CN116103332A

CN116103332A - 转基因大豆事件cal16及其检测方法

Info

Publication number: CN116103332A
Application number: CN202211088062.3A
Authority: CN
Inventors: 郑挺; 王鹏飞; 许超; 林海燕; 姜媛媛; 徐雪珍; 唐梦珍; 李静; 童红英; 江虹; 姜纯; 林朝阳; 沈志成
Original assignee: Hangzhou Ruifeng Bio Tech Co ltd
Current assignee: Hangzhou Ruifeng Bio Tech Co ltd
Priority date: 2022-09-07
Filing date: 2022-09-07
Publication date: 2023-05-12
Also published as: WO2024051077A1

Abstract

本发明涉及一种转基因大豆事件CAL16及其检测方法，所述转基因大豆事件CAL16是将外源基因(即T‑DNA)插入大豆基因组18号染色体上SEQ ID NO:27所示的3’端和SEQ ID NO:28所示的5’端之间获得的DNA分子；本发明转基因大豆植物CAL16对鳞翅目昆虫具有较好的抗性并对草甘膦除草剂具有较好的耐受性，对产量无影响，且检测方法可以准确快速的鉴定生物样品中是否包含转基因大豆事件CAL16的DNA分子。

Description

转基因大豆事件CAL16及其检测方法

(一)技术领域

本发明涉及转基因大豆事件及其鉴定方法，特别涉及将外源基因插入大豆细胞基因组构建转基因大豆事件CAL16、以及用于检测该事件的特异性引物、探针和方法，包含所述转基因大豆事件CAL16的微生物及产品，所述外源基因包括融合杀虫蛋白编码基因和耐草甘膦基因。

(二)背景技术

大豆(Glycine max)是世界许多地区的重要作物，并且已将生物技术方法应用于这种作物以产生具有所需性状的大豆品种。最为重要的两种所需性状是昆虫抗性和除草剂耐受性。昆虫抗性和除草剂耐受性转基因在植物中的表达可赋予植物所需的昆虫抗性性状和除草剂耐受性状，但转基因的表达受许多不同因素的影响，包括驱动目的基因转移到植物染色体的单个基因表达盒的取向和组成、染色体位置、以及转基因插入的基因组结果。例如，已在植物中观察到在转基因的染色体插入位点上不同但在其它方面相同的单个事件中的转基因表达的水平和模式方面存在变化。在事件之间还存在非所需的和/或所需的表型或农艺学差异。因此，经常必需的是，产生和分析大量单个植物细胞转化事件以选择兼备适于获得商业成功的所需性状及最优表型和农业特征的事件。选择优选转基因事件需要广泛的分子表征以及许多年来在多个地方且在多种条件下对许多事件的温室和田间试验。收集显著量的效力、表型及分子数据，并且随后由科学家和农学家小组分析所得到的数据和观察结果，目标在于选择一个或多个商业上合适的事件。最后再将合适的事件使用植物育种方法将所需的转基因性状基因渗入其它遗传背景中，由此产生含有所需性状且适当地适于特定局部农艺学条件的许多不同作物品种。目前，这种方法不仅费时费力，而且杂交后代会出现性状分离，导致杂交作物不适合留种，且育种过程缓慢，过程复杂；杂交的结果不可预期，需要大量的选种制种工作，后代表现结果较差。

此外，依赖于针对昆虫侵染的杀昆虫防治的单一毒素表达的转基因大豆可处于耐久性有限的风险中，这是因为昆虫害虫对毒素的抗性发展的可能性提高。相对于表达单一毒素的转基因大豆，提供同时表达两种或多种以上毒性的大豆植物对抗性风险管理是有益的。已经公开含三种抗鳞翅目害虫的大豆转化事件，即表达Cry1Ac毒素蛋白的转化事件、表达Cry1Ac和Cry1F毒素蛋白的大豆转化事件、以及表达Cry1A.105和Cry2Ab的大豆转基因事件，即是导入单一毒素基因到导入多个毒素基因的策略转变。向大豆作物同时导入抗虫基因及抗除草剂基因成为转基因大豆的重要发展趋势。

已知外源基因在植物体内的表达受到它们的染色体位置的影响，可能是由于染色质结构(如异染色质)或转录调节元件(如增强子)接近整合位点。为此，通常需要筛选大量的事件才有可能鉴定出可以商业化的事件(即导入的目标基因得到最优表达的事件)。例如，在植物和其他生物体中已经观察到导入基因的表达量在事件间可能有很大差异；在表达的空间或时间模式上可能也存在差异，如在不同植物组织之间转基因的相对表达存在差异，这种差异表现在实际的表达模式可能与根据导入的基因构建体中的转录调节元件所预期的表达模式不一致。因此，通常需要产生成百上千个不同的事件并从这些事件中筛选出具有以商业化为目的所预期的转基因表达量和表达模式的单一事件。获得具有预期的转基因表达量和表达模式的事件后，可用于采用常规育种方法通过有性异型杂交将转基因渗入到其他遗传背景中。通过这种杂交方式产生的后代保持了原始转化事件的转基因表达特征。

能够检测特定事件的存在以确定有性杂交的后代是否包含目的基因将是有益的。此外，检测特定事件的方法还将有助于遵守相关法规，例如来源于重组农作物的食物在投入市场前需要获得正式批准和进行标记。通过任何熟知的多核苷酸检测方法来检测转基因的存在都是可能的，例如聚合酶链式反应(PCR)或利用多核苷酸探针的DNA杂交。这些检测方法通常集中于常用的遗传元件，例如启动子、终止子、标记基因等。因此，除非与插入的转基因DNA相邻的染色体DNA(“侧翼DNA”)的序列是己知的，否则上述这种方法就不能够用于区别不同的事件，特别是那些用相同的DNA构建体产生的事件。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种转基因大豆事件CAL16及其检测方法，将外源基因转入大豆细胞基因组特定位点构建转基因大豆事件CAL16，明确了外源基因插入位点，解决了现有方法不能准确快速鉴定生物样品的问题。本发明利用跨越了插入的外源基因和大豆基因组侧翼DNA的接合部位的一对引物通过PCR来鉴定转基因特定事件，具体地说是包含侧翼序列的第一引物和包含插入序列的第二引物，克服现有方法不能够区别不同的事件的缺陷。利用本发明提供的核酸序列、引物、探针及其检测方法，可以准确快速地鉴定生物样品中是否包含转基因大豆事件CAL16的DNA分子。本发明外源基因可以是任意基因，比如所述外源基因包括抗虫基因表达盒和抗草甘膦基因表达盒，其中抗虫基因表达盒通过表达对鳞翅目害虫物种有毒性的两种蛋白的融合蛋白Cry1Ab/Vip3Da克服了转基因事件的抗虫耐久性问题，特别是对鳞翅目害虫(斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、棉铃虫以及小地老虎)耐药性显著降低，同时抗草甘膦基因表达盒编码G10evo EPSPS提供大豆植物对草甘膦的耐受性。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

第一方面，本发明提供一种转基因大豆事件CAL16，所述转基因大豆事件CAL16是将外源基因(即T-DNA)插入大豆基因组18号染色体上SEQ ID NO:27所示的3’端和SEQ IDNO:28所示的5’端之间获得的DNA分子；所述大豆基因组核酸序列来源于NCBI:RefSeqGenome Database(Glycine max cultivar Williams 28-v4.0)；所述外源基因包括抗草甘膦基因表达盒和抗虫基因表达盒，所述抗草甘膦基因表达盒包括：用作草甘膦基因g10evo-epsps表达的启动子pCaMV35S启动子、拟南芥EPSPS叶绿体信号肽、g10evo-epsps基因、CaMV的35S终止子；所述抗虫基因表达盒包括：pCsVMV启动子、cry1Ab/vip3Da抗虫融合基因、NOS终止子。

SEQ ID NO.27

TTTGGCAAAGGGAGAAGGGAATGAAAAAGATGAATAGCACAAGTTTTCAAGGTTTGGAAAAACCAAAAAACTTTGGAAAGCTTTTAGCAAAAGGAAGGAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGTTCAAAGAGATTCAAGGCTTGTAAAGGATTGTATAAGATTGATTGGAAAAGTGTATTGAAAAGCAAATCATGTCAACATTAATGAGCCTGGGATGCTCTAAACACATGATTGGAGATGCATCAAAGCTCACTCATATTTCTCCCAAGAATAGTGGACATGTGACTTATGGCGACACCAATAATGGTAGAATCCTTGGAGTTGGAAAAACTCTTGTGTGTTTGTCTCCTTCTTCCCTACTCTTTTACTTTCCATTGTGCATTTTAATTTCCTCTTTTACTTTCTGTTAAGTTTCTCTTCTACTCCTCATGTCAACATATC.

SEQ ID NO.28

CACTATTATTGTTTTTGTATTATATTTTCCCAGGCTTATCTTTTATCAATGAGTTATATATAAAGAAATAATCAGTCAACATGTAGCAACAAAATATTTGCAGTAATAATAATAACGTTAAACAATAGAAATTAAAAAAACCTAACAACAAATGTCTTGATTTTAAAGACTTGTGTTCACATGATCATTTGATCAAGTAAAAGATAACTTCCTAAGGCAAGAATGAAAGTAGTGAGATGTTTTTAGTTTTTTTTTTCCACACAAACTAATTCTAAAAACATTTTATCTTAAACAAAAATACAATTAACAAAGAAAATATTTTTCAACAATCTCATACTAATGTAAAACTTCAGGAAATACATAATATAATAAAAACATTTTTAATGGAACATCATGCATTGTGTTTTCATCCATTAATTTTTCATGCTTACTAGAAAGGAACTTAATCATATCCATTATAGATATTTTGATACAACATCATGCTACTGCAGAAAAGACTATGCAAGAAGAAAGTATAAAACATTTTTCTCTCTTAAGACTGTTGGAAAATAAAACAAAAATGAAGGAAAATAAATACGAAGAAGATGCACAGTCTTGAATTA。

优选的，所述转基因大豆事件CAL16的DNA分子核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。

优选的，所述转基因大豆事件CAL16以大豆(Glycine max)CAL16种子的形式保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：P202205，保藏日期2022年4月18日，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072。

特别需要指出的是，本领域的研究人员公知，大豆基因组中存在大量活跃的转座子序列，不同遗传背景下的大豆基因组中可能存在序列位置的偏移。本领域的研究人员可以通过杂交等方式获得本发明转基因大豆事件CAL16的后代，任意后代的基因组中外源T-DNA的旁侧序列为SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28的大豆事件都应视为本发明的内容。

第二方面，本发明提供一种用于检测所述转基因大豆事件CAL16的核酸序列，所述核酸序列包括SEQ ID NO:1或其互补序列、和/或SEQ ID NO:2或其互补序列。

SEQ ID NO:1：tcaacatatctcaaacactg atagt；

SEQ ID NO:2：ttaagttgtccactattattgtttt。

所述SEQ ID NO:1或其互补序列为转基因大豆事件CAL16中在插入序列的5’末端位于插入接合部位附近的一个长度为25个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:1或其互补序列跨越了大豆插入位点的侧翼基因组DNA序列和插入序列的5’末端的DNA序列，包含所述SEQID NO:1或其互补序列即可鉴定为转基因大豆事件CAL16的存在。所述SEQ ID NO:2或其互补序列为转基因大豆事件CAL16中在插入序列的3’末端位于插入接合部位附近的一个长度为25个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:2或其互补序列跨越了插入序列的3’末端的DNA序列和大豆插入位点的侧翼基因组DNA序列，包含所述SEQ ID NO:2或其互补序列即可鉴定为转基因大豆事件CAL16的存在。

进一步，本发明所述核酸序列还包括SEQ ID NO:3或其互补序列、和/或SEQ IDNO:4或其互补序列。

SEQ ID NO:3：aagtttctct tctactcctc atgtcaacat atctcaaaca ctgatagtttaaactgaagg；

SEQ ID NO:4：acgtccgcaa tgtgttatta agttgtccac tattattgtt tttgtattatattttcccag。

所述SEQ ID NO:3或其互补序列为转基因大豆事件CAL16中在插入序列的5’末端位于插入接合部位附近的一个长度为60个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:3或其互补序列跨越了大豆插入位点的侧翼基因组DNA序列和插入序列的5’末端的DNA序列，包含所述SEQID NO:3或其互补序列即可鉴定为转基因大豆事件CAL16的存在。所述SEQ ID NO:4或其互补序列为转基因大豆事件CAL16中在插入序列的3’末端位于插入接合部位附近的一个长度为60个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:4或其互补序列跨越了插入序列的3’末端的DNA序列和大豆插入位点的侧翼基因组DNA序列，包含所述SEQ ID NO:4或其互补序列即可鉴定为转基因大豆事件CAL16的存在。

进一步，本发明所述核酸序列还包括SEQ ID NO:5或其互补序列、和/或SEQ IDNO:6或其互补序列。

SEQ ID NO:5：ttcctctttt actttctgtt aagtttctct tctactcctc atgtcaacatatctcaaaca ctgatagttt aaactgaagg cgggaaacga caatctgatc；

SEQ ID NO:6：gttaattcag tacattaaaa acgtccgcaa tgtgttatta agttgtccactattattgtt tttgtattat attttcccag gcttatcttt tatcaatgag。

所述SEQ ID NO:5或其互补序列为转基因大豆事件CAL16中在插入序列的5’末端位于插入接合部位附近的一个长度为100个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:5或其互补序列跨越了大豆插入位点的侧翼基因组DNA序列和插入序列的5’末端的DNA序列，包含所述SEQID NO:5或其互补序列即可鉴定为转基因大豆事件CAL16的存在。所述SEQ ID NO:6或其互补序列为转基因大豆事件CAL16中在插入序列的3’末端位于插入接合部位附近的一个长度为100个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:6或其互补序列跨越了插入序列的3’末端的DNA序列和大豆插入位点的侧翼基因组DNA序列，包含所述SEQ ID NO:6或其互补序列即可鉴定为转基因大豆事件CAL16的存在。

进一步，本发明所述核酸序列还包括SEQ ID NO:7或其互补序列、和/或SEQ IDNO:8或其互补序列。

SEQ ID NO:7：

tttggcaaag ggagaaggga atgaaaaaga tgaatagcac aagttttcaa ggtttggaaaaaccaaaaaa ctttggaaag cttttagcaa aaggaaggag aagaagaaga agaagaagaa gaagttcaaagagattcaag gcttgtaaag gattgtataa gattgattgg aaaagtgtat tgaaaagcaa atcatgtcaacattaatgag cctgggatgc tctaaacaca tgattggaga tgcatcaaag ctcactcata tttctcccaagaatagtgga catgtgactt atggcgacac caataatggt agaatccttg gagttggaaa aactcttgtgtgtttgtctc cttcttccct actcttttac tttccattgt gcattttaat ttcctctttt actttctgttaagtttctct tctactcctc atgtcaacat atctcaaaca ctgatagttt aaactgaagg cgggaaacgacaatctgatc caagctcaag ctgctctagc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatcggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggtaacgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa gcttccagaa ggtaattatccaagatgtag catcaagaat ccaatgttta cgggaaaaac tatggaagta ttatgtgaac tcagcaagaagcagatcaat atgcggcaca tatgcaacct atgttcaaaa atgaagaatg tacagataca agatcctatactgccagaat acgaagaaga atacgtagaa attgaaaaag aagaaccagg cgaagaaaag aatcttgaagacgtaagcac tgacgacaac aatgaaaaga agaagataag gtcggtgatt gtgaaagaga catagaggacacatgtaagg tggaaaatgt aagggcggaa agtaacctta tcacaaagga atcttatccc ccactacttatccttttata tttttccgtg tcactagtga agacgtaagc actgacgaca acaatgaaaa gaagaagataaggtcggtga ttgtgaaaga gacatagagg acacatgtaa ggtggaaaat gtaagggcgg aaagtaaccttatcacaaag gaatcttatc ccccactact tatcctttta tatttttccg tgtcattttt gcccttgagttttcctatat aaggaaccaa gttcggcatt tgtgaaaaca agaaaaaatt tggtgtaagc tattttctttgaagtactga ggatacaact tcagagaaat ttgtaagttt gtggatccaa caatggacaa caaccccaacatcaacgagt gcatccccta caactgcctg agcaaccccg aggtggaggt gctgggcggc gagcgcatcgagaccggcta cacccccatc gacatcagcc tgagcctgac ccagttcctg ctgagcgagt tcgtgcccggcgccggcttc gtgctgggcc tggtggacat catctggggc atcttcggcc ccagccagtg ggacgccttcctggtgcaga。

SEQ ID NO:8：

atgttcctcg gtcctcttct tcctgacgga ctcgaactta gactcaccgg tgatatcaagtcccacgctc ctcttagaca gacacttgac accctctctg atttcggtgt tagagctact gcctccgatgaccttagaag aatctccatc cctggtggtc agaagtacag accaggtaga gtgctcgttc ctggtgattaccctggttcc gctgctatcc ttaccgccgc tgctcttctc ccaggtgagg ttagactttc taaccttagagaacacgacc tccagggtga gaaggaagct gtgaacgttc ttagagagat gggtgctgat atcgttagagaaggtgatac ccttaccgtg agaggtggta gacctctcca cgctgttact agagatggtg attccttcaccgacgccgtg caagctctta ccgctgctgc tgccttcgct gagggtgata ccacctggga aaacgttgctactcttagac tcaaggaatg cgatagaatc tctgacacca gagctgagct tgaaagactt ggtcttagagcaagagagac cgccgattct ctctccgtta ctggttctgc tcaccttgct ggtggtatca ccgctgatggtcacggtgac cacagaatga tcatgcttct cacccttctt ggtctcagag cagatgctcc acttagaatcaccggtgcac accacatcag aaagtcctac cctcagttct tcgctcacct tgaagctctt ggtgctagattcgaatacgc tgaggctacc gcctaatagg agctcgagtt tctccataat aatgtgtgag tagttcccagataagggaat tagggttcct atagggtttc gctcatgtgt tgagcatata agaaaccctt agtatgtatttgtatttgta aaatacttct atcaataaaa tttctaattc ctaaaaccaa aatccagtac taaaatccagatcccccgaa ttaattcggc gttaatccag tacattaaaa acgtccgcaa tgtgttatta agttgtccactattattgtt tttgtattat attttcccag gcttatcttt tatcaatgag ttatatataa agaaataatcagtcaacatg tagcaacaaa atatttgcag taataataat aacgttaaac aatagaaatt aaaaaaacctaacaacaaat gtcttgattt taaagacttg tgttcacatg atcatttgat caagtaaaag ataacttcctaaggcaagaa tgaaagtagt gagatgtttt tagttttttt tttccacaca aactaattct aaaaacattttatcttaaac aaaaatacaa ttaacaaaga aaatattttt caacaatctc atactaatgt aaaacttcaggaaatacata atataataaa aacattttta atggaacatc atgcattgtg ttttcatcca ttaatttttcatgcttacta gaaaggaact taatcatatc cattatagat attttgatac aacatcatgc taccgcagaaaagactatgc aagaagaaag tataaaacat ttttctctct taagactgtt ggaaaataaa acaaaaatgaaggaaaataa atacgaagaa gatgcacagt cttgaatta。

所述SEQ ID NO:7或其互补序列为转基因大豆事件CAL16中在插入序列的5’末端位于插入接合部位附近的一个长度为1610个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:7或其互补序列由443个核苷酸的大豆侧翼基因组DNA序列(SEQ ID NO:7的核苷酸1-443)、1167个核苷酸的pCAL构建体DNA序列(SEQ ID NO:7的核苷酸444-1610)组成，包含所述SEQ ID NO:7或其互补序列即可鉴定为转基因大豆事件CAL16的存在。所述SEQ ID NO:8或其互补序列为转基因大豆事件CAL16中在插入序列的3’末端位于插入接合部位附近的一个长度为1639个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:8或其互补序列由1037个核苷酸pCAL构建体DNA序列(SEQ IDNO:8的核苷酸1-1037)和602个核苷酸的大豆整合位点侧翼基因组DNA序列(SEQ ID NO:8的核苷酸1038-1639)组成，包含所述SEQ ID NO:8或其互补序列即可鉴定为转基因大豆事件CAL16的存在。

更进一步，所述核酸序列包含SEQ ID NO:10或其互补序列。

tttggcaaag ggagaaggga atgaaaaaga tgaatagcac aagttttcaa ggtttggaaaaaccaaaaaa ctttggaaag cttttagcaa aaggaaggag aagaagaaga agaagaagaa gaagttcaaagagattcaag gcttgtaaag gattgtataa gattgattgg aaaagtgtat tgaaaagcaa atcatgtcaacattaatgag cctgggatgc tctaaacaca tgattggaga tgcatcaaag ctcactcata tttctcccaagaatagtgga catgtgactt atggcgacac caataatggt agaatccttg gagttggaaa aactcttgtgtgtttgtctc cttcttccct actcttttac tttccattgt gcattttaat ttcctctttt actttctgttaagtttctct tctactcctc atgtcaacat atctcaaaca ctgatagttt aaactgaagg cgggaaacgacaatctgatc caagctcaag ctgctctagc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatcggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggtaacgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa gcttccagaa ggtaattatccaagatgtag catcaagaat ccaatgttta cgggaaaaac tatggaagta ttatgtgaac tcagcaagaagcagatcaat atgcggcaca tatgcaacct atgttcaaaa atgaagaatg tacagataca agatcctatactgccagaat acgaagaaga atacgtagaa attgaaaaag aagaaccagg cgaagaaaag aatcttgaagacgtaagcac tgacgacaac aatgaaaaga agaagataag gtcggtgatt gtgaaagaga catagaggacacatgtaagg tggaaaatgt aagggcggaa agtaacctta tcacaaagga atcttatccc ccactacttatccttttata tttttccgtg tcactagtga agacgtaagc actgacgaca acaatgaaaa gaagaagataaggtcggtga ttgtgaaaga gacatagagg acacatgtaa ggtggaaaat gtaagggcgg aaagtaaccttatcacaaag gaatcttatc ccccactact tatcctttta tatttttccg tgtcattttt gcccttgagttttcctatat aaggaaccaa gttcggcatt tgtgaaaaca agaaaaaatt tggtgtaagc tattttctttgaagtactga ggatacaact tcagagaaat ttgtaagttt gtggatccaa caatggacaa caaccccaacatcaacgagt gcatccccta caactgcctg agcaaccccg aggtggaggt gctgggcggc gagcgcatcgagaccggcta cacccccatc gacatcagcc tgagcctgac ccagttcctg ctgagcgagt tcgtgcccggcgccggcttc gtgctgggcc tggtggacat catctggggc atcttcggcc ccagccagtg ggacgccttcctggtgcaga tcgagcagct gatcaaccag cgcatcgagg agttcgcccg caaccaggcc atcagccgcctggagggcct gagcaacctg taccaaatct acgccgagag cttccgcgag tgggaggccg accccaccaaccccgccctg cgcgaggaga tgcgcatcca gttcaacgac atgaacagcg ccctgaccac cgccatccccctgttcgccg tgcagaacta ccaggtgccc ctgctgagcg tgtacgtgca ggccgccaac ctgcacctgagcgtgctgcg cgacgtcagc gtgttcggcc agcgctgggg cttcgacgcc gccaccatca acagccgctacaacgacctg acccgcctga tcggcaacta caccgaccac gccgtgcgct ggtacaacac cggcctggagcgcgtgtggg gtcccgacag ccgcgactgg atcaggtaca accagttccg ccgcgagctg accctgaccgtgctggacat cgtgagcctg ttccccaact acgacagccg cacctacccc atccgcaccg tgagccagctgacccgcgag atttacacca accccgtgct ggagaacttc gacggcagct tccgcggcag cgcccagggcatcgagggca gcatccgcag cccccacctg atggacatcc tgaacagcat caccatctac accgacgcccaccgcggcga gtactactgg agcggccacc agatcatggc cagccccgtc ggcttcagcg gccccgagttcaccttcccc ctgtacggca ccatgggcaa cgctgcacct cagcagcgca tagtggcaca gctgggccagggagtgtacc gcaccctgag cagcaccctg taccgtcgac ctttcaacat cggcatcaac aaccagcagctgagcgtgct ggacggcacc gagttcgcct acggcaccag cagcaacctg cccagcgccg tgtaccgcaagagcggcacc gtggacagcc tggacgagat cccccctcag aacaacaacg tgccacctcg acagggcttcagccaccgtc tgagccacgt gagcatgttc cgcagtggct tcagcaacag cagcgtgagc atcatccgtgcacctatgtt cagctggatt caccgcagtg ccgagttcaa caacatcatc cccagcagcc agatcacccagatccccctg accaagagca ccaacctggg cagcggcacc agcgtggtga agggccccgg cttcaccggcggcgacatcc tgcgccgcac cagccccggc cagatcagca ccctgcgcgt gaacatcacc gcccccctgagccagcgcta ccgcgtccgc atccgctacg ccagcaccac caacctgcag ttccacacca gcatcgacggccgccccatc aaccagggca acttcagcgc caccatgagc agcggcagca acctgcagag cggcagcttccgcaccgtgg gcttcaccac ccccttcaac ttcagcaacg gcagcagcgt gttcaccctg agcgcccacgtgttcaacag cggcaacgag gtgtacatcg accgcatcga gttcgtgccc gccgaggtga ccttcgaggccgagtacgac ctggagaggg ctcagaaggc cgtgaacgag ctgttcacca gcagcaacca gatcggcctgaagaccgacg tgaccgacta ccacatcgat caggtgcgag gccccggtgg agcaggtgga gcaggtggagggggtaaagg aaacaacacc aagctgaacg ccagggccct gccgagcttc atcgactact tcaacggcatctacggcttc gccaccggca tcaaggacat catgaacatg atcttcaaga ccgacaccgg cggcaacctgaccctggacg agatcctgaa gaaccagcag ctgctgaacg agatcagcgg caagctggac ggcgtgaacggcagcctgaa cgacctgatc gcccagggca acctgaacac cgagctgagc aaggagatcc tgaagatcgccaacgagcag aaccaggtgc tgaacgacgt gaacaacaag ctggacgcca 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所述SEQ ID NO:10或其互补序列为表征转基因大豆事件CAL16的长度为9559个核苷酸的序列，其具体包含的基因组和遗传元件如表1所示。包含所述SEQ ID NO:10或其互补序列即可鉴定为转基因大豆事件CAL16的存在。

本发明提供了转基因大豆事件CAL16所特有的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列可用于表征转基因大豆事件CAL16，从而可用于检测样品中是否存在转基因大豆事件CAL16。具体而言，样品中SEQ ID NO:1-10中一种或多种所示的核酸分子中至少11个连续的核苷酸的存在均表明该样品中存在转基因大豆事件CAL16。

本发明中，用于检测样品中转基因大豆事件CAL16的第一核酸序列可以为SEQ IDNO:7或其互补序列和/或SEQ ID NO:8或其互补序列和/或SEQ ID NO:9或其互补序列中转基因插入序列的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸，第二核酸序列可以为SEQ IDNO:7或其互补序列中5’侧翼大豆基因组DNA区域的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸。当第一核酸序列和第二核酸序列一起使用时，这些核酸序列在产生扩增产物的DNA扩增方法中包括DNA引物对。使用DNA引物对在DNA扩增方法中产生的扩增产物是包括SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的扩增产物时，可以诊断转基因大豆事件CAL16或其后代的存在。本领域技术人员熟知的，第一和第二核酸序列不必仅仅由DNA组成，也可包括RNA、DNA和RNA的混合物，或者DNA、RNA或其它不作为一种或多种聚合酶模板的核苷酸或其类似物的组合。此外，本发明中用于检测的探针或引物选自SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中所述的核苷酸，所述探针或引物至少是11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个连续核苷酸的长度；当选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的核苷酸时，所述探针和引物可以为长度是至少大约21个到大约50个或更多的连续核苷酸。

所述核酸序列或其互补序列可用于DNA扩增法中以产生扩增子，所述扩增子用于检测诊断生物样品中转基因大豆事件CAL16或其后代的存在；所述核酸序列或其互补序列可用于核苷酸检测法中，以检测生物样品中转基因大豆事件CAL16或其后代的存在。

第三方面，本发明提供一种检测样品中转基因大豆事件CAL16的DNA分子存在的方法，所述方法包括：(1)将待检测样品与DNA探针或引物对在核酸扩增反应液中接触；所述引物对包括第一引物和第二引物；所述第一引物为SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25中的一种；所述第二引物为SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26中的一种；所述DNA探针为SEQ ID NO:24所示；(2)进行核酸扩增反应；(3)检测扩增产物的存在；所述扩增产物包括SEQ ID NO:1或其互补序列、和/或SEQ ID NO:2或其互补序列中至少11个连续核苷酸。所述探针用至少一种荧光基团标记，优选为6FAMTM(6-羧基荧光素)。

优选的，所述扩增产物包括SEQ ID NO:3或其互补序列中至少11个连续核苷酸、和/或SEQ ID NO:4或其互补序列中至少11个连续核苷酸。

进一步，优选所述扩增产物包括SEQ ID NO:5或其互补序列中至少11个连续核苷酸、和/或SEQ ID NO:6或其互补序列中至少11个连续核苷酸。

进一步，优选所述扩增产物包括SEQ ID NO:7或其互补序列中至少11个连续核苷酸、和/或SEQ ID NO:8或其互补序列中至少11个连续核苷酸。

更进一步，所述扩增产物包括SEQ ID NO:1或其互补序列、SEQ ID NO:2或其互补序列、SEQ ID NO:3或其互补序列、SEQ ID NO:4或其互补序列、SEQ ID NO:5或其互补序列、SEQ ID NO:6或其互补序列、SEQ ID NO:7或其互补序列、和/或SEQ ID NO:8或其互补序列、和/或SEQ ID NO:9或其互补序列、和/或SEQ ID NO:10或其互补序列中至少11个连续核苷酸。

本发明所述引物对包括至少一种源于SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的DNA引物序列。引物SEQ ID NO:22与对应于SEQ ID NO:10的位置8929至8954和SEQ ID NO:8的位置999至1024以及SEQ ID NO:6的位置9至34的核苷酸序列相同。引物SEQ ID NO:23与对应于SEQ ID NO:10的位置9042至9069和SEQ ID NO:8的位置1112至1139的反向互补核苷酸序列相同。探针序列(SEQ ID NO:24)与对应于SEQ ID NO:10的位置8996至9010和SEQ ID NO:8的位置1066至1080以及SEQ ID NO:6的位置76至95的核苷酸序列相同。引物SEQ ID NO:25与对应于SEQ ID NO:10的位置296至323和SEQ ID NO:7的位置296至323的核苷酸序列相同。引物SEQ ID NO:26与对应于SEQ ID NO:10的位置500至525和SEQ ID NO:9的位置57至82和SEQ ID NO:7的位置500至525的反向互补核苷酸序列相同。

第四方面，本发明还提供了一种培育含所述转基因大豆事件CAL16的抗虫大豆植物的方法，所述方法包括：种植含特定核酸序列的大豆种子，收获与其他不含特定核酸序列大豆植物相比，抗鳞翅目昆虫能力显著提高的大豆，保护大豆植物免于昆虫侵袭；所述特定核酸序列选自：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10中的一种或其互补序列；所述鳞翅目昆虫包括但不限于：斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、棉铃虫、小地老虎。

第五方面，本发明还提供了一种培育含所述转基因大豆事件CAL16的耐除草剂大豆植物的方法，所述方法包括：种植含特定核酸序列的大豆种子，喷施除草剂，收获与其他不含特定核酸序列大豆植物相比，耐除草剂能力显著提高的大豆；所述特定核酸序列选自：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10中的一种或其互补序列；所述除草剂包括草甘膦。

第六方面，本发明还提供了一种控制种植含所述转基因大豆事件CAL16的大豆植物的田间杂草的方法，所述方法包括：种植含特定区域核酸序列的转基因大豆植物，喷施有效剂量草甘膦除草剂，杀灭杂草；所述转基因大豆基因组中包含来自转基因大豆事件CAL16的特定区域核酸序列，所述特定区域核酸序列包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10中的一种或其互补序列。

第七方面，本发明还提供了一种产生昆虫抗性或/和草甘膦耐受性大豆植物的方法，所述方法包括：将含有特定区域核酸序列的大豆植株，与另一种大豆植株杂交，从而产生子代植株；收获与其他不含有特定区域核酸序列的植株相比，对除草剂的耐受性和/或抗虫性显著提高的植物；所述特定区域核酸序列来自转基因大豆事件CAL16，所述特定区域的核酸序列包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10中的一种或其互补序列。

第八方面，本发明还提供了一种产生自转基因大豆事件CAL16的转基因植物细胞，所述转基因植物细胞是将所述转基因大豆事件CAL16的特定区域核酸序列转入植物基因组获得的，所述特定区域的核酸序列包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10中的一种或其互补序列。

第九方面，本发明还提供了一种产生自转基因大豆事件CAL16的商品或农产品，所述大豆商品或农产品包括：大豆油、大豆蛋白、大豆粕、大豆粉、大豆坯片、大豆豆皮、豆浆、大豆干酪、大豆酒、包含大豆的动物饲料、包含大豆的纸、包含大豆的乳酪、大豆生物质、以及使用大豆植物及大豆植物部分生产的燃料产品。

所述“大豆(soybean)”意指大豆(Glycine max)且包括可用含有转基因大豆事件CAL16的大豆植物育种的所有植物品种，包括野生大豆物种以及属于容许物种之间的育种的大豆属的那些植物。所述术语“包含”意指“包括但不限于”。

所述“侧翼DNA”可以包含天然存在于例如植物的生物体中的基因组或通过转化过程引入的外源(异源)DNA，例如与转化事件相关的片段。因此，侧翼DNA可以包括天然和外源DNA的组合。在本发明中，“侧翼区”或“侧翼序列”或“基因组边界区”或“基因组边界序列”是指至少3、5、10、11、15、20、50、100、200、300、400、1000、1500、2000、2500或5000碱基对或更长的序列，其位于最初外源插入DNA分子的直接上游或下游并且与最初外源插入DNA分子相邻。当该侧翼区位于下游时，其也可以称为“左边界侧翼”或“3’侧翼”或“3’基因组边界区”或“基因组3’边界序列”等。当该侧翼区位于上游时，其也可以称为“右边界侧翼”或“5’侧翼”或“5’基因组边界区”或“基因组5’边界序列”等。

引起外源DNA的随机整合的转化程序会导致含有不同侧翼区的转化事件，所述不同侧翼区是每个转化事件所特异性含有的。当重组DNA通过传统杂交被引入植物时，其侧翼区通常不会改变。转化事件也会含有异源插入物DNA和基因组DNA的段之间或两段基因组DNA之间或两段异源DNA之间的独特的接合。“接合”是两个具体的DNA片段连接的点。例如，接合存在于插入物DNA连接侧翼DNA的位置。接合点还存在于转化的生物体中，其中两个DNA片段以修饰自天然生物体中发现的方式的连接在一起。“接合DNA”是指包含接合点的DNA。

本发明转基因大豆事件CAL16比现有的转基因大豆植物及同时构建的新事件，具有更加优良的性质和性能，包含了一个DNA构建体并以单一形式插入大豆基因组。

所述DNA构建体(图1)包含一个T-DNA，该T-DNA区段含有两个连接的植物表达盒，其中调控遗传元件为在大豆植物细胞中表达融合杀虫蛋白Cry1Ab/Vip3Da，以及耐草甘膦G10evo EPSPS所必需。所述DNA区段编码两个不同的杀昆虫蛋白的融合蛋白，由如SEQ IDNO:10中列出且在图1中示出的插入的转基因DNA的表达盒表达的Cry1Ab-Vip3Da蛋白。Cry1Ab-Vip3Da基因表达盒是由pCsVMV启动子、抗虫融合基因cry1Ab-vip3Da和农杆菌NOS终止子构成。其中pCsVMV启动子为组成型启动子，来源于玄参花叶病毒，可驱动目的基因在所有植物组织中表达，终止子为NOS终止子，来源于农杆菌。所述DNA区段编码具有草甘膦耐性的5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶G10evo EPSPS，由如SEQ ID NO:10中列出且在图1中示出的插入的转基因DNA的表达盒表达的G10evo EPSPS蛋白。g10evo epsps基因表达盒是由35S启动子、TEV 5’UTR，拟南芥EPSPS信号肽，g10evo epsps基因和35S终止子构成。其中35S启动子为组成型启动子，来源于花椰菜花叶病毒，可驱动目的基因在所有植物组织中表达，叶绿体信号肽来源于拟南芥，g10evo epsps来源于耐辐射奇球菌Deinococcusradiodurans，终止子为35S终止子，来源于花椰菜花叶病毒。

所述DNA构建体采用农杆菌介导的大豆子叶节转化法被引入大豆基因组。

本发明提供示范性引物或探针，其可用于检测源自于包含事件CAL16 DNA的大豆植物的DNA在样品中的存在。此类引物或探针对靶核酸序列有特异性且因而适用于通过本文所述的本发明方法鉴别大豆事件CAL16核酸序列。

所述“探针”是与靶核酸的一条链互补的分离的核酸。根据本发明的探针不仅包含脱氧核糖核酸或核糖核酸，而且包含聚酰胺及其它探针材料，其特异性地结合至靶DNA序列且此类结合的检测可适用于诊断、区分、测定、或证实靶DNA序列在特定样品中的存在。探针可连接至常规的可检测标记或报道分子，例如放射性同位素、配体、化学发光剂或酶。适用作探针的示例性DNA分子作为SEQ ID NO:24来提供。

所述“引物”可以是高度纯化的、分离的多核苷酸，其被设计用于涉及热扩增的特异性退火或杂交方法中。一对引物可与模板DNA(如大豆基因组DNA的样品)在如聚合酶链反应(PCR)的热扩增中一起使用以产生扩增子，其中由此类反应产生的扩增子将具有对应于位于其中引物杂交至模板的两个位点之间的模板DNA序列的DNA序列。如本文所用，“扩增子”是已使用扩增技术合成的DNA的片段(piece/fragment)的复制。本发明的扩增子可包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10所提供的至少一个序列。引物通常被设计来杂交至互补的靶DNA链以形成引物与靶DNA链之间的杂种，并且引物的存在是通过聚合酶识别的点以使用靶DNA链作为模板开始引物的延伸(即，另外的核苷酸聚合至加长的核苷酸分子中)。如本发明中使用的引物对意在指示使用双链核苷酸区段的两个引物结合相反链，以便通常在热扩增反应或其它常规的核酸扩增方法中线性地扩增在靶向由引物对的单个元件结合的位置之间的多核苷酸区段。适用作引物的示例性DNA分子作为SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26来提供。作为SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26提供的引物对适用作第一DNA分子和不同于第一DNA分子的第二DNA分子，并且两者都具有足够长度的SEQ ID NO:10的连续核苷酸以用作DNA引物，所述DNA引物当在热扩增反应中与源自于大豆事件CAL16的模板DNA一起使用时产生用于诊断样品中的大豆事件CAL16 DNA的扩增子。

根据本发明的探针和引物可与靶序列具有完全的序列同一性，尽管保留优先地杂交至靶序列的能力的不同于靶序列的引物和探针可通过常规方法来设计。为了使核酸分子能用作引物或探针，其仅需在序列上足够互补以便能够在特定的溶剂和所用的盐浓度下形成稳定的双链结构。任何常规的核酸杂交或扩增方法都可用于鉴别来自大豆事件CAL16的转基因DNA在样品中的存在。探针和引物一般是至少约11、18、24、或30个核苷酸或更长。此类探针和引物在严格的杂交条件下特异性地杂交至靶DNA序列。常规的严格条件是由Sambrook等人,1989且由Haymes等人在Nucleic Acid Hybridization,A PracticalApproach,IRL Press,Washington,DC(1985)中描述。

如本发明使用的，“经过扩增的DNA”或“扩增子”是指作为核酸模板一部分的目标核酸序列的核酸扩增产物。例如，为了确定大豆植物是否由含有本发明转基因大豆事件CAL16，通过有性杂交方式产生，或采集自田地的大豆样品是否包含转基因大豆事件CAL16，或大豆提取物，例如粗粉、粉或油是否包含转基因大豆事件CAL16，从大豆植物组织样品或提取物提取的DNA可以通过使用引物对的核酸扩增方法以产生对于转基因大豆事件CAL16的DNA的存在是诊断性的扩增子。所述引物对包括一个来源于植物基因组中与插入的外源DNA插入位点相邻的侧翼序列的第一引物，和来源于插入的外源DNA的第二引物。扩增子具有一定长度和序列，所述序列对所述转基因大豆事件CAL16也是诊断性的。扩增子的长度范围可以是引物对的结合长度加上一个核苷酸碱基对，优选加上约五十个核苷酸碱基对，更优选加上约两百五十个核苷酸碱基对，最优选加上约四百五十个核苷酸碱基对或更多。

本领域技术人员所熟知的许多方法都可用于分离和操纵在本发明中所公开的DNA分子或其片段，包括热扩增方法。也可以通过其它技术获得DNA分子或其片段，如通过化学方法直接合成片段，比如利用自动寡核苷酸合成仪。

所述“后代或子代”包括包含源自于祖先植物的事件CAL16 DNA和/或包含具有选自由以下组成的组的至少一个序列的DNA分子的任何植物、种子、植物细胞和/或可再生的植物部分：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10。植物、后代、及种子对于转基因可以是纯合的或杂合的。后代可从由含有大豆事件CAL16的植物产生的种子和/或从由用来自含有大豆事件CAL16的植物的花粉受精的植物产生的种子长成。后代植物可通过自花授粉(又名“自交”)产生真正的植物育种系，即对转基因纯合的植物。适当的后代自交可产生对于加入的外源性基因是纯合的植物。或者，后代植物可异型杂交，例如用另一不相关的植物育种，产生品种或杂种种子或植物。另一不相关的植物可以是转基因或非转基因的。本发明的品种或杂种种子或植物可因此通过将缺少大豆事件CAL16的特异性及独特的DNA的第一亲代与包含大豆事件CAL16的第二亲代有性地杂交由此产生包含大豆事件CAL16的特异性及独特的DNA的杂种而得到。每个亲代可以是杂种或近交种/品种，只要所述杂交或育种产生本发明的植物或种子，即具有至少一个含有大豆事件CAL16的DNA的等位基因和/或具有选自以下的至少一个序列的DNA分子的种子：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、及SEQ ID NO:10。两个不同的转基因植物可因此杂交产生含有两个独立分离的、加入的、外源性基因的杂种后代。例如，含有赋予大豆以双重昆虫抗性作用模式以及耐草甘膦的CAL16可与其它转基因大豆植物杂交产生具有两种转基因亲代特征的植物。一个实例将是含有赋予大豆以双重昆虫抗性作用模式以及草甘膦耐性的CAL16与具有一个或多个如除草剂耐受性和/或害虫防治的另外的性状的植物的杂交，从而产生具有对鳞翅目昆虫害虫以双重抗性作用模式且具有至少一个或多个另外的性状的后代植物或种子。还可以与亲本植物进行回交和与非转基因植物进行异型杂交，以及无性繁殖。通常用于不同性状和作物的其它育种方法的描述可见于若干参考文献的一篇中，例如Fehr,Breeding Methods for CultivarDevelopment,Wilcox J.编著,American Society of Agronomy,Madison WI(1987)。

所述“转基因植物细胞”适用于许多工业应用中，包括但不限于：(i)用作科学探究或工业研究的研究工具；(ii)在用于产生内源或重组碳水化合物、脂质、核酸或蛋白产物或小分子的培养中使用，这些物质可用于随后的科学研究或用作工业产品；以及(iii)与现代植物组织培养技术一起用于产生转基因植物或植物组织培养物，其随后可用于农业研究或生产。如转基因植物细胞的微生物的生产和使用利用现代微生物学技术和人工干预以产生人工的、独特的微生物。在此过程中，将重组DNA插入植物细胞基因组中以生成转基因植物细胞，所述转基因植物细胞是单独的且独特于天然存在的植物细胞。此转基因植物细胞可然后像细菌和酵母细胞一样使用现代微生物学技术来培养并且可以未分化的单细胞状态存在。转基因植物细胞的新遗传组成和表型是通过将异源DNA整合到细胞的基因组中而产生的技术效果。本发明的另一方面是一种使用本发明微生物的方法。使用本发明微生物如转基因植物细胞的方法包括(i)通过将重组DNA整合到细胞的基因组中产生转基因细胞，然后使用此细胞得到具有相同的异源DNA的另外的细胞的方法；(ii)使用现代微生物学技术培养含有重组DNA的细胞的方法；(iii)从培养细胞产生和纯化内源或重组碳水化合物、脂质、核酸或蛋白产物的方法；以及(iv)用转基因植物细胞使用现代植物组织培养技术产生转基因植物或转基因植物组织培养物的方法。

所述“商品产品”是指由源自于含有大豆事件CAL16 DNA的大豆植物、完整或加工的大豆种子、一个或多个植物细胞和/或植物部分的材料构成的任何组合物或产物。商品产品可以出售给消费者并且可以是活的或非存活的。非存活的商品产品包括但不限于非存活的种子；完整的或加工的种子、种子部分、及植物部分；大豆油、大豆蛋白、大豆粕(soybeanmeal)、大豆粉(soybean flour)、大豆坯片、大豆豆皮、豆浆、大豆干酪、大豆酒、包含大豆的动物饲料、包含大豆的纸、包含大豆的乳酪、大豆生物质、以及使用大豆植物及大豆植物部分生产的燃料产品。活的商品产品包括但不限于种子、植物、及植物细胞。包含事件CAL16的大豆植物因此可用于制造通常从大豆获取的任何商品产品。源自于包含事件CAL16的大豆植物的任何此类商品产品都可含有至少可检测量的对应于大豆事件CAL16的特异性及独特的DNA，并且具体说来可含有可检测量的包含具有至少一个选自以下的序列的DNA分子的多核苷酸：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、及SEQ ID NO:10。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

(1)本发明提供了一种转基因大豆事件CAL16，本发明转基因大豆事件CAL16是对鳞翅目害虫的摄食损伤有抗性的，并且耐受含草甘膦的农业除草剂的植物毒性作用。编码昆虫抗性和草甘膦耐受性性状的基因连锁在同一DNA区段上，并且存在于转基因大豆事件CAL16基因组的单一基因座上，这一点提供了增强的育种效率并使得能够用分子标记来追踪繁殖群体及其子代中的转基因插入片段。所述转基因大豆事件CAL16以大豆(Glycinemax)CAL16种子的形式保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：P202205，保藏日期2022年4月18日，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072。

(2)本发明提供的用于检测大豆植物的特异性核酸序列及其检测方法，本发明检测方法中提供的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、及SEQ ID NO:10或其互补序列能够特异性检测转基因大豆事件CAL16。

(3)本发明提供的用于检测大豆植物的特异性核酸序列及其检测方法，针对特异性序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、及SEQ ID NO:10或其互补序列设计的特异性检测引物对或探针，可以作为DNA引物或探针以产生诊断为转基因大豆事件CAL16或其后代的扩增产物，且可以快速、准确、稳定的鉴定出来源于转基因大豆事件CAL16的植物材料的存在。能够实现对CAL16的研究、生产加工和应用进行溯源和全流程监管。

(4)本发明方法获得的含所述转基因大豆事件CAL16的后代或农产品或商品。

(四)附图说明

图1、用于生成转基因大豆事件的转化构建体示意图。

图2、T0代转化事件的棉铃虫生测结果图。a.转化事件CAL16；b.转化事件CAL29；c.转化事件CAL13；d.转化事件CAL39；e.转化事件CAL56；f.非转基因大豆天隆一号。

图3、鉴定包含转基因大豆事件CAL16的具有任何育种活性的组织的PCR图。M：Maker；1：转基因大豆事件CAL16的种子；2：转基因大豆事件CAL16的叶片；3：转基因大豆事件CAL16的花荚；4：空白对照；5：非转基因大豆天隆一号；6：转基因大豆中黄6106；7：常规水稻；8：转基因抗虫棉花。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，本领域技术人员应当了解，在以下实施例中公开的技术代表发明人发现在实践本发明中运行良好的方法，且因此可以被认为构成了实施本发明的优选实施例。然而，本领域技术人员应理解可以根据本公开内容对所公开的特定实施方案进行许多改变，且仍然可以获得相似或类似的结果，而不会脱离本发明的精神和范围。本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明以下实施例中所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术。在Ausubel编写的John Wiley and Sons公司出版的Current Protocols in MolecularBiology，和J.Sambrook等编写的Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)出版的Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3^rd ED.等文献均有详细的说明。

本发明以下实施例中所使用的培养基具体配方如下：

YEP固体培养基组成：Trytone(蛋白胨)10g/L，Yeast extract(酵母提取物)10g/L，氯化钠5g/L，琼脂2.8g/L，溶剂为水，pH7.0。

萌发培养基组成：MS盐(Phytotech M524)4.33g/L，蔗糖20g/L，琼脂2.75g/L，溶剂为水，pH5.8。

GADT液体培养基组成：B5盐(Phytotech G398)0.32g/L，吗啉乙磺酸(MES)3.9g/L，蔗糖30g/L，溶剂为水，pH5.4。高温高压灭菌冷却后，加入过滤灭菌的0.835mg/L的6-苄基氨基嘌呤(6-BA)、过滤灭菌的0.25mg/L的赤霉素A3(GA3)、过滤灭菌的40mg/L的乙酰丁香酮(AS)、过滤灭菌154mg/L的DL-二硫苏糖醇(DTT)、过滤灭菌的1mM的连二亚硫酸钠(S)、过滤灭菌的2.4g/L的半胱氨酸(Cys)。

恢复培养基组成：B5盐(Phytotech G398)3.21g/L，MES 0.6g/L，蔗糖30g/L，琼脂2.8g/L，溶剂为水，pH5.7。高温高压灭菌冷却后，加入过滤灭菌的0.835mg/L的6-BA、过滤灭菌的200mg/L的特美汀(Timentin)。

筛选培养基组成：B5盐(Phytotech G398)3.21g/L，MES 0.6g/L，蔗糖30g/L，琼脂2.8g/L，溶剂为水，pH5.7。高温高压灭菌冷却后，加入过滤灭菌的0.835mg/L的6-BA、过滤灭菌的200mg/L的Timentin、过滤灭菌的25mg/L的草甘膦。

伸长培养基组成：MS盐与B5维生素混合物(Phytotech M404)4.44g/L，MES 0.59g/L，天冬酰胺0.05g/L，谷氨酰胺0.05g/L，蔗糖30g/L，琼脂2.8g/L，溶剂为水，pH5.7。高温高压灭菌冷却后，加入过滤灭菌的200mg/L的Timentin、过滤灭菌的25mg/L的草甘膦、过滤灭菌的0.25mg/L的GA3、过滤灭菌的1mg/L的玉米素(Zeatin)、过滤灭菌的0.1mg/L的吲哚-3-乙酸(IAA)。

生根培养基组成：MS盐与B5维生素混合物(Phytotech M404)4.44g/L，MES 0.59g/L，蔗糖30g/L，琼脂2.8g/L，溶剂为水，pH5.7。高温高压灭菌冷却后，加入过滤灭菌的200mg/L的Timentin、过滤灭菌的25mg/L的草甘膦、过滤灭菌的0.1mg/L的IAA。

实施例1、转化事件的获得

(1)含有外源基因的质粒载体的获得

本发明用于大豆转化的质粒载体pCAL图谱如图1所示。质粒载体pCAL以pCambia1300(GenBank:AF234296.1)为植物转化载体框架，在其多克隆位点区域加入包含抗虫表达框(即完整表达Cry1Ab/Vip3Da融合蛋白表达框)和耐草甘膦表达框(即表达C10evo EPSPS蛋白表达框)的T-DNA获得的。抗虫表达框：Cry1Ab-GAGGAGGG-Vip3Da融合基因，驱动Cry1Ab/Vip3Da融合基因的启动子为来源于玄参花叶病毒的pCsVMV启动子，终止子为来源于农杆菌的NOS终止子；耐草甘膦表达框：来源于花椰菜花斑病病毒(CauliflowerMosaic Virus,CaMV)的35S启动子，该启动子驱动N端连有一段编码拟南芥的CTP基因信号肽的G10evo EPSPS，终止子是CaMV的35S基因终止子。

质粒载体pCAL的T-DNA(SEQ ID NO:9，即SEQ ID NO:10中444-8957bp)具体组成元件及位置如下如表1所示：RB右边界区间序列(444-674，231bp)、pCsVMV启动子(675-1362，688bp)、区间序列(1363-1372，10bp)、cry1Ab/vip3Da(1373-5722，4350bp)、区间序列(5723-5728，6bp)、NOS终止子(5729-5976，248bp)、区间序列(5977-6219，243bp)、pCaMV35S启动子(6220-7018，799bp)、区间序列(7019-7155，137bp)、CTP(7156-7389，234bp)、g10evo-epsps(7390-8706，1317bp)、区间序列(8707-8718，12bp)、CaMV的35S终止子(8719-8908，190bp)、LB左边界区间序列(8909-8957，49bp)。

表1、SEQ ID NO:10包含的基因组和遗传元件

(2)转化农杆菌

利用电击法(2500V)将步骤(1)获得的质粒载体pCAL导入农杆菌LBA4404中，获得含有转化载体T-DNA的农杆菌。

(3)大豆遗传转化

大豆转化参考李桂兰等报道的方法(李桂兰等，2005农杆菌介导大豆子叶节遗传转化的研究，作物学报，31(2)170-176)，其中筛选化合物是草甘膦，具体步骤如下：

①大豆种子消毒(氯气灭菌法)：挑选饱满、无病斑、无开裂、无硬实的成熟大豆种子天隆一号，放入90*15mm的培养皿中，每皿约150粒单层平铺。灭菌前将培养皿开盖置于超净台上，打开光照并风吹1h，之后放入干燥器中。干燥器中放入250ml烧杯，烧杯中先加入30ml次氯酸钠和70ml水，混合均匀，再加入8ml(质量浓度36％)浓盐酸，立即盖上干燥皿盖子。静置约12小时后，打开干燥器盖子，将表面灭菌后的大豆种子移到超净台上风吹1h，吹散残留的氯气。

②大豆种子萌发：将消毒完成后的大豆种子种脐朝下插入到萌发培养基(Germination Medium，GM)，种子约一半浸没到培养基中。每皿15粒，24℃光培养12h，获得吸胀的大豆种子。

③农杆菌菌液的准备：用接种环取-80℃保存的步骤(1)构建的含有转化载体的农杆菌接种到YEP固体培养基中，24℃暗培养12h。用灭菌后的1ml枪头划取农杆菌到GADT液体培养基中，涡旋菌体，并加入适量GADT液体培养基调OD650为0.5，获得农杆菌菌液。

④外植体准备与农杆菌侵染：将步骤②吸胀的大豆种子置于灭菌后的滤纸上，用11号解剖刀从种子胚方向先斜切去掉胚根顶端，然后沿中轴线将大豆种子剖开。将胚附着的那一半子叶去皮，在体视镜下将其胚芽处的两片幼叶分开，露出包裹在下面的生长点，用解剖刀轻微破坏生长点，获得外植体。将准备的外植体浸入步骤③农杆菌菌液中约1.5h。

⑤共培养：倒掉步骤④多余的菌液，将沾有菌液的外植体置于培养皿中，每皿15个，26℃暗培养3d。

⑥恢复培养：将步骤⑤共培养后的外植体与水平面成30°角斜插入恢复培养基(Rest Medium，RM)中，子叶约一半浸入培养基，每皿7个外植体。26℃，16/8昼夜比，3000lx光照强度条件下培养1周。

⑦丛生芽的诱导：将步骤⑥恢复培养后的外植体转移到筛选培养基(ShootInduction Medium，SIM)中，按相同方法摆放。26℃，16h/8h昼夜比，3000lx光照强度条件下培养3周。

⑧芽的伸长：将长出丛生芽的外植体置于灭过菌的滤纸上，切去子叶和变黄的部分，将丛生芽转移到伸长培养基(Shoot Elongation Medium，SEM)中，基部浸入培养基，每皿4-5个外植体。26℃，16h/8h昼夜比，3000lx光照强度条件下培养，每2周换一次培养基直至长出约3cm的幼苗。

⑨幼苗的生根：将步骤⑧幼苗从组织上切下，用吲哚丁酸(IBA，indole-3-butytric acid，IBA)浸泡切口2min后转移到生根培养基(Rooting Medium)中，26℃，16/8昼夜比，3000lx光照强度条件下继续培养1-2周后，当幼苗长出约2cm长的根时，获得生根苗。

⑩苗的移栽：将步骤⑨生根苗从培养基中取出，用自来水冲去根部残留的培养基，植物转化一共产生685个T0代转化事件(即独立转基因单株)。

实施例2、大豆转化事件的筛选

将实施例1获得的685个T0代转化事件经炼苗后移栽至温室内的自然土中，在温室中移栽成活546棵幼苗。待T0代转基因大豆长至营养生长期时，喷施草甘膦除草剂(草甘膦有效剂量为60g/亩)，没有药害的转化事件为87个，有药害的转化事件为327个，死亡的转化事件为132个(表2)。

表2.T0代大豆转化事件对草甘膦的耐受性

对没有药害的转化事件进行定量PCR检测，测定外源基因在87个转化事件中的含量，从而评估T-DNA的插入拷贝数，放弃带有两个或者两个以上拷贝的转化事件。取上述转化事件的植株，用CTAB法提取植物基因组。通过SYBR Green荧光定量PCR方法检测基因的拷贝数以确定外源基因的拷贝数。选取大豆基因组中的Lectin作为内参基因，随机选取一个大豆转化事件作为基准，计算目的基因在反应初始的相对含量。

本实施例使用SYBR Green荧光定量PCR试剂盒(BIO RAD)，在Bio-Rad RadCFX96TMReal-Time PCR仪中进行反应，利用Ct值比较法分析结果。体系及程序参照SYBRGreen荧光定量PCR试剂盒的说明书，引物序列如下：

表3.定量PCR引物序列表

序列号	引物名称	引物序列5’-3’
			SEQ ID NO:11	qLEC-FS	GCCCTCTACTCCACCCCCAT
SEQ ID NO:12	qLEC-RS	GCCCATCTGCAAGCCTTTTT
			SEQ ID NO:13	CAL-F	AGCTGGACGCCATCAACA
SEQ ID NO:14	CAL-R	CTCAGGTACTCCACCTGCA

通过分析G10基因拷贝数的实验结果，进而证实外源基因己整合到所检测的大豆植株的染色体组中，其中有54个单拷贝的转基因大豆转化事件。

对54个选定的单拷贝转化事件的后代进行更高剂量草甘膦的耐受性检测，喷施草甘膦除草剂(草甘膦有效剂量为120g/亩)，结果显示，对更高浓度草甘膦具有耐受性的转化事件有5个，分别记为转化事件CAL16、CAL29、CAL13、CAL39和CAL56。

表4.T1代大豆转化事件对草甘膦的耐受性

取五个转化事件CAL16、CAL29、CAL13、CAL39和CAL56的叶片进行棉铃虫生测。

生测方法：1％的琼脂高温高压灭菌后稍冷却，以每孔1ml的量加入到CorningCostar 24孔板，冷却凝固后，将大豆叶片用直径为10mm的打孔器打孔，平铺到24孔板，每个转化事件一个板。用毛笔将棉铃虫(Helicoverpa armigera)初孵幼虫挑取到24孔板，每孔1头。接完虫，将24孔板用盖子盖好，用3M微孔透气胶带封好，置于28℃，70％湿度，16h光照：8h黑暗的培养箱内，放置三天后拍照记录取食情况和死亡率。同样条件下，以非转基因大豆天隆一号为对照。

结果如图2所示，CAL16棉铃虫几乎不取食；CAL29和CAL13虽然有少数孔有取食，但是在生测结束时检查，所有孔里的虫子都已经死亡；CAL39，有较多孔被取食，第三天检查时有少数孔棉铃虫还未死亡，但是五天后，所有孔内棉铃虫全部死亡；CAL56被取食情况比较严重，第三天检查只有1/4的孔内棉铃虫死亡，其余孔不同程度的被取食；非转基因对照天隆一号被取食的情况严重，3天就几乎被取食完。

通过抗虫性能检测及耐草甘膦性能检测，并结合田间农艺性状表现，最终选定转化事件CAL16更为优异，该转化事件具有良好的抗虫和耐草甘膦性能、外源基因单拷贝插入，农艺性状表现优秀，抗虫和耐草甘膦性状稳定遗传。

实施例3、大豆转化事件CAL16的检测

(1)大豆基因组的提取

采用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取大豆转化事件CAL16基因组DNA。

取1000mg克幼嫩的大豆转化事件CAL16的T0代叶片在液氮中研磨成粉后，加入0.8mL于65℃水浴锅中预热的CTAB缓冲液(20g/L CTAB，1.4M NaCl，100mM Tris-HCl，20mMEDTA，溶剂为水，pH 8.0)，充分混匀后，于65℃水浴锅中水浴60min；

加入等体积的三氯甲烷，颠倒混匀，12000rpm(每分钟转数)转速下离心10min，吸取上清液至新的离心管中；

加入0.7倍体积的异丙醇，轻柔晃动离心管，12000rpm转速下离心1min，收集DNA到管底；弃上清液，加入1mL质量浓度为75％的乙醇，洗涤沉淀，12000rpm转速下离心1min，重复洗涤一次，在超净台吹干；

DNA沉淀溶解于适量的TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，溶剂为水，pH 8.0)中，Nanodrop测定DNA的浓度，保存备用。

(2)侧翼DNA序列的分析

使用Liu等报道的TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR)方法(Liu，Plant Journal1995，8(3):457-463)对实施例1筛选的优良转化事件CAL16外源基因DNA插入点两侧的区域序列进行测定。该方法通过3个嵌套的特异性引物分别和简并引物组合进行连续的PCR扩增，利用不同退火温度选择性地扩增目标片段。分别根据T-DNA左右边界区域设计三个巢式特异性PCR引物LB-SP1、LB-SP2和LB-SP3；RB-SP1、RB-SP2和RB-SP3依次与简并引物AD4L组进行PCR扩增，引物序列见表5，PCR反应条件见表6，PCR反应体系见表7。

表5.TAIL-PCR引物序列

序列号	引物	序列
			SEQ ID NO:15	LB-SP1	TTTCTCCATAATAATGTGTGAGTAGTTCCC
SEQ ID NO:16	LB-SP2	CTCATGTGTTGAGCATATAAGAAACCCTTAG
			SEQ ID NO:17	LB-SP3	CTAAAACCAAAATCCAGTACTAAAATCC
SEQ ID NO:18	RB-SP1	CTTGGCACTGGCCGTCGTTT
			SEQ ID NO:19	RB-SP2	GACTGGGAAAACCCTGGCGTT
SEQ ID NO:20	RB-SP3	AGCTGGCGTAATAGCGAAGAGG
			SEQ ID NO:21	AD4L	AGGTTATGCTANTCAGSTWTSGWGWT

表6.TAIL-PCR反应条件

表7.PCR反应体系

试剂	体积
		模板DNA	1μl
正向引物(10μM)	2μl
		反向引物(10μM)	2μl
2*Easy Taq PCR SuperMix	25μl
		<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	20μl
总体积	50μl

第一轮反应：以LB-SP1/RB-SP1与AD4L为引物，CAL16基因组为模板；

第二轮反应：以LB-SP2/RB-SP2与AD4L为引物，第一轮产物稀释1000倍为模板；

第三轮反应：以LB-SP3/RB-SP3与AD4L为引物，第二轮产物稀释1000倍为模板。

采用Axygen公司的PCR产物回收试剂盒回收第3轮PCR扩增产物，连接到PMD20-T克隆载体上(TaKaRa,Code:D107A)，转化大肠杆菌，将得到的阳性克隆进行测序。获得的序列信息与大豆网上数据库(http://www.soybase.org)进行比对分析，检索相似的大豆基因组序列。

(3)CAL16整合入基因组序列信息

上述经测序比对和验证过的插入位点上下游旁侧序列、外源抗虫基因表达框和抗除草剂基因表达框序列拼接形成本发明所述的转化事件，核苷酸序列为SEQ ID NO.10，SEQID NO:10包含的基因组和遗传元件见表1。对应大豆转化事件CAL16以大豆(Glycine max)CAL16种子的形式保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:P202205，保藏日期2022年4月18日。

实施例4、转基因大豆事件CAL16特异性检测

这一实施例描述用于鉴定大豆样品中转基因大豆事件CAL16的DNA存在的方法。设计一对PCR引物和探针用于鉴定转基因大豆事件CAL16的插入T-DNA序列及其左侧翼的大豆基因组序列，序列涵盖于SEQ ID NO:1-10中。

本实施例的PCR引物和探针分别为：SQ111、SQ112和PB113。寡核苷酸正向引物SQ111的序列(SEQ ID NO:22)与对应于SEQ ID NO:10的位置8929至8954和SEQ ID NO:8的位置999至1024以及SEQ ID NO:6的位置9至34的核苷酸序列相同。寡核苷酸反向引物SQ112的序列(SEQ ID NO:23)与对应于SEQ ID NO:10的位置9042至9069和SEQ ID NO:8的位置1112至1139的反向互补核苷酸序列相同。寡核苷酸探针PB113的序列(SEQ ID NO:24)与对应于SEQ ID NO:10的位置8996至9010和SEQ ID NO:8的位置1066至1080以及SEQ ID NO:6的位置76至95的核苷酸序列相同。PCR引物SQ111(SEQ ID NO:22)和SQ112(SEQ ID NO:23)扩增在事件CAL16的正确接合点处独特的基因组/插入DNA的141个核苷酸扩增子。探针PB113经荧光标记(比如6FAMTM荧光标记)后，可用于检测引物SQ111和SQ112的PCR产物，以鉴定样品中源于事件CAL16的DNA的存在。

SEQ ID NO:22：agtacattaaaaacgtccgcaatgtg；

SEQ ID NO:23：tgcaaatattttgttgctacatgttgac；

SEQ ID NO:24：cccaggcttatcttt。

除SQ111(SEQ ID NO:22)、SQ112(SEQ ID NO:23)和PB113(SEQ ID NO:24)以外，对于本领域的技术人员应显而易知，还可设计其它引物和/或探针以扩增和/或杂交SEQ IDNO:10内对于检测样品中源于事件CAL16的DNA的独特存在并且用于检测样品中源于事件CAL16的DNA的存在的序列。

根据标准分子生物学实验室规范，开发用于事件鉴定的PCR测定来用于检测样品中的事件CAL16 DNA。由用于检测样品SQ111(SEQ ID NO:22)、SQ112(SEQ ID NO:23)和PB113(SEQ ID NO:24)中源于事件CAL16的DNA的存在的引物对和探针(即，由如6FAMTM的荧光标签标记的探针)的各集合优化标准PCR测定或PCR测定的参数。PCR反应的对照包括对大豆基因组中的单一拷贝基因具特异性的内部对照引物和内部对照探针(例如，VICTM标记)。本领域的技术人员应知晓如何设计对大豆基因组中的单一拷贝基因具特异性的引物。一般来说，针对样品中事件CAL16 DNA的检测优化的参数包括引物和探针浓度、模板DNA的量以及PCR扩增循环参数。

实施例5、鉴定包含转基因大豆事件CAL16的具有任何育种活性的组织

本实施例利用一对引物经PCR产生的扩增子来检测包含转基因大豆事件CAL16的任何育种活性的组织。确定转基因大豆事件CAL16存在的扩增子包含以SEQ ID NO:1或SEQID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQID NO:8或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10形式提供的任意一至少11个以上连续的核苷酸。引物对包括基于侧接序列和插入的表达盒(SEQ ID NO:9)的引物对。

本实施例为了获得发现SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的诊断性扩增子，基于SEQ ID NO:7的碱基1至1610设计正向引物分子SQ114(SEQ ID NO:25)，同时基于插入的表达盒DNA序列(SEQ ID NO:9的位置1至8514)设计反向引物分子SQ115(SEQ ID NO:26)，其中所述引物分子具有足够长度的邻近核苷酸以特异性地杂交于SEQ ID NO:7和SEQID NO:9。寡核苷酸正向引物SQ114的序列(SEQ ID NO:25)与对应于SEQ ID NO:10的位置296至323和SEQ ID NO:7的位置296至323的核苷酸序列相同。寡核苷酸反向引物SQ115的序列(SEQ ID NO:26)与对应于SEQ ID NO:10的位置500至525和SEQ ID NO:9的位置57至82和SEQ ID NO:7的位置500至525的反向互补核苷酸序列相同。

SEQ ID NO:25：gacaccaataatggtagaatccttggag；

SEQ ID NO:26：gcctgaatggcgaatgctagagcagc。

分别取实施例1转基因大豆事件CAL16的T0代植株的叶片、花荚和种子采用CTAB法提取DNA作为模板，在引物SQ114和SQ115的作用下，按照表8反应体系进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图3所示。同样条件下，以非转基因大豆天隆一号、转基因大豆中黄6106(中国农业科学院)、常规水稻、转基因抗虫棉花为对照，同时以不添加模板为空白对照。

PCR反应程序为：95℃变性3min，95℃变性15s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共进行32个循环，最后72℃延伸3min。

表8.PCR反应体系

应用引物对SQ114和SQ115扩增产物电泳结果显示，仅有CAL16样品能够检测到约230bp大小的条带，条带大小与预期一致，不含CAL16基因组的其他样品检测不到特异性条带，本发明提供的引物对能够特异性检测出CAL16事件的存在(图3)。

除SQ114(SEQ ID NO:25)、SQ115(SEQ ID NO:26)以外，对于本领域的技术人员应显而易知，还可设计其它引物以扩增SEQ ID NO:10内对于检测样品中源于转基因大豆事件CAL16的DNA的独特存在并且用于检测样品中源于转基因大豆事件CAL16的DNA的存在的序列；其他的引物序列可由DNA扩增方法领域的技术人员选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9。在对本实施例的方法进行修改的情况下使用这些DNA引物序列在本发明的范围内。本发明从包含CAL16的样品中能获得扩增子的引物序列包括由至少一种源于SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的DNA引物序列。

实施例6、蛋白表达量测定

分别取转基因大豆事件CAL16不同代次(T4、T5、T6)的叶片V4、叶片V6、叶片R2、叶片R6、豆荚R6、茎杆R6、根R6及种子R8，分别采用Cry1Ab/Cry1Ac检测试剂盒(美国EnviroLogix公司)和G10 EPSPS酶联免疫定量检测试剂盒(上海佑隆生物科技有限公司)检测不同时期的Cry1Ab/Cry1Ac和G10 EPSPS的蛋白表达情况，结果如表9和表10所示。结果显示，转基因大豆事件CAL16的外源蛋白稳定遗传表达。

Cry1Ab/Cry1Ac检测试剂盒操作步骤：

1.准备样品及正对照：液氮研磨待测样品，称量20mg磨好的样品加入1ml样品提取缓冲液，同时用2ml样品提取缓冲液稀释试剂盒自带的正对照，充分混匀后冰上静置3min，12000g离心10min，取上清用PBS稀释20-200倍，准备加样；

2.孵育：在ELISA板中每孔加入50μl Cry1Ab/Cry1Ac-酶联反应液，分别将不同的样品以及用于标准曲线制作的不同浓度的Cry1Ab/Vip3Da蛋白各取50μl加入到相应的样品孔中，混匀后用parafilm将ELISA板封好，置于水平摇床上，室温180rpm孵育2小时；

3.洗板：用洗板缓冲液洗板3次，每次加洗板缓冲液300μl，加满一板后倒掉，洗完后将酶联板倒置，充分去除内部残留液体；

4.显色：加入100μl显色底物，充分混匀后室温下180rpm孵育15-20min；

5.终止：每孔加入100μl终止缓冲液后充分混匀，30分钟内测定结果；

6.检测：通过Thermo MK3酶标仪在450nm波长下分析不同样品的吸光值，利用正对照绘制标准曲线，进行目标蛋白定量。

G10 EPSPS酶联免疫定量检测试剂盒操作步骤：

1.准备样品及正对照：液氮研磨待测样品，称量20mg磨好的样品加入1ml样品提取缓冲液，充分混匀后置于冰上静置3min，12000g离心10min，取上清稀释200-1000倍，准备加样；

2.样品孵育：向ELISA板上加稀释好的样品以及用于标准曲线制作的不同浓度的G10evo阳性蛋白，每孔100ul，于水平摇床上180rpm室温孵育45min；

4.酶标抗体孵育：每孔加入100μl酶标抗体，水平摇床上180rpm室温孵育30min；

5.洗板：用洗板缓冲液洗板3次，每次加洗板缓冲液300μl，加满一板后倒掉，洗完后将板倒置，充分去除内部残留液体；

6.显色：每孔加入100μl显色底物，180rpm室温孵育15-20min。

7.终止：每孔加入100μl终止缓冲液后充分混匀，30分钟内测定结果；

8.检测：通过Thermo MK3酶标仪在450nm波长下分析不同样品的吸光值，利用正对照绘制标准曲线，进行目标蛋白定量。

表9.不同代次转基因大豆事件CAL16中Cry1Ab/Vip3Da蛋白表达量测定结果

*以鲜重微克每克植物组织(μg/g fw)为单位，计算外源蛋白表达水平，表述形式为算术平均数和标准差。样本数n＝20，括号内为ELISA测定结果的最大值和最小值。

表10.不同代次转基因大豆CAL16中G10evo-EPSPS蛋白表达量测定结果

实施例7、转基因大豆事件CAL16抗虫性测定

(1)实验室抗虫能力测试

选择转基因大豆事件CAL16的T4代、T5代和T6代对斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、棉铃虫和小地老虎进行室内抗虫性分析。采集转基因大豆事件CAL16不同代次和亲本非转基因大豆天隆一号的V4期叶片带回实验室，接初孵幼虫10头。每个代次每种供试昆虫重复10次。分别在24h，48h，72h统计死亡情况。结果见表11所示。结果显示，转基因大豆事件CAL16接虫2～3天内，幼虫全部死亡。

表11.不同代次转基因大豆CAL16 V4期对四种靶标昆虫的抗性(实验室)

注：表11中a、b表示差异显著

(2)田间抗虫性能测试

选择转基因大豆事件CAL16的T4代、T5代和T6代对斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、棉铃虫和小地老虎进行田间抗虫性分析。田间设置48个小区，每个小区面积5m×5m，分别双粒播种转基因大豆事件CAL16和非转基因大豆天隆一号，株距25cm，行距50cm，小区间设1m间隔。每种大豆3次重复。每小区各取10株，接一龄幼虫10个，接虫14天后调查害虫为害情况，进行抗虫分级。结果如表12所示，转基因大豆事件CAL16具备高抗虫性能。

抗虫分级采用9级标准(Marcon et al.,1999)：1～3级：虫孔针刺状(1级：稀少、分散；2级：中等数量；3级：大量)。4～6级：虫孔火柴头大小(4级：稀少、分散；5级：中等数量；6级：大量)。7～9级：虫孔大于火柴头(7级：稀少分散；8级：中等数量；9级：大量)。抗性级别分类：1～2级(高抗)，3～4级(抗虫)，5～6级(感虫)，7～9级(高感)。

表12.不同代次转基因大豆CAL16的V4期对四种靶标昆虫的抗性(田间)

实施例8、转基因大豆事件CAL16草甘膦耐受性测试

采用随机区组设计，共24个小区，每个小区面积5m×5m，分别双粒播种转基因大豆事件CAL16和非转基因大豆天隆一号，株距25cm，行距50cm，小区间设1m间隔，每种大豆3次重复。在V3期按如下步骤处理：1)不喷施；2)喷施中剂量草甘膦，有效剂量60克/亩；3)中剂量2倍量草甘膦，有效剂量120克/亩；4)中剂量4倍量草甘膦，有效剂量240克/亩。在用药后1周、2周、4周调查成苗率，植株高度(选取最高的5株)、药害症状(选取药害症状最轻的5株)，药害症状分级按GB/T 17980.42-2000执行。除草剂受害率计算公式：

(X-受害率，单位为％，N-同级受害株数；S-级别数；T-总株数；M-最高级别)。

用方差分析方法比较不同处理的转基因大豆事件CAL16、非转基因大豆天隆一号在出苗率、成苗率和受害率方面的差异。判别转基因大豆事件CAL16对除草剂的耐受水平。结果见表13所示，草甘膦田间测试结果，转基因大豆事件CAL16对草甘膦具有高度耐受性。

表13.大豆转化事件CAL16对草甘膦的耐受性

实施例9、杂交产生含转基因大豆事件CAL16的后代

为了产生包含增强的农艺学、杀昆虫或除草特性的大豆植物或其植物部分，可使含有转基因大豆事件CAL16的大豆植物与潜在的含有任何其它大豆事件或其组合的大豆植物杂交且评估表型以测定后代植物的所得特性。

杂交具体操作步骤：

1.选花：在无病虫、无损伤、生长健壮的非转基因大豆事件CAL16的大豆植株中部偏上节位(第6-12)上，选花瓣即将露出花萼，已能看出花瓣颜色的花；

2.去雄：用左手食指和拇指顺势轻捏花柄和花朵基部，右手用镊子先把大半的花萼向下或斜向下撕去，露出合在一起的花冠。此时，从旗瓣向龙骨瓣方向斜向下(与花柄约呈45度角)夹住花冠上部约1/3(因柱头向旗瓣方向弯曲，如此可避免夹伤柱头)，微微斜向旗瓣方向拔起；

3.取花授粉：将转基因大豆事件CAL16父本花龙骨瓣处的萼片撕下，从两龙骨瓣之间分开花冠，露出黄色的花药(看上去表面蓬松)；再从花丝中部，将花粉团整个夹出，左手轻捏去雄花，花药对准柱头，轻轻摩擦一两下；然后，再小心地将花粉团倒插在花柱上，一则可继续散粉，二则可保护裸露的柱头。

杂交赋予由所述植物育种产生的后代植物的特性可延伸超过事件CAL16的鳞翅目抗性和草甘膦抗性，包括但不限于地上害虫控制、除草剂耐性、杀线虫特性、抗旱性、病毒抗性、抗真菌控制、细菌抗性、雄性不育性、耐寒性、耐盐性、增加的产率、增强的油组成、增加的油含量、增强的营养物使用效率或改变的氨基酸含量。具有改进的农艺学性状的转基因事件的实例为本领域中众所周知的。

以下为可用于由转基因大豆事件CAL16育种的可能的转基因大豆品系的非限制性清单以赋予大豆植物、植物部分、种子或商品产品中增强的特性。育种可包括以下任何一种或所有组合：除草剂耐性：大豆GTS 40-3-2、MON87708、MON89788、A2704-12、A2704-21、A5547-35、A5547-127、BPS-CV127-9、DP356043、GU262、W62、W98、DAS-44406-6、DAS-68416-4、FG72、BPS-CV127-9、SYHT04R、SYHT0H2、3560.4.3.5、EE-GM3、pDAB4472-1606、pDAB4468-0416、pDAB8291.45.36.127、AAD-12；昆虫抗性：MON87701、DAS-81419-2；增加的增强的油组成：DP-305423、G94-1、G94-19、G168、OT96-15、MON87705、MON87769；增加的产率：MON87712。

Claims

1.一种转基因大豆事件CAL16，其特征在于，所述转基因大豆事件CAL16是将外源基因插入大豆基因组18号染色体上SEQ ID NO:27所示的3’端和SEQ ID NO:28所示的5’端之间获得的DNA分子；所述外源基因包括抗草甘膦基因表达盒和抗虫基因表达盒。

2.如权利要求1所述转基因大豆事件CAL16，其特征在于，所述抗草甘膦基因表达盒包括：用作草甘膦基因g10evo-epsps表达的启动子pCaMV35S启动子、拟南芥EPSPS叶绿体信号肽、g10evo-epsps基因、CaMV的35S终止子；所述抗虫基因表达盒包括：pCsVMV启动子、cry1Ab/vip3Da抗虫融合基因、NOS终止子。

3.如权利要求1所述转基因大豆事件CAL16，其特征在于，所述转基因大豆事件CAL16的DNA分子核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。

4.一种用于检测权利要求1所述转基因大豆事件CAL16的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包括SEQ ID NO:1或其互补序列、和/或SEQ ID NO:2或其互补序列。

5.如权利要求4所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包括SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10中的一种或其互补序列。

6.一种检测样品中权利要求1所述转基因大豆事件CAL16的DNA分子存在的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)将待检测样品与DNA探针或引物对在核酸扩增反应液中接触；所述引物对包括第一引物和第二引物；所述第一引物为SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25中的一种；所述第二引物为SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26中的一种；所述DNA探针为SEQ ID NO:24所示；(2)进行核酸扩增反应；(3)检测扩增产物的存在；所述扩增产物包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10中的一种或其互补序列中至少11个连续核苷酸。

7.一种培育含权利要求1所述转基因大豆事件CAL16的抗虫大豆植物的方法，其特征在于，所述方法包括：种植含特定核酸序列的大豆种子，收获与其他不含特定核酸序列大豆植物相比，抗鳞翅目昆虫能力显著提高的大豆，保护大豆植物免于昆虫侵袭；所述特定核酸序列选自：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10中的一种或其互补序列；所述鳞翅目昆虫包括但不限于：斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、棉铃虫、小地老虎。

8.一种培育含权利要求1所述转基因大豆事件CAL16的耐除草剂大豆植物的方法，其特征在于，所述方法包括：种植含特定核酸序列的大豆种子，喷施除草剂，收获与其他不含特定核酸序列大豆植物相比，耐除草剂能力显著提高的大豆；所述特定核酸序列选自：SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10中的一种或其互补序列；所述除草剂包括草甘膦。

9.一种控制种植含权利要求1所述转基因大豆事件CAL16的大豆植物的田间杂草的方法，其特征在于，所述方法包括：种植含特定区域核酸序列的转基因大豆植物，喷施有效剂量草甘膦除草剂，杀灭杂草；所述转基因大豆基因组中包含来自转基因大豆事件CAL16的特定区域核酸序列，所述特定区域核酸序列包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10中的一种或其互补序列。

10.一种产生昆虫抗性或/和草甘膦耐受性大豆植物的方法，其特征在于，所述方法包括：将含有特定区域核酸序列的大豆植株，与另一种大豆植株杂交，从而产生子代植株；收获与其他不含有特定区域核酸序列的植株相比，对除草剂的耐受性和/或抗虫性显著提高的植物；所述特定区域核酸序列来自转基因大豆事件CAL16，所述特定区域的核酸序列包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10中的一种或其互补序列。

11.一种产生自权利要求1所述转基因大豆事件CAL16的转基因植物细胞，其特征在于，所述转基因植物细胞是将所述转基因大豆事件CAL16的特定区域核酸序列转入植物基因组获得的，所述特定区域的核酸序列包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10中的一种或其互补序列。

12.一种产生自权利要求1所述转基因大豆事件CAL16的商品或农产品，其特征在于，所述大豆商品或农产品包括：大豆油、大豆蛋白、大豆粕、大豆粉、大豆坯片、大豆豆皮、豆浆、大豆干酪、大豆酒、包含大豆的动物饲料、包含大豆的纸、包含大豆的乳酪、大豆生物质、以及使用大豆植物及大豆植物部分生产的燃料产品。