CN114404566A - 一种木霉菌素的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种木霉菌素的用途，该木霉菌素用于作为制备治疗由须癣毛癣菌引起的皮肤病的药物。本发明的木霉菌素源于紫杉木霉菌株ZJUF0986，对须癣毛癣菌具有抑制作用，有潜力作为治疗由须癣毛癣菌引起的皮肤病的药物，为生物防治法治疗须癣毛癣菌引起的家畜皮肤真菌病提供科学依据。体外抑菌结果表明，在木霉菌素1000μg/mL作用下，须癣毛癣菌菌落生长被完全抑制。

Description

一种木霉菌素的用途
技术领域
本发明涉及一种生防菌代谢产物的用途，具体涉及一种木霉菌素的用途。
背景技术
须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes，Tm)，又称石膏样毛癣菌，是一种重要的人畜共患皮肤癣菌，主要感染人和动物皮肤角质层及其附属角质化组织，危害人类和动物健康。须癣毛癣菌皮肤病的治疗主要依赖药物，目前临床上的药物有多种，但由于长期治疗和重复给药导致的耐药性，使得药物总体疗效不稳定，易复发。因此，寻找新的高效、长效药物迫在眉睫。
从天然产物中发现新型化合物，是新药创制的重要途径。微生物是自然界中天然产物的主要来源。木霉属中多种真菌可用于植物病害的生物防治，生防机制包括重寄生、抗生、竞争等，其产生的抗生物质在生防机制有很重要的作用。植物内生真菌的分离鉴定和功能研究是新兴的研究领域。前期研究已发现植物内生真菌紫杉木霉菌株ZJUF0986和来源于该菌株的活性物质木霉菌素具有抗植物病原真菌活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种木霉菌素的用途，对须癣毛癣菌具有抗菌作用，为生物防治法治疗须癣毛癣菌引起的家兔皮肤病提供科学依据，能够作为治疗须癣毛癣菌引起的皮肤病的药物。
为了达到上述目的，本发明提供了一种木霉菌素的用途，该木霉菌素用于作为制备治疗由须癣毛癣菌引起的皮肤病的药物。
优选地，所述木霉菌素为从紫杉木霉菌株ZJUF0986获得的活性代谢产物。
优选地，所述木霉菌素抑制须癣毛癣菌的菌落生长。
优选地，所述木霉菌素的浓度大于或等于10μg/mL且小于20mg/mL。
优选地，所述木霉菌素的浓度等于或大于10μg/mL，对须癣毛癣菌菌落生长抑制率为等于或大于18％。
优选地，所述木霉菌素的浓度等于或大于100μg/mL，对须癣毛癣菌菌落生长抑制率为等于或大于40％。
优选地，所述木霉菌素的浓度为等于或大于1000μg/mL，对须癣毛癣菌菌落生长完全抑制。
优选地，所述木霉菌素抑制须癣毛癣菌孢子萌发。
优选地，所述木霉菌素的浓度为等于或大于10μg/mL，对须癣毛癣菌孢子萌发抑制率为等于或大于69％。
优选地，所述木霉菌素的浓度为等于或大于100μg/mL，对须癣毛癣菌孢子萌发抑制率为等于或大于91％。
本发明的另一目的是提供一种调控木霉菌素对须癣毛癣菌作用的方法，该方法包含：通过下调CDR1基因的表达或者敲除CDR1基因，使得木霉菌素抑制须癣毛癣菌的作用增强。
本发明的木霉菌素的用途，具有以下优点：
本发明的木霉菌素，通过紫杉木霉菌株ZJUF0986分离纯化获得的，对须癣毛癣菌具有抗菌作用，为生物防治法治疗须癣毛癣菌引起的家兔皮肤病提供科学依据，能够作为治疗须癣毛癣菌引起的皮肤病的药物。
从体外抑菌结果来看，木霉菌素1000μg/mL作用下，须癣毛癣菌菌落被完全抑制，说明木霉菌素1000μg/mL能够完全抑制须癣毛癣菌的菌丝生长。在木霉菌素作用下，线粒体的相关表达基因呈显著下降的过程，这意味着线粒体在木霉菌素处理过程中受到损伤或参与了木霉菌素的耐受过程。须癣毛癣菌的多个ABC基因在木霉菌素作用下下调。通过敲除其中一个ABC基因CDR1，药敏实验结果表明，CDR1基因在须癣毛癣菌耐受木霉菌素作用中起到关键作用。
附图说明
图1为本发明实验例1不同浓度木霉菌素作用下Tm的菌落生长情况。
图2为本发明实验例1不同浓度木霉菌素作用下Tm的菌落直径。
图3为本发明实验例1不同浓度木霉菌素作用下Tm的菌落产孢量。
图4为本发明实验例1不同浓度木霉菌素作用下的Tm孢子萌发率。
图5为本发明实验例1不同浓度木霉菌素作用下Tm的超微结构。
图6为本发明实验例1不同浓度木霉菌素作用下Tm的线粒体染色观察结果。
图7为本发明实验例1木霉菌和Tm的互作情况。
图8为本发明实验例1木霉菌的GFP转化株和Tm的RFP转化株互作观察结果。
图9为本发明实验例2的CDR1基因敲除株对木霉菌素药敏实验结果。
图10为本发明实验例3木霉菌素对Tm引起的兔皮肤病的治疗结果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验例1木霉菌素对Tm的抑制作用
1、木霉菌素作用下Tm的菌落生长与产孢量
该木霉菌素为源于紫杉木霉菌株ZJUF0986的活性代谢产物(以下实验例相同)，所用的测试菌株为须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes，Tm)，药敏板分别为含10、100、1000μg/mL木霉菌素的SDA板，每浓度3个重复；采用菌饼打孔法制作Tm菌饼在药敏板上培养(以下实验例相同)，培养6天，观察并拍照，测量菌落大小；用生理盐水洗涤菌落，用两层滤纸过滤，再用血细胞计数板进行孢子计数，计算每SDA板的产孢量。
如图1所示，为本发明实验例1不同浓度木霉菌素作用下的Tm菌落生长情况；如图2所示，为本发明实验例1不同浓度木霉菌素作用下的Tm菌落大小；生长6天后，随着木霉菌素浓度的升高，药敏板上Tm菌落依次减小，均显著小于空白对照组SDA(CK)上的菌落(P<0.01)；当木霉菌素浓度为10、100μg/mL时，菌落生长抑制率分别为18％和40％；当木霉菌素浓度达到1000μg/mL，Tm菌落生长被完全抑制。如图3所示，为本发明实验例1不同浓度木霉菌素作用下Tm的产孢量；在木霉菌素浓度为10μg/mL和100μg/mL的药敏板上，每个Tm菌落的产孢数分别为8.4×107和2.3×107个，均显著低于对照组1.84×108个(P<0.01)，且呈剂量依赖关系。
2、木霉菌素作用下Tm的孢子萌发率
制成浓度为5×105个/mL并分别含0、10、100μg/mL浓度木霉菌素的Tm孢子液，28℃黑暗条件下培养14h，借助卡氏白染色，观察并计算孢子萌发率。具体操作如下：将培养后的孢子液滴在玻璃板上，用20μL卡式白染色液染色，立即在荧光显微镜下观察，观察孢子萌发情况，记算萌发率。
如图4所示，为本发明实验例1不同浓度木霉菌素作用下Tm的孢子萌发率(A为荧光显微镜观察，B为统计的孢子萌发率)，培养14h后，通过卡式白染色观察发现，10μg/mL、100μg/mL木霉菌素处理的Tm的孢子萌发率分别为13.3％与3.9％，与空白对照(43.5％)相比均显著下降，孢子萌发抑制率分别为69％与91％(参见表1)，萌发率被抑制的程度与木霉菌素浓度的升高呈相关性。
表1为菌落生长、产孢量与孢子萌发抑制率数据
Figure BDA0003509404330000041
3、木霉菌素作用下Tm的显微观察
分别制成含10、100μg/mL木霉菌素的SDA板，接种Tm培养6天，在透射电子显微镜下进行超微结构观察。同时，用MitoTracker Green FM绿色染料，对Tm进行线粒体染色，在共聚焦显微镜下观察。MitoTracker Green FM绿色染料是一种亮绿色荧光探针(F488nm)，在水溶液中几乎不发荧光，只有当聚集在线粒体的脂质环境才能发荧光。使用前，先按照说明书用DMSO配制染料成1mM储存液，再将2μL储存液加入1000μL水中制备染色工作液。在载玻片上滴加15μL水，挑取菌丝置于水中，再滴加15μL染色工作液进行染色，立即在共聚焦显微镜下观察。
如图5所示，为本发明实验例1不同浓度木霉菌素作用下Tm的超微结构观察结果，电子显微镜下，Tm的线粒体呈现膨大，菌丝形态发生改变；如图6所示，为本发明实验例1不同浓度木霉菌素作用下Tm的线粒体荧光染色观察结果，通过线粒体染料MitoTrackerGreen FM染色，观察发现在木霉菌素的作用下，Tm菌丝内的线粒体数量明显增加。
4、木霉菌和Tm的互作情况
在SDA板上相隔5厘米分别接种木霉菌和Tm，培养3天后，两个菌落接近，在显微镜下观察二者互作情况。
如图7所示，为本发明实验例1木霉菌和Tm互作情况，共培养3天后，可见木霉菌菌丝向Tm方向延伸、侵袭，与Tm的菌丝相互牵扯、缠绕，Tm在木霉菌的进攻下退缩。
如图8所示，为本发明实验例1木霉菌的GFP转化株和Tm的RFP转化株的互作情况观察结果，在共聚焦显微镜下，借助GFP(绿色荧光蛋白)和RFP(红色荧光蛋白)的标记，木霉菌和Tm的互作与菌丝互相缠绕更加明显可见。
进一步通过转录组数据分析发现，在木霉菌素作用下，多个线粒体相关基因(bifunctional dethiobiotin synthetase/7,8-diamino-pelargonic acidaminotransferase、zinc-binding oxidoreductase、RutC family protein、oxygen-dependent coproporphyrinogen-III oxidase、biotin synthase、argininebiosynthesis bifunctional protein)的表达呈现下调，说明线粒体在木霉菌素处理过程中受到损伤或参与了Tm对木霉菌素的耐受过程。
实验例2 CDR1基因对木霉菌素药敏实验影响
CDR1基因缺失株的获得：以Tm菌株基因组DNA作为模板，用PCR分别扩增1.2kb的CDR1上游片段(SEQ ID NO.1)和1.1kb的CDR1下游片段(SEQ ID NO.2)，然后分别将这两个片段插入p1300-KO(通过潮霉素基因导入pCAMBIA1300(Cambia,Canberra,Australia)构建)中，生成CDR1敲除载体pKO-TmCDR1。将pKO-TmCDR1通过AtMT导入Tm菌株，使用含有250μg/mL潮霉素B的CM平板筛选转化子。通过多重基因组PCR扩增方法和实时定量PCR筛选并验证，最终获得CDR1缺失株T9-21和T4-12。将TmCDR1的同源基因，导入到T9-21缺失株中，获得互补菌株PNMNR6(5)和PNMG7(6)。
CDR1基因对木霉菌素药敏实验影响：在含有10、100μg/mL木霉菌素的SDA板上，分别接种Tm菌株、CDR1缺失株T9-21和T4-12、CDR1基因回补株PNMNR6(5)和PNMG7(6)进行培养，每处理6个重复，培养6天。如图9所示，为本发明实验例2的CDR1基因影响木霉菌素药敏结果，在培养6天，木霉菌素10、100μg/mL浓度作用下，与野生株对照相比，CDR1缺失株T9-21和T4-12被显著抑制，而CDR1基因回补后的菌株PNMNR6(5)和PNMG7(6)对于木霉菌素的敏感性降低。
实验例3动物皮肤攻毒和治疗实验
首先用Tm对兔皮肤进行攻毒，攻毒后发病明显的个体用于治疗试验，以1000μg/mL、20mg/mL木霉菌素进行涂抹治疗，每天涂抹1次，每次涂抹2mL，连续治疗3天，治疗14天后观察拍照。
如图10所示，为本发明实验例3的动物皮肤攻毒和治疗实验结果，经1000μg/mL木霉菌素涂抹治疗后，显著改善了Tm皮肤病创面的愈合效果，但是木霉菌素用量不宜过大，达到20mg/mL后可引起皮肤毒性损伤。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序 列 表
<110> 浙江省农业科学院
<120> 一种木霉菌素的用途
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1240
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagtattgca gagacaaccc ttagcggaag tcctctacag tgctgggaca acagcactag 60
aggccttgac agtgccaatg cccttgaatt tgtcaaatca ctccgcctgt ctactaaata 120
ctcgggaacc actgccatcg ttgccatcta ccaggccggt caagcaatct acgacatctt 180
cgacaaagcg gttgttctat acgagggaca tcagatctac tttggaaatg ctgtccgagc 240
aaaagaatac tttatcgaga tgggttttga ctgtcctagc cgacagacca ctgctgattt 300
cttaacttcg gtcaccagtc cgtccgaacg gagagtcagg cctggctacg agtctcgtgt 360
accccagaca ccggctgagt ttgctcagcg atggaaagaa agtgaagaca gacgaattct 420
catgcaggag attgatgaat acaataagac ctacccgcta catggcgaac agctacagaa 480
attccaggcc tctcggtcag ctgaaaagtc taggtcagcc agcaagtcct cgccgtatac 540
cctctcttac cccatggaga tcaaactttg catgtggcgt ggattccaga gactgaaggg 600
agacatgtcc atgactctga cctccataat tggaaacatc gccatgtccc tgatcattgc 660
cagtgtgttc tataaccagc aagaaaccac tgacagcttt ttctcccgtg gctctctcct 720
tttctttgcc attctcatga acgcctttgc tagttccctg gaaattttga ccctctggca 780
tcaacggccc atcgtggaaa aacatgataa atacgctcta tatcatccat cctccgaagc 840
catcagttct atacttgtcg atatgcctgc aaaattggcc gtggccatcg tgtttaatct 900
gatcatatat tttatgacca acctaaggag aacccccggt cacttctttg tctttttcct 960
cttctccttc accacgaccc tgaccatgtc taacgtcttc cgttccattg ctgccgtgtc 1020
tcgtacctta tcccaagctt tggtccctac ctcaatcttt atgcttgcct tggttatcta 1080
cactggtttt accattccag ttcgtgatat gcgaccctgg ttcaagtgga tcagttacat 1140
caaccccatt cagtacgcgt ttgagtctct catgatcaac gagttccatg accgagaatt 1200
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<210> 2
<211> 1091
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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tgccatcggc ttgtattggc ttctccgtgt ccccaaaagg aaatctggcg tgaagcaggg 1080
acagcagcca c 1091

Claims (10)

1.一种木霉菌素的用途，其特征在于，该木霉菌素用于作为制备治疗由须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)引起的皮肤病的药物。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述木霉菌素为源于木霉属真菌的代谢产物，优选的，源于紫杉木霉菌株ZJUF0986。
3.根据权利要求1所述的木霉菌素的用途，其特征在于，所述的木霉菌素浓度等于或大于10μg/mL且小于20mg/mL。
4.根据权利要求1所述的木霉菌素的用途，其特征在于，所述的木霉菌素抑制须癣毛癣菌的菌落生长。
5.根据权利要求4所述的木霉菌素的用途，其特征在于，所述木霉菌素的浓度等于或大于10μg/mL，对须癣毛癣菌菌落生长抑制率为等于或大于18％。
6.根据权利要求4所述的木霉菌素的用途，其特征在于，所述木霉菌素的浓度为等于或大于1000μg/mL，对须癣毛癣菌菌落生长完全抑制。
7.根据权利要求1所述的木霉菌素的用途，其特征在于，所述的木霉菌素抑制须癣毛癣菌的孢子萌发。
8.根据权利要求7所述的木霉菌素的用途，其特征在于，所述木霉菌素的浓度等于或大于10μg/mL，对须癣毛癣菌孢子萌发抑制率为等于或大于69％。
9.根据权利要求7所述的木霉菌素的用途，其特征在于，所述木霉菌素的浓度为等于或大于100μg/mL，对须癣毛癣菌孢子萌发抑制率为等于或大于91％。
10.一种调控木霉菌素对须癣毛癣菌作用的方法，其特征在于，该方法包含：
通过下调CDR1基因的表达或者敲除CDR1基因，使得木霉菌素抑制须癣毛癣菌的作用增强。
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