CN1086739C - 沙眼衣原体,解脲脲原体,淋病奈瑟菌的单管同步三重pcr检测方法及所使用的引物 - Google Patents

Abstract

本发明根据沙眼衣原体(CT)，解脲脲原体(UU)，淋病奈瑟菌(NG)相关DNA序列、设计了3对相应的特异聚合酶链式反应(PCR)寡聚核苷酸。可在临床样品中分别扩增出CT、UU、NG相应序列的205碱基对(bp)、439bp和672bp的DNA片段，三个扩增片段大小间相差230bp左右，在普通琼脂糖凝胶电泳中有很高的分辨率。本发明用单管同步检测CT、UU、NG三种病原体的现有PCR方法代替只能检测一种或2种病原体的三重PCR方法，从而达到降低临床样品PCR诊断的工作量和诊断成本的目的。

Description

沙眼衣原体，解脲脲原体，淋病奈瑟菌的 单管同步三重PCR检测方法以及所使用的引物

本发明涉及一种新型分子生物学方法，用于单管同步检测沙眼衣原体、解脲脲原体和淋病奈瑟菌，本发明还涉及本发明的方法中所使用的引物。

进入90年代以来，性传播疾病(STD)在发达国家正在明显下降，而发展中国家STD的流行情况确非常严重，在我国STD发病率近年来大幅度增长，目前它已成为影响我国人民，尤其是妇女儿童身心健康的主要传染性疾病之一。淋病和非淋病菌性尿道炎是我国最常见的性传播病。淋病的病原体为淋病奈瑟菌，非淋病性尿道炎的病原体中以沙眼衣原体和解脲脲原体最为常见，在临床淋病和非淋菌性尿道炎的病原体存在较高的复合感染率。传统的诊断STD的方法有二种，一是临床经验诊断，二是病原体培养诊断。临床诊断需要有经验丰富的医师，且还时常有误诊的可能；病原体培养诊断常常受到病原体培养营养要求，标本运送及培养时间等诸多因素的限制，因此人们一直在努力寻找更为敏感、特异、简便、快速的STD诊断方法。随着PCR技术(polymerase Chain Reaction)的不断完善和成本的降低，用PCR方法分别诊断沙眼原体(CT)，解脲脲原体(UU)和淋病奈瑟菌(NG)已在临床上加以应用(1.M.J.Loeffelholz et al.，J clinMicrobiol，1992；30(11)：2847-2851.2.A.Blanchard et al.，ClincalInfeetions Diseases，1993；17(Suppli)：S148-53.3.Ho BSW et al.，JClin pathol，1992；45(5)：439-442.)，并受到临床应用部门的欢迎。为了进一步降低PCR检测的成本和工作量，近年来国外已有使用复合PCR技术检测二种STD病原体的报告(3.HO BSW et al.，J clinpathol，1992；45(5)：439-442.4.Purohit A etal.，Abstraets of theGeneral Meeting of AmericanSociety for Microbiology，Massachusetts，1994，Washington.DC：AmericanSociety for Microbiology，1994：476 C-171 5.K.C.Wong et al.，J Clinpathol，1995；18：101-104 6.S.Mitram-rosembaum et al，Am J ObstetGynecol，1994；171(3)：784-790)。

本发明的一个目的是提供一种用于单管同步检测沙眼衣原体、解脲脲原体和淋病奈瑟菌三种病原体的PCR反应的引物。

本发明的另一个目的是提供一种单管同步检测沙眼衣原体、解脲脲原体和淋病奈瑟菌三种病原体的检测方法。

本发明在国外沙眼衣原体(CT)、解脲脲原体(UU)和淋病奈瑟菌(NG)临床PCR检测的研究基础上，把通常的单一或复合PCR检测发展为三重PCR检测，发明了沙眼衣原体(CT)、解脲脲原体(UU)和淋病奈瑟菌(NG)三种病原体的单管同步三重PCR检测方法。

沙眼衣原体(CT)、解脲脲原体(UU)、淋病奈瑟菌(NG)三种病原体的分别PCR扩增检测只需合成相对特异PCR扩增寡聚核苷酸和设定适合每对寡聚核苷酸的PCR扩增条件即可在临床检测中获得良好的结果，因此，该方法已在国内外临床检验中广泛应用。近年来兴起的可以同时检测二种STD病原体的复合PCR方法，在寡聚核苷酸设计和PCR扩增条件设定方面需要考虑更多的问题。根据一般性原则，在PCR反应中不同的寡聚核苷酸组合需要选定不同的反应条件才能使多重PCR反应最佳，在同一反应中，所加寡聚核苷酸对越多，适合的反应条件的可能性越小。因此，本发明的三重PCR反应寡聚核苷酸的设计和PCR扩增条件选择是影响三重PCR反应成功的关键。

在三重PCR反应的三对PCR寡聚核苷酸的设计中，除应遵循一般PCR寡聚核苷酸设计原则外，首先采用适当调整三对PCR扩增寡聚核苷酸长度的方法，使3对PCR寡聚核苷酸的解链温度(Tm)尽可能一致，以保证同一反应条件下的良好扩增结果；其次应使3对寡聚核苷酸PCR扩增产物片段大小有相当的差异，以保证在普通琼脂糖凝胶电泳中有良好的分辨率。在10×PCR反应缓冲液的配制中，除保留通常PCR反应缓冲液组成成份外(100mmol/L Tris-HCl(PH9.0)，500mmol/L KCl，1％Triton X 100，0.1％明胶，15mmol/L MgCl₂)，加入5-10％的DMSO(二甲亚砜)以提高三重PCR反应的三个扩增片段间的分离程度和3对扩增寡聚核苷酸Tm值的趋真性；加入2-5％Tween20，以消除含多种杂质的临床模板DNA对三重PCR扩增反应的影响。

本发明利用下述步骤实施发明目的，临床模板DNA制备和PCR扩增条件采用常规方法，但本发明的主要特征是PCR扩增反应扩增寡聚核苷酸的设计及特定PCR缓冲液的配制。

本发明提供了一种用于单管同步检测沙眼衣原体、解脲脲原体和淋病奈瑟菌三种病原体的PCR反应的引物，包括下述的6个寡核苷酸引物：

寡聚核苷酸1.5′-ggATTCCTgTAACAACAAgTCAgg-3′

寡聚核苷酸2.5′-CTCTTCCCCAgAACAATAAgAACAC-3′

寡聚核苷酸3.5′-TAATgCAATCTgCTCgTgAAgTATTA-3′

寡聚核苷酸4.5′-TCgAAACgACgTCCATAAgCAACT-3′

寡聚核苷酸5.5′-TTATCgTTTggCTggTTgATTCAAg-3′

寡聚核苷酸6.5′-ATgAgCAAgATTTCCgATTTggCg-3′。

本发明还提供了一种单管同步检测沙眼衣原体、解脲脲原体和淋病奈瑟菌三种病原体的检测方法，其特征在于，所使用的PCR引物为下述6个寡核苷酸引物：

寡聚核苷酸1.5′-ggATTCCTgTAACAACAAgTCAgg-3′

寡聚核苷酸2.5′-CTCTTCCCCAgAACAATAAgAACAC-3′

寡聚核苷酸3.5′-TAATgCAATCTgCTCgTgAAgTATTA-3′

寡聚核苷酸4.5′-TCgAAACgACgTCCATAAgCAACT-3′

寡聚核苷酸5.5′-TTATCgTTTggCTggTTgATTCAAg-3′

寡聚核苷酸6.5′-ATgAgCAAgATTTCCgATTTggCg-3′；所使用的反应体系中除常规成分外还含有

5％-10％ DMSO，和

2％-5％  Tween20。

在本发明的方法中，所述的反应体系中最好含有：

        100mmol/L Tris-HCl(PH9.0)

        500mmol/L  KCl

              1％   TritonX 100

            0.1％   明胶

         15mmol/L  MgCl₂

           5％-10％ DMSO

           2％-5％  Tween20

实施例

①三重PCR三对扩增寡聚核苷酸的设计根据PCR扩增寡聚核苷酸设计的一般原则和三对寡聚核苷酸Tm值相类似及相应扩增片段大小在普通琼脂糖凝胶电泳中可分辨的原则，设计三重PCR扩增寡聚核苷酸。

寡聚核苷酸1.5′-ggATTCCTgTAACAACAAgTCAgg-3′

寡聚核苷酸2.5′-CTCTTCCCCAgAACAATAAgAACAC-3′

寡聚核苷酸3.5′-TAATgCAATCTgCTCgTgAAgTATTA-3′

寡聚核苷酸4.5′-TCgAAACgACgTCCATAAgCAACT-3′

寡聚核苷酸5.5′-TTATCgTTTggCTggTTgATTCAAg-3′

寡聚核苷酸6.5′-ATgAgCAAgATTTCCgATTTggCg-3′

上述6个寡聚核苷酸中寡聚核苷酸1和寡聚核苷酸2、寡聚核苷酸3和寡聚核苷酸4、寡聚核苷酸5和寡聚核苷酸6各组成一对寡聚核苷酸，分别可扩增出沙眼衣原体(CT)、解脲脲原体(UU)和淋病奈瑟菌(NG)相应序列的205bp、439bp和672bp的DNA片段，三个扩增片段大小间相差230bp，在普通琼脂糖凝胶电泳中有很高的分辨率。

②临床样品模板DNA制备

a、取所检分泌物溶于1ml超纯水中，离心10000转5分钟，去上清。

b、沉淀中加入50μl裂介液，并同时加入蛋白酶K10μg。

c、50℃水浴1小时。

d、100℃水浴10分钟

e、离心10000转5分钟，取上清10μl进行PCR扩增反应。

裂介液配制：

10mmol/L  Tris-HCl(PH8.3)

50mmol/L  KCl

0.45％     NP40

0.45％     Tween 20

2.5mmol/L MgCl₂

高压灭菌后冷冻保存

③三重PCR扩增反应

临床样品检测使用25μl PCR反应体积。

三重PCR扩增反应含：

      10×PCR缓冲液         2.5μl

      2.5mmol/L dNTP          1μl

      Taq酶                   2单位

      六个寡聚核苷酸        各50ng

      模板DNA                 10μl

      加水           至       25μl

三重PCR反应扩增条件：

     94℃  5分钟  预变性；

     94℃  30秒   变性，65℃ 1分钟退火，

     72℃  1分30秒  链延伸，共反应35个循环；

     72℃  5分钟  结束整个反应。

10×PCR缓冲液配制：

     100mmol/L  Tris-HCl(PH9.0)

     500mmol/L  KCl

           1％   TritonX 100

         0.1％   明胶

       15mmol/L MgCl₂

       10％ DMSO

       2％  Tween20

④电泳检测

用2％琼脂糖凝胶进行电泳(溴化乙碇染色)并在紫外灯下检测。电泳图谱中出现205bp扩增片段可诊断为沙眼衣原体(CT)感染，439bp扩增片段可诊断为解脲脲原体(UU)感染，672bp扩增片段可诊断为淋病奈瑟菌(NG)感染。

本发明在单管同步的PCR扩增反应中同时诊断临床样品沙眼衣原体(CT)、解脲脲原体(UU)和淋病奈瑟菌(NG)三种病原体的感染情况，而现有的PCR诊断方法在单管中仅能诊断一种或二种病原体的感染情况。因此，本发明可以降低沙眼衣原体(CT)、解脲脲原体(UU)和淋病奈瑟菌(NG)三种病原体临床诊断工作量和诊断成本。

本发明的技术可以组装成临床诊断沙眼衣原体(CT)、解脲脲原体(UU)、淋病奈瑟菌(NG)三种病原体感染的三重PCR诊断试剂盒，提供医院和科研单位使用。

Claims (3)

1.一种用于单管同步检测沙眼衣原体、解脲脲原体和淋病奈瑟菌三种病原体的PCR反应的引物，包括下述的6个寡核苷酸引物：

寡聚核苷酸1.5′-ggATTCCTgTAACAACAAgTCAgg-3′

寡聚核苷酸2.5′-CTCTTCCCCAgAACAATAAgAACAC-3′

寡聚核苷酸3.5′-TAATgCAATCTgCTCgTgAAgTATTA-3′

寡聚核苷酸4.5′-TCgAAACgACgTCCATAAgCAACT-3′

寡聚核苷酸5.5′-TTATCgTTTggCTggTTgATTCAAg-3′

寡聚核苷酸6.5′-ATgAgCAAgATTTCCgATTTggCg-3′。

2.一种单管同步检测沙眼衣原体、解脲脲原体和淋病奈瑟菌三种病原体的检测方法，其特征在于，所使用的PCR引物为下述6个寡核苷酸引物：

寡聚核苷酸1.5′-ggATTCCTgTAACAACAAgTCAgg-3′

寡聚核苷酸2.5′-CTCTTCCCCAgAACAATAAgAACAC-3′

寡聚核苷酸3.5′-TAATgCAATCTgCTCgTgAAgTATTA-3′

寡聚核苷酸4.5′-TCgAAACgACgTCCATAAgCAACT-3′

寡聚核苷酸5.5′-TTATCgTTTggCTggTTgATTCAAg-3′

寡聚核苷酸6.5′-ATgAgCAAgATTTCCgATTTggCg-3′；所使用的反应体系中含有

5％-10％ DMSO，和

2％-5％  Tween20。

3.按照权利要求2所述的方法，其中，所述的反应体系中含有：

        100mmol/L Tris-HCl(PH9.0)

        500mmol/L KCl

              1％  TritonX 100

            0.1％  明胶

         15mmol/L MgCl₂

          5％-10％ DMSO

          2％-5％  Tween20