CN101445809B

CN101445809B - 诱导胚状体形成和植物再生的植物双元表达载体及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN101445809B
Application number: CN2008102370027A
Authority: CN
Inventors: 邓伟; 李正国; 杨迎武; 罗克明; 金凯
Original assignee: Chongqing University
Current assignee: Chongqing University
Priority date: 2008-12-30
Filing date: 2008-12-30
Publication date: 2010-11-03
Anticipated expiration: 2028-12-30
Also published as: CN101445809A

Abstract

本发明公开了一种诱导胚状体形成和植物再生的植物双元表达载体，包含BBM基因和FLP-FRT位点特异性重组系统，FLP-FRT位点特异性重组系统包含FLP基因和两个同向FRT位点，BBM基因和FLP基因位于两个同向FRT位点之间，BBM基因由组成型启动子控制，FLP基因由诱导型启动子控制；还公开了构建该植物双元表达载体的方法及利用该植物双元表达载体诱导胚状体形成和植物再生的方法；本发明不仅可以促进植物愈伤组织形成胚状体，再诱导形成转基因植株，显著提高植物的转化频率和再生频率，而且可以消除外源基因对转基因植株的负面影响，为难以进行遗传转化的植物品种提供了一种新的遗传转化策略，具有广阔的应用前景。

Description

诱导胚状体形成和植物再生的植物双元表达载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种重组表达载体，特别涉及一种诱导胚状体形成和植物再生的植物双元表达载体，还涉及该表达载体的构建方法和应用。

背景技术

利用基因工程技术把特定的外源基因导入植物受体中，达到改变植物性状(如抗虫、抗病、抗逆等)以及快速培育植物新品种的目的，是现代遗传育种的重要途径。

植物基因工程的核心是植物的遗传转化。植物遗传转化方法主要分为两类：即利用载体系统转化(如农杆菌介导法、脂质体法等)和直接遗传转化(如基因枪法、PEG法、电激法、显微注射法、花粉管通道法、超声波法等)。其中，农杆菌介导法是采用含有目的基因的农杆菌浸染植物受体，通过诱导抗性植物再生从而获得转基因植株。由于其具有易操作、低费用、高效率、插入片段确定性好和转基因拷贝数低等独特优点，已经成为植物遗传转化的首选方法。目前，通过农杆菌介导方法获得转基因植株的植物已达100种以上，包括水稻、玉米、马铃薯、棉花、大豆、油菜、番茄、黄瓜、苜蓿、核桃、蔬菜和牧草等。但是，该方法仍然存在以下问题：(1)一些重要植物(如木本植物、单子叶植物)的转化频率低，转化植株难于再生；(2)同种植物不同品种之间的转化频率和再生频率差异大；(3)一些在生产上运用较广的植物品种难以进行遗传转化等。研究发现，存在上述问题的主要原因在于：植物再生困难，组织培养中无法获得再生苗。

发明内容

有鉴于此，为克服现有植物遗传转化技术存在的不足，本发明的目的之一在于提供一种诱导胚状体形成和植物再生的植物双元表达载体，不仅可以利用外源基因的超量表达促进植物愈伤组织形成胚状体，再诱导形成转基因植株，显著提高植物的转化频率和再生频率，而且可以从转基因植株的基因组中有效地删除外源基因，以消除外源基因的超量表达对转基因植株的负面影响。

为达到此目的，本发明的植物双元表达载体，包含BBM基因和FLP-FRT位点特异性重组系统，所述FLP-FRT位点特异性重组系统包含FLP基因和两个同向FRT位点，所述BBM基因和FLP基因位于两个同向FRT位点之间，BBM基因由组成型启动子控制，FLP基因由诱导型启动子控制。

进一步，所述组成型启动子选自花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、甘露碱合成酶基因(mas)启动子或章鱼碱合成酶基因(ocs)启动子；

进一步，所述诱导型启动子选自热激启动子HSP18.2、Gmhsp17.5-E或Gmhsp17.5C；

进一步，所述植物为双子叶植物；

进一步，所述双子叶植物为杨树；

进一步，所述植物双元表达载体为pLFFLPBBM。

胚状体诱导是植物组织培养的常用方法，具有增殖率高、可免去生根步骤等优点。BBM(BABY BOOM)基因(核苷酸序列如SEQ ID No.14所示)来自于油菜(Brassica napus)，为AP2/ERF家族成员，在发育的胚中特异性表达，可以促进细胞分裂和体细胞胚胎的形态发生变化，起诱导植物激素的作用或提高细胞对激素的敏感性。BBM基因超量表达，可以使外植体在没有外源激素的条件下产生大量的胚状体，显著提高植物的再生频率。

FLP-FRT位点特异性重组系统来自于啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞核内2μm质粒，由FLP基因(核苷酸序列如SEQ ID No.15所示)和FLP重组识别位点(FLP recognition target，FRT)组成，重组酶FLP可催化位于同一分子上两个同向FRT(loxPFRT)位点间DNA片段的切除。由于BBM基因的超量表达会对转基因植株产生一些负面影响，如植物矮化、形成玫瑰型叶片、花器官异型和降低植物育性等，在BBM基因发挥完诱导胚状体形成和植物再生的作用后，在转基因植株中诱导FLP表达，催化位于BBM基因两侧loxPFRT位点间的重组反应，即可从转基因植株的基因组中有效地删除BBM基因，消除其对转基因植株的负面影响。

植物基因启动子是重要的顺式作用元件，处于基因转录调控的中心环节。组成型启动子(constitutive promoter)是指在该类启动子控制下，结构基因的表达在一定水平上保持恒定，在不同组织、部位表达水平没有明显差异，包括但不限于：CaMV 35S启动子、mas启动子和ocs启动子。诱导型启动子(inducible promoter)是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该类启动子可以大幅度地提高基因的转录水平，如光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子等，其中热诱导表达基因启动子包括但不限于：HSP18.2(Characterization of two genes encoding small heat-shock proteinsin Arabidopsis thaliana.Takahashi T et al.Mol Gen Genet，Vol.219，365～372，1989)、Gmhsp17.5-E(DNA sequence and transcript mapping of a soybeangene encoding a small heat-shock protein.Czarnecka E et al.Proc NatlAcad Sci USA，Vol.82，3726～3730，1985)和Gmhsp17.5C(A heatshock-switchable gene expression system.Chen M et al.Agr Sci China，Vol.2，722～728.2003.)。

在植物双元表达载体pLFFLPBBM中，BBM基因和FLP基因位于两个同向FRT位点之间，BBM基因由CaMV 35S启动子控制，FLP基因由热激启动子HSP18.2控制，FLP基因位于BBM基因的上游。当然，FLP基因也可位于BBM基因的下游，同样可以达到发明目的。

本发明的目的之二在于提供一种构建所述植物双元表达载体的方法，操作简便、成本低廉。

为达到此目的，本发明的构建所述植物双元表达载体的方法，包括以下步骤：

a、DNA片段loxPFRT-MCS-loxPFRT的制备

人工合成包含两个同向FRT位点以及EcoRI、KpnI、SalI、SacI、XhoI和NheI酶切位点的DNA片段loxPFRT-MCS-loxPFRT，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

b、中间载体pHSP-FLP-NOS1的构建

b1、以载体pBI121为模板，以核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的引物NOS1-F和核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的引物NOS1-R为上、下游引物进行PCR扩增，获得包含终止子NOS且5’端含有XhoI酶切位点、3’端含有SacI酶切位点的DNA片段I；

b2、以载体pTT119为模板，以核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的引物HSP18.2-F和核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的引物HSP18.2-R为上、下游引物进行PCR扩增，获得包含热激启动子HSP18.2且5’端含有KpnI和SalI酶切位点、3’端含有XhoI酶切位点的DNA片段II；

b3、以载体pFLP2为模板，以核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的引物FLP-F和核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的引物FLP-R为上、下游引物进行PCR扩增，获得包含FLP基因且5’端和3’端均含有XhoI酶切位点的DNA片段III；

b4、将步骤b1所得DNA片段I用XhoI和SacI双酶切后，连接到用SalI和SacI双酶切的载体pBlueScript(SK+)上，获得载体pNOS1；

b5、将步骤b2所得DNA片段II用KpnI和XhoI双酶切后，连接到用KpnI和XhoI双酶切的步骤b4所得载体pNOS1上，获得载体pHSP-NOS1；

b6、将步骤b3所得DNA片段III用XhoI酶切后，连接到用XhoI酶切的步骤b5所得载体pHSP-NOS1上，获得中间载体pHSP-FLP-NOS1；

c、中间载体p35S-BBM-NOS2的构建

c1、以载体pBI121为模板，以核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的引物NOS2-F和核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的引物NOS2-R为上、下游引物进行PCR扩增，获得包含终止子NOS且5’端含有XhoI酶切位点、3’端含有SalI和SacI酶切位点的DNA片段IV；

c2、以载体pBI121为模板，以核苷酸序列如SEQ ID No.10所示的引物35S-F和核苷酸序列如SEQ ID No.11所示的引物35S-R为上、下游引物进行PCR扩增，获得包含组成型启动子35S且5’端含有KpnI和SalI酶切位点、3’端含有XhoI酶切位点的DNA片段V；

c3、从油菜中提取总RNA，反转录成cDNA，再以所得cDNA为模板，以核苷酸序列如SEQ ID No.12所示的引物BBM-F和核苷酸序列如SEQ ID No.13所示的引物BBM-R为上、下游引物进行PCR扩增，获得包含BBM基因且5’端和3’端均含有XhoI酶切位点的DNA片段VI；

c4、将步骤c1所得DNA片段IV用XhoI和SacI双酶切后，连接到用SalI和SacI双酶切的载体pBlueScript(SK+)上，获得载体pNOS2；

c5、将步骤c2所得DNA片段V用KpnI和XhoI双酶切后，连接到用KpnI和XhoI双酶切的步骤c4所得载体pNOS2上，获得载体p35S-NOS2；

c6、将步骤c3所得DNA片段VI用XhoI酶切后，连接到用XhoI酶切的步骤c5所得载体p35S-NOS2上，获得中间载体p35S-BBM-NOS2；

d、植物双元表达载体pLFFLPBBM的构建

d1、将步骤a所得DNA片段loxPFRT-MCS-loxPFRT用EcoRI和NheI双酶切后，连接到用EcoRI和NheI双酶切去除T-DNA序列的载体pBIN19上，获得载体pLF；

d2、将步骤c所得中间载体p35S-BBM-NOS2用SacI和SalI双酶切后，获得DNA片段35S-BBM-NOS，将其插入到用SacI和SalI双酶切的步骤d1所得载体pLF上，获得载体pLFBBM；

d3、将步骤b所得中间载体pHSP-FLP-NOS1用SalI酶切后，获得DNA片段HSP-FLP-NOS，将其插入到用SalI酶切的步骤d2所得载体pLFBBM上，即获得植物双元表达载体pLFFLPBBM。

本发明的目的之三在于提供一种利用所述植物双元表达载体诱导胚状体形成和植物再生的方法，操作简便、成本低廉、效果好。

为达到此目的，本发明的利用所述植物双元表达载体诱导胚状体形成和植物再生的方法，包括以下步骤：

a、将植物双元表达载体转化根瘤农杆菌，获得含有植物双元表达载体的根瘤农杆菌；

b、将步骤a所得含有植物双元表达载体的根瘤农杆菌浸染植物愈伤组织，在不添加植物激素的条件下诱导植物愈伤组织形成胚状体，再诱导胚状体形成幼苗，获得转基因植株；

c、在步骤b所得转基因植株的幼苗中诱导FLP表达，从转基因植株的基因组中删除BBM基因和FLP基因，消除BBM基因对转基因植株的负面影响。

进一步，所述植物为双子叶植物；

进一步，所述植物双元表达载体为pLFFLPBBM。

本发明的有益效果在于：本发明克服了现有植物遗传转化技术存在的不足，公开了一种诱导胚状体形成和植物再生的植物双元表达载体，不仅可以利用超量表达的BBM基因促进植物愈伤组织形成胚状体，再诱导形成转基因植株，显著提高植物的转化频率和再生频率，而且可以从转基因植株的基因组中有效地删除BBM基因，以消除BBM基因的超量表达对转基因植株产生的负面影响；本发明还公开了一种构建所述植物双元表达载体的方法及一种利用所述植物双元表达载体诱导胚状体形成和植物再生的方法，操作简便、成本低廉、效果好；本发明为难以进行遗传转化的植物品种提供了一种新的遗传转化策略，在诱导胚状体形成和植物再生领域有着广阔的应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为植物双元表达载体pLFFLPBBM的构建示意图；

图2为热激处理删除35S::BBM基因和HSP18.2::FLP基因示意图；

图3为BBM基因超量表达诱导胚状体形成和植物再生的示例图；

图4为热激处理前后转基因杨树植株的Southern杂交结果；

图5为BBM基因在转基因杨树植株中表达的RT-PCR检测结果。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明的优选实施例采用CaMV 35S启动子控制BBM基因超量表达，促进植物愈伤组织形成胚状体，再诱导形成转基因植株，从而促进植物再生和遗传转化；同时，采用热激启动子HSP18.2控制FLP基因，通过对所得转基因植株进行热激处理诱导FLP表达，将35S::BBM基因和HSP18.2::FLP基因从转基因植株的基因组中删除，从而消除了超量表达BBM基因对转基因植株产生的负面影响。

1、植物双元表达载体pLFFLPBBM的构建

图1为植物双元表达载体pLFFLPBBM的构建示意图；如图1所示，植物双元表达载体pLFFLPBBM的构建包括以下步骤：

a、DNA片段loxPFRT-MCS-loxPFRT的制备

人工合成包含两个同向FRT位点以及EcoRI、KpnI、SalI、SacI、XhoI和NheI酶切位点的DNA片段loxPFRT-MCS-loxPFRT，其核苷酸序列如下(粗斜体部分为FRT位点，下划线部分为酶切位点)：

5’-gcgaattc

ggtacctat

EcoRI FRT KpnI

gtcgacgtagagctcgactcgag

SalI SacI XhoI FRT

gctagcggc-3’(SEQ ID No.1)

NheI

b、中间载体pHSP-FLP-NOS1的构建

b1、合成1对引物：NOS1-F：5’-aactcgaggatcgttcaaacatttggca-3’(SEQ IDNo.2)，下划线部分为XhoI酶切位点；NOS1-R：5’-aagagctccgatctagtaacatagatgac-3’(SEQ ID No.3)，下划线部分为SacI酶切位点；以载体pBI121(美国Clontech公司)为模板，以NOS1-F和NOS1-R为上、下游引物进行PCR扩增，反应条件为：温度94℃变性5分钟，然后温度94℃变性30秒、56℃退火30秒、72℃延伸45秒，共40个循环，最后温度72℃延伸8分钟；将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收纯化PCR产物，获得包含终止子NOS且5’端含有XhoI酶切位点、3’端含有SacI酶切位点的DNA片段I；

b2、合成1对引物：HSP18.2-F：5’-ttggtacctgtcgacagtggatcccccgtcatttc-3’(SEQ ID No.4)，下划线部分分别为KpnI和SalI酶切位点；HSP18.2-R：5’-ttctcgagatgg ttcgttgcttttcggg-3’(SEQ ID No.5)，下划线部分为SacI酶切位点；以载体pTT119(按照文献方法制得：Characterization of two genesencoding small heat-shock proteins in Arabidopsis thaliana.TakahashiT et al，Molecular and General Genetics MGG，Vol.219，365～372，1989)为模板，以HSP18.2-F和HSP18.2-R为上、下游引物进行PCR扩增，反应条件与步骤b1所述相同；将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收纯化PCR产物，获得包含热激启动子HSP18.2且5’端含有KpnI和SalI酶切位点、3’端含有XhoI酶切位点的DNA片段II；

b3、合成1对引物：FLP-F：5’-ttctcgagaaatgcgtacttatatgcgtc-3’(SEQ IDNo.6)，下划线部分为XhoI酶切位点；FLP-R：5’-ttctcgaggaggttgtatgccacaattt-3’(SEQ ID No.7)，下划线部分为XhoI酶切位点；以载体pFLP2(按照文献方法制得：A broad-host-range Flp-FRT recombination system for site-specific excision of chromosomally-located DNA sequences：applicationfor isolation of unmarked Pseudomonas aeruginosa mutants.Hoang TT etal，Gene，Vol.212，77～86，1998)为模板，以FLP-F和FLP-R为上、下游引物进行PCR扩增，反应条件与步骤b1所述相同；将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收纯化PCR产物，获得包含FLP基因(SEQ ID No.15)且5’端和3’端均含有XhoI酶切位点的DNA片段III；

b4、将步骤b1所得DNA片段I用XhoI和SacI双酶切后，连接到用SalI和SacI双酶切的载体pBlueScript(SK+)(美国Stratagene公司)上，获得载体pNOS1；

c、中间载体p35S-BBM-NOS2的构建

c1、合成1对引物：NOS2-F：5’-aactcgaggatcgttcaaacatttggca-3’(SEQ IDNo.8)，下划线部分为XhoI酶切位点；NOS2-R：5’-aagagctctgtcgaccgatctagtaacatagatgac-3’(SEQ ID No.9)，下划线部分分别为SacI和SalI酶切位点；以载体pBI121为模板，以NOS2-F和NOS2-R为上、下游引物进行PCR扩增，反应条件与步骤b1所述相同；将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收纯化PCR产物，获得包含终止子NOS且5’端含有XhoI酶切位点、3’端含有SalI和SacI酶切位点的DNA片段IV；

c2、合成1对引物：35S-F：5’-ttggtacctgtcgacgcccacagatggttagagag-3’(SEQ ID No.10)，下划线部分分别为KpnI和SalI酶切位点；35S-R：5’-ttctcgagccgtgttctctcc aaatgaa-3’(SEQ ID No.11)，下划线部分为XhoI酶切位点；以载体pBI121为模板，以35S-F和35S-R为上、下游引物进行PCR扩增，反应条件与步骤b1所述相同；将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收纯化PCR产物，获得包含启动子35S且5’端含有KpnI和SalI酶切位点、3’端含有XhoI酶切位点的DNA片段V；

c3、合成1对引物：BBM-F：5’-ttctcgagatgaactcgatgaataactgg-3’(SEQ IDNo.12)，下划线部分为XhoI酶切位点；BBM-R：5’-ttctcgagctaagtgtcgttccaaactg-3’(SEQ ID No.13)，下划线部分为XhoI酶切位点；采用TRIzol试剂(美国Promega公司)提取油菜总RNA，按试剂说明书操作；以所得油菜总RNA为模板，采用反转录试剂盒(美国Promega公司)合成cDNA，按照试剂盒说明书操作；以所得cDNA为模板，以BBM-F和BBM-R为上、下游引物进行PCR扩增，反应条件为：温度94℃变性5分钟，然后温度94℃变性30秒、56℃退火30秒、72℃延伸1分钟，共40个循环，最后温度72℃延伸10分钟；将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收纯化PCR产物，获得包含BBM基因(SEQ ID No.14)且5’端和3’端均含有XhoI酶切位点的DNA片段VI；

d、植物双元表达载体pLFFLPBBM的构建

d1、将步骤a所得DNA片段loxPFRT-MCS-loxPFRT用EcoRI和NheI双酶切后，连接到用EcoRI和NheI双酶切去除T-DNA序列的载体pBIN19(按照文献方法制得：Binary Agrobacterium vectors for plant transformation，Bevan，Nucleic Acids Research，vol.12，8711～8720，1984)上，获得载体pLF；

2、植物双元表达载体pLFFLPBBM的应用

植物双元表达载体pLFFLPBBM可用于诱导胚状体形成和植物再生。以双子叶植物杨树为例，利用植物双元表达载体pLFFLPBBM诱导胚状体形成和植物再生的方法，包括以下步骤：

a、用冻融法将植物双元表达载体pLFFLPBBM转化入根瘤农杆菌LBA4404菌株，再用含有卡那霉素和链霉素的YEB平板筛选阳性克隆，获得含有植物双元表达载体pLFFLPBBM的根瘤农杆菌LBA4404；转化及筛选方法为：将pLFFLPBBM1μg加至LBA4404感受态细胞100μL中，冰浴30分钟，液氮速冻5分钟，温度37℃水浴5分钟，立即冰浴2分钟，再转移至预热至温度28℃的YEB液体培养基1000μL中，在温度28℃条件下振摇培养3小时，离心收集菌体，用YEB液体培养基100μL重悬后，均匀涂布在含有浓度为50mg/L的卡那霉素和浓度为125mg/L的链霉素的YEB平板上，在温度37℃条件下培养48小时，从平板上挑取单个菌落(即阳性克隆)，置温度-80℃保存，备用；

b、取杨树叶片作为外植体，用水清洗干净，置质量百分浓度为10％的次氯酸钠溶液中灭菌10分钟，再用水清洗干净，置愈伤诱导培养基(由MS基本培养基、浓度为2mg/L的玉米素和浓度为0.5mg/L的萘乙酸组成)上诱导愈伤，避光培养20天后，获得杨树白色愈伤组织；将步骤a所得含有植物双元表达载体pLFFLPBBM的根瘤农杆菌LBA4404接种于含有浓度为50mg/L的卡那霉素和浓度为125mg/L的链霉素的YEB平板上，在温度28℃条件下培养2天，从平板上挑取单个菌落，接种于含有浓度为50mg/L的卡那霉素和浓度为125mg/L的链霉素的YEB液体培养基5mL中，在温度28℃、振摇速度200r/min条件下振摇培养，待OD₆₀₀值达到0.8时(OD₆₀₀值在0.5～0.8之间都可以实现本发明目的)，浸染所得杨树愈伤组织，10分钟后除去菌液(10～30分钟都可以实现本发明目的)，将杨树愈伤组织转移到共培养基(由MS基本培养基、浓度为2mg/L的玉米素和浓度为0.5mg/L的萘乙酸组成)上，在温度28℃、避光条件下共培养2天(2～3天都可以实现本发明目的)，再将杨树愈伤组织转移到未添加任何激素的MS基本培养基上，诱导培养约20天后形成胚状体，再将胚状体转移到0.5×MS基本培养基上，诱导培养至形成幼苗，获得转基因杨树植株；

c、将步骤b所得转基因杨树植株的幼苗进行热激处理：在温度37℃(温度在37～42℃之间都可以实现本发明目的)条件下保温1小时，在温度25℃(温度在15～30℃之间都可以实现本发明目的)条件下放置1小时，再在温度37℃(温度在37～42℃之间都可以实现本发明目的)条件下保温1小时，最后在温度25℃(温度在15～30℃之间都可以实现本发明目的)条件下培养，即得已删除35S::BBM基因和HSP18.2::FLP基因的转基因杨树植株，如图2所示。

BBM基因超量表达诱导杨树胚状体形成和植物再生的结果如图3所示，其中，A为未进行转化的杨树愈伤组织，未见胚状体形成；B为用含有植物双元表达载体pLFFLPBBM的根瘤农杆菌LBA4404介导转化的杨树愈伤组织，可见胚状体形成，黑色箭头所指处为胚状体；C为胚状体形成的幼苗。

应用效果验证：转基因杨树植株的分子鉴定

(1)Southern杂交

取步骤b所得未经过热激处理的转基因杨树植株和步骤c所得经过热激处理的转基因杨树植株，分别参照文献(Isolation of plant DNA from fresh tissue.Doyle JJ et al，Focus，Vol.12：13～15，1990)采用改良CTAB法提取基因组DNA；将所得基因组DNA用Hind III酶切，酶切产物经质量百分浓度为1％的琼脂糖电泳分离后转移至尼龙膜(美国Amersham Pharmacia Biotech公司)上，与采用探针制备试剂盒(美国Amersham Pharmacia Biotech公司)标记的BBMcDNA探针进行杂交，杂交完毕后洗膜，压X光片，放射性自显影。结果如图4所示，其中，1～6为未经过热激处理的转基因杨树植株，1T～6T为经过热激处理的转基因杨树植株，WT是未进行转化的对照杨树植株，P是DNA分子量标准；从图可知，在6个未经过热激处理的转基因杨树植株中，除了植株4以外，植株1、2、3、5和6均显示BBM基因的杂交条带，表明除了4为假阳性植株以外，1、2、3、5和6均为转基因杨树植株，BBM基因已经整合到植株的基因组中；而在除了假阳性植株4T以外的5个经过热激处理的转基因杨树植株中，植株1T、2T、3T和5T未显示BBM基因的杂交条带，表明BBM基因已经成功地从转基因杨树植株1T、2T、3T和5T的基因组中删除。

(2)RT-PCR检测

取上述经过Southern杂交鉴定的转基因杨树植株1、2、3、5和6，采用TRIzol试剂(美国Promaga公司)提取总RNA，按照试剂盒说明书操作；以所得总RNA为模板，采用反转录试剂盒(美国Promega公司)合成cDNA，按照试剂盒说明书操作；以所得cDNA为模板，以BBM-F和BBM-R为上、下游引物进行PCR扩增，反应条件为：温度94℃变性5分钟，然后温度94℃变性30秒、56℃退火30秒、72℃延伸1分钟，共40个循环，最后温度72℃延伸10分钟；将PCR产物进行质量百分浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳。结果如图5所示，其中，1、2、3、5和6是转基因杨树植株，WT是未进行转化的对照杨树植株；从图可知，BBM基因在转基因杨树植株1、2、3、5和6中均有明显表达，与Southern杂交结果一致。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

序列表

<110>重庆大学

<120>诱导胚状体形成和植物再生的植物双元表达载体及其构建方法和应用

<160>15

<210>1

<211>145

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：loxPFRT-MCS-loxPFRT片段

<400>1

gcgaattcga agttcctata ctttctagag aataggaact tcggaatagg aacttcggta 60

cctatgtcga cgtagagctc gactcgagga agttcctata ctttctagag aataggaact 120

tcggaatagg aacttcgcta gcggc 145

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物NOS1-F

<400>2

aactcgagga tcgttcaaac atttggca 28

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物NOS1-R

<400>3

aagagctccg atctagtaac atagatgac 29

<210>4

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物HSP18.2-F

<400>4

ttggtacctg tcgacagtgg atcccccgtc atttc 35

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物HSP18.2-R

<400>5

ttctcgagat ggttcgttgc ttttcggg 28

<210>6

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物FLP-F

<400>6

ttctcgagaa atgcgtactt atatgcgtc 29

<210>7

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物FLP-R

<400>7

ttctcgagga ggttgtatgc cacaattt 28

<210>8

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物NOS2-F

<400>8

aactcgagga tcgttcaaac atttggca 28

<210>9

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物NOS2-R

<400>9

aagagctctg tcgaccgatc tagtaacata gatgac 36

<210>10

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物35S-F

<400>10

ttggtacctg tcgacgccca cagatggtta gagag 35

<210>11

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物35S-R

<400>11

ttctcgagcc gtgttctctc caaatgaa 28

<210>12

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物BBM-F

<400>12

ttctcgagat gaactcgatg aataactgg 29

<210>13

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物BBM-R

<400>13

ttctcgagct aagtgtcgtt ccaaactg 28

<210>14

<211>1755

<212>DNA

<213>油菜(Brassica napus)

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(1755)

<400>14

atgaactcga tgaataactg gttaggcttc tctctctctc ctcatgatca aaatcatcac 60

cgtacggatg ttgactcctc caccaccaga accgccgtag atgttgccgg agggtactgt 120

tttgatctgg ccgctccctc cgatgaatct tctgccgttc aaacatcttt tctttctcct 180

ttcggtgtca ccctcgaagc tttcaccaga gacaataata gtcactcccg agattgggac 240

atcaatggtg gtgcatgcaa tacattaacc aataacgaac aaaatggacc aaagcttgag 300

aatttcctcg gccgcaccac cacgatttac aataccaacg agaccgttgt agatggaaat 360

ggcgattgtg gaggaggaga cggtggtggt ggcggctcac taggcctttc gatgataaaa 420

acatggctga gtaatcattc ggttgctaat gctaatcatc aagacaatgg taacggtgca 480

cgaggcttgt ccctctctat gaattcatct actagtgata gcaacaacta caacaacaat 540

gatgatgtcg tccaagagaa gactattgtt gatgtcgtag aaactacacc gaagaaaact 600

attgagagtt ttggacaaag gacgtctata taccgcggtg ttacaaggca tcggtggaca 660

ggtagatacg aggcacattt atgggacaat agttgcaaaa gagaaggcca gactcgcaaa 720

ggaagacaag tttatctggg aggttatgac aaagaagaaa aagcagctag ggcttacgat 780

ttagccgcac taaagtattg gggacccacc actactacta acttcccctt gagtgaatat 840

gagaaagagg tagaagagat gaagcacatg acgaggcaag agtatgttgc ctctctgcgc 900

aggaaaagta gtggtttctc tcgtggtgca tcgatttatc gaggagtaac aaggcatcac 960

caacatggaa ggtggcaagc taggatcgga agagtcgccg gtaacaaaga cctctacttg 1020

ggaactttcg gcacacagga agaggctgct gaggcttatg acattgcagc cattaaattc 1080

agaggattaa gcgcagtgac taacttcgac atgaacagat acaatgttaa agcaatcctc 1140

gagagcccga gtctacctat tggtagttct gcgaaacgtc tcaaggacgt taacaatccg 1200

gttccagcta tgatgattag taataacgtt tcagagagtg caaataatgt tagcggttgg 1260

caaaacactg cgtttcagca tcatcaggga atggatttga gcttattgca gcaacagcag 1320

gagaggtacg ttggttatta caatggagga aacttgtcta ccgagagtac tagggtttgt 1380

ttcaaacaag aggaggaaca acaacacttc ttgagaaact cgccgagtca catgactaat 1440

gttgatcatc atagctcgac ctctgatgat tctgttaccg tttgtggaaa tgttgttagt 1500

tatggtggtt atcaaggatt cgcaatccct gttggaacat cggttaatta cgatcccttt 1560

actgctgctg agattgctta caacgcaaga aatcattatt actatgctca gcatcagcaa 1620

caacagcaga ttcagcagtc gccgggagga gattttccgg tggcgatttc gaataaccat 1680

agctctaaca tgtactttca cggggaaggt ggtggagaag gggctccaac gttttcagtt 1740

tggaacgaca cttag 1755

<210>15

<211>1272

<212>DNA

<213>啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(1272)

<400>15

atgccacaat ttggtatatt atgtaaaaca ccacctaagg tgcttgttcg tcagtttgtg 60

gaaaggtttg aaagaccttc aggtgagaaa atagcattat gtgctgctga actaacctat 120

ttatgttgga tgattacaca taacggaaca gcaatcaaga gagccacatt catgagctat 180

aatactatca taagcaattc gctgagtttc gatattgtca ataaatcact ccagtttaaa 240

tacaagacgc aaaaagcaac aattctggaa gcctcattaa agaaattgat tcctgcttgg 300

gaatttacaa ttattcctta ctatggacaa aaacatcaat ctgatatcac tgatattgta 360

agtagtttgc aattacagtt cgaatcatcg gaagaagcag ataagggaaa tagccacagt 420

aaaaaaatgc ttaaagcact tctaagtgag ggtgaaagca tctgggagat cactgagaaa 480

atactaaatt cgtttgagta tacttcgaga tttacaaaaa caaaaacttt ataccaattc 540

ctcttcctag ctactttcat caattgtgga agattcagcg atattaagaa cgttgatccg 600

aaatcattta aattagtcca aaataagtat ctgggagtaa taatccagtg tttagtgaca 660

gagacaaaga caagcgttag taggcacata tacttcttta gcgcaagggg taggatcgat 720

ccacttgtat atttggatga atttttgagg aattctgaac cagtcctaaa acgagtaaat 780

aggaccggca attcttcaag caataaacag gaataccaat tattaaaaga taacttagtc 840

agatcgtaca ataaagcttt gaagaaaaat gcgccttatt caatctttgc tataaaaaat 900

ggcccaaaat ctcacattgg aagacatttg atgacctcat ttctttcaat gaagggccta 960

acggagttga ctaatgttgt gggaaattgg agcgataagc gtgcttctgc cgtggccagg 1020

acaacgtata ctcatcagat aacagcaata cctgatcact acttcgcact agtttctcgg 1080

tactatgcat atgatccaat atcaaaggaa atgatagcat tgaaggatga gactaatcca 1140

attgaggagt ggcagcatat agaacagcta aagggtagtg ctgaaggaag catacgatac 1200

cccgcatgga atgggataat atcacaggag gtactagact acctttcatc ctacataaat 1260

agacgcatat aa 1272

Claims

1.诱导胚状体形成和植物再生的植物双元表达载体，其特征在于：所述植物双元表达载体为pLFFLPBBM，所述pLFFLPBBM是在载体pBIN19的EcoRI和NheI酶切位点之间插入BBM基因和FLP-FRT位点特异性重组系统，所述FLP-FRT位点特异性重组系统包含FLP基因和两个同向FRT位点，所述BBM基因和FLP基因位于两个同向FRT位点之间且BBM基因位于FLP基因的下游，所述BBM基因由花椰菜花叶病毒35S启动子和NOS终止子启动和终止转录，所述FLP基因由热激启动子HSP18.2和NOS终止子启动和终止转录。

2.一种构建权利要求1所述的诱导胚状体形成和植物再生的植物双元表达载体的方法，其特征在于：包括以下步骤：

a、DNA片段loxPFRT-MCS-loxPFRT的制备

b、中间载体pHSP-FLP-NOS1的构建

b4、将步骤b1所得DNA片段I用XhoI和SacI双酶切后，连接到用SalI和SacI双酶切的载体pBlueScript SK+上，获得载体pNOS1；

c、中间载体p35S-BBM-NOS2的构建

c1、以载体pBI121为模板，以核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的引物NOS2-F和核苷酸序列如SEQID No.9所示的引物NOS2-R为上、下游引物进行PCR扩增，获得包含终止子NOS且5’端含有XhoI酶切位点、3’端含有SalI和SacI酶切位点的DNA片段IV；

c4、将步骤c1所得DNA片段IV用XhoI和SacI双酶切后，连接到用SalI和SacI双酶切的载体pBlueScript SK+上，获得载体pNOS2；

d、植物双元表达载体pLFFLPBBM的构建

3.利用权利要求1所述的植物双元表达载体诱导胚状体形成和植物再生的方法，其特征在于：包括以下步骤：

a、将植物双元表达载体pLFFLPBBM转化根瘤农杆菌，获得含有植物双元表达载体pLFFLPBBM的根瘤农杆菌；

b、将步骤a所得含有植物双元表达载体pLFFLPBBM的根瘤农杆菌浸染双子叶植物的愈伤组织，在不添加植物激素的条件下诱导植物愈伤组织形成胚状体，再诱导胚状体形成幼苗，获得转基因植株；

c、在步骤b所得转基因植株的幼苗中诱导FLP表达，从转基因植株的基因组中删除BBM基因和FLP基因。