CN101168758A - 木霉菌酯素的提纯方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种木霉菌酯素的提纯方法，包括以下步骤：1)选用保存编号为CGMCC1672的紫杉木霉菌株ZJUF0986发酵后所得的发酵液；2)在上述发酵液中加入助滤剂或絮凝剂搅拌后静止沉淀蛋白，取上清液离心以除去沉淀；3)将上述离心处理后的上清液进行萃取、分离，得水相A和有机相A；4)在有机相A中加入干燥剂进行干燥，过滤后减压旋转蒸发，得淡黄色粗提物；5)将淡黄色粗提物进行萃取、分离，得水相B和有机相B；6)有机相B中加入干燥剂进行干燥，过滤后减压旋转蒸发，得无色重提物。使用本发明的方法提纯木霉菌酯素简单、高效且回收率高。

Description

木霉菌酯素的提纯方法

技术领域

本发明属生物工程技术领域，涉及到微生物发酵液的分离技术，特别涉及到一种南方红豆杉内生真菌紫杉木霉次生代谢产物木霉菌酯素的提取及纯化方法。

背景技术

由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起的纹枯病和立枯病、由灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)引起的灰霉病是农业生产中的重要病害，目前生产上主要靠农业防治和化学防治控制其危害，如灰霉病化学防治主要依赖施佳乐、速克灵等化学药剂。由于抗药性问题等，从天然动植物、微生物中寻找新型生物活性物质，并进行新型生物农药的研究开发是现代农药工业的一个重要研究领域。从南方红豆杉分离得到的内生真菌菌株ZJUF0986(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存编号：CGMCC1672)属于一种木霉属新种：紫杉木霉，其产生的新结构化合物木霉菌酯素(trichodermisin)对重要植物病原真菌立枯丝核菌和灰葡萄孢菌有很强的抑制作用(申请号200610050963.5)。研究设计一种高效提取及纯化木霉菌酯素的方法，是研究木霉菌酯素的理化特性及解决木霉菌酯素的生产工艺参数的改进及产品质量控制的关键问题之一。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种简单、高效且回收率高的木霉菌酯素的提纯方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种木霉菌酯素的提纯方法，包括以下步骤：

1)、选用保存编号为CGMCC1672的紫杉木霉菌株ZJUF0986发酵后所得的发酵液；

2)、在上述发酵液中加入助滤剂或絮凝剂搅拌后静止沉淀蛋白，取上清液离心以除去沉淀；

3)、将上述离心处理后的上清液以低极性有机溶剂为萃取剂进行振荡，静止后分离，得水相A和有机相A；

4)、在有机相A中加入干燥剂进行干燥，过滤后减压旋转蒸发，得淡黄色粗提物；

5)、将淡黄色粗提物用低极性有机溶剂溶解，然后再以去离子水为萃取剂进行振荡，静止后分离，得水相B和有机相B；

6)、在有机相B中加入干燥剂进行干燥，过滤后减压旋转蒸发，得无色重提物。

作为本发明的木霉菌酯素的提纯方法的改进：将上述无色重提物用氯仿溶解，过硅胶柱纯化，辅以包括高效薄层层析及活性追踪的办法获得木霉菌酯素的纯品。

作为本发明的木霉菌酯素的提纯方法的进一步改进：步骤2)中的助滤剂或絮凝剂的用量是发酵液重量的0.1％～1.0％；搅拌后静止12～24小时沉淀蛋白，离心条件为：5000～10000rmp/min，室温下离心5～10min。

作为本发明的木霉菌酯素的提纯方法的进一步改进：步骤3)中，室温条件下以低极性有机溶剂为萃取剂分1～5次进行萃取，所述离心后的上清液与低极性有机溶剂的体积比为1∶0.5～2；每次萃取中：振荡时间为5～10min，静止时间为1～5小时。

作为本发明的木霉菌酯素的提纯方法的进一步改进：步骤4)中干燥剂的用量为有机相A重量的5％～10％；步骤6)中干燥剂的用量为有机相B重量的5％～10％；步骤4)和步骤6)均为用滤纸过滤后，在负压0.08MPa、50℃的条件下旋转蒸发浓缩，以回收有机溶剂。

作为本发明的木霉菌酯素的提纯方法的进一步改进：步骤5)中，首先将淡黄色粗提物在10～50℃的温度下用低极性有机溶剂溶解；然后在室温条件下以去离子水为萃取剂分1～5次进行萃取，去离子水的用量是淡黄色粗提物体积的100～500倍；每次萃取中：振荡时间为5～10min，静止时间为1～5小时。

作为本发明的木霉菌酯素的提纯方法的进一步改进：助滤剂可选用硅藻土助滤剂、珍珠岩助滤剂或粘胶棉助滤剂，絮凝剂可选用硫酸铝钾、聚合硫酸铝铁、甲壳素或高分子聚壳糖。低极性有机溶剂可选用石油醚(60～90)、或石油醚(30～60)或乙酸乙酯。干燥剂可选用无水硫酸钠、无水碳酸钾或无水硫酸钠。

作为本发明的木霉菌酯素的提纯方法的进一步改进：硅胶柱为直径4cm、长为50cm的玻璃柱；无色重提物用氯仿溶解后拌入层析硅胶，用干法上样；将层析硅胶活化后与氯仿混匀，并用超声波赶除气泡后湿法装柱；平衡后，放出氯仿至硅胶柱上表面，按极性从小到大顺序，选择不同梯度的氯仿/甲醇作洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液；分别将各单位洗脱液浓缩后配制成甲醇溶液，采用高效薄层层析色谱追踪斑点，选择最优化展开剂系统，以254nm及365nm的紫外光照射或碘蒸汽显迹，同时以终极腐霉、立枯丝核菌、灰葡萄孢为指示菌，用滤纸片法进行活性追踪；最终获得木霉菌酯素的纯品。

将本发明的木霉菌酯素的提纯方法用于提纯南方红豆杉内生真菌紫杉木霉次生代谢产物，具有以下优点：

1、所用溶剂无毒无害、消耗量少、对环境不造成污染；

2、紫杉木霉发酵液中木霉菌酯素提取率可达到98.95％；纯化后总回收率达到85％，纯度在99.5％以上。

在本发明中，所选用的保存编号为CGMCC1672的紫杉木霉菌株ZJUF0986发酵后所得的发酵液，其发酵工艺及步骤同本申请人同一天递交的另一篇专利《发酵生产木霉菌酯素的方法及所用的发酵培养基》。具体内容如下：

1、制作发酵培养基：

将葡萄糖、淀粉、蛋白胨、硫酸镁、硝酸钠、磷酸氢二铵和氯化钾溶于水形成混合液，葡萄糖、淀粉、蛋白胨、硫酸镁、硝酸钠、磷酸氢二铵和氯化钾在混合液中的浓度分别是16.0g/L、25.8g/L、2.0g/L、1.0g/L、0.5g/L、2.0g/L和0.5g/L。

即所得的发酵培养基的组成为：葡萄糖16.0g/L、淀粉25.8g/L、蛋白胨2.0g/L、硫酸镁1.0g/L、硝酸钠0.5g/L、磷酸氢二铵2.0g/L和氯化钾0.5g/L，其余为水。

2、一种发酵生产木霉菌酯素的方法，依次进行以下步骤：

1)、先将低温(即-20℃)保存的编号为CGMCC1672的紫杉木霉菌株ZJUF0986接种在PDA培养基上，于28℃～30℃活化培养5天，活化处理后，用打孔器切取菌落边缘菌饼；

2)、将上述直径为5mm的菌饼10粒接入到内装液体种子培养基的1000mL三角瓶中(1000mL的三角瓶装200mL液体种子培养基)，28℃～30℃、180r/min避光培养72小时，得种子液。液体种子培养基组成：葡萄糖20.0g/L、淀粉15.0g/L、蛋白胨2.0g/L、尿素0.5g/L、硫酸镁1.0g/L、硝酸钠0.5g/L、磷酸氢二铵2.0g/L、氯化钾0.5g/L、碳酸钙0.4g/L，其余为水。

3)、选用10升机械通气发酵罐(FJG-10，江苏格瑞生物技术有限公司)作为发酵罐，选用上述发酵培养基。

将上述步骤2)所得的种子液以发酵培养基10％(体积比)的比例接入内装发酵培养基的发酵罐中，依次进行以下发酵步骤(在整个发酵过程中罐压控制在0.03MPa～0.05MPa之间，培养时间共为240小时)：

初期：温度控制在28℃～30℃，通入空气进行搅拌，通气比：1∶0.5V/V/min，搅拌转速为200r/min，pH自然调节；培养时间为120小时，

中期：将温度降低到25℃，提高通气比，使通气比为：1∶1V/V/min，当还原糖浓度降到10g/L左右、溶解氧(DO)开始缓慢上升时补加质量浓度为20％的淀粉溶液，一次性补加量为淀粉溶液中的淀粉是发酵培养基中的淀粉重量的30％，用氢氧化钠人工调节的方式来控制发酵罐中的PH值为5.0～6.0，培养时间为48小时；

后期：温度保持在25℃，停止补加碳源，降低通气比，使通气比为1∶0.5V/V/min；当还原糖降到1g/L以下时，镜检发现菌丝开始自溶，形成节孢子后将所得的发酵液放罐；培养时间为72小时。

在本发明中，所用的高效液相色谱检测方法，同本申请人同一天递交的另一篇专利《木霉菌酯素的测定方法及用途》。具体内容如下：

1、色谱条件

1)、Waters C18分析柱(sunfire C18 5μm 4.6×250mm)

2)、Waters的二元高压梯度泵(1525 binary HPLC pump)

3)、Waters 2487检测器(Waters 2487 DualλAbsorbance Detector)

4)、77251手动进样器(KIT 72251 Manual injector 1500 series)

5)、流动相为乙腈∶水＝3∶2(V∶V)

6)、流速0.8mL/min～1.2mL/min，例如为1.0mL/min

7)、进样量20μL

8)、检测波长为193nm

9)、温度：室温

2、所用仪器设备

1)、Waters液相色谱仪，配Waters的二元高压梯度泵(1525 binary HPLC pump)、Waters2487检测器(Waters 2487 DualλAbsorbance Detector)、77251手动进样器(KIT72251 Manual injector 1500 series)

2)、色谱工作站：Breeze

3)、高速台式离心机：Sigma 1-15K

4)、电子天平：METTLER AB204-E

5)、旋转蒸发器：RE-52AA

6)、PH测定仪：METTLER TOLEDO 320

3、所用试剂

1)、乙腈：HPLC美国Weston Scientific

2)、水：三蒸水(自制)

3)、其它所用试剂均为国产分析纯。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1提取纯化木霉菌酯素的技术路线流程图；

图2紫杉木霉发酵液的高效液相色谱检测图谱；

图3紫杉木霉发酵液石油醚萃余液的高效液相色谱检测图谱；

图4初提获得的淡黄色粘稠状物的高效液相色谱检测图谱；

图5重提获得无色粘稠状物的高效液相色谱检测图谱；

图6纯化获得的木霉菌酯素纯品的高效液相色谱检测图谱。

具体实施方式

实施例1、一种木霉菌酯素的提纯方法，依次进行以下步骤(其流程图如图1所示)：

1)、选用保存编号为CGMCC1672的紫杉木霉菌株ZJUF0986发酵后所得的发酵液；用高效液相色谱进行检测，结果如图2所示。

2)、在上述发酵液中加入硫酸铝钾搅拌后静止12～24小时沉淀蛋白，硫酸铝钾用量是发酵液重量的0.5％；然后取上清液离心以除去沉淀，离心条件为：5000～10000rmp/min，室温下离心5～10min。

3)、取用1000mL上述离心处理后的上清液，以石油醚(60～90)为萃取剂；在室温条件下将离心处理后的上清液用石油醚(60～90)分三次进行萃取，每次萃取时：石油醚(60～90)的用量是300mL，振荡时间为10min，静止时间为2小时；静止后分离，得水相A和有机相A。

4)、在有机相A中加入无水硫酸钠进行干燥，无水硫酸钠的重量是有机相A的7％；再用滤纸过滤后，在负压0.08MPa、50℃的条件下旋转蒸发浓缩，以回收有机溶剂石油醚。得1.25g淡黄色粗提物。该淡黄色粗提物用高效液相色谱进行检测，结果如图4所示。

同时将步骤3)所得的水相A在80℃/-0.08Mpa的条件下进行蒸发，回收萃取剂后定容至100mL，用高效液相色谱进行检测，结果如图3所示。

通过图2、图3及图4这三张高效液相检测图谱可知，发酵液经石油醚萃取后木霉菌酯素的残留量已极微，提取效率达到98.95％，表明石油醚已完全萃取发酵滤液中的木霉菌酯素。

5)、首先将淡黄色粗提物在10～50℃的温度下用石油醚(60～90)溶解，淡黄色粗提物与石油醚(60～90)的体积比为1∶100；然后在室温条件下以去离子水为萃取剂，去离子水总的用量为淡黄色粗提物体积的315倍，平均分成3次进行萃取，每次萃取中：振荡时间为10min，静止时间为2小时。静止后分离，得水相B和有机相B；

6)、在有机相B中加入有机相B10％重量比的无水硫酸钠干燥；然后用滤纸过滤后，在负压0.08MPa、50℃的条件下旋转蒸发浓缩，回收有机溶剂石油醚，重提得1.08g无色重提物。

图5为重提获得的无色粘稠状物(即无色重提物)的高效液相色谱检测图谱，从分析结果来看，无色重提物的主成份木霉菌酯素含量达到98％左右。

7)、为获得纯品，将无色重提物过硅胶柱再纯化。具体操作如下：将200～300目的层析硅胶(青岛海洋化工集团)置于120℃活化1h，称取约200g活化后的硅胶与500mL的氯仿混匀，并用超声波赶除汽泡后湿法装入直径4cm、长为50cm的玻璃柱。将1.08g无色重提物用5mL～10mL氯仿溶解后拌入200～300目的层析硅胶(不呈油渍状为宜)，待溶剂挥干后上样。平衡2h后，放出氯仿至硅胶柱上表面，按极性从小到大顺序，选择不同梯度的氯仿/甲醇(1/0～1.0)作洗脱剂进行洗脱，50mL为单位进行洗脱液收集，收得40份洗脱液。分别将各单位洗脱液浓缩后配制成甲醇溶液，采用高效薄层层析色谱(TLC)追踪斑点，选择最优化展开剂系统，以紫外光(254nm及365nm)照射或碘蒸汽显迹，同时以终极腐霉、水稻纹枯病菌、灰葡萄孢为指示菌，用滤纸片法进行活性追踪。

纯品木霉菌酯素为氯仿/甲醇为1/0.2的组份，浓缩后用高效液相色谱(HPLC)进行检测，保留时间在11.4min左右的就是本发明所述方法提取纯化后所获得的木霉菌酯素(如图6所示)，经硅胶柱纯化后共获得纯品木霉菌酯素0.836g，纯度可达到99.5％以上，以紫杉木霉发酵滤液中木霉菌酯素的含量来计算，总回收效率达到85％。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种木霉菌酯素的提纯方法，其特征在于包括以下步骤：

1)、选用保存编号为CGMCC1672的紫杉木霉菌株ZJUF0986发酵后所得的发酵液；

2)、在上述发酵液中加入助滤剂或絮凝剂搅拌后静止沉淀蛋白，取上清液离心以除去沉淀；

3)、将上述离心处理后的上清液以低极性有机溶剂为萃取剂进行振荡，静止后分离，得水相A和有机相A；

4)、在有机相A中加入干燥剂进行干燥，过滤后减压旋转蒸发，得淡黄色粗提物；

5)、将淡黄色粗提物用低极性有机溶剂溶解，然后再以去离子水为萃取剂进行振荡，静止后分离，得水相B和有机相B；

6)、在有机相B中加入干燥剂进行干燥，过滤后减压旋转蒸发，得无色重提物。

2.根据权利要求1所述的木霉菌酯素的提纯方法，其特征在于：将上述无色重提物用氯仿溶解，过硅胶柱纯化，辅以包括高效薄层层析及活性追踪的办法获得木霉菌酯素的纯品。

3.根据权力要求1或2所述的木霉菌酯素的提纯方法，其特征在于：所述步骤2)中的助滤剂或絮凝剂的用量是发酵液重量的0.1％～1.0％；搅拌后静止12～24小时沉淀蛋白，离心条件为：5000～10000rmp/min，室温下离心5～10min。

4.根据权力要求3所述的木霉菌酯素的提纯方法，其特征在于：所述步骤3)中，室温条件下以低极性有机溶剂为萃取剂分1～5次进行萃取，所述离心后的上清液与低极性有机溶剂的体积比为1∶0.5～2；每次萃取中：振荡时间为5～10min，静止时间为1～5小时。

5.根据权力要求4所述的木霉菌酯素的提纯方法，其特征在于：步骤4)中干燥剂的用量为有机相A重量的5％～10％；步骤6)中干燥剂的用量为有机相B重量的5％～10％；步骤4)和步骤6)均为用滤纸过滤后，在负压0.08MPa、50℃的条件下旋转蒸发浓缩，以回收有机溶剂。

6.根据权力要求5所述的木霉菌酯素的提纯方法，其特征在于：所述步骤5)中，首先将淡黄色粗提物在10～50℃的温度下用低极性有机溶剂溶解；然后在室温条件下以去离子水为萃取剂分1～5次进行萃取，去离子水的用量是淡黄色粗提物体积的100～500倍；每次萃取中：振荡时间为5～10min，静止时间为1～5小时。

7.根据权力要求6所述的木霉菌酯素的提纯方法，其特征在于：所述助滤剂为硅藻土助滤剂、珍珠岩助滤剂或粘胶棉助滤剂，所述絮凝剂为硫酸铝钾、聚合硫酸铝铁、甲壳素或高分子聚壳糖。

8.根据权力要求7所述的木霉菌酯素的提纯方法，其特征在于：所述低极性有机溶剂为石油醚(60～90)、或石油醚(30～60)或乙酸乙酯。

9.根据权力要求8所述的木霉菌酯素的提纯方法，其特征在于：所述干燥剂为无水硫酸钠、无水碳酸钾或无水硫酸钠。

10.根据权力要求9所述的木霉菌酯素的提纯方法，其特征在于：所述硅胶柱为直径4cm、长为50cm的玻璃柱；无色重提物用氯仿溶解后拌入层析硅胶，用干法上样；将层析硅胶活化后与氯仿混匀，并用超声波赶除气泡后湿法装柱；平衡后，放出氯仿至硅胶柱上表面，按极性从小到大顺序，选择不同梯度的氯仿/甲醇作洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液；分别将各单位洗脱液浓缩后配制成甲醇溶液，采用高效薄层层析色谱追踪斑点，选择最优化展开剂系统，以254nm及365nm的紫外光照射或碘蒸汽显迹，同时以终极腐霉、立枯丝核菌、灰葡萄孢为指示菌，用滤纸片法进行活性追踪；最终获得木霉菌酯素的纯品。

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