KR20080055336A

KR20080055336A - 벼흰잎마름병원균의 레이스의 판별용 유전자 마커 및 이를이용한 레이스 판별방법

Info

Publication number: KR20080055336A
Application number: KR1020060128550A
Authority: KR
Inventors: 이병무; 노태환; 김영태; 김정구; 조희정
Original assignee: 대한민국(관리부서:농촌진흥청)
Priority date: 2006-12-15
Filing date: 2006-12-15
Publication date: 2008-06-19
Also published as: KR100842447B1

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 벼흰잎마름병원균의 레이스 판별용 유전자 마커(genetic marker) 및 벼흰잎마름병원균의 레이스의 판별방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 벼흰잎마름병원균의 레이스 판별용 유전자 마커 및 상기 프로브를 제한효소에 의해 절단된 벼흰잎마름병원균 게놈 DNA와 혼성화시키는 것을 특징으로 하는 벼흰잎마름병원균의 레이스의 판별방법에 관한 것이다. 본 발명의 벼흰잎마름병원균의 레이스의 판별방법은 벼흰잎마름병원균의 레이스를 효율적으로 판별할 수 있는 효과를 갖는다. 따라서 본 발명의 판별방법은 벼흰잎마름병원균의 레이스 판별의 목적으로 사용할 수 있다.

벼흰잎마름병, 벼흰잎마름병원균, RFLP, 레이스, 판별

Description

벼흰잎마름병원균의 레이스의 판별용 유전자 마커 및 이를 이용한 레이스 판별방법{Genetic marker for race-typing of Xanthomonas oryzae pv. oryzae and method for race-typing of Xanthomonas oryzae pv. oryzae using the same}

도 1은 벼흰잎마름병원균의 게놈 DNA를 분리한 결과를 나타낸 것이다.

도 2는 벼흰잎마름병원균의 게놈 DNA로부터 본원발명의 마커를 PCR로 증폭한 결과를 나타낸 것이다.

M : size marker , 1 : 유전자 마커

도 3은 본원발명의 프로브를 이용하여 벼흰잎마름병원균에 대해 RFLP를 수행한 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 벼흰잎마름병원균의 RFLP 결과를 이용하여 근연관계를 분석한 결과이다.

본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 벼흰잎마름병원균의 레이스 판별용 유전자 마커(genetic marker) 및 벼흰잎마름병원균의 레이스의 판별방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 벼흰잎마름병원균의 레이스 판별용 유전자 마커 및 상기 프로브를 제한효소에 의해 절단된 벼흰잎마름병원균 게놈 DNA와 혼성화시키는 것을 특징으로 하는 벼흰잎마름병원균의 레이스의 판별방법에 관한 것이다.

벼흰잎마름병은 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)에 의해 발병하는 세균병으로 주로 잎에 발생되며, 피해양상은 광합성 부족에 의한 임실률 및 등숙률 저하에 의한 수량 감소 및 품질 저하를 가져온다. 벼흰잎마름병은 우리나라는 물론 아시아, 아프리카, 라틴아메리카, 호주 등 대부분의 벼 재배지역에서 발생되고 있으며,특히 동남아시아 지역에서 피해가 매우 심한 병으로 알려져 있다.

우리나라에서는 1930년 전남 해남에서 최초로 본 병이 발견된 이후 주로 남부지방에서만 발병하였으나 1960년대에는 점차 발생면적이 확대되어 1965년에는 전남지방의 극심한 피해와 함께 전국적인 발생분포를 보이게 되었으며, 그 후, 1979년에는 무려 43%가 발병이 되어 상당한 피해를 발생시켰다. 이후, 벼 흰잎마름병은 1980년대를 정점으로 1990년대에는 발생이 감소하였으나 최근에 다시 증가되는 경향을 보이고 있다.

벼흰잎마름병에 의한 피해는 그 병원균인 벼흰잎마름병원균의 종류에 따라서 차이를 보일 수 있다. 따라서, 벼흰잎마름병의 발생시 그 원인이 되는 병원균의 종류를 신속하게 판별하는 것이 이후의 방제 등의 대책 수립에 중요한 자료가 된다.

같은 식물병원균 내에서의 분화형 또는 변종 중에서 기준 품종에 대한 기생성이 다른 것을 레이스(race)라고 하며, 레이스를 판별할 때에는 그들을 구분하는 기준품종을 선정할 필요가 있는데 이를 판별품종(differential variety)이라고 한다.

현재, 우리나라에서는 일본판별품종을 우리나라 판별품종(밀양42호, 한강찰벼, 풍산벼, 청청벼, 밀양23호)으로 대체하여 레이스를 검정하고 있으며 그 결과 5개의 레이스 (K1, K2, K3, K4, K5)가 있음이 보고되었으며, 2005년 전국 레이스를 조사한 결과 K1(37%), K2(29%), K3(29%), K4(2%), K5(2%)로 나타났다.

하지만, 레이스의 판별은 병원균을 5개의 판별품종에 접종하여 나타나는 병징에 따라 감수성 또는 저항성으로 판정하여 구분하기 때문에 많은 시간과 노력이 소요되며 또한 형태적, 생리적, 생화학적인 특징이 나타나지 않기도 하여 발생 병원균의 신속한 판정이 어려운 실정이다.

이에 본 발명자들은 벼흰잎마름병원균의 레이스를 신속, 정확하게 판별하는 방법을 개발하기 위하여 연구한 결과, 서열번호 1의 염기서열을 가지는 벼흰잎마름병원균의 레이스의 판별용 유전자 마커 및 이를 프로브로 이용한 RFLP(Restiction Fragment Length Polymorphism)을 통한 벼흰잎마름병원균의 레이스 판별방법을 개 발하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 벼흰잎마름병원균 레이스 판별용 유전자 마커를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 유전자 마커를 프로브로 이용하여 제한효소에 의해 절단된 벼흰잎마름병원균 게놈 DNA와 혼성화시키는 것을 특징으로 하는 벼흰잎마름병원균의 레이스의 판별방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 벼흰잎마름병원균 레이스 판별용 유전자 마커를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 유전자 마커를 프로브로 이용하여 제한효소에 의해 절단된 벼흰잎마름병원균 게놈 DNA와 혼성화시키는 것을 특징으로 하는 벼흰잎마름병원균의 레이스의 판별방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 판별방법에 따라 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 마커를 가지는 벼흰잎마름병원균의 레이스 판별용 키트를 제공한다.

이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 벼흰잎마름병원균의 레이스 판별용 유전자 마커는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 마커는 레이스 판별을 위한 RFLP(Restiction Fragment Length Polymorphism)의 검출을 위한 프로브로 사용되며, 보다 상세하게는 제한효소로 절단된 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)의 게놈 DNA와 혼성화에 있어서의 프로브로 사용된다. 바람직하게는 본 발명의 마커는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 벼흰잎마름병원균의 레이스의 판별방법은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 마커를 프로브로 이용하여 제한효소로 절단한 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)의 게놈 DNA와 혼성화시키는 것을 특징으로 하며, 이러한 판별방법은 RFLP를 검출하는 것을 기반으로 한다.

RFLP란 특정부위의 점 돌연변이(point mutation)에 의해 제한효소로 절단하였을 때 생기는 절편들의 길이가 다형성을 보이는 현상을 말하는 것으로 제한효소가 인지하는 염기서열에 점 돌연변이가 발생하여 제한효소의 인지부위가 새로 생성되거나 또는 현존하는 제한효소 인지부위가 소실되어 제한효소에 의한 DNA의 절편양상이 달라지게 되고, 이것은 전기영동 등을 통하여 쉽게 감지될 수 있게 된다.

이러한, RFLP는 미생물의 동정(또는 레이스의 판별)에 이용될 수 있는데, 동정에 이용하기 위해서는 다형성을 검출하기 위한 프로브의 선정이 필요하다. 본 발명에서는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 뉴클레오티드를 프로브로 사용할 수 있으며, 이는 벼흰잎마름병균 유전체의 IS(insertion sequence) 인자 분포에 대한 연구결과, 보다 상세하게는 IS 인자 부위에서 레이스별로 RFLP를 보이는 부분을 탐색하는 연구결과를 토대로 알아낸 것이며, 이러한 본원발명의 프로브를 특이 DNA 단편에 대한 유전적 다형성을 분석하여 병원균 레이스 판별 마커로 활용하고자 하였다.

아울러, RFLP의 수행을 위해서는 대상이 되는 게놈 DNA, 즉 벼흰잎마름병원균 게놈 DNA를 제한효소로 처리하여 절단할 필요가 있다. 제한효소는 당업계에 공지된 제한효소가 사용될 수 있으나, 바람직하게는 EcoRI 및 HindIII를 조합하여 사용할 수 있다. 제한효소를 이용한 절단은 게놈 DNA가 부분 절단(partial digestion)되도록 하는 것이 바람직하며, 이는 제한효소의 양의 조절, 반응시간의 조절 등 당업계에 공지된 방법을 통해 수행될 수 있다.

이러한 RFLP에 의한 동정방법은 당업계에 공지된 RFLP 기법에 의해 수행될 수 있으나, 바람직하게는 본 발명의 판별방법은

(a) 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)의 게놈 DNA를 분리하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계의 게놈 DNA를 제한효소로 부분절단하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계에서 절단된 게놈 DNA를 크기별로 분리하는 단계;

(d) 상기 (c) 단계에서 분리된 게놈 DNA와 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 마커를 프로브로 이용하여 혼성화(hybridization)를 하는 단계;

(e) 상기 (d) 단계에서 혼성화된 프로브를 검출하는 단계; 및

(f) 상기 (e) 단계에서 검출된 단편의 양상을 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 벼흰잎마름병원균의 레이스(race)의 판별방법에 의해 수행될 수 있다.

각 단계에 대해서 상세히 설명하면 다음과 같다.

제(a)단계 : 게놈 DNA 를 분리하는 단계

상기 (a) 단계에서 게놈 DNA의 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol . Biol . Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al ., Nuc . Res ., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.

제(b)단계 : 게놈 DNA 를 제한효소를 부분절단하는 단계

상기 (b) 단계에서의 제한효소는 당업계에 공지된 제한효소가 사용될 수 있으나, 바람직하게는 EcoRI 및 HindIII를 조합하여 사용할 수 있다. 제한효소를 이용한 절단은 게놈 DNA가 부분 절단(partial digestion)되도록 하는 것이 바람직하며, 이는 제한효소의 양의 조절, 반응시간의 조절 등 당업계에 공지된 방법을 통해 수행될 수 있다.

제(c)단계 : 게놈 DNA 를 크기별로 분리하는 단계

상기 (c) 단계에서는 당업계에서 널리 공지된 방법에 따라 절단된 게놈 DNA산물을 크기별로 분리할 수 있다. 바람직하게는 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동에 의해 확인할 수 있다. 크기별로 분리된 게놈 DNA는 (d) 단계에서의 혼성화를 위하여 당업계에 공지된 매체, 예를 들면 나일론 멤브레인에 이전된다. 매체로의 이전은 당업계에 공지된 통상적인 방법, 즉, 모세관 현상을 이용한 이전(capillary transfer), 전기장에 의한 이전(electrophoretic transfer), 진공에 의한 이전(vacuum transfer)에 따라 수행될 수 있다. 본 발명에서의 이전은 분자의 크기가 큰 DNA도 이전되어야 하므로 가급적 전기장에 의한 이전 및 진공에 의한 이전에 의해 수행되는 것이 바람직하다.

제(d)단계 : 프로브와 혼성화시키는 단계

상기 (d)단계에서의 혼성화는 부분절단된 게놈 DNA와 프로브와의 혼성화로서 이는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 본 발명에서 프로브는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 뉴클레오티드를 사용할 수 있으며, 프로브의 검출을 위하여 프로브에 표지될 수 있다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 서열번호 2 및 서열번호 3의 염기서열을 가지는 뉴클레오티드를 프라이머로 하고 벼흰잎마름병원균의 게놈 DNA을 주형으로 하여 PCR을 수행하여 수득될 수 있다.

제(e)단계 : 프로브를 검출하는 단계

상기 (e)단계에서의 프로브의 검출은 프로브에 부착된 표지의 종류에 따라서 당업계에 공지된 방법, 예를 들면, 방사선 동위원소 표지를 프로브에 부착한 경우 감광용 필름에 의해 수행될 수 있다.

제(f)단계 : 검출된 단편의 양상을 분석하는 단계

상기 (f) 단계에서 검출된 단편의 양상의 분석은 시료가 되는 샘플과 대조군의 각각의 검출된 단편의 크기를 서로 비교하는 방법으로 수행된다. 각 검출단편의 크기 비교 결과를 종합하여 시료가 되는 샘플과 대조군의 결과가 동일 또는 동일한 레이스에 속한다고 판단할 수 있을 정도로 거의 유사하면 시료가 되는 샘플은 대조 군과 동일한 레이스로 판별할 수 있다. 이와 같은 판별 방법은 신규 흰잎마름병원균의 레이스 판정이 필요한 경우에 유용하게 이용될 수 있다.

대조군에 대한 RFLP는 시료가 되는 샘플과 동시에 수행될 수도 있으나, 시료가 되는 샘플 보다 이전에 수행되어 판별의 기준표(reference)로 작성될 수도 있다. 이러한 기준표를 이용하면 시료가 되는 샘플에 대한 RFLP에 의한 판별 실험만을 수행하여 기준표와 비교할 수 있어 유용하게 이용할 수 있다.

상기에서 기재된 사항이외에도 일반적인 RFLP를 이용한 판별방법 및 그 결과 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 서열번호 1의 염기서열을 가지는 마커를 포함하는 벼흰잎마름병원균의 레이스 판별용 키트를 제공한다. 레이스 판별 방법은 상기에서 기재한 바와 같다. 이외에 RFLP 반응을 용이하게 수행할 수 있기 위해 제한효소 및 반응 완충용액을 추가로 포함될 수 있으며, 전기영동 수행에 필요한 구성성분 또는 공지된 레이스에 대한 판별 기준표들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 벼흰잎마름병균 유전체 해독정보로부터 IS(insertion sequences) 부위에 대해서 레이스 특이적인 DNA 유전자(981bp) 단편 을 선발하였다. 이 유전자 단편의 염기서열을 바탕으로 프라이머를 제작하고 벼흰잎마름병원균 유전체로부터 PCR법으로 분리하였다. 증폭된 PCR산물을 프로브로 이용하여 RFLP(restriction fragment length polymorphism)법으로 벼흰잎마름병원균의 레이스 판별을 수행하였고, 동 유전자는 벼흰잎마름병원균 레이스에 따라 특이적으로 존재 하는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 벼흰잎마름병원균의 레이스를 판별할 수 있는 유전자 마커 및 이를 이용한 판별방법을 제공한다.

이하. 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 벼흰잎마름병원균의 배양 및 게놈 DNA 추출

<1-1> 벼흰잎마름병원균의 수집 및 배양

수집된 벼흰잎마름병원균을 YDC(2.0 %(w/v) D-(+)-glucose, 2.0 %(w/v) CaCO₃, 1.0 %(w/v) yeast extract, 1.5 %(w/v) agar) 고체배지에 접종하여 28℃에서 3일간 정치 배양하였다. 레이스 판별에 사용된 균주는 표 1에 정리하였다. 하기 표 1에서 품종명은 기탁기관의 기탁명 또는 수집기관(호남농업연구소)에서 지정한 명칭을 나타낸다.

번호	품종	레이스	번호	품종	레이스
1	KACC10331	(K1)	50	HB 03047	(K3)
2	KACC10878	(K1)	51	HB 03050	(K3)
3	KACC10859	(K1)	52	HB 03054	(K3)
4	KACC10380	(K1)	53	HB 03055	(K3)
5	HB 01013	(K1)	54	HB 03058	(K3)
6	HB 01013	(K1)	55	HB 03059	(K3)
7	HB 02010	(K1)	56	HB 03060	(K3)
8	HB 02022	(K1)	57	HB 03061	(K3)
9	HB 02027	(K1)	58	HB 03063	(K3)
10	HB 02028	(K1)	59	HB 03065	(K3)
11	HB 02033	(K1)	60	HB 03067	(K3)
12	HB 02045	(K1)	61	HB 03071	(K3)
13	HB 03011	(K1)	62	HB 03072	(K3)
14	HB 03087	(K1)	63	HB 03074	(K3)
15	HB 04006	(K1)	64	HB 03076	(K3)
16	HB 04027	(K1)	65	HB 03077	(K3)
17	HB 04068	(K1)	66	HB 03079	(K3)
18	KACC10382	(K2)	67	HB 03084	(K3)
19	HB 01014	(K2)	68	HB 03086	(K3)
20	HB 02030	(K2)	69	HB 03091	(K3)
21	HB 03026	(K2)	70	HB 04000	(K3)
22	HB 03028	(K2)	71	HB 04002	(K3)
23	HB 04032	(K2)	72	HB 04007	(K3)
24	HB 04046	(K2)	73	HB 04009	(K3)
25	HB 04048	(K2)	74	HB 04012	(K3)
26	HB 04049	(K2)	75	HB 04015	(K3)
27	HB 04059	(K2)	76	HB 04021	(K3)
28	HB 01015	(K3)	77	HB 04022	(K3)
29	HB 01001	(K3)	78	HB 04023	(K3)
30	HB 01002	(K3)	79	HB 04024	(K3)
31	HB 01003	(K3)	80	HB 04030	(K3)
32	HB 01005	(K3)	81	HB 04031	(K3)
33	HB 01015	(K3)	82	HB 04050	(K3)
34	HB 02003	(K3)	83	HB 04052	(K3)
35	HB 02019	(K3)	84	HB 0102	(K3a)
36	HB 02024	(K3)	85	HB 0103	(K3a)
37	HB 02038	(K3)	86	HB 0109	(K3a)
38	HB 02041	(K3)	87	HB 01001	(K3a)
39	HB 03002	(K3)	88	HB 03032	(K3a)
40	HB 03009	(K3)	89	HB 04045	(K4)
41	HB 03010	(K3)	90	HB 04034	(K5)
42	HB 03013	(K3)	91	HB 04037	(K5)
43	HB 03014	(K3)	92	HB 04039	(K5)
44	HB 03029	(K3)	93	HB 04040	(K5)
45	HB 03034	(K3)	94	HB 04044	(K5)
46	HB 03035	(K3)	95	HB 04047	(K5)
47	HB 03042	(K3)	96	HB 04054	(K5)
48	HB 03045	(K3)	97	HB 04058	(K5)
49	HB 03046	(K3)	98	HB 04071	(K5)

<1-2> 게놈 DNA 추출

배양된 벼흰잎마름병원균의 게놈 DNA는 토요보사(Toyobo, Japan)의 게놈 DNA 정제 키트를 이용하여 제조사의 지침에 따라 추출하였다: NB(Duchefa, USA)배지에서 배양된 벼흰잎마름병원균 3ml을 취하여 10,000 rpm에서 5분간 원심분리하고 벼흰잎마름병원균을 제외한 배양여액을 제거하였다. 850μl의 용해·흡착액과 40ul의 자성비드(bead)를 첨가하고 10분간 교반하여 세균세포로부터 DNA를 용출·흡착시켰다. 이 후 900μl의 세정액을 첨가하고 5분간 교반하여 세척한다. 세척 후 70%의 에탄올을 첨가하여 다시 한 번 세척하고 100μl의 멸균증류수를 첨가하여 자성비드(bead)와 게놈 DNA를 분리하여 회수하였다.

각 게놈 DNA의 추출상태를 확인하기 위하여 1% 아가로스 겔에서 전기영동을 하였다. 그 결과 도 1에서와 보는 바와 같이 각각의 벼흰잎마름병원균에서 게놈 DNA가 잘 추출되었음을 알 수 있었다.

< 실시예 2> PCR 증폭을 이용한 마커 단편의 분리

벼흰잎마름병원균(X. oryzae pv. oryzae) 유전체로부터 서열번호 1의 염기서열을 가지는 뉴클레오티드를 분리하기 위하여 유전체 염기서열을 바탕으로 서열번호 2(tgcagctgacgttcggtga) 및 서열번호 3(ttacaggcgcacgctctcca)의 PCR용 프라이머를 제작하였다. 상기 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머를 이용한 PCR 기법에 의해 다음과 같이 증폭하였다. PCR 증폭반응은 PTC-225 thermalcycler (MJ research, USA)를 사용하여 실시하였으며, 반응은 20ng의 벼흰잎마름병원균의 게놈 DNA, 1 × 반응버퍼, 0.8mM의 4 x dNTP, 10pM의 각 프라이머, 2.5 units의 Taq 중합효소(Toyobo, Japan)를 함유하는 PCR 혼합액(총 50㎕)으로 수행하였다. PCR 반응은 초기 94℃에서 5분간 반응 후 94℃ 15 초, 60℃ 15초, 72℃ 30초를 25회 반응한 후 최종 72℃에서 5분간 반응하였다. 반응 후 PCR 증폭산물을 1% 아가로스 겔에 전기영동을 한 결과 도 2에서와 같이 981bp크기의 서열번호 1의 염기서열을 가지는 뉴클레오티드가 단일 밴드로 증폭되었음을 확인할 수 있었다.

< 실시예 3> 벼흰잎마름병원균의 RFLP 분석

상기의 방법으로 추출한 벼흰잎마름병원균들의 게놈 DNA를 약 1ug의 농도로 정량하여 RFLP 분석에 사용하였다. RFLP 분석은 다음과 같은 방법에 의해 수행되었다: 1μg의 게놈 DNA, 1 × 반응 버퍼, 각 10 units의 EcoRI 및 HindIII 제한효소를 총 10ul의 반응액에 첨가하고, 37℃ 항온수조에서 2시간동안 반응시켜 부분절단(partial digestion)하였다. 절단 후 0.9% 아가로스 겔에서 전기영동하고 나일론 멤브레인(Hybond-N+ nylon membrane, Amersham, UK)에 옮겨 고정시켰다.

상기에서 증폭된 단편(서열번호 1)을 프로브로 사용하기 위해 상용의 표지용 키트(Ladderman labeling kit, Takara, Japan)을 이용하여 제조사의 지침에 따라서 방사선 동위원소 [³²P]dCTP로 표지하였다.

방사성 동위원소로 표지된 프로브와 나일론 멤브레인에 고정된 게놈 DNA와의 혼성화(hybridization)는 65℃에서 18시간 동안 혼성화 용액 (0.75M NaCl, 75mM sodium citrate, 0.5 % sodium dodecyl sulfate, 0.1 % BSA, 0.1 % Ficoll, 0.1 % polyvinylpyrrolidone, 50ug/ml salmon sperm DNA)하에서 수행되었다. 혼성화 후 나일론 멤브레인을 0.1 % SDS가 포함된 2 × SSC(standard saline citrate) 용액으로 실온에서 10분간 두 번 세척하고, 다시 0.1 × SSC 용액으로 65℃에서 15분간 2번 세척하였다. 세척 후 나일론 멤브레인을 X-ray 필름 (AGFA, Belgium)에 18시간 동안 노출한 후 현상하였다.

그 결과, 도 3에서 볼 수 있듯이 본 발명의 마커는 벼흰잎마름병원균에 따라 모두 다르게 특이적으로 분포하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, RFLP 분석패턴을 바탕으로 NTSYSpc 프로그램(Exeter Software, USA)을 이용하여 벼흰잎마름병원균간의 근연관계를 분석한 결과,도 4와 같이 크게 9종류 패턴이 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 벼흰잎마름병원균에는 기존의 정립된 레이스 판별기준에 따른 5가지의 레이스보다 유전적으로 더욱 다양한 레이스로 구분할 수 있음을 보여준다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 벼흰잎마름병원균의 레이스의 판별방법은 벼흰잎마름병원균의 레이스를 효율적으로 판별할 수 있는 효과를 갖는다. 따라서 본 발명의 판별방법은 벼흰잎마름병원균의 레이스 판별의 목적으로 사용할 수 있다.

<110> Republic of Korea <120> Genetic marker for race-typing of Xanthomonas oryzae pv. oryzae and method for race-typing of Xanthomonas oryzae pv. oryzae using the same <130> NP06-1112 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 981 <212> DNA <213> Xanthomonas oryzae <400> 1 atgcagctga cgttcggtga cgctgagggc ccggtcaagc gcaagcagac ccggcgcgag 60 attttcctgg ccgagatgga gcagatggtt ccctggcagc aactgcgcgt gctgatcgcg 120 ccgcactctc cggtgtcggg gcggccaggg cggcagccat acgccctggc gacgatgtgg 180 cggattcatc tgctgcagca gtggtatgcg ttgagcgatc cggcaatgga agaagcgctg 240 cacgagatag cgacattgcg gcgttttacc cagctcggcg gcttggacga cattcccgac 300 gagcccacga ttctcaacgt tcgccgcctg ctggagaccc atggccttgc cgcacggatg 360 ctggaagcgg tcaacgcgca tctggcgcgc aagggccaga gcttgcggtc cggcacgatt 420 gtcgatgcga gactgatcgc tgcgcccagt tcgaccaaga acgcccatca cgcgcgcgac 480 actgagatgc atcagaccag gaagcgcaat cagtggtatt tcgggatgaa ggcgcacatc 540 ggcgtggatg cgttttccgt gcgggcgcac catgtccatg gcacagcagc caatgtcgcc 600 gatgtcacgg tgacgcacac cttgctgcat ggcaaagaag accgcgtgtt cggcgacagc 660 ggctataccg gcgcagaaaa acgcgacgaa ctgcgggact gcaaagcagc atccttcttc 720 gccgccaggc cctcgacgat ccaagccatc ggcaacaacc gcgagcgtgc tcgggaacag 780 cgttgggaac acgtcaaagc cagcgtgcgc gcgaaggtgg agcatccatt ccgggtgatc 840 aagcgccggt tcggctacac caaggtccgc tatcgcggac tggccgagaa cacggcacac 900 gtgctgagct tgtttgcgct gtcaaccctg tggatgaagc gaaagcagtt actgcacgcc 960 atggagagcg tgcgcctgta a 981 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 2 tgcagctgac gttcggtga 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 3 ttacaggcgc acgctctcca 20

Claims

서열번호 1의 염기서열을 포함하는 벼흰잎마름병원균의 레이스 판별용 유전자 마커(genetic marker).
제1항의 마커를 프로브로 이용하여 제한효소로 절단한 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae) 게놈 DNA와 혼성화시키는 것을 특징으로 하는 벼흰잎마름병원균의 레이스(race)의 동정방법.
제2항에 있어서,

(a) 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)의 게놈 DNA를 분리하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계의 게놈 DNA를 제한효소로 부분절단하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계에서 절단된 게놈 DNA를 크기별로 분리하는 단계;

(d) 상기 (c) 단계에서 분리된 게놈 DNA와 제1항의 마커를 프로브로 이용하여 혼성화(hybridization)를 하는 단계;

(e) 상기 (d) 단계에서 혼성화된 프로브를 검출하는 단계; 및

(f) 상기 (e) 단계에서 검출된 단편의 양상을 분석하는 단계를 포함하는 것 을 특징으로 하는 벼흰잎마름병원균의 레이스(race)의 판별방법.
제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 제한효소는 EcoRI 및 HindIII인 것을 특징으로 하는 벼흰잎마름병원균의 레이스의 판별방법.
제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 2의 염기서열 및 서열번호 3의 염기서열을 프라이머쌍으로 이용하여 벼흰잎마름병원균 게놈 DNA로부터 PCR(Polymerase Chain Reaction)에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는 벼흰잎마름병원균의 레이스의 판별방법.
제1항의 마커를 포함하는 것을 특징으로 하는 벼흰잎마름병원균의 레이스 판별용 키트.