CN114317806A - 一种鉴定灰树花h1菌种的ssr引物组合、鉴定方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴定灰树花H1菌种的SSR引物组合、鉴定方法及应用，涉及灰树花菌种的检测技术领域。其包括：SEQ ID NO.1‑2所示的第一引物对、SEQ ID NO.3‑4所示的第二引物对和SEQ ID NO.5‑6所示的第三引物对。本发明提供SSR引物组合可以快速准确的实现灰树花H1菌种的鉴定，经验证，使用上述SSR引物扩增出的带型明亮，清晰可辨，重复性好。本发明提供的鉴定方法具有操作简便、稳定可靠，鉴定周期短、准确率高、覆盖率广以及重复性好的优点，可以准确地区分市场上的灰树花H1菌株，具有良好的应用前景。

Description

一种鉴定灰树花H1菌种的SSR引物组合、鉴定方法及应用

技术领域

本发明涉及灰树花菌种的检测技术领域，具体而言，涉及一种鉴定灰树花H1菌种的SSR引物组合、鉴定方法及应用。

背景技术

灰树花(Grifola frondosa)又称贝叶多孔菌、栗子蘑、千佛菌、舞茸(日本)等，是一种食药同源食用菌。新鲜灰树花肉质柔软味美，具有很高的药用价值。灰树花子实体或菌丝体所含的多糖成分已被研究证实在抗HIV病毒、抗肿瘤、降血糖及提高机体免疫功能等方面具有一定的功效。

灰树花在日本有着50多年的栽培历史，而我国是在上世纪80年代开始的灰树花的人工种植。据统计，截止2018年，我国灰树花的年产量达到2.87万吨，比2017年增长了8.95％，工厂化栽培也逐见雏形。而菌种是影响工厂化生产的重要环节，也是凸显知识产权的重要部分，进一步辅以优质灰树花菌株的鉴定方法显得尤为关键。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鉴定灰树花H1菌种的SSR引物组合、鉴定方法及应用以解决上述技术问题。

本发明利用系统选育的方法筛选出适合工厂化生产的菌株H1，建立了一种成熟、快速、精准的分子生物学鉴定技术体系，该鉴定方法以及SSR标记引物成为了保护食用菌品种知识产权的有力手段。本发明的提出有助于保护灰树花种业从业者的劳动成果，有助于维护食用菌种业的健康发展。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种鉴定灰树花H1菌种的SSR引物组合，其包括：SEQ ID NO.1-2所示的第一引物对、SEQ ID NO.3-4所示的第二引物对和SEQ ID NO.5-6所示的第三引物对。

灰树花H1菌种(Grifola frondosa H1)，即为灰树花(Grifola frondosa)荣白001(F)，分类学名称为：Grifola frondosa。于2021年12月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所；保藏编号为GDMCC：62154。鉴定结果为存活。

上述引物组合的具体序列如下表1所示：

表1 SSR引物详细信息表。

上述引物对是发明人基于灰树花H1菌种的基因组简单重复序列片段经过长期的引物设计和筛选获得的具有分型效果好的SSR引物，该引物扩增带型明亮，清晰可辨，重复性好。

在其他实施方式中，本领域的技术人员基于本申请提供的SSR引物对进行1-3个碱基的增加或删减，从而获得相比于本发明的引物对扩增效果稍微较差、稍微较好、明显更优或明显较差的效果也是可预期的，也均在本发明的保护范围之内。

上述引物组合的产品形态包括不限于：粉剂、溶液、乳液和悬浮液。

本发明还提供了一种鉴定灰树花H1菌种的试剂盒，其包括上述的SSR引物组合。

本发明还提供了一种鉴定灰树花H1菌种的方法，其包括：

采用上述的SSR引物组合或上述的试剂盒对待测菌株进行PCR扩增，通过电泳对照胶图的方法，或毛细管电泳与GeneMapper数据分析相结合的方法获知各SSR引物对扩增的等位片段的数量和相对分子量，若扩增产物的等位片段的数量和相对分子量为如下编号组合：(1+2)/(1+3)/1，则判断待测菌株为灰树花H1菌种；

编号组合：(1+2)/(1+3)/1的含义如下表所示：

若扩增产物的带型不是(1+2)/(1+3)/1，则判断所鉴定的样本不属于灰树花H1菌种。

本发明提供的鉴定方法具有鉴定周期短、准确率高、覆盖率广以及重复性好的优点。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述PCR扩增的反应条件包括：

95-96℃ 5min；95-96℃ 30s，45-60℃ 30s，70-72℃ 30s，15-20个循环；95-96℃30s，50-54℃ 30s，70-72℃ 30s，20-25个循环；70-72℃ 30min。通过梯度循环可以增加PCR扩增的特异性，有助于提升鉴定结果的准确率。

在上述反应条件下，可以实现待测样本的快速准确鉴定。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述PCR扩增的反应体系包括：

DNA模板0.2-1.5μl，上游引物0.1-1μl，下游引物0.1-1μl，PCR缓冲液5-25μl，其余为水。

上述扩增反应体系包括不限于15μl、20μl、25μl和30μl。本领域的技术人员可以根据DNA模板的纯度设置DNA模板的添加量，也可以根据PCR缓冲液的浓度进行设置添加量，并不限于上述的反应体积。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述毛细管电泳与GeneMapper数据分析相结合的方法包括：将PCR扩增产物与荧光内标、去离子甲酰胺(HiDi)混合，上样进行毛细管电泳，电泳后的结果导入GeneMapper软件中，分析得到相应位点的片段大小和信号值。

在一种可选的实施方式中，上述荧光内标包括不限于：LIZ500。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述上样前还包括对PCR扩增产物与荧光内标、去离子甲酰胺混合液进行变性处理；

优选地，变性是在94-100℃下变性1-10min。

本发明还提供了一种灰树花H1菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法，其包括：根据灰树花H1菌种的基因组测序结果选取多态性序列设计SSR引物，采用设计的SSR引物对灰树花H1菌种的基因组进行PCR扩增；然后进行电泳检测，检测的结果使用GeneMapper软件进行数据分析。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述使用GeneMapper软件进行数据分析是指：将电泳检测的数据文件导入到分析软件GeneMapper中，运用POPGENE、NTSYS软件进行群体结构分析、聚类及杂合度的分析，核心种质资源计算分析。分析等位基因数(Na，Ne)、Nei’s遗传多样性指数(He)、shannon’s多样性信息指数(I)和基因观测杂合度(Ho)。

本发明还提供了一种SSR引物组合或试剂盒在灰树花菌种鉴定中的应用。该应用包括不限于：灰树花菌种进化研究、变异位点鉴定。

本发明具有以下有益效果：

与传统的形态学检测、拮抗试验以及DUS出菇测试相比，本发明提供的SSR引物组合可以快速准确的实现灰树花H1菌种的鉴定，经验证，使用上述SSR引物扩增出的带型明亮，清晰可辨，重复性好。本发明提供的鉴定方法具有操作简便、稳定可靠，鉴定周期短、准确率高、覆盖率广以及重复性好的优点，可以准确地区分市场上的灰树花H1菌株，具有良好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为第一引物对分别在所选灰树花H1和几种主栽商业品种中依次检测得到的等位位点相对分子量峰图；

图2为第二引物对分别在所选灰树花H1和几种主栽商业品种中依次检测得到的等位位点相对分子量峰图；

图3为第三引物对分别在所选灰树花H1和几种主栽商业品种中依次检测得到的等位位点相对分子量峰图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种灰树花H1菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法。

(1)菌丝培养：将灰树花H1菌种转接到PDA培养基上25℃培养7d后收集菌丝；

(2)基因组DNA的提取：利用CTAB方法提取DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致。

具体地，将真菌样本加入液氮充分研磨，置于高温灭菌后的1.5mL EP管中，加入少量已灭菌的石英砂，研磨至粉末状。加入600μL 65℃下预热的2％CTAB，混匀后放置于65℃的水浴锅中保温1h以上，向离心管中加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，翻转摇动10min以充分混合，4℃10,000rpm离心10min。上清液转移至一个新的1.5mL离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，翻转摇动10min后，10,000rpm离心10min。再次将上清液转移至一个新的1.5mL离心管中，加入0.6倍体积–20℃下预冷的异丙醇和1/10体积的醋酸钠(pH＝5.2)，–20℃下静置沉淀20min以上，可过夜。10,000rpm离心10min，弃上清液，加入500μL 70％乙醇，轻轻混合后，10,000rpm离心10min，弃上清液，重复一次后敞开离心管口，室温干燥。完全干燥后，加入30-60μL TE缓冲液或100uL双蒸水(视DNA量而定)，4℃下静置至DNA沉淀充分溶解，放置在–20℃冰箱中冻存备用。

(3)SSR分子标记引物开发：将以上提取的DNA纯化，具体利用Qiagen高分子量DNA纯化试剂盒，按照说明书操作步骤进行。

打断，构建300bp测序库，在Illumina平台上进行测序，下机数据量为5G，利用SPAdes-3.15.2进行基因组拼接，根据基因组之间的差异性，选择多态性序列设计10对SSR引物；

(4)SSR分子标记的检测：根据设计SSR引物序列，合成引物，进行PCR扩增验证；

PCR反应总体积10μl，包括：10×PCR buffer 1μl，2.5mmol/l dNTP 0.8μl，5U/μlTAKARA HSTaq酶0.1μl，5μmol/l TP-M13 0.5μl,5μmol/l SSR标记特异引物总体积各0.6μl，浓度20ng～30ng/μl提取的模板DNA 1.2μl，ddH₂O 5.2μl；

PCR反应条件：95℃ 5min；95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；95℃ 5min；95℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 30s，10个循环；60℃ 30min。

对上述的PCR扩增条件和体系进行验证，PCR反应体系：DNA模板1μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，2×PCR mix 10μl，加水8μl，总体积20μl；

PCR反应参数：预变性95℃ 5min，变性95℃ 30s，退火60℃ 30s，延伸72℃30s 15个循环；变性95℃ 30s，退火50℃ 30s，延伸72℃ 30s，20个循环，终延伸72℃ 7min。

(5)待上述PCR结束以后，瞬时离心样品以除去管壁样品，随机挑取样品2uL进行凝胶电泳。从胶图判断各引物是否有单一、明亮的扩增条带，条带大小是否和预期片段大小大概一致，同时确定样品浓度。

取一新的96孔板标明板号。根据电泳情况调整加样量并加样(如有必要需稀释后加样)，加入冷的70％乙醇至终体积50uL，震荡充分混匀。3,700r/min，4℃离心30min，以纯化样品。倒置瞬离，以除去乙醇。静置15min待乙醇挥发干净。在乙醇已经挥发完全的板中加入内标LIZ500和高浓度去离子甲酰胺(HiDi)，震荡充分混匀，瞬离以除去管壁样品。然后置于PCR仪中，95℃ 4min变性。再放到3730XL中进行毛细管电泳。结果出来后用GeneMapper进行分析，得到相应的位点的片段大小和信号值。

(6)GeneMapper进行数据分析具体为：将检测得到的原始数据文件导入到分析软件GeneMapper中，运用POPGENE、NTSYS等软件进行群体结构分析、聚类及杂合度的分析，核心种质资源计算分析。分析等位基因数(Na，Ne)、Nei’s遗传多样性指数(He)、shannon’s多样性信息指数(I)和基因观测杂合度(Ho)。

本实施例对收集的9份在国内广泛栽培的灰树花商业品种使用SSR引物进行扩增，确定了3对SSR引物在各个灰树花栽培品种中扩增出的等位片段的数量并编号如表2所示，通过不同SSR等位位点的编号组合能够在所收集的9份主栽品种中有效识别H1菌种。统计SSR片段可知，H1菌种的编号组合为：(1+2)/(1+3)/1，表2为所有的菌株的扩增片段情况，H1对应的等位片段编号为8和11片段。

图1中为第一引物对分别在所选灰树花H1(1号峰图)和几种主栽商业品种中依次检测得到的等位位点相对分子量峰图。图2为第二引物对分别在所选灰树花H1(1号峰图)和几种主栽商业品种中依次检测得到的等位位点相对分子量峰图。图3为第三引物对分别在所选灰树花H1(1号峰图)和几种主栽商业品种中依次检测得到的等位位点相对分子量峰图，每种峰图特征见表3。由图可知，灰树花H1菌种的编号组合为：(1+2)/(1+3)/1。

表2 SSR引物扩增的等位片段信息汇总表。

表3 每个菌株SSR扩增片段信息

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏华绿生物科技股份有限公司

<120> 一种鉴定灰树花H1菌种的SSR引物组合、鉴定方法及应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cacaccttac gaggtgagca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgtttgatgt tagccgaacg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggagtttgag ttgaggcagc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgaaccaga ccaaagaccg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcttcttgta gagcgcctcg 20

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctctcgacgc gtgttcct 18

Claims (10)

1.一种鉴定灰树花H1菌种的SSR引物组合，其特征在于，其包括：SEQ ID NO.1-2所示的第一引物对、SEQ ID NO.3-4所示的第二引物对和SEQ ID NO.5-6所示的第三引物对。

2.一种鉴定灰树花H1菌种的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的SSR引物组合。

3.一种鉴定灰树花H1菌种的方法，其特征在于，其包括：

采用权利要求1所述的SSR引物组合或权利要求2所述的试剂盒对待测菌株进行PCR扩增，通过电泳对照胶图的方法，或毛细管电泳与GeneMapper数据分析相结合的方法获知各SSR引物对扩增的等位片段的数量和相对分子量，若扩增产物的等位片段的数量和相对分子量为如下编号组合：(1+2)/(1+3)/1，则判断待测菌株为灰树花H1菌种；

编号组合：(1+2)/(1+3)/1的含义如下表所示：

4.根据权利要求3所述的鉴定灰树花H1菌种的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件包括：

95-96℃ 5min；95-96℃ 30s，45-60℃ 30s，70-72℃ 30s，15-20个循环；95-96℃ 30s，50-54℃ 30s，70-72℃ 30s，20-25个循环；70-72℃ 30min。

5.根据权利要求4所述的鉴定灰树花H1菌种的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系包括：

DNA模板0.2-1.5μl，上游引物0.1-1μl，下游引物0.1-1μl，PCR缓冲液5-25μl，其余为水。

6.根据权利要求3所述的鉴定灰树花H1菌种的方法，其特征在于，所述毛细管电泳与GeneMapper数据分析相结合的方法包括：将PCR扩增产物与荧光内标、去离子甲酰胺混合，上样进行毛细管电泳，电泳后的结果导入GeneMapper软件中，分析得到相应位点的片段大小和信号值。

7.根据权利要求6所述的鉴定灰树花H1菌种的方法，其特征在于，所述上样前还包括对PCR扩增产物与荧光内标、去离子甲酰胺混合液进行变性处理；

优选地，所述变性是在94-100℃下变性1-10min。

8.一种灰树花H1菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法，其特征在于，其包括：根据灰树花H1菌种的基因组测序结果选取多态性序列设计SSR引物，采用设计的SSR引物对灰树花H1菌种的基因组进行PCR扩增；然后进行电泳检测，检测的结果使用GeneMapper软件进行数据分析。

9.根据权利要求8所述的灰树花H1菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述使用GeneMapper软件进行数据分析是指：将电泳检测的数据文件导入到分析软件GeneMapper中，运用POPGENE、NTSYS软件进行群体结构分析、聚类及杂合度的分析，核心种质资源计算分析。

10.一种如权利要求1所述的SSR引物组合或权利要求2所述的试剂盒在灰树花菌种鉴定中的应用。

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