KR20050035584A - 벼흰잎마름병원균의 특이 ｄｎａ 단편의 검출을 위한ｐｃｒ 프라이머 및 이를 이용하여 벼의벼흰잎마름병원균의 감염여부를 진단하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)의 특이 DNA 단편의 검출을 위한 프라이머 및 이를 이용하여 벼의 벼흰잎마름병원균의 감염여부를 진단하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 프라이머는 벼흰잎마름병원균에 대해서만 증폭밴드를 형성할 수 있어, 종래의 방법들과 달리 신속, 정확하게 벼의 벼흰잎마름병원균의 감염여부를 진단할 수 있기 때문에 벼흰잎마름병원균의 예방 및 사후처리에 신속하게 대응할 수 있게 되고, 따라서, 농가피해를 최소화할 수 있다.

Description

벼흰잎마름병원균의 특이 ＤＮＡ 단편의 검출을 위한 ＰＣＲ 프라이머 및 이를 이용하여 벼의 벼흰잎마름병원균의 감염여부를 진단하는 방법{Primer for Identifying of Specific DNA Fragment of a Pathogen Xanthomonas oryzae pv. oryzae, and Specific-Identification Methods of the Pathogen using the Primer}
본 발명은 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)의 특이 DNA 단편의 검출을 위한 프라이머 및 이를 이용하여 벼의 벼흰잎마름병원균의 감염여부를 진단하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 벼의 흰잎마름병의 원인균인 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)에 특이적으로 존재하는 특이 DNA 단편을 분리 및 염기서열을 결정하고, 이를 기초로 하여 제작된 벼흰잎마름병원균을 검출할 수 있는 PCR 프라이머 및 이를 이용하여 벼의 벼흰잎마름병원균의 감염여부를 진단하는 방법에 관한 것이다.
벼의 흰잎마름병(白葉枯病, Bacterial blight)은 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)이 월동기간 동안 기주식물로 알려진 겨풀, 나도겨풀 등의 땅속줄기 또는 뿌리주위나 병든 볏짚, 벼 그루터기에 잠복해 있다가 관개수에 의해 논으로 이동한 후, 벼잎의 물구멍과 공기구멍 부위, 절단된 뿌리 등에 침입하여 벼에 감염되고, 감염된 벼에서 증식하여 2차로 전염되는 것에 의해 7월초~수확기, 특히 7월 상순~8월 중순에 발병하는 병해로, 도 1과 같은 병징을 나타내며, 최종적으로 벼가 말라 죽게 되어 수확량의 감소를 초래하므로 농가에 피해를 입힌다.
따라서, 종래에는 이러한 벼의 흰잎마름병을 예방 및 방제하기 위하여 저수지나 관계수로에 있는 병원균의 기주식물을 제거하는 방법; 질소질 비료의 사용량이 많으면 질소질 비료에 의해 벼가 감수성으로 되어 흰잎마름병의 발병이 촉진되므로, 질소질 비료의 사용량을 조절하는 방법; 벼가 물에 잠기지 않도록 하고, 만약 잠기게 되면 최대한 빨리 물을 빼주어 침수시간을 짧게 하여 병원균과의 접촉을 차단하여 병의 전염을 방지하는 방법; 약제를 사용한 방법 등을 사용하여 왔다.
그러나, 상기한 방법들은 그 효과가 매우 미비한 실정이다. 특히 약제방제법은 벼흰잎마름병원균이 벼의 도관내에서 증식하여 병징을 나타내기 때문에 그 효과가 매우 낮은 문제점이 있었다. 따라서, 벼흰잎마름병원균을 조기에 발견하여 미연에 벼의 흰잎마름병을 예방 또는 방제하여 농가의 피해를 최소화할 수 있는 새로운 방제방법의 개발이 필요하였지만, 현재는 벼흰잎마름병원균의 검출을 위해서 선택배지를 이용하거나 병원균의 생리, 생화학적 특성의 검정을 수행하는 방법에 의해 검정하거나, 또는 병이 어느 정도 진행된 상태에서 육안으로 병을 인지하여 왔을 뿐이다.
그러나, 병원균의 생리, 생화학적 특성을 이용하는 방법은 병원균의 분리 및 배양에 장시간이 소요되고 분리균의 농도가 상당히 높은 상태(103CFU 이상)에서만 진단이 가능하며, 유사한 생리적 특성으로 인하여 동일한 속(Xanthomonas) 또는 동일한 종(Xanthomonas oryzae) 내의 여러 비병원성 아종들과의 관계에서 정확한 동정이 매우 어렵기 때문에 전문적인 분류학자를 통해서만 분리가 가능한 문제점이 있고, 육안으로 관찰하는 방법은 병을 조기에 진단할 수 없다는 문제점이 있었다.
한편, 항체반응을 이용한 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 진단법을 이용하여 검출하는 방법도 이용되었는데, 이 방법은 검출 감도가 높은 것임에도 불구하고 절차가 복잡하고 고가의 분석비용이 요구되며, 시간이 많이 소요되는 동정방법이라는 문제점이 있었다.
따라서, 본 발명자들은 최근의 분자생물학적 기법의 발전에 의하여 유전자(DNA) 수준에서 생물종을 식별하는 방법을 이용하여 벼흰잎마름병원균의 감염여부를 진단하고자 하였다.
일반적으로, 유전자 수준에서 생물종을 식별하는 방법으로 가장 광범위하게 사용되고 있는 방법은 핵산지문법(DNA fingerprinting)이다. 이 방법은 다시, 제한효소단편장다형(RFLP; Restriction Fragment Length Polymorphism) 분석법, 라이보좀 구성 핵산 염기서열의 차이를 이용한 방법, 특정 프라이머를 이용한 PCR(polymerase chain reaction) 진단법 등으로 구분된다. PCR법은 10~20mer로 구성된 특정 DNA 단편(프라이머)을 세균의 게놈유전자(genomic DNA)에 접촉(annealing)한 후, 내열성 DNA 중합효소(Taq polymerase)를 첨가하고 합성반응을 반복적으로 행하게 되면, 프라이머가 결합된 영역이 급속히 증폭하게 되며, 그 PCR 증폭산물을 아가로스젤(agarose gel) 또는 아크릴아마이드젤(acrylamide gel)에 전기영동하고 에티디움브로마이드(ethidium bromide) 및 은염색(silver stain)으로 DNA를 염색한 후 나타나는 DNA 밴드의 유무 혹은 형태의 차이와 같은 세균종의 DNA 다형성을 검출 진단하는 방법이다. 현재, 이러한 PCR에 의한 세균의 진단법은 인체나 동물의 세균성 질병을 진단하는데 이용되고 있는데, 식중독 관련 병원성 세균인 대장균, 콜레라균 등의 검출용 PCR 진단키트들이 개발되어 있다. 또한 외국의 경우는 식물 병원균에 대해서도 어위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)를 비롯한 다양한 병원균에 대한 PCR 진단법이 개발되어 병의 진단과 함께 수출입 농산물의 검역에 이용되고 있다.
더구나, PCR 진단에 소요되는 시간은 다른 진단방법에 비해 매우 짧아 6시간 이내에 완료되고, 진단에 소요되는 비용 또한 저렴할 뿐 아니라 많은 샘플을 동시에 검정할 수 있어 경제적이므로, 본 발명에서도 핵산지문법 중 PCR 공정을 이용하여 벼의 벼흰잎마름병원균을 조기에 진단하여 농가의 피해를 최소화하고자 하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 벼의 흰잎마름병의 원인균인 벼흰잎마름병원균 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae)에 특이적인 DNA 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기한 DNA 단편으로부터 유래되고, 벼흰잎마름병원균에만 특이적으로 발현하여 벼의 벼흰잎마름병원균의 감염여부를 진단할 수 있는 PCR 프라이머를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 벼흰잎마름병원균의 특이 DNA 단편의 존재유무를 벼에서 확인함으로써 벼흰잎마름병원균의 감염여부를 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
상기한 목적으로 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 벼흰잎마름병원균에 특이적인 DNA 단편은 서열번호 1로 표시됨을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 벼의 벼흰잎마름병원균 감염여부 진단용 PCR 프라이머는 서열번호 1의 염기서열내의 연속된 약 20mer의 서열을 포함함을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 벼의 벼흰잎마름병원균의 감염여부 진단 방법은 (A) 식물체 검체를 분리하여 총 DNA를 추출하는 단계;(B) 상기 추출된 DNA를 본 발명의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하는 단계; 및 (C) 상기 PCR 증폭 결과로부터 벼흰잎마름병원균의 특이 DNA 단편의 존재여부를 확인하는 단계를 포함함을 특징으로 한다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 ① 벼의 흰잎마름병의 원인균인 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)이 해당되는 산타모나스속 미생물들은 병원성에 관여하는 단백질 유전자인 hpaA를 공통으로 가지고 있고 ② 이들 hpaA 유전자의 염기서열이 상당한 상동성을 가지고 있지만 hpaA 핵산서열의 일부 부위에 대응되는 염기서열만은 높은 차별성을 가지며 ③ 특히 벼흰잎마름병원균의 hpaA 핵산서열은 벼흰잎마름병원균과 계통학적으로 근연성이 있는 다른 미생물들 즉, 같은 속에 속하는 다른 종 미생물 및 다른 속에 속하는 미생물들과 전혀 상이한 특이성을 가진다는 사실에 근거하여, 벼흰잎마름병원균에만 특이적인 DNA 단편을 확인하였고, 이 DNA 단편을 이용하여 벼흰잎마름병원균의 진단 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 벼흰잎마름병원균에 특이적인 DNA 단편은 828bp 단편 또는 상기 828bp 내의 단편들이다.
본 발명에서는 상기 벼흰잎마름병원균의 특이 DNA 단편을 확인하여 벼의 흰잎마름병원균의 감염여부를 진단할 수 있는 방법을 제공한다. 바람직한 진단 방법은 서열번호 1의 828bp내의 단편을 이용하여 확인하는 것으로, PCR 방법이 가장 바람직하다.
벼의 흰잎마름병원균의 감염여부를 진단하기 위한 PCR 방법에서 가장 중요한 것은 특정부위를 증폭할 수 있는 프라이머이다. 본 발명에 따른 벼흰잎마름병원균 진단용 프라이머는 상기 벼흰잎마름병원균의 특이 828bp내의 일련의 염기서열을 포함하는 DNA 단편 또는 828bp의 DNA 단편을 증폭할 수 있도록 제조하는 것이 바람직하다.
본 발명의 벼흰잎마름병원균 진단용 프라이머는 서열번호 1의 염기서열에 기초하여 제작할 수 있으며, PCR을 용이하게 실시하기 위하여 통상적인 최적의 프라이머의 제조방법에 따라 컴퓨터 프로그램(Primer Designer V. 1.01, Scientific and educational software(IBM사))을 이용하여 제작한다. 더욱 바람직하게는 벼흰잎마름병원균 진단용 프라이머는 약 20mer를 포함하고, 프라이머내의 GC 함량이 50% 이상인 것이 좋다. 상기 프라이머는 서열번호 2의 XOF 프라이머 또는 서열번호 3의 XOR 프라이머가 바람직하다.
본 발명의 PCR을 이용한 벼흰잎마름병원균의 진단방법은 상기 프라이머를 이용하여 이루어지며, PCR 조건은 통상의 조건이 바람직하고, 프라이머의 특성에 따라 적절히 조절하여 실시가능하다.
상기 PCR법에 의해 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)의 특이 DNA단편을 증폭시키면, 신속, 정확하게 벼의 벼흰잎마름병원균의 감염여부를 판별할 수 있다.
또한, 본 발명의 벼흰잎마름병원균에의 특이 DNA 단편은 벼흰잎마름병원균과 계통학적으로 근연성이 있는 다른 미생물들, 즉 같은 속에 속하는 다른 종 미생물 및 다른 속에 속하는 미생물들에서는 검출되지 않기 때문에, 벼흰잎마름병원균을 진단할 수 있는 DNA 마커로도 이용할 수 있다.
이하 실시예 및 적용예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예 및 적용예는 본 발명을 설명하고자 하는 예시적인 것일 뿐 이에 의해 본 발명의 기술적 사상의 본질 및 내용이 변경되거나 축소되는 것은 아니다.
[참조예] 미생물의 출처 및 이들의 배양 조건
본 발명에서 사용된 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)을 포함한 기타 미생물은 수원의 농업과학기술원 유전자원과의 한국농용미생물보존센터(Korean Agricultural Culture Collection; KACC), 벨기에 미생물 공동 수집소(Belgian Coordinated Collections of Microorganisms; BCCM) 등에서 분양받은 것으로, 본 발명에서 사용된 미생물 및 이들의 출처를 하기 표 1에 나타내었다.
상기 미생물들중에서 산타모나스속(Xanthomonas) 균주는 YGC 배지(D-(+)-글루코스 2.0%, 탄산칼슘 2.0%, 효모추출액 1.0% :1??)에서, 퓨사리움속(Fusarium spp.) 균주는 감자추출액 한천 배지(potato extrose agar; PDA, Difco)에서, 대장균(Escherichia coli)은 LB한천 배지(Sambrook와 Maniatis 1989)에서, 다른 박테리아들은 한천영양배지(nutrient agar; NA, Difco)에서 배양하여 준비하였다.
[실시예 1] 미생물에 의한 hpaA 유전자의 존재 확인
벼흰잎마름병원균 및 이 미생물과 계통학적, 생화학적으로 유사성이 있는 것으로 인정되는 같은 종의 여러 변종 미생물, 즉, 같은 속(Xanthomonas)의 여러 미생물 및 다른 속의 여러 미생물에서 hpaA 유전자의 존재 여부를 DNA 도트 블롯을 통하여 확인하였다.
즉, 산타모나스속 균주의 총 DNA는 CTAB 방법으로, 다른 미생물의 총 DNA는 Qiagen(Hilden, Germany)사의 게놈 DNA 추출 키트(Genomic-tips)를 이용하여 추출하였다.
각각의 미생물로부터 추출된 20ng의 게놈 DNA를 하이브리드-N+ 나일론막 (Amersham pharmacia biotech, UK)에 각각 분주한 후, UV 크로스-링크를 사용하여 고정시켰다. 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)으로부터 증폭된 유전자 단편을 유전자 탐침인자로 사용하기 위해 램덤 프라임 방법에 따라 라더만(Ladderman)TM 라벨링 키트(Takara, Japan)을 이용하여 방사선 동위원소 [32P]dCTP로 표식하였다. 방사선 동위원소로 표식된 탐침인자와 하이브리드-N+ 나일론 막에 고정된 각각의 미생물의 게놈 DNA와의 혼성화는 65℃에서 18시간 동안 혼성화 완충용액(NaCl 0.75M, 시트르산나트륨 75mM, 0.5% SDS, 0.1% BSA, 0.1% 피콜, 0.1% 폴리비닐 피롤리돈과 변성된 연어 혈청 DNA 50㎍/㎖)을 사용하여 실시하였다. 혼성화된 나일론막을 0.1%의 SDS(sodium dodecyl sulfate)가 포함된 2×SSC 완충액으로 실온에서 두 번 세척(각 10분씩)하고, 0.1%의 SDS를 포함한 0.1×SSC로 65℃에서 다시 두 번(각 15분씩) 세척하였다. 혼성화 작업 및 세척작업 후 나일론막을 X-ray 필름(AGFA, Belgium)에 -70℃에서 하루 동안 노출시킨 후 현상하였고, 현상된 사진을 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, hpaA 유전자는 산타모나스 속에 속하는 균주들에서는 발현 정도의 차이는 있지만 발현이 관찰되는 반면에 다른 속(genus)에 속하는 미생물에서는 아주 약하게 발현이 관찰되거나 발현이 관찰되지 않았다. 이로부터, hpaA 유전자는 산타모나스속에 속하는 미생물에 모두 존재하나, 미생물의 종류에 따라 특이적인 유전자 서열을 가질 것이라는 것을 알 수 있었다.
[실시예 2] hpaA 유전자의 서열분석
상기 실시예 1에서 산타모나스속에 속하는 미생물의 hpaA 유전자가 특이적인 유전자 서열을 가질 것으로 예상하였기 때문에, 이를 확인하기 위해서 산타모나스속에 속하는 미생물의 hpaA 유전자의 염기 서열을 비교, 분석하였다.
즉, 산타모나스속 미생물인 Xanthomonas campestris pv. glycines, Xanthomonas axonopodis pv. citri, Xanthomonas campestris pv. vesicatoria 및 Xanthomonas campestris pv. campestris 유래의 hpaA 유전자의 염기서열를 Genebank의 데이터베이스에서 조사한 다음, 이를 하기의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭한 후, DNASTAR 소프트웨어 패키지(DNASTAR Inc.)를 이용하여 각각의 염기서열을 분석하여 비교하였다. 이때, 각각의 미생물의 hpaA 유전자의 GenBank(NCBI)의 데이터베이스에서의 수탁번호는 각각 AAM40522(X. c. pv. campestris), AAN46419(X. o. pv. oryzae), AAP34351(X. c. pv. glycines), AAD21323(X. c. pv. vesicatoria), AAM35291(X. c. pv. glycines)이다.
hpaA-ampF : 5'-gccatcatgcagttcggtca-3'
hpaA-ampR : 5'-aacctcctgagccgcctgtt-3'
한편, 본 발명의 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)의 hpaA 유전자의 염기서열은 한국 농용미생물보존센터에 수탁번호 KACC10331로 기탁되어 있는 균주의 hpaA 유전자를 상기 프라이머를 이용하여 증폭한 다음, 동일한 방법으로 염기서열을 분석하여 비교하였다.
그 결과들을 도 3 및 도 4에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 산타모나스속 미생물들의 hpaA 유전자의 유연적 유연관계를 분석하였을 때, 벼흰잎마름병원균의 hpaA 유전자는 다른 미생물들의 hpaA 유전자와 71% 이상의 매우 높은 상동성을 나타내었다. 구체적으로는, 벼흰잎마름병원균(Xoo; X. o. pv. oryzae)은 Xcv(X. c. pv. vesicatoria)에 92.3%, Xac( X. a. pv. citri)에 82.7%, Xcg(X. c. pv. glycines)에 82.7%, Xcc(X. c. pv. campestris)에 70.2%의 유사성을 보였다. 특히, Xoo와 Xcv는 그 유사성이 92.3%로 매우 높게 나타났다.
그러나, 도 4a 내지 4c로부터 알 수 있는 바와 같이, 그 구체적인 염기서열에 있어서는 벼흰잎마름병원균의 1~828bp는 다른 산타모나스속 미생물들과 비교하여 상당히 비유사하였다.
따라서, 벼흰잎마름병원균의 hpaA 유전자가 다른 산타모나스속 미생물들의 hpaA 유전자와 매우 유사성이 높음에도 불구하고, 특이적으로 비유사 서열이 집중되어 있는 DNA 단편이 존재한다는 것이 확인되었다. 그러므로, 이 특이적인 DNA 단편을 비교-분석한다면 벼흰잎마름병원균을 다른 근연 미생물들에 대하여 특이적으로 검출할 수 있을 것이라는 것을 예측할 수 있다. 한편, 상기 벼흰잎마름병원균에 존재하는 특이 DNA 단편의 염기서열을 서열번호 1로 표시하였다.
[실시예 3] 특이 DNA 단편의 증폭을 위한 프라이머의 제작 및 특이성 확인
상기 실시예 2에서 전술한 벼흰잎마름병원균의 특이 DNA 단편이 산타모나스속 균주들의 hpaA 중에서 벼흰잎마름병원균의 hpaA를 구별할 수 있는 단편이 될 수 있음을 예측하였기 때문에, 실제 산타모나스속 균주들중에서 벼흰잎마름병원균의 특이 DNA 단편이 검출되는지를 확인하였다.
(3-1) 특이 DNA 단편의 증폭을 위한 프라이머 제작
산타모나스속 균주들 중에서 벼흰잎마름병원균만이 가지는 것으로 파악된 상기 특이 DNA 단편을 증폭할 수 있는 프라이머를 하기의 방법으로 제작하였다.
즉, 벼흰잎마름병원균의 hpaA 유전자의 N-말단부위의 90번~109번 염기서열과 동일한 서열을 가지는 XOF 프라이머와, 605번~624번 염기서열의 안티서열을 가지는 XOR 프라이머를 컴퓨터 프로그램(Primer Designer V. 1.01, Scientific and educational software(IBM사))을 이용하여 제작하였다.
도 5는 XOF 프라이머와 XOR 프라이머의 결합부분을 나타낸 것으로, 서열번호 2는 XOF 프라이머이고, 서열번호 3은 XOR 프라이머이다.
(3-2) 프라이머의 특이성 확인
상기 XOF 프라이머와 XOR 프라이머의 벼흰잎마름병원균에 대한 특이성을 확인하기 위해 산타모나스속 미생물과 기타 다른 미생물들을 대상으로 PCR 반응을 실시하였다.
PCR 반응액의 총량은 50㎕로 하고, 각각의 미생물로부터 분리한 게놈 DNA 50ng, 10pM의 프라이머, 완충액(Tris-HCl 10mM, KCl 50mM, MgCl2 1.5mM, 젤라틴 0.01%), 4종류의 dNTP(각 0.2mM), 2unit의 텍 중합효소(Taq polymerase; Promega, Madison, Wis.)를 함유하게 하였다.
PCR은 PTC-225TM(MJ. research사, Watertown, mass)에서, 94℃에서 15초, 58℃에서 15초, 72℃에서 30초로 30회 반복시킨 후, 최종적으로 72℃에서 7분 동안 중합시키는 조건으로 수행하였다. 증폭반응 후, 8㎕의 PCR 증폭 산물을 1% 농도의 아가로스젤에 전기영동한 후, 에티디움 브로마이드에 착색시켜 자외선 조사기(UV transilluminator)에서 확인하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 벼흰잎마름병원균에서만 증폭이 관찰되었고, 기타 다른 산타모나스속 미생물과 다른 미생물들에서는 증폭이 관찰되지 않았다. 특히, XOF와 XOR 프라이머를 각각 사용하여 PCR 반응을 시켰을 때 벼흰잎마름병원균에서만 534bp 길이의 유전자 단편이 증폭됨을 확인할 수 있었다.
또한, PTC-225TM 대신에 Perkin Elmer 9600(Perkin Elmer International, Rotkreuz)를 사용하여 PCR 반응을 수행한 결과, 상기에서와 동일한 결과를 얻었다. 또한, 기타 다른 제조업체(Promega, Takara, Toyobo)에서 판매하는 텍 중합효소를 사용하여 PCR 반응을 수행한 경우에도 동일한 결과를 얻었다.
따라서, XOF 프라이머 또는 XOR 프라이머는 벼흰잎마름병원균의 특이 DNA 단편만을 증폭시킬 수 있으므로, 벼흰잎마름병원균의 감염여부 진단을 위한 PCR 프라이머로 이용 가능하다라는 것을 알 수 있다. 결과적으로, 서열번호 1의 특이 DNA 단편으로부터 제작된 프라이머는 벼에서 벼흰잎마름병원균의 감염여부를 진단하기 위한 PCR 프라이머로 사용할 수 있다.
[실시예 4] 현장 적용실험
본 발명에 의한 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행하였을 때 실제 벼흰잎마름병원균에 감염된 벼 잎으로부터 벼흰잎마름병원균을 검출할 수 있는지를 확인하였다.
즉, 상기 실시예 3의 XOF 프라이머와 XOR 프라이머의 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)에 대한 특이성을 확인하기 위해 전북 익산에 소재한 호남 작물시험장으로부터 벼의 흰잎마름병원균에 감염된 벼 잎과 감염되지 않은 건강한 벼 잎을 채집하여 PCR 반응을 하기 방법으로 수행하였다.
멸균된 가위를 이용하여 벼흰잎마름병원균에 감염된 벼 조직 및 비감염된 벼 조직을 적당한 크기로 절단하고, CTAB 방법을 이용하여 총 게놈 DNA를 각각 추출하였다. 벼 조직에서 추출된 게놈 DNA 20ng을 취하고, XOF 프라이머 및 XOR 프라이머를 사용하여 상기 실시예 3의 (3-2)에서와 동일한 방법으로 PCR 반응을 수행하여, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 벼흰잎마름병원균에 감염된 벼의 잎 조직에서만 대조구(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)와 동일하게 PCR 증폭된 유전자 단편이 확인되었다.
따라서, 상기 벼흰잎마름병원균의 특이 DNA 단편의 전부 또는 일부를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR반응을 수행하면 벼에 벼흰잎마름병원균이 감염되었는지 여부를 특이적으로 그리고 신속하게 진단할 수 있다.
상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 프라이머를 이용하면 벼의 흰잎마름병의 원인이 되는 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)의 감염여부를 신속하고, 정확하며, 간편하게 진단할 수 있어 벼의 흰잎마름병에 의한 농가의 피해를 최소화할 수 있다.
또한, 본 발명은 벼흰잎마름병원균의 감염 경로를 추적하거나, 중간 기주식물인 줄풀, 겨풀 등에 대한 벼흰잎마름병원균의 감염여부를 진단하는데 매우 유용하게 이용할 수 있으므로 벼흰잎마름병원균을 예방하고 방제하는데 기여할 수 있다.
도 1은 벼의 흰잎마름병의 병징을 나타내는 사진이다.
도 2는 여러 미생물에서의 hpaA 유전자 존재여부를 보여주는 DNA 도트-블롯 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은 산타모나스속 미생물들의 hpaA 유전자의 유전적 유연관계를 분석한 도면으로, (a)는 퍼센트 단위로 환산한 유전적 유사도 분석이고, (b)는 유전적 근연관계를 분석한 도면이다.
도 4a 내지 도 4c는 산나모나스속 미생물들의 hpaA 유전자의 염기서열을 비교 분석한 결과이다.
도 5는 벼흰잎마름병원균의 hpaA 유전자의 특정부위에 대응하는 프라이머의 결합부위를 나타내는 도면이다.
도 6는 본 발명에 의한 프라이머를 이용한 다양한 미생물들의 특이적 PCR 증폭 결과를 나타내는 블럿 사진으로, 각각의 번호는 하기 표 1의 미생물들을, M은 분자량 마커를 나타낸다.
도 7은 본 발명에 의한 프라이머를 이용하여 벼흰잎마름병원균에 감염된 벼 및 비감염된 벼로부터 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)의 감염여부를 진단한 결과를 나타내는 블럿 사진이다.
<도면기호에 대한 간단한 설명>
A : 벼흰잎마름병원균에 비감염된 벼 잎
B : 벼흰잎마름병원균에 감염된 벼 잎
1~12: 벼의 종류(각각, 밀양24, 밀양42, 청청, 삼강, 대청, 한강찰, 풍산, 동진, 서광, 중국45, 화영, 동진1)
Control: 벼흰잎마름병원균
M : 1kb의 분자량 마커
<110> Republic of Korea(Management: Rural Development Administration) <120> Primer for Identifying of Specific DNA Fragment of a Pathogen Xanthomonas oryzae pv. oryzae, and Specific-Identification Methods of the Pathogen using the Primer <130> APE-03-0410 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 828 <212> DNA <213> Xanthomonas oryzae pv. oryzae <400> 1 atgatccgtc gcatctcgcc cggtcccttg cagccctcgg tttccaccga gcatggcggc 60 tcgcatcacc atgccgatca ccatgccgat gcggcaagca ccagcgcagg gtcgcctgcc 120 gacattgcgg caagagcaac ccgtctgcgc cctgctccac cgcgcaggcg acgacgcggg 180 aaccggtcgc tggacggcca cgaggatgaa ttcgacgcca acgagcagga agagatcgaa 240 gccaaacgcg agtgcgcact gcgcggacgg gtaagcgtgg cgatcgctcc ggcccagagc 300 cgggagcatg gccagagcga ccagcacggc ggtgaccgca acacgcatac cgacgacacg 360 caggccggtc cgtggcacgg tggcgctcca aggcaggtga ccgacagcat acgcacgtgc 420 atcgacgcga ttctcaatcg ctacgtggcc aggcgcgacg ccgatccagt ggccaagcga 480 gacgcgctgg ctgctgcgct tgtcgaactg cgcgccatcg gcgtttcgca tcctgccgtc 540 gccccgttga ctgagacggt ctggaggttg atgcgcgagc atctgagctc gtacgacaag 600 gccaccgcgg cggaaaacct gcagaccttg cggacccgat tactggagtt gatgccatcc 660 gagttggaac cggtgccagc gctacgcaat tttcatctac tgcttccact gatattgctg 720 aatgcggaaa aaccgcgcag acaggtcgat cgtagacatg ccatcacacg tctgaacaca 780 cttctgattg agcaaccaga acaggcggct caggaggttc gcccatga 828 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XOF Primer for Identification of Xanthomonas oryzae pv. oryzae <400> 2 atgccgatca ccatgccgat 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XOR Primer for Identification of Xanthomonas oryzae pv. oryzae <400> 3 tggccttgtc gtacgagctc 20

Claims (5)

  1. 서열번호 1로 표시되고, 벼의 벼흰잎마름병의 병원균인 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)에 존재하는 특이 DNA 단편.
  2. 서열번호 1의 염기서열내의 연속된 약 20mer의 서열을 포함하는 벼의 벼흰잎마름병원균의 감염여부를 진단하는 프라이머.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 벼의 흰잎마름병원균의 감염여부를 진단하는 프라이머는 서열번호 2의 XOF 프라이머 임을 특징으로 하는 프라이머.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 벼의 흰잎마름병원균의 감염여부를 진단하는 프라이머는 서열번호 3의 XOR 프라이머 임을 특징으로 하는 프라이머.
  5. (A) 식물체 검체를 분리하여 총 DNA를 추출하는 단계;
    (B) 상기 추출된 DNA를 청구항 2의 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하는 단계; 및
    (C) 상기 PCR 증폭결과로부터 청구항 1의 특이 DNA 단편의 존재여부를 확인하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 벼의 벼흰잎마름병원균의 감염여부를 진단하는 방법.
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