CN114487045A - 一种检测T2毒素的CRISPR-Cas14a响应型光电化学传感检测方法和试剂盒 - Google Patents

一种检测T2毒素的CRISPR-Cas14a响应型光电化学传感检测方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测T2毒素的CRISPR‑Cas14a响应型光电化学传感检测方法和试剂盒，涉及小分子毒素检测领域。该检测包括以下步骤：(1)磁性探针的制备；(2)电极修饰；(3)磁珠的识别；(4)SDA等温扩增；(5)切割步骤；(6)光电化学检测；(7)制作标曲。本发明还提供一种检测T2毒素的CRISPR‑Cas14a响应型光电化学传感检测试剂盒。本发明利用SDA等温扩增放大信号，Cas14a反式切割特性和光电信号对目标物进行检测，提高了检测稳定性、特异性强和灵敏度。

Description

一种检测T2毒素的CRISPR-Cas14a响应型光电化学传感检测 方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及小分子毒素检测领域，特别是涉及一种检测T2毒素的CRISPR-Cas14a响应型光电化学传感检测方法和试剂盒。
背景技术
T2毒素是自然界中镰刀菌分泌的A型毛霉烯中毒性最强的毒素之一，广泛存在于玉米、小麦等食品中。T2毒素痕量致毒，进入人体后会在肝脏、脑、生殖系统等多个器官引起毒性效应。因此，开发针对T2毒素的超灵敏和稳定性强的检测策略具有重要意义。
目前大部分基于CRISPR-Cas系统的传感器都以荧光作为输出信号。而相较于荧光信号，电信号具更好的性价比和便携特性。近来，光电化学(PEC)作为一种光化学与电化学相结合的新型分析工具得到了广泛的发展。其主要原理是光照射下光活性材料上发生的电子-空穴对的分离和电荷转移导致光电信号的转换，而相应的光电流会受到电子供体/受体的显著影响。基于光电化学的生物传感平台具有信号读出速度快、操作简单，灵敏度高等优点，但是准确性是限制光电化学生物传感的关键因素之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测T2毒素的CRISPR-Cas14a响应型上转换光电化学传感检测方法和试剂盒，以解决上述现有技术存在的问题，本发明利用SDA等温扩增放大信号，Cas14a反式切割特性和光电信号对目标物进行检测，提高了检测稳定性、特异性强和灵敏度。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种检测T2毒素的CRISPR-Cas14a响应型光电化学传感检测方法和试剂盒，包括以下步骤：
(1)磁性探针的制备：磁珠与T2-APT混合，制备成磁性探针；
(2)电极修饰：ITO玻璃经超声清洗后，利用电化学沉积方法制备得到CdS-Au/ITO电极；巯基修饰的DNA-UCNPs与TCEP混合还原后，再与所述CdS-Au/ITO电极反应，得到CdS-Au-UCNPs/ITO电极；
(3)磁珠的识别：所述磁性探针重悬后加入T2-APT，孵育结合，然后加入互补的T2-cDNA和目标物进行竞争，通过磁分离获得竞争出的cDNA；
(4)SDA等温扩增：不同浓度的步骤(3)获得的cDNA经SDA等温扩增得到不同浓度cDNA对应的ssDNA；
(5)切割步骤：Cas 14a和sgRNA孵育形成Cas 14a-sgRNA复合物，再加入不同浓度cDNA对应的步骤(4)得到的ssDNA，得到混合溶液，再让所述CdS-Au-UCNPs/ITO电极在所述混合溶液中浸泡或将所述混合溶液滴加到电极表面，然后在37℃条件下静置1h；
(6)光电化学检测：采用三电极体系，以步骤(5)静置后的CdS-Au-UCNPs/ITO电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，Pt片电极为辅助电极，以980nm为激发光源，采用电流-时间曲线法进行光电化学检测；
(7)制作标准曲线：将所述光电化学检测测得的吸光度值为纵坐标，T2毒素浓度为横坐标制作标准曲线。
进一步地，在步骤(1)中，所述磁性探针的制备方法包括：取100μL磁珠经磁性分离和洗涤后，加入500μLT2-APT，在室温条件下混合30min。
进一步地，在步骤(2)中，所述CdS-Au/ITO电极的制备方法包括：ITO玻璃经超声清洗后，以CdS和Na2S2O3溶液为电解液，用循环伏安法在ITO玻璃表面沉积CdS纳米粒子，得到CdS/ITO电极，将所述CdS/ITO电极放入到Au/ITO的制备液中，制备得到所述CdS-Au/ITO电极。
进一步地，在步骤(3)中，所述SDA等温扩增包括以下操作：TemDNA和不同浓度的步骤(3)获得的cDNA于95℃加热5min后缓慢冷却至室温，降温退火过程持续2h；再加入CutSmart缓冲液，dNTP，Klenow Fragment酶，混匀并在37℃反应15min；再加入Nt.BsmAI酶，混合均匀，置于37℃3h，之后灭酶，得到ssDNA。
进一步地，在步骤(5)中，所述孵育的反应条件为：37℃，10min。
进一步地，在步骤(6)中，电解液为无水0.1M PBS和0.01M抗坏血酸。
本发明还提供一种检测T2毒素的CRISPR-Cas14a响应型光电化学传感检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下组分：磁性探针、CdS-Au-UCNPs/ITO电极、Ag/AgCl电极、Pt片电极、T2-cDNA、SDA等温扩增体系、Cas 14a和sgRNA；
所述磁性探针由磁珠与T2-APT混合制备而成；
所述CdS-Au-UCNPs/ITO电极的制备方法包括：ITO玻璃经超声清洗后，利用电化学沉积方法制备得到CdS-Au/ITO电极；巯基修饰的DNA-UCNPs与TCEP混合还原后，再与所述CdS-Au/ITO电极反应，得到所述CdS-Au-UCNPs/ITO电极；
所述T2-APT的序列为SEQ ID NO：1所示序列；所述T2-cDNA的序列为SEQ ID NO：2所示序列；所述sgRNA的序列为SEQ ID NO：3所示序列。
本发明还提供上述的检测方法或试剂盒在检测T2毒素中的应用。
CRISPR-Cas14a在靶向核酸方面的准确性可以弥补光电化学生物传感的缺点。为进一步提高光电信号的准确性和灵敏性，我们使用光毒性和背景值低的近红外(NIR)光作为光源代替传统的可见光/紫外光。因此，具有光稳定性和长荧光寿命的上转换纳米材料被引入作为近红外光的吸收介质。在此基础上，设计的电极工作原理主要是将UCNPs、Au和CdS的光学特性相互匹配。当980nm近红外光照射到电极表面时，UCNPs被激发并发射550nm波长的光。UCNPs发射的光通过荧光共振能量转移(FRET)将能量转移到Au。Au再通过等离子体共振能量转移(PRET)将积累的能量传递给CdS，产生电子(e-)和光生空穴(h+)。由于被激发的电子向ITO电极转移，光生空穴可被溶液中的AA捕获，并将抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸，从而有效避免了电子和空穴的复合，使光电流增强。
本发明公开了以下技术效果：
本发明可以对T2毒素进行高灵敏检测。本发明利用SDA等温扩增放大信号，Cas14a反式切割特性和光电信号对目标物进行检测，稳定性好，反应特异性强，灵敏度高，操作简便，反应条件要求较低。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明检测方法原理图；
图2为CdS-Au-UCNPs/ITO电极表征图；
图3为实施例1中目标物的检测标准曲线；
图4为实施例1中特异性检测的结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明的检测过程原理图如图1所示。UCNPs-Cas14a光电化学引入了一种简单的信号转换方法，为基于CRISPR的传感器可以检测的分析物类别上提供了新的自由度。同时，该传感器通过CRISPR和纳米材料的巧妙结合实现光电信号输出，从而进一步提高检测灵敏度。UCNPs-Cas14a光电化学传感器的工作原理主要分为三个部分：信号识别转换部分依靠磁珠ATP-cDNA复合物实现；信号放大部分是进行SDA得到大量目标链；信号输出部分包含可被目标链激活切割活性的Cas14a-sgDNA和光电化学工作站(工作电极：修饰了UCNPs-ssDNA-CdS@Au的ITO，对电极：铂片，参比电极：Ag/AgCl)。其中，我们在光电化学站中设计了一个非特异性的ssDNA报告器，它带有一个用于吸收近红外光(980nm)并将光能转移到CdS@Au/ITO的UCNPs和一个用于在传感器表面拴系的巯基部分，以获得电学信号。在目标物的存在下，cDNA可以从适配体结合区解离，因为磁珠上的适配体与目标物结合。通过磁分离收集游离的cDNA可以引发SDA(cDNA与模板链结合并在聚合酶的协助下沿着5’-3’方向聚合，然后Nt.BsmAI会识别并切割双链中的一条单链形成缺口，KF随即切入聚合成完整的双链，并将切割后的片段置换下来，如此经过数轮循环)得到大量ssDNA。Cas14a-sgRNA复合物的切割活性被上述ssDNA激活，将UCNPs从CdS-Au/ITO电极表面切割下来。UCNPs和CdS-Au/ITO的距离变远，UCNPs吸收的近红外光很难转移到CdS-Au/ITO，因此电信号变弱。没有目标物存在的情况下，Cas14a-sgRNA切割活性被沉默，因此UCNPs-ssDNA-CdS-Au/ITO结构保持完整。
以下实施例中，所有寡核苷酸均由生工生物工程技术服务有限公司(中国上海)合成和提纯，表1列出了本发明中使用的寡核苷酸序列。链霉亲和素磁珠购自海狸(中国苏州)，Cas14a酶购自近岸蛋白(中国上海)。氧化铟锡(ITO)透明导电玻璃(厚1.1mm，方电阻≤100欧姆，苏州板硝子电子有限公司)。氯化镉(AR)，硫代硫酸钠(AR)，CH3CSNH2，六偏磷酸钠，半胱氨酸，盐酸(浓度为0.1M)购买自麦克林生化科技有限公司(中国上海)；HAuCl4·4H2O(AR)买自Sigma-Aldrich，Inc.(美国圣路易斯)。氨基化上转换纳米颗粒购买自西安瑞禧生物科技公司(中国)。Klenow Fragment(3′→5′exo-)，NtBsmAI，dNTP购自New EnglandBioLabs Inc(英国伊普斯威奇)。其他试剂购自国药化学试剂公司(中国上海)。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例用于说明燕麦中T2毒素检测的CRISPR-Cas14a响应型超灵敏上转换光电化学用于T2毒素检测方法，具体包括以下步骤：
(1)磁性探针的制备：取100μL磁珠加入到新的离心管中，将离心管置于磁性分离器上进行磁性分离；用1mL Buffer I(10mM Tris-HCl(pH 7.5)，1mM EDTA，1M NaCl，0.01％～0.1％Tween-20)洗涤磁珠三次；再加入500μL生物素化APT(即T2-APT，DNA终浓度为2nmol/mL)，并在室温条件下旋转混合30min；磁性分离后洗涤三次，得到磁性探针，再重悬备用。
(2)电极修饰：将ITO玻璃划成长4.0cm，宽0.6cm的长方形，随后依次用氨水(水：氨水＝30mL：1mL)、去离子水、无水乙醇、亚沸水各超声清洗10min；CdS/ITO电极的制备主要以2mL 0.1M CdS和2.0mL 0.02M Na2S2O3溶液为电解液，用0.1M HCl调pH值到2-3之间，用循环伏安法在ITO玻璃表面沉积CdS纳米粒子，电解参数：沉积电位为-0.2V到-0.8V，扫速0.05V/s，沉积40圈，温度：50℃。将制备好的CdS/ITO电极放入到Au/ITO的制备液(即1.2mL，1mMHAuCl4，4.0mL pH＝7.0的缓冲溶液)中，制备CdS-Au/ITO电极。将200μL的2mg/mL的巯基修饰的DNA-UCNPs(即PEC-DNAReporter)与5μL的26.7mM的TCEP混合，室温下还原30min。后续可以直接与CdS-Au/ITO电极在室温条件下混合反应2h制备CdS-Au-UCNPs/ITO电极。
(3)磁珠的识别：步骤(1)制备的磁性探针用PBS洗涤重悬后加入生物素修饰的适配体(T2-APT)孵育结合，然后加入互补的T2-cDNA和目标物(待测燕麦样品或T2毒素标准品)进行竞争，通过磁分离获得竞争出的cDNA。
(4)SDA等温扩增：TemDNA(1μmol/L，1μL)和不同浓度目标物对应的步骤(3)通过磁分离获得竞争出的cDNA(5.5μL)于95℃热水浴中加热5min后缓慢冷却至室温，降温退火过程持续2h；再加入1μL CutSmart(10X)缓冲液，1.5μL dNTP(10mmol/L)，0.5μL KlenowFragment(3’-5’exo-)酶(5000U/mL)，混匀并在37℃反应15min；加入1μL Nt.BsmAI酶(10000U/mL)，用超纯水补足至20μL。混合均匀，置于37℃温育3h。最后在80℃热水中加热10min灭酶活性，得到ssDNA；使用12％PAGE凝胶电泳验证扩增产物。
(5)切割步骤：首先，Cas 14a(0.5μL,1mg/mL)，sgRNA(25μL,0.5nmol/mL)和10×裂解缓冲液(10μL)在37℃下孵育10min形成Cas 14a-sgRNA复合物。再加入不同浓度目标物对应的步骤(4)得到的ssDNA(20μL)，并用dd水补至100μL。让CdS-Au-UCNPs/ITO工作电极浸泡其中或将上述溶液滴加到电极表面，然后在37℃条件下放置1h。
(6)光电化学检测：采用三电极体系，以CdS-Au-UCNPs/ITO为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，Pt片电极为辅助电极。以980nm为激发光源，无水0.1M PBS(pH 7.41)和0.01M抗坏血酸(ASCORBIC ACID，AA)为电解液，在0V偏压下，采用电流-时间曲线法进行光电化学检测。实验开始前，电解液需要通高纯氮20min，实验开始后将氮气悬于电解液上方保持氮气环境。
(7)制作标曲：将反应测得的吸光度值为纵坐标，T2毒素浓度为横坐标制作标准曲线，如图3所示。
(8)样品检测：
称量5g磨碎的燕麦，在室温下，用25mL甲醇/水(70：30，v/v)旋转提取50min，之后以4000rpm离心10min，用滤纸过滤，取上清液用去离子水1：5稀释。用稀释液进行样品检测。
实际样品检测：将含有不同浓度T2毒素的燕麦样品a、b和c按照上述步骤进行反应，分析得出的电流强度代入标准曲线中，计算T2毒素的含量。结果如表2所示。
表1
Figure BDA0003490394550000071
表2
Figure BDA0003490394550000072
特异性检测：采用与T2毒素相同的实验方法，对T2毒素的类似物，如玉米赤霉烯酮(ZEN)、赭曲霉毒素A(OTA)、伏马毒素(FB1)和黄曲霉毒素B1(AFB1)进行了研究。特异性检测的结果如图4所示，从图4可以看出，本发明的方法用以检测T2毒素，具有较强的特异性。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所
<120> 一种检测T2毒素的CRISPR-Cas14a响应型光电化学传感检测方法和试剂盒
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagctcagaa gcttgatcct gtatatcaag catcgcgtgt ttacacatgc gagaggtgaa 60
gactcgaagt cgtgcatctg 80
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acctctcgca tgtgt 15
<210> 3
<211> 227
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cuucacugau aaaguggaga accgcuucac caaaagcugu cccuuagggg auuagaacuu 60
gagugaaggu gggcugcuug caucagccua augucgagaa gugcuuucuu cggaaaguaa 120
cccucgaaac aaauucauuu uuccucucca auucugcaca agaaaguugc agaacccgaa 180
uagacgaaug aaggaaugca acuaccgaac gaaccaccag cagaaga 227
<210> 4
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cattaaaaat accgaacgaa ccaccagcag aagataaaac agagacacat gcgagaggt 59
<210> 5
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tttttttt 8

Claims (8)

1.一种检测T2毒素的CRISPR-Cas14a响应型光电化学传感检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)磁性探针的制备：磁珠与T2-APT混合，制备成磁性探针；
(2)电极修饰：ITO玻璃经超声清洗后，利用电化学沉积方法制备得到CdS-Au/ITO电极；巯基修饰的DNA-UCNPs与TCEP混合还原后，再与所述CdS-Au/ITO电极反应，得到CdS-Au-UCNPs/ITO电极；
(3)磁珠的识别：所述磁性探针重悬后加入T2-APT，孵育结合，然后加入互补的T2-cDNA和目标物进行竞争，通过磁分离获得竞争出的cDNA；
(4)SDA等温扩增：不同浓度的步骤(3)获得的cDNA经SDA等温扩增得到不同浓度cDNA对应的ssDNA；
(5)切割步骤：Cas 14a和sgRNA孵育形成Cas 14a-sgRNA复合物，再加入不同浓度cDNA对应的步骤(4)得到的ssDNA，得到混合溶液，再让所述CdS-Au-UCNPs/ITO电极在所述混合溶液中浸泡或将所述混合溶液滴加到电极表面，然后在37℃条件下静置1h；
(6)光电化学检测：采用三电极体系，以步骤(5)静置后的CdS-Au-UCNPs/ITO电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，Pt片电极为辅助电极，以980nm为激发光源，采用电流-时间曲线法进行光电化学检测；
(7)制作标准曲线：将所述光电化学检测测得的吸光度值为纵坐标，T2毒素浓度为横坐标制作标准曲线。
2.根据权利要求1所述的检测T2毒素的CRISPR-Cas14a响应型光电化学传感检测方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述磁性探针的制备方法包括：取100μL磁珠经磁性分离和洗涤后，加入500μLT2-APT，在室温条件下混合30min。
3.根据权利要求1所述的检测T2毒素的CRISPR-Cas14a响应型光电化学传感检测方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述CdS-Au/ITO电极的制备方法包括：ITO玻璃经超声清洗后，以CdS和Na2S2O3溶液为电解液，用循环伏安法在ITO玻璃表面沉积CdS纳米粒子，得到CdS/ITO电极，将所述CdS/ITO电极放入到Au/ITO的制备液中，制备得到所述CdS-Au/ITO电极。
4.根据权利要求1所述的检测T2毒素的CRISPR-Cas14a响应型光电化学传感检测方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述SDA等温扩增包括以下操作：TemDNA和不同浓度的步骤(3)获得的cDNA于95℃加热5min后缓慢冷却至室温，降温退火过程持续2h；再加入CutSmart缓冲液，dNTP，Klenow Fragment酶，混匀并在37℃反应15min；再加入Nt.BsmAI酶，混合均匀，置于37℃3h，之后灭酶，得到ssDNA。
5.根据权利要求1所述的检测T2毒素的CRISPR-Cas14a响应型光电化学传感检测方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述孵育的反应条件为：37℃，10min。
6.根据权利要求1所述的检测T2毒素的CRISPR-Cas14a响应型光电化学传感检测方法，其特征在于，在步骤(6)中，电解液为无水0.1M PBS和0.01M抗坏血酸。
7.一种检测T2毒素的CRISPR-Cas14a响应型光电化学传感检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下组分：磁性探针、CdS-Au-UCNPs/ITO电极、Ag/AgCl电极、Pt片电极、T2-cDNA、SDA等温扩增体系、Cas 14a和sgRNA；
所述磁性探针由磁珠与T2-APT混合制备而成；
所述CdS-Au-UCNPs/ITO电极的制备方法包括：ITO玻璃经超声清洗后，利用电化学沉积方法制备得到CdS-Au/ITO电极；巯基修饰的DNA-UCNPs与TCEP混合还原后，再与所述CdS-Au/ITO电极反应，得到所述CdS-Au-UCNPs/ITO电极；
所述T2-APT的序列为SEQ ID NO：1所示序列；所述T2-cDNA的序列为SEQ ID NO：2所示序列；所述sgRNA的序列为SEQ ID NO：3所示序列。
8.根据权利要求1-6任一项所述的检测方法或权利要求7所述的试剂盒在检测T2毒素中的应用。
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