coltura in fiasche, dischi, roller bottles o altri contenitori, raggiungono in breve tempo una situazione di confluenza, in cui lo spazio per la ulteriore crescita è impedito dalla presenza di altre cellule. In questo caso, non essendo sufficiente sostituire il mezzo di coltura privo di nutrienti con del terreno fresco, occorre provvedere al distacco delle cellule dal loro supporto, e successivamente metterle in coltura in contenitori di maggiori dimensioni. Il distacco delle cellule adese al supporto è inoltre necessario per poterle studiare con metodi quali la citofluorimetria, la microscopia ottica, la microscopia confocale a fluorescenza, ecc.
I metodi più conosciuti per il distacco delle cellule dai contenitori di crescita si dividono in metodi enzimatici e non enzimatici, che si distinguono a loro volta in metodi chimici e metodi fisici.
I metodi di distacco enzimatico più utilizzati prevedono varie fasi di lavoro e consistono nel: 1) rimuovere il terreno dal contenitore di crescita; 2) lavare più volte le cellule con tampone fosfato (qui di seguito indicato con la sigla “PBS”); 3) rimuovere il PBS dal contenitore; 4) aggiungere una soluzione enzimatica di lisi, generalmente tripsina o tripsina-EDTA (0,25% peso/volume) precedentemente riscaldata a 37°C, o una soluzione di collagenasi o di altri enzimi. La procedura di rimozione del terreno residuo dalle cellule ed il lavaggio con PBS prima dell’aggiunta dell’enzima di lisi, viene effettuata anche per prevenire fenomeni di inibizione da parte delle proteine del siero contenute nel terreno stesso. Il contenitore viene quindi mantenuto per qualche minuto in incubatore dopodiché viene leggermente agitato per facilitare il distacco delle cellule. Nei casi più difficili in cui le cellule hanno difficoltà a staccarsi, viene utilizzata anche un’apposita spatola, o scraper, per rimuovere il tappeto cellulare in adesione.
In letteratura (Saura J. et al. Glia. 2003 Dee; 44(3):183-9) è stato riportato l’utilizzo di soluzioni di tripsina (0,05-0,12%) in presenza di una soluzione 0,2-0, 5 mM di EDTA e di una soluzione 0, 5-0,8 mM di ioni Ca (II) per effettuare una tripsinizzazione moderata che può portare al distacco selettivo solo di alcuni tipi cellulari (microglia) rispetto ad altri che restano adesi (astrociti).
Tali procedure di distacco prevedono comunque l’utilizzo di soluzioni enzimatiche sterili che normalmente vengono ottenute mediante filtrazione attraverso membrane da 0,22 μιτι i cui pori potrebbero non avere caratteristiche tali da impedire il passaggio di eventuali virus, micoplasma, forme di Pseudomonas e altri batteri, o tossine prodotte dai batteri stessi (Melnick, J. L. et al. Developments in biological standardization (1976) Dee 13-15, 3777-82). Inoltre, la necessità di effettuare tali manipolazioni, aumenta il consumo di reagenti, contenitori, materiali di laboratorio, ed il rischio di una eventuale contaminazione.
Un ulteriore aspetto negativo connesso all’uso di soluzioni enzimatiche nel distacco delle cellule, è il loro effetto proteolitico, che può provocare non solo una degradazione delle proteine presenti in soluzione o un adsorbimento di proteine estranee, ma anche aggredire la membrana cellulare degradando recettori cellulari e/o altre molecole di superficie. L’utilizzo di metodiche non proteolitiche sarebbe quindi particolarmente utile in tutti quegli studi che sono dipendenti dall’integrità delle proteine di membrana, riconosciute mediante legame con opportuni anticorpi. I metodi di distacco non enzimatico comunemente utilizzati si basano su un concetto simile al distacco enzimatico sopra descritto, ma prevedono l’utilizzo di tamponi che facilitano, dopo un certo periodo di incubazione (5-10 minuti), il distacco delle cellule mediante scuotimento. Tale sistema richiede però la rimozione del terreno di coltura una volta che le cellule siano arrivate a confluenza, un passaggio di lavaggio con tamponi, il consumo di materiale da laboratorio per dispensare le soluzioni e un certo tempo di attesa per l'incubazione del reagente; inoltre, tale sistema è applicabile solo a colture di cellule non fortemente adese.
All’interno dei metodi non enzimatici vi sono poi alcuni metodi “fisici” per il distacco cellulare quali l’uso di ultrasuoni, o la formazione di bolle mediante onde d’urto o l’utilizzo di polimeri termosensibili, quali la Poli-N-isopropilacrilammide (PIPAAm), sui quali vengono fatte aderire le cellule. Il distacco delle cellule dai supporti rivestiti con tali polimeri viene realizzato sottoponendo le colture a temperature di circa 10-20°C fino al completo distacco dal supporto (Okano T. et al. Biomaterials.
1995 Mar; 16(4):297-303). Utilizzando però questo metodo si possono osservare alcuni cambiamenti morfologici delle cellule, che potrebbero indicare una alterazione (attivazione o disattivazione) di particolari processi metabolici.
Ad oggi è pertanto sentita l’esigenza di disporre di un metodo di distacco delle cellule adese, che non mostri gli svantaggi dei metodi noti sopra descritti.
SOMMARIO DELL'INVENZIONE
Ora i Richiedenti hanno trovato che nel caso di cellule che crescono adese a superfici, ad esempio al contenitore di coltura, l'aggiunta di sostanze tensioattive non ioniche al terreno di coltura, anche a basse concentrazioni (e quindi a concentrazioni non tossiche), facilitano il distacco delle cellule dalle superfici dove vengono fatte crescere.
Rappresenta pertanto oggetto dell’invenzione un metodo per la coltura di cellule che crescono adese a superfici, comprendente la coltura di dette cellule fino allo stadio di crescita voluto, ovvero fino a confluenza, in un adatto contenitore contenente il terreno di coltura addizionato con una o più sostanze tensioattive non ioniche in modo che la concentrazione totale di tensioattivo sia compresa tra 0,001% e 1% in peso rispetto al volume totale di detto terreno di coltura non addizionato, seguita dal distacco delle cellule adese alle superfici mediante scuotimento del contenitore.
Ulteriore oggetto dell’invenzione è l’uso di uno o più tensioattivi non ionici in terreni di coltura per cellule che crescono adese a superfici; e tale terreno di coltura addizionato con uno o più tensioattivi non ionici. Caratteristiche e vantaggi dell’invenzione saranno descritti in dettaglio nella seguente descrizione dettagliata.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE
Lo scopo della presente invenzione è quello di fornire un nuovo metodo di coltura di cellule adese che ne consenta un facile distacco, senza l’utilizzo di enzimi o altri reagenti, senza il consumo di altro materiale, e senza l'utilizzo di mezzi meccanici o strumentazioni complesse.
I tipi cellulari che è possibile utilizzare nel metodo dell'invenzione sono ad esempio cellule di mammiferi, ratto, topo, cellule vegetali, cellule umane, come ad esempio CHO, ibridomi, cellule BHK (Baby Hamster Kidney), cellule di mieloma, C6, HEK-293, GP293, U87-MG, linfoblastoidi, e cellule staminali.
Sostanze tensioattive non ioniche semplici, quali ad esempio esteri di sorbati o poiisorbati, etossilati di alcool, ammine, ammidi, acidi, ecc., o sostanze complesse, quali ad esempio copolimeri a blocchi formati da miscele di poliossietilene e poliossipropilene, polialcoli, ecc., o loro miscele, possono essere utilizzate come tensioattivi non ionici nel metodo di coltura secondo l’invenzione.
Secondo una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, il tensioattivo non ionico aggiunto al terreno di coltura cellulare è scelto nel gruppo consistente di composti di formula (I)
in cui w, x, y e z, uguali o diversi tra loro, sono numeri interi compresi tra 0 e 100 a condizione che non siano tutti contemporaneamente 0, Ri, R2, R3e R4, uguali 0 diversi tra loro, sono scelti tra H, catene alchiliche, lineari o ramificate, aventi da 10 a 20 atomi di carbonio, e residui di acidi grassi, saturi 0 insaturi, aventi da 10 a 20 atomi di carbonio, e X rappresenta una catena etilenica, propilenica 0 superiore, composti di formula (II)
(II)
in cui R è scelto tra gruppi alchilici, lineari 0 ramificati, aventi da 10 a 20 atomi di carbonio, e residui di acidi grassi, saturi o insaturi, aventi da 10 a 20 atomi di carbonio,
composti di formula (III)
R(OCH2CH2)nOH (III) in cui R è definito come sopra per i composti di formula (II) e n è un numero intero compreso tra 1 e 100,
composti di formula (IV)
R0(CH2CH20)n(IV) in cui R ed n sono definiti come sopra per i composti di formula (III), e loro miscele.
Per “residuo di acido grasso" secondo l’invenzione, si intende ad esempio il residuo di un acido scelto tra gli acidi decanoico, laurico, miristico, paimitico, stearico, arachidico, oleico, e arachidonico.
Preferiti sono i composti di formula (I) sopra riportata in cui w+x+y+z è maggiore di 20.
Esempi di composti di formula (I) disponibili in commercio includono i composti appartenenti alla famiglia dei prodotti conosciuti con il nome Tween<®>, ossia poliossietilen derivati di esteri di acidi grassi con sorbitolo, quali poliossietilene (20) sorbitan monolaurato (Tween<®>20), poliossietilene (4) sorbitan monolaurato (Tween<®>21), poliossietilene (20) sorbitan monopalmitato (Tween<®>40), poliossietilene (20) sorbitan monostearato (Tween<®>60), poliossietilene (4) sorbitan monostearato (Tween<®>61), poliossietilene (20) sorbitan tristearato (Tween<®>65), poliossietilene (20) sorbitan monoleato (Tween<®>80), poliossietilene (5) sorbitan monoleato (Tween<®>81), e poliossietilene (20) sorbitan trioleato (Tween<®>85); preferito è poliossietilene (20) sorbitan monoleato (Tween<®>80).
Esempi di composti di formula (II) disponibili in commercio includono i composti appartenenti alla famiglia dei prodotti conosciuti con il nome Span<®>, che sono esteri di acidi grassi con sorbitolo, quali sorbitan monolaurato (Span<®>20), sorbitan monopalmitato (Span<®>40), sorbitan monostearato (Span<®>60), sorbitan tristearato (Span<®>65), sorbitan monoleato (Span<®>80), e sorbitan trioleato (Span<®>85).
Esempi di composti di formula (III) disponibili in commercio includono i composti appartenenti alla famiglia dei prodotti conosciuti con il nome Brij<®>, che sono poliossietilen eteri di acidi grassi derivati dagli alcoli laurilico, cetilico, stearico, ed oleico, quali poliossietilene (4) lauril etere (Brij<®>30), poliossietilene (23) lauril etere (Brij<®>35), poliossietilene (2) cetil etere (Brij<®>52), poliossietilene (20) cetil etere (Brij<®>58), poliossietilene (2) stearil etere (Brij<®>72), poliossietilene (10) stearil etere (Brij<®>76), poliossietilene (20) stearil etere (Brij<®>78), poliossietilene (2) oleil etere (Brij<®>93), poliossietilene (10) oleil etere (Brij<®>97), poliossietilene (20) oleil etere (Brij<®>98), e poliossietilene (21) stearil etere (Brij<®>721).
Esempi di composti di formula (IV) disponibili in commercio includono i composti appartenenti alla famiglia dei prodotti conosciuti con il nome Myrj<®>, che sono poliossietilen derivati dell’acido stearico, quali poliossietilene (8) stearato (Myrj<®>45), poliossietilene (20) stearato (Myrj<®>49), e poliossietilene (100) stearato (Myrj<®>59).
Ulteriori tensioattivi non ionici oltre a quelli sopra citati, capaci di dare risultati equivalenti in termini di distacco delle cellule adese quando aggiunti al terreno di coltura, sono da considerarsi compresi nello scopo della presente invenzione.
I Richiedenti hanno sorprendentemente trovato che l’aggiunta di uno o più dei suddetti tensioattivi non ionici al terreno di coltura, fa sì che un leggero scuotimento del contenitore di coltura o un urto sulle sue pareti esterne sia sufficiente al distacco del tappeto cellulare in adesione. Così, per il distacco delle cellule adese, non si ha più necessità di utilizzare enzimi o altri metodi che presentano gli svantaggi descritti sopra, prima di tutto la rottura di antigeni o proteine di membrana.
Il comportamento di tali tensioattivi non ionici è sorprendente poiché è noto nell’arte che sostanze tensioattive aggiunte a mezzi di coltura cellulare, hanno la proprietà di rompere le pareti cellulari ed emulsionare proteine di membrana, colesterolo ed altri fosfolipidi, con conseguente morte cellulare e dispersione dei contenuti proteici nel mezzo di coltura. Al contrario, i Richiedenti hanno trovato che, a basse concentrazioni non tossiche per la cellula, i tensioattivi non ionici non solo non provocano effetti citotossici, e possono perciò essere aggiunti direttamente nel terreno di coltura fin dall’inizio dell’accrescimento, ma aiutano il distacco delle cellule adese una volta che queste hanno raggiunto lo stadio di crescita desiderato o sono giunte a confluenza. Secondo l’invenzione, i tensioattivi non ionici possono quindi essere presenti nel terreno di coltura fino dall'inizio dell’accrescimento, costituendo un semplice additivo presente nel terreno di coltura, oppure possono essere aggiunti una volta che le colture cellulari hanno raggiunto lo stadio di crescita desiderato o la confluenza. La prima modalità presenta il vantaggio di disporre di un terreno di coltura completo, che non dovrà subire ulteriori manipolazioni successive. Dal punto di vista della coltura e dei risultati in termini di distacco delle cellule adese, le due modalità sono invece equivalenti, in entrambi i casi si è infatti osservato che le cellule in coltura crescono senza effetti collaterali visibili fino a confluenza e si distaccano facilmente e senza danni dalle superfici interne del contenitore. Il distacco può essere ad esempio messo in atto anche manualmente scuotendo la fiasca o il contenitore di coltura o sbattendolo energicamente contro il palmo della mano, senza l'ausilio di ulteriori reagenti o mezzi meccanici.
I terreni di coltura a cui viene aggiunto un additivo costituito da uno o più tensioattivi non ionici secondo l'invenzione, sono ad esempio terreni basali, di Dulbecco, di Earle, di Hank, DME/F-12 Ham, MEM, DMEM, GMEM, IMDM, L-15, McCoy 5A, MCDB, Medium 199, NCTC, RPMI, ecc. Risultati ottimali sono stati ottenuti dai Richiedenti usando come terreno di coltura DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium).
II terreno di coltura dell’invenzione presenta inoltre il vantaggio di non alterare la produzione di proteine extracellulari da parte delle cellule e può essere quindi utilizzato per la produzione di molecole di interesse farmaceutico come frammenti anticorpali, proteine ingegnerizzate, e simili. I seguenti esempi sono riportati a scopo illustrativo e non limitativo dell’invenzione.
ESEMPIO 1
Preparazione del terreno di coltura
Ad 1 I di DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) addizionato di siero FCS al 10%, 2mM di L-glutammina e antibiotici (100 U/ml Pennicillina e 100 mg/ml Streptomicina), vengono aggiunti 50 mg di Tween<®>80, e la miscela così ottenuta viene posta sotto agitazione fino a completa dissoluzione. Il terreno così ottenuto viene quindi filtrato attraverso filtri sterili da 0,2 μιτι prima del suo utilizzo.
ESEMPIO 2
Coltura di cellule di glioma umano U87-MG nel terreno di coltura dell'invenzione
Cellule di glioma umano U87-MG sono state messe in coltura utilizzando il terreno preparato come descritto sopra nell’Esempio 1 a 37°C in atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2. Le cellule U87-MG sono state piastrate in una fiasca da 75 ml contenente 40 mi di terreno ad una densità di 10<4>e fatte crescere fino a confluenza. La fiasca è stata sbattuta energicamente contro il palmo della mano per due volte ottenendo il completo distacco del tappeto cellulare.
ESEMPIO 3
Valutazione della tossicità cellulare del terreno di coltura dell’invenzione Cellule di glioma umano U87-MG messe in coltura utilizzando il terreno preparato come descritto sopra nell’Esempio 1, sono state contate periodicamente (ogni 2 giorni) con un microscopio ottico per valutare il rapporto cellule vive/cellule morte mediante saggio colorimetrico (Trypan Blue). Per il conteggio delle cellule sono state seguite procedure standard comunemente utilizzate e ben note alle persone esperte nel campo dell’invenzione. E’ stato così possibile osservare che il terreno di coltura dell’invenzione non risulta essere tossico per le cellule, il cui numero è cresciuto esponenzialmente nel tempo (Figura 1A) e la cui vitalità percentuale (rapporto cellule vive/cellule totali x 100) si è mantenuta a livelli superiori al 95% per un tempo superiore a 10 giorni (Figura 1B).
ESEMPIO 4
Valutazione dell’alterazione dell’attività di proliferazione e produzione di proteine da parte di cellule poste nel terreno di coltura dell’invenzione Per verificare se l'aggiunta di tensioattivi non ionici al terreno di coltura possa interferire con i processi vitali della cellula come espressione genica, traduzione dell’mRNA, ecc., mediante citofluorimetria si è investigata la presenza di una eventuale alterazione nell'espressione di proteine di membrana sulla superficie di linfociti fatti crescere nel presente terreno di coltura, rispetto a quella di linfociti cresciuti in un terreno privo di tensioattivi. Tale differenza può essere considerata come una verifica indiretta di una diversa espressione dei geni coinvolti nella produzione di tali proteine; con buona approssimazione, questo criterio può essere esteso anche alla valutazione di eventuali differenze nell’espressione di altre proteine e quindi, indirettamente, può essere considerato un buon indicatore dello “stato vitale” e dell'espressione genica delle due colture cellulari.
Con un analizzatore di cellule Beckman-Coulter (Cytomics FC 500) è stato provato che le cellule accresciute in presenza di tensioattivi, nel terreno di coltura dell’invenzione come descritto sopra nell’Esempio 2, non mostrano alterazioni morfologiche o funzionali rispetto ad una analoga coltura condotta in assenza di tensioattivi. In particolare, le cellule sono state analizzate nel gate dei linfociti che sono risultati positivi per CD45; i linfociti sono stati analizzati per CD4 (helper/inducer), CD8 (citotossici) e CD14 (macrofagi e monociti).
La popolazione dei linfociti CD4 risulta essere pari a 34,2% per il terreno addizionato di tensioattivo mentre 32% per il terreno semplice (Figure 2A e 2B). La popolazione dei linfociti CD8 risulta essere pari a 36,8% per il terreno addizionato di tensioattivo e 37,2% per il terreno semplice. La popolazione dei linfociti CD14 risulta essere pari a 12,3% per il terreno addizionato di tensioattivo mentre 10,6% per il terreno semplice.
Claims (23)
- RIVENDICAZIONI 1. Metodo per la coltura di cellule che crescono adese a superfici, comprendente la coltura di dette cellule fino allo stadio di crescita voluto, ovvero fino a confluenza, in un adatto contenitore contenente il terreno di coltura addizionato con una o più sostanze tensioattive non ioniche in modo che la concentrazione totale di tensioattivo sia compresa tra 0,001% e 1% in peso rispetto al volume totale di detto terreno di coltura non addizionato, seguita dal distacco delle cellule adese alle superfici mediante scuotimento del contenitore.
- 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui dette cellule sono cellule di mammiferi, ratto, topo, cellule vegetali, o cellule umane.
- 3. Metodo secondo la rivendicazione 2, in cui dette cellule umane sono scelte tra CHO, ibridomi, cellule BHK (Baby Hamster Kidney), cellule di mieloma, C6, HEK-293, GP293, U87-MG, iinfoblastoidi, e cellule staminali.
- 4. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detti tensioattivi non ionici sono scelti tra esteri di sorbati o polisorbati, etossilati di alcoli, ammine, ammidi, e acidi, copolimeri a blocchi formati da miscele di poliossietilene e poliossipropilene, polialcoli, e loro miscele.
- 5. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detto tensioattivo non ionico è scelto nel gruppo consistente di composti di formula (I)in cui w, x, y e z, uguali o diversi tra loro, sono numeri interi compresi tra 0 e 100 a condizione che non siano tutti contemporaneamente 0, R-i, R2R3e R4, uguali o diversi tra loro, sono scelti tra H, catene alchiliche, lineari o ramificate, aventi da 10 a 20 atomi di carbonio, e residui di acidi grassi, saturi o insaturi, aventi da 10 a 20 atomi di carbonio, e X rappresenta una catena etilenica, propilenica o superiore, composti di formula (II) (II) in cui R è scelto tra gruppi alchilici, lineari o ramificati, aventi da 10 a 20 atomi di carbonio, e residui di acidi grassi, saturi o insaturi, aventi da 10 a 20 atomi di carbonio, composti di formula (III) R(OCH2CH2)nOH (III) in cui R è definito come sopra per i composti di formula (II) e n è un numero intero compreso tra 1 e 100, composti di formula (IV) R0(CH2CH20)n(IV) in cui R ed n sono definiti come sopra per i composti di formula (III), e loro miscele.
- 6. Metodo secondo la rivendicazione 5, in cui detti residui di acidi grassi sono residui di acidi scelti tra gli acidi decanoico, laurico, miristico, paimitico, stearico, arachidico, oleico, e arachidonico.
- 7. Metodo secondo la rivendicazione 5, in cui in detti composti di formula (I) w+x+y+z è maggiore di 20.
- 8. Metodo secondo la rivendicazione 5, in cui detti composti di formula (I) sono scelti tra poliossietilen derivati di esteri di acidi grassi con sorbitolo, detti composti di formula (II) sono scelti tra esteri di acidi grassi con sorbitolo, detti composti di formula (III) sono scelti tra poliossietilen eteri di acidi grassi derivati dagli alcoli laurilico, cetilico, stearico, ed oleico, e detti composti di formula (IV) sono scelti tra poliossietilen derivati dell’acido stearico.
- 9. Metodo secondo la rivendicazione 5, in cui detti composti di formula (I) sono scelti tra poliossietilene (20) sorbitan monolaurato, poliossietilene (4) sorbitan monolaurato, poliossietilene (20) sorbitan monopalmitato, poliossietilene (20) sorbitan monostearato, poliossietilene (4) sorbitan monostearato, poliossietilene (20) sorbitan tristearato, poliossietilene (20) sorbitan monoleato, poliossietilene (5) sorbitan monoleato, e poliossietilene (20) sorbitan trioleato, detti composti di formula (II) sono scelti tra sorbitan monolaurato, sorbitan monopalmitato, sorbitan monostearato, sorbitan tristearato, sorbitan monoleato, e sorbitan trioleato, detti composti di formula (III) sono scelti tra poliossietilene (4) lauril etere, poliossietilene (23) lauril etere, poliossietilene (2) cetil etere, poliossietilene (20) cetil etere, poliossietilene (2) stearil etere, poliossietilene (10) stearil etere, poliossietilene (20) stearil etere, poliossietilene (2) oleil etere, poliossietilene (10) oleil etere, poliossietilene (20) oleil etere, e poliossietilene (21) stearil etere, e detti composti di formula (IV) sono scelti tra poliossietilene (8) stearato, poliossietilene (20) stearato, e poliossietilene (100) stearato.
- 10. Metodo secondo la rivendicazione 5, in cui detto composto di formula (I) è poliossietilene (20) sorbitan monoleato.
- 11. Metodo secondo la rivendicazione 1 , in cui la concentrazione totale di detto tensioattivo non ionico è pari a 0,05% in peso rispetto al volume totale di detto terreno di coltura non addizionato.
- 12. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detti tensioattivi non ionici sono presenti nel terreno di coltura fino dall'inizio dell’accrescimento, ovvero sono aggiunti una volta che la coltura cellulare ha raggiunto lo stadio di crescita desiderato o la confluenza.
- 13. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detto terreno di coltura è scelto nel gruppo consistente di terreni basali, di Dulbecco, di Earle, di Hank, DME/F-12 Ham, MEM, DMEM, GMEM, IMDM, L-15, McCoy 5A, MCDB, Medium 199, NCTC, e RPMI.
- 14. Metodo secondo la rivendicazione 13, in cui detto terreno di coltura è DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium).
- 15. Uso di uno o più tensioattivi non ionici come additivo per terreni di coltura per cellule che crescono adese su superfici, in cui la concentrazione totale di detti tensioattivi è compresa tra 0,001% e 1% in peso rispetto al volume totale del terreno di coltura.
- 16. Uso secondo la rivendicazione 15, in cui la concentrazione totale di detto tensioattivo non ionico è pari a 0,05% in peso rispetto al volume totale di detto terreno di coltura non addizionato.
- 17. Uso secondo la rivendicazione 15, in cui detti tensioattivi non ionici sono definiti come nelle rivendicazioni 4-10.
- 18. Uso secondo la rivendicazione 15, in cui detto terreno di coltura è definito come nelle rivendicazioni 13-14.
- 19. Uso secondo la rivendicazione 15, in cui dette cellule che crescono adese su superfici sono definite come nelle rivendicazioni 2-3.
- 20. Terreno di coltura per cellule che crescono adese su superfici, addizionato con uno o più tensioattivi non ionici, in cui la concentrazione totale di detti tensioattivi è compresa tra 0,001 % e 1 % in peso rispetto al volume totale del terreno di coltura.
- 21. Terreno di coltura secondo la rivendicazione 20, in cui la concentrazione totale di detto tensioattivo non ionico è pari a 0,05% in peso rispetto al volume totale del terreno di coltura non addizionato.
- 22. Terreno di coltura secondo la rivendicazione 20, in cui detti tensioattivi non ionici sono definiti come nelle rivendicazioni 4-10.
- 23. Terreno di coltura secondo la rivendicazione 20, in cui detto terreno di coltura è definito come nelle rivendicazioni 13-14.
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