CN101580879A - 检测结核杆菌耐药基因膜芯片 - Google Patents
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Abstract
一种检测结核杆菌耐药基因膜芯片，是针对结核杆菌rpoB、kagG、embB、inhA、ahpC、gyrA、rrs、rpsL、pncA基因的突变位点，设计54个探针点样于尼龙膜上而构成，利用5’端带有生物素标记的12对特异引物，将样品DNA经三重PCR，扩增出大量带生物素的基因片段产物，扩增产物与膜芯片上的探针进行特异性杂交，再经过洗膜，酶联和显色反应即可。所述基因膜芯片及其检测方法，能够一次性检测结核杆菌对异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、喹诺酮类药物耐药的常见基因突变，适用于体外检测痰样、临床分离株以及组织样本中结核杆菌耐多药基因。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因膜芯片及其检测方法，特别是一种检测结核杆菌耐多药的基因型膜芯片。可适用于体外检测痰样、临床分离株以及组织样本中结核杆菌耐多药基因。
背景技术
目前，对结核分枝杆菌耐药分子机制的研究主要集中于各种抗结核药物的作用靶位及其相关基因的突变。现在已经发现的结核杆菌基因突变的类型主要是点突变，其实质是一个基因内部的一个或几个核苷酸的插人、缺失或取代，致使错误的核苷酸密码翻译出错误的氨基酸顺序，导致结核杆菌对抗结核药物产生耐受。现已确定耐药的抗结核药物主要是异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素、吡嗪酰胺、喹诺酮类等，并已证明结核分枝杆菌的耐药性分别与katG、inhA、ahpC、rpoB、embABC、rpsL、rrs、pncA、gyrAB等基因突变有关。在现阶段，我国各医院广泛采用痰培养加药物敏感性试验来检测结核杆菌的耐药性，即先培养出结核杆菌，再给予抗结核药物，并观察药物抑菌效果。该法的检测结果可靠，但最大不足之处是培养条件要求高，结核杆菌生长缓慢，往往需要6～8周；同时痰培养检出率低，仅为30％左右，故药敏试验的检出率也仅有30％左右，不能满足临床检测的需求。
发明内容
本发明目的在于提供一种检测结核杆菌耐药基因膜芯片，它能够一次性检测引起结核杆菌对异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、喹诺酮类药物耐药的常见的基因突变，是一种灵敏、特异、高效和实用的结核杆菌耐多药基因检测的方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案是：提供一种检测结核杆菌耐药基因膜芯片，所述膜芯片针对常见结核杆菌rpoB、katG、embB、inhA、ahpC、gyrA、rrs、rpsL、pncA基因的突变位点，设计54个检测探针，将探针点样于尼龙膜上构建成膜芯片，每一个被检测样本的DNA分4个反应管，每管加入三对不同的引物，共12对引物是分别针对结核杆菌rpoB、katG、embB、inhA、ahpC、gyrA、rrs、rpsL、pncA基因特异设计的，其中每对引物中的下游引物5’端均带有生物素标记，在同一PCR条件下4个反应管同时经三重PCR，扩增出大量带有生物素的结核杆菌相应的基因片段产物，将扩增产物与膜芯片上的探针进行特异性杂交，杂交后带有生物素的目标基因与探针牢牢的结合在一块，洗去未结合的扩增基因片段，再进行酶联和显色反应即可用肉眼判断结果。
所述54个检测探针中52个为结核杆菌检测探针，2个为质控探针。
所述52个结核杆菌检测探针中，包括14个检测结核杆菌耐异烟肼的探针，分别命名为kaN1、kaN2、ka315M、inN1、inN2、inN3、inN4、inN5、inN6、in-15M、in94M、ahN1、ahN2、ah-15M，其探针序列(5’→3’)分别为：
TTTTTTTTTAAGACCCATGGCGCCGGC
TTTTTTTTTTGCGATCACCAGCGGCATC
TTTTTTTTTTGCGATCACCAMCGGCATC
TTTTTTTTTTCGCGGCGAGACGATAGGT
TTTTTTTTATCATCACCGACTCGTCGATC
TTTTTTTTTGATTCAGCGCATCACCGACC
TTTTTTTTTGGTGCTCACCGGGTTCGAC
TTTTTTTTGTGGTGCATTCGATTGGGTTC
TTTTTTTTGGATGGGCATCAACCCGTTCT
TTTTTTTTTTCGCGGCGAGATGATAGGT
TTTTTTTTGTGGTGCATGCGATTGGGTTC
TTGGTGTGATATATCACCTTTGCCTGACAG
TTTTTTTTACTTCACGGCACGATGGAATGT
TTTTTTTTACTTCATGGCACGATGGAATGT
所述52个结核杆菌检测探针中，包括11个检测结核杆菌耐利福平的探针，分别命名为rpN1、rpN2、rpN3、rpN4、rpN5、rpN6、rp516M、rp526M1、rp526M2、rp531M1、rp531M2，其探针序列(5’→3’)分别为：
TTTTTTTTGCCGCGATCAAGGAGTTCTTC
TTTTTTTTGGCACCAGCCAGCTGAGCCAA
TTTTTTTTCATGGACCAGAACAACCCGCTG
TTTTTTTTTCTGTCGGGGTTGACCCACAAG
TTTTTTTTTTTTTCCGACTGTCGGCGCTGG
TTTTTTTTTACGCGCGGGTCAACCCGTT
TTTTTTTTTCATGGKCCAGAACAACCCGCT
TTTTTTTTCTGTCGGGGTTGACCTACAAGC
TTTTTTTTCTGTCGGGGTTGACCGACAAG
TTTTTTTTTTTTGCCGACTGTTGGCGCTGG
TTTTTTTTCGCCGACTGTGGGCGCTG
所述52个结核杆菌检测探针中，包括7个检测结核杆菌耐链霉素的探针，分别命名为rlN1、rlN2、rl43M、rl88M、rrN1、rrN2、rrN3，其探针序列(5’→3’)分别为：
TTTTTCCACCACTCCGAAGAAGCCGAACTC
TTTTTTTTGTGAAGGACCTGCCTGGTGTG
TTTTTCCACCACTCCGAGGAAGCCGAACTC
TTTTTTTTGTGAGGGACCTGCCTGGTGTG
TTTTTGGAGAAGAAGCACCGGCCAACTACG
TTTTTTTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACG
TTTTTTCTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCG
所述52个结核杆菌检测探针中，包括6个检测结核杆菌耐乙胺丁醇的探针，分别命名为emN1，emN2，emN3，em306M1，em306M2，em306M3，其探针序列(5’→3’)分别为：
GGCATGGCCCGAGTCGCCTTTTTTTT
TTTTTTTTGCCGGCTACATGTCCAACTAT
TTTTTTTTGAGGATCCCTTCGGCTGGTAT
GGCSTGGCCCGAGTCGCCTTTTTTTT
GGCATWGCCCGAGTCGCCGTTTTTTTT
GGCATCGCCCGAGTCGCCTTTTTTTT
所述52个结核杆菌检测探针中，包括12个检测结核杆菌耐吡嗪酰胺的探针，分别命名为pnN1，pnN2，pnN3，pnN4，pnN5，pnN6，pnN7，pnN8，pnN9，pnN1O，pn12M，pn85M，其探针序列(5’→3’)分别为：
TTTTTTTTGAACGTATGGTGGACGTATGC
TTTTTTTTGACGTGCAGAACGACTTCTGC
TTTTTTTTTGGCAACCAAGGACTTCCACA
TTTTTTTTTCGACCCGGGTGACCACTTCT
TTTTTTTTGACTATTCCTCGTCGTGGCCA
TTTTTTTTGCATTGCGTCAGCGGTACTCC
TTTTTTTTGACTTCCATCCCAGTCTGGAC
TTTTTTTTGTGGTCGGTATTGCCACCGAT
TTTTTTTTCATTGTGTGCGCCAGACGGCC
TTTTTTTTAGGGTGCTGGTGGACCTGACA
TTTTTTTTGACGTGCAGAACGCCTTCTGC
TTTTTTTTGACTTCCATCCCAGTCGGGAC
所述52个结核杆菌检测探针中，包括2个检测结核杆菌耐喹诺酮类的探针，分别命名为gyN1，gyN2，其探针序列(5’→3’)分别为TTTTTTTTCCCGCACGGCGACGCGTCGA，TTTTTTTCGATCTACGACAGCCTGGTGCGC。
所述2个质控探针分别为质控探针P和N，其探针序列(5’→3’)分别为BIO’+CGCAGCGAGAGGTCAGTGG，TTTTTTTGTCCGAGCCGAGCATACGAG。
所述将探针点样于尼龙膜上构建成膜芯片，是将54个探针，共分四行14例排列固定于尼龙膜上，其中第1行1-14列排列的探针分别为
kaN1，kaN2，inN1，inN2，inN3，inN4，inN5，inN6，ahN1，ahN2，rpN1，rpN2，rpN3，第2行1-14列排列的探针分别为rpN4，rpN5，rpN6，rlN1，rlN2，rrN1，rrN2，rrN3，emN1，emN2，emN3，pnN1，pnN2，pnN3，第3行1-14列排列的探针分别为pnN4，pnN5，pnN6，pnN7，pnN8，pnN9，pnN10，gyN1，gyN2，ka315M，in-15M，in94M，ah-15M，rp516M，第4行1-14列排列的探针分别为rp526M1，rp526M2，rp531M1，rp531M2，rl43M，rl88M，em306M1，em306M2，em306M3，pn12M，pn85M，
其中：
代表质控探针中的阳性对照探针P，
N代表野生型检测探针，
M代表突变型检测探针。
所述12对引物的序列(5’→3’)如下：
扩增katG基因上游引物P1序列为：TCGGCGGTCACACTTTCGGTA，下游引物P2序列为：BIO’+CGCAGCGAGAGGTCAGTGG。
扩增inhA基因片段1的上游引物P1序列为：CGGAAATCGCAGCCACGTTA，下游引物P2序列为：BIO’+CAGGACTGAACGGGATACGAA。；
扩增inhA基因片段2上游引物P1序列为：GCCACTGACACAACACAAGGA，下游引物P2序列为：BIO’+ACGAATACGCCGAGATGTGGA。
扩增OxyR-ahpC基因上游引物P1序列为：GCTTGCGGCACTGCTGAAC，下游引物P2序列为：BIO’+CACCACCCGCCACTTGCCT。
扩增rpoB基因上游引物P1序列为：GGAGCGGATGACCACCCAGGAC，下游引物P2序列为：BIO’+CGTCGGCGGTCAGGTACAC。
扩增embB基因上游引物P1序列为：CGCACCTTCACCCTGACCGAC，下游引物P2序列为：BIO’+ATCAGCGCCAGCAGGTTGTA。
扩增rpsL基因上游引物P1序列为：TCGTCGGGACAAGATCAGTAA，下游引物P2序列为：BIO’+CTTGACACCCTGCGTATCCA。
扩增rrs基因片段1的上游引物P1序列为：ACGAAGGTCCGGGTTCTCTC，下游引物P2序列为：BIO’+GCATTCCACCGCTACACCA。
扩增rrs基因片段2上游引物P1序列为：AGGCGGGTCTCTGGGCAGTAA，下游引物P2序列为：BIO’+TGCACACAGGCCACAAGGGAA。
扩增pncA基因片段1的上游引物P1序列为：GTCGCCCGAACGTATGGTG，下游引物P2序列为：BIO’+CGAAGCCGCTGTACGCTCC。
扩增pncA基因片段2上游引物P1序列为：CGACGAGAACGGCACGCCACT，下游引物P2序列为：BIO’+GCTGCAAACCAACTCGACGCT。
扩增gyrA基因上游引物P1序列为：ACCGCAGCCACGCCAAGTC，下游引物P2序列为：BIO’+CGGGCTTCGGTGTACCTCATC。
本发明的突出优点在于：
1、灵敏度高，采用PCR技术，数量极少的结核杆菌基因被成几何倍数扩增出来，从而达到检测的目的。
2、特异性好，扩增的特异性以及膜芯片探针杂交的特异性，决定了本方法具有准确性高、特异性好的优点，克服了单纯PCR带来的假阳性的问题。
3、简便高效。可一次性检测引起结核杆菌对异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、喹诺酮类药物耐药的常见的基因突变。
2、经济实用。使用普通设备，检测结果直观容易判断，使得本方法可在基层广泛应用。
附图说明
图1为结核杆菌敏感株的膜芯片检测结果。
图2为结核杆菌利福平耐药(531位点突变)膜芯片检测结果。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
1.检测使用的膜芯片宽2cm，长6.5cm。
2.检测所需设备：PCR仪、摇床、杂交炉、恒温水浴箱。
3.所需试剂：
20×SSC液：NaCl 175.3g，柠檬酸钠88.2g，溶于900ml水中调节pH至7.0，加水定容至1L，高温高压灭菌。
10％SDS：在900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加几滴浓盐酸，调节pH至7.2，加水定容至1L。
A液(2×SSC，0.1％SDS，pH7.4)，高温高压灭菌。
B液(0.5×SSC，0.1％SDS，pH7.4)，高温高压灭菌。
C液(0.1M柠檬酸钠，pH5.4)，高温高压灭菌。
四甲基联苯胺(TMB)
3％双氧水
4.操作步骤：
(1)三重PCR
①提取待检测样品(临床分离株，痰样或痰培养洗涤液)的结核杆菌DNA样品分4管，每管4μl作为三重PCR反应的模板。
②三重PCR反应体系：所有引物的浓度均为10μM，dNTP各2.5mM，Taq酶为5U/μl。具体配制如表1所示(单位：μl)。
表1多重PCR反应体系列表
③按以下程序进行PCR反应：95℃预变性5min，94℃50s，60C45s，72℃50s，共计35个循环，72℃10min。
电泳实验检测PCR产物：取上述产物5μl，加1.5μl 6×Loading Buffer缓冲液，点样于溴化乙锭(EB)染色的2.0％琼脂糖凝胶上，电压120V，电泳35min，DNA Marker同时电泳。观察电泳结果，根据DNA Marker电泳的位置以及PCR产物电泳的位置来判断是否有相关产物。
(2)杂交
①清洗膜芯片：室温下用A液清洗膜芯片30秒。
②预杂交：约10ml A液加入到50ml离心管中，放入膜芯片，使膜芯片全部浸泡在液体中。每管1张膜芯片。55℃杂交炉(或水浴箱)15～30min。
③变性产物：PCR产物50μl置于98℃PCR仪上变性10min，再置于冰内3～5min。
④杂交：将保持单链状态的变性产物加入已预热的A液中，55℃4h。同时预热B液至55℃(每张膜芯片25ml)。
⑤洗膜：取出膜芯片，放入已预热的B液中，55℃洗膜10min。
⑥酶联：取出膜芯片，放入10ml POD溶液(5μl POD母液+10ml A液)中，置于摇床上，室温下轻摇45min。
⑦洗膜：取出膜芯片，置入A液25ml，室温下轻摇5min；重复洗一次；取出膜芯片再在C液25ml中室温下轻摇3min。
⑧显色反应：以下试剂新鲜配制并按以下顺序加入容器中：
19ml C液+1ml TMB+10μl 3％双氧水；
放入膜芯片，室温下避光显色15～30min。
⑨终止显色：膜芯片置于清水中(自来水即可)3～5min，终止显色。
(3)结果：质控点
呈现蓝紫色、
无显色时，即可判定杂交显色结果。
序列表
<110>广西医科大学
<120>检测结核杆菌耐多药基因膜芯片
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<170>PatentIn version 3.2
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<213>结核分枝杆菌(M.tuberculosis)
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ttttttttgt ggtcggtatt gccaccgat 29
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<212>DNA
<213>结核分枝杆菌(M.tuberculosis)
<400>47
ttttttttca ttgtgtgcgc cagacggcc 29
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<213>结核分枝杆菌(M.tuberculosis)
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ttttttttag ggtgctggtg gacctgaca 29
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cgcagcgaga ggtcagtgg 19
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tcggcggtca cactttcggta 21
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caccacccgc cacttgcct 19
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<213>结核分枝杆菌(M.tuberculosis)
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ggagcggatg accacccagg ac 22
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cgggcttcgg tgtacctcat c 21
Claims (4)
1、一种检测结核杆菌耐药基因膜芯片，其特征在于，针对常见结核杆菌rpoB、katG、embB、inhA、ahpC、gyrA、rrs、rpsL、pncA基因的突变位点，设计54个检测探针，将探针点样于尼龙膜上构建成膜芯片，每一个被检测样本的DNA分4个反应管，每管加入三对不同的引物，共12对引物是分别针对结核杆菌rpoB、katG、embB、inhA、ahpG、gyrA、rrs、rpsL、pncA基因特异设计的，其中每对引物中的下游引物5’端均带有生物素标记，在同一PCR条件下4个反应管同时经三重PCR，扩增出大量带有生物素的结核杆菌相应的基因片段产物，将扩增产物与膜芯片上的探针进行特异性杂交，杂交后带有生物素的目标基因与探针牢牢的结合在一块，洗去未结合的扩增基因片段，再进行酶联和显色反应即可用肉眼判断结果。
2、根据权利要求1所述检测结核杆菌耐药基因膜芯片，其特征在于，所述54个检测探针中52个为结核杆菌检测探针，2个为质控探针。
所述52个结核杆菌检测探针中，包括14个检测结核杆菌耐异烟肼的探针，分别命名为kaN1、kaN2、ka315M、inN1、inN2、inN3、inN4、inN5、inN6、in-15M、in94M、ahN1、ahN2、ah-15M，其探针序列(5’→3’)分别为：
TTTTTTTTTAAGACCCATGGCGCCGGC
TTTTTTTTTTGCGATCACCAGCGGCATC
TTTTTTTTTTGCGATCACCAMCGGCATC
TTTTTTTTTTCGCGGCGAGACGATAGGT
TTTTTTTTATCATCACCGACTCGTCGATC
TTTTTTTTTGATTCAGCGCATCACCGACC
TTTTTTTTTGGTGCTCACCGGGTTCGAC
TTTTTTTTGTGGTGCATTCGATTGGGTTC
TTTTTTTTGGATGGGCATCAACCCGTTCT
TTTTTTTTTTCGCGGCGAGATGATAGGT
TTTTTTTTGTGGTGCATGCGATTGGGTTC
TTGGTGTGATATATCACCTTTGCCTGACAG
TTTTTTTTACTTCACGGCACGATGGAATGT
TTTTTTTTACTTCATGGCACGATGGAATGT
所述52个结核杆菌检测探针中，包括11个检测结核杆菌耐利福平的探针，分别命名为rpN1、rpN2、rpN3、rpN4、rpN5、rpN6、rp516M、rp526M1、rp526M2、rp531M1、rp531M2，其探针序列(5’→3’)分别为：
TTTTTTTTGCCGCGATCAAGGAGTTCTTC
TTTTTTTTGGCACCAGCCAGCTGAGCCAA
TTTTTTTTCATGGACCAGAACAACCCGCTG
TTTTTTTTTCTGTCGGGGTTGACCCACAAG
TTTTTTTTTTTTTCCGACTGTCGGCGCTGG
TTTTTTTTTACGCGCGGGTCAACCCGTT
TTTTTTTTTCATGGKCCAGAACAACCCGCT
TTTTTTTTCTGTCGGGGTTGACCTACAAGC
TTTTTTTTCTGTCGGGGTTGACCGACAAG
TTTTTTTTTTTTGCCGACTGTTGGCGCTGG
TTTTTTTTCGCCGACTGTGGGCGCTG
所述52个结核杆菌检测探针中，包括7个检测结核杆菌耐链霉素的探针，分别命名为rlN1、rlN2、r143M、r188M、rrN1、rrN2、rrN3，其探针序列(5’→3’)分别为：
TTTTTCCACCACTCCGAAGAAGCCGAACTC
TTTTTTTTGTGAAGGACCTGCCTGGTGTG
TTTTTCCACCACTCCGAGGAAGCCGAACTC
TTTTTTTTGTGAGGGACCTGCCTGGTGTG
TTTTTGGAGAAGAAGCACCGGCCAACTACG
TTTTTTTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACG
TTTTTTCTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCG
所述52个结核杆菌检测探针中，包括6个检测结核杆菌耐乙胺丁醇的探针，分别命名为emN1，emN2，emN3，em306M1，em306M2，em306M3，其探针序列(5’→3’)分别为：
GGCATGGCCCGAGTCGCCTTTTTTTT
TTTTTTTTGCCGGCTACATGTCCAACTAT
TTTTTTTTGAGGATCCCTTCGGCTGGTAT
GGCSTGGCCCGAGTCGCCTTTTTTTT
GGCATWGCCCGAGTCGCCGTTTTTTTT
GGCATCGCCCGAGTCGCCTTTTTTTT
所述52个结核杆菌检测探针中，包括12个检测结核杆菌耐吡嗪酰胺的探针，分别命名为pnN1，pnN2，pnN3，pnN4，pnN5，pnN6，pnN7，pnN8，pnN9，pnN10，pn12M，pn85M，其探针序列(5’→3’)分别为：
TTTTTTTTGAACGTATGGTGGACGTATGC
TTTTTTTTGACGTGCAGAACGACTTCTGC
TTTTTTTTTGGCAACCAAGGACTTCCACA
TTTTTTTTTCGACCCGGGTGACCACTTCT
TTTTTTTTGACTATTCCTCGTCGTGGCCA
TTTTTTTTGCATTGCGTCAGCGGTACTCC
TTTTTTTTGACTTCCATCCCAGTCTGGAC
TTTTTTTTGTGGTCGGTATTGCCACCGAT
TTTTTTTTCATTGTGTGCGCCAGACGGCC
TTTTTTTTAGGGTGCTGGTGGACCTGACA
TTTTTTTTGACGTGCAGAACGCCTTCTGC
TTTTTTTTGACTTCCATCCCAGTCGGGAC
所述52个结核杆菌检测探针中，包括2个检测结核杆菌耐喹诺酮类的探针，分别命名为gyN1，gyN2，其探针序列(5’→3’)分别为TTTTTTTTCCCGCACGGCGACGCGTCGA，TTTTTTTCGATCTACGACAGCCTGGTGCGC。
所述2个质控探针分别为质控探针P和N，其探针序列(5’→3’)分别为BIO’+CGCAGCGAGAGGTCAGTGG，TTTTTTTGTCCGAGCCGAGCATACGAG。
3、根据权利要求1所述检测结核杆菌耐药基因膜芯片，其特征在于，所述将探针点样于尼龙膜上构建成膜芯片，是将54个探针，共分四行14例排列固定于尼龙膜上，其中第1行1-14列排列的探针分别为kaN1，kaN2，inN1，inN2，inN3，inN4，inN5，inN6，ahN1，ahN2，rpN1，rpN2，rpN3，第2行1-14列排列的探针分别为rpN4，rpN5，rpN6，rlN1，rlN2，rrN1，rrN2，rrN3，emN1，emN2，emN3，pnN1，pnN2，pnN3，第3行1-14列排列的探针分别为pnN4，pnN5，pnN6，pnN7，pnN8，pnN9，pnN10，gyN1，gyN2，ka315M，in-15M，in94M，ah-15M，rp516M，第4行1-14列排列的探针分别为rp526M1，rp526M2，rp531M1，rp531M2，rl43M，rl88M，em306M1，em306M2，em306M3，pn12M，pn85M，
其中：
代表质控探针中的阳性对照探针P，
N代表野生型检测探针，
M代表突变型检测探针。
4、根据权利要求1所述的检测结核杆菌耐药基因膜芯片，其特征在于，所述12对引物的序列(5’→3’)如下：
扩增katG基因上游引物P1序列为：TCGGCGGTCACACTTTCGGTA，下游引物P2序列为：BIO’+CGCAGCGAGAGGTCAGTGG。
扩增inhA基因片段1的上游引物P1序列为：CGGAAATCGCAGCCACGTTA，下游引物P2序列为：BIO’+CAGGACTGAACGGGATACGAA。；
扩增inhA基因片段2上游引物P1序列为：GCCACTGACACAACACAAGGA，下游引物P2序列为：BIO’+ACGAATACGCCGAGATGTGGA。
扩增OxyR-ahpC基因上游引物P1序列为：GCTTGCGGCACTGCTGAAC，下游引物P2序列为：BIO’+CACCACCCGCCACTTGCCT。
扩增rpoB基因上游引物P1序列为：GGAGCGGATGACCACCCAGGAC，下游引物P2序列为：BIO’+CGTCGGCGGTCAGGTACAC。
扩增embB基因上游引物P1序列为：CGCACCTTCACCCTGACCGAC，下游引物P2序列为：BIO’+ATCAGCGCCAGCAGGTTGTA。
扩增rpsL基因上游引物P1序列为：TCGTCGGGACAAGATCAGTAA，下游引物P2序列为：BIO’+CTTGACACCCTGCGTATCCA。
扩增rrs基因片段1的上游引物P1序列为：ACGAAGGTCCGGGTTCTCTC，下游引物P2序列为：BIO’+GCATTCCACCGCTACACCA。
扩增rrs基因片段2上游引物P1序列为：AGGCGGGTCTCTGGGCAGTAA，下游引物P2序列为：BIO’+TGCACACAGGCCACAAGGGAA。
扩增pncA基因片段1的上游引物P1序列为：GTCGCCCGAACGTATGGTG，下游引物P2序列为：BIO’+CGAAGCCGCTGTACGCTCC。
扩增pncA基因片段2上游引物P1序列为：CGACGAGAACGGCACGCCACT，下游引物P2序列为：BIO’+GCTGCAAACCAACTCGACGCT。
扩增gyrA基因上游引物P1序列为：ACCGCAGCCACGCCAAGTC，下游引物P2序列为：BIO’+CGGGCTTCGGTGTACCTCATC。
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