JPWO2018194151A1 - 多相ポリマー微粒子を用いた検体物質の検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
1. 2種以上のポリマーがそれぞれ集合して形成される2種以上のポリマー相を少なくとも表面上に有する多相ポリマー微粒子であって、第1のポリマー相が検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質に結合可能であり、第2のポリマー相が標識物質を有する、上記微粒子。
2. 第1若しくは第2のポリマー相、又は第3のポリマー相が磁性体を含む、上記1記載の微粒子。
3. 上記1若しくは2記載の微粒子の第1のポリマー相に共有結合した検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質を有する、多相ポリマー微粒子。
4. 第2のポリマー相に共有結合した標識物質を有する、上記3記載の多相ポリマー微粒子。
5. 検体物質が、タンパク質若しくはペプチド、糖類、核酸、脂質、又はステロイド化合物である、上記1〜4のいずれか記載の微粒子。
6. 標識物質が蛍光色素、化学発光物質又は放射性標識物質である、上記1〜5のいずれか記載の微粒子。
7. サンプル中の検体物質を検出する方法であって、以下の工程:
検体物質に特異的に結合する捕捉用試薬を固定化した固相支持体とサンプルとを接触させる工程;
該固相支持体と上記3〜6のいずれか記載の微粒子とを接触させる工程;及び
固相支持体上に結合した微粒子上の標識を検出する工程
を含む、上記方法。
8. 微粒子が検体物質に共有結合した微粒子であり、サンプル中の検体物質が未結合の捕捉用試薬と微粒子上に存在する検体物質とが結合する、上記7記載の方法。
9. 微粒子が検体物質と特異的に結合し得る物質に共有結合した微粒子であり、捕捉用試薬に結合したサンプル中の検体物質と微粒子上に存在する上記検体物質と特異的に結合し得る物質とが結合する、上記7記載の方法。
10. 検体物質が生物学的サンプル中に含まれる、上記7〜9のいずれか記載の方法。
11. 生物学的サンプルが血液、血漿、又は血清である、上記10記載の方法。
12. 捕捉用試薬が抗体である、上記7〜11のいずれか記載の方法。
13. サンプル中の検体物質の捕捉手段と、捕捉された検体物質の検出手段とを含む、サンプル中の検体物質の検出のためのシステムであって、上記捕捉手段が、検体物質と特異的に結合する試薬が固定された固相支持体であって、上記検出手段が、サンプル中の検体物質と未結合の捕捉用試薬又は捕捉用試薬と結合した検体物質と、上記3〜6のいずれか記載の微粒子との結合によって検出可能な標識を検出するものである、上記システム。
14. 小型デバイスの形態で提供される、上記13記載のシステム。
15. 固相支持体が、サンプルを通過させるデバイス内のマイクロ流路上に固定されたチップである、上記14記載のシステム。
16. 検出手段が、固相支持体上に捕捉された微粒子からの蛍光を検出するCCDカメラである、上記14又は15記載のシステム。
17. 検体物質の量及び/又は濃度を測定する、上記13〜16のいずれか記載のシステム。
18. 少なくとも予め設定した閾値と比較して高濃度又は低濃度である場合に計測結果が表示される、上記13〜17のいずれか記載のシステム。
19. 目的の検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質が予め結合された上記3〜6のいずれか記載の微粒子と、サンプル中の検体物質と特異的に結合する捕捉用試薬及び捕捉された検体物質の検出器を有するデバイスと、反応のために必要な試薬とを含む、サンプル中の検体物質の検出のためのキット。
本発明は、2種以上のポリマーがそれぞれ集合して形成される2種以上のポリマー相を少なくとも表面上に有する多相ポリマー微粒子であって、第1のポリマー相が検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質に結合可能であり、第2のポリマー相が標識物質を有する、上記微粒子を提供する。微粒子に含まれるポリマー相は2種以上であれば良く、必要に応じて3種、4種又はそれ以上であり得る。しかしながら、ポリマー相の数が少ない場合に微粒子の製造がより容易となるため、本発明の目的であるサンプル中の検体物質の検出のためにはポリマー相は2種であれば良い。ポリマー相の識別のために、本明細書中において便宜上「第1のポリマー相」、「第2のポリマー相」等と表記するが、これらの表記はポリマーの種類を特定するものではない。
1)水溶性ポリマー、例えばN-イソプロピルアクリルアミド、ポリエチレングリコール等;
2)非水溶性ポリマー、例えば1,4-シス-イソプレン、イソプレンエラストマー、ポリスチレン、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリメチルメタクリレート、ポリn-ブチルアクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリアクリロニトリル、ポリ乳酸等;
3)共重合体、例えばブタジエン:スチレン共重合体等。
本発明はまた、サンプル中の検体物質を検出する方法を提供する。本発明の方法は、以下の工程:
検体物質に特異的に結合する捕捉用試薬を固定化した固相支持体とサンプルとを接触させる工程;
該固相支持体と上記本発明の多相ポリマー微粒子とを接触させる工程;及び
固相支持体上に結合した微粒子上の標識を検出する工程
を含む。
本発明はまた、サンプル中の検体物質の捕捉手段と、捕捉された検体物質の検出手段とを含む、サンプル中の検体物質の検出のためのシステムを提供する。
また、本発明のシステムは、洗浄することで繰り返し使用可能であり、またディスポーサブルタイプとすることができる。
本発明は更に、目的の検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質が予め結合された本発明の多相ポリマー微粒子と、サンプル中の検体物質と特異的に結合する捕捉用試薬、及び捕捉された検体物質の検出器を有するデバイスと、検体物質と捕捉用試薬との結合反応、多相ポリマー微粒子の結合反応、及び検体物質の検出のために必要な試薬とを含む、サンプル中の検体物質の検出のためのキットを提供することができる。検出手段として化学発光物質を用いる場合には、酵素反応のために必要な基質等もキットに含めることができる。
酸化第二鉄(Fe2O3)紛末(粒径50nm以下)37.5 mgをクロロホルム1.25 mlに分散し、5分間超音波処理した。これにMacromolecular Rapid Communications, 35(20), 1763-1769 (2014)に記載の方法で合成したドデシルアクリルアミドとドーパミンメタクリルアミドの8:1ランダム共重合体(PS:PDMAの共重合比が8:1のPS-r-PDMA、D81)25 mg及びクロロホルム1.25 mlを添加して更に5分間超音波処理した後、室温で12時間、振とうしながら反応させた。これにネオジウム磁石を容器に近づけ、粒子を捕集した後、クロロホルムを加え、3回洗浄して未反応のD81を除去し、室温で3.5時間、真空下で乾燥した。生成物をTHFに1mg/mlの濃度となるように再度分散させて5分間超音波処理した。
得られた磁性ナノ粒子は粒径100〜300nmの範囲のものであり、磁性粒子が凝集した状態でポリマーに被覆されていることが確認された。
酸化第二鉄(Fe2O3)粉末(粒径50nm以下)90 mgを10 mlの透明バイアル中のDMF 5mlに分散し、ホモジナイザー(強度30%)で10分間ホモジナイズした。これに調製例1と同様にして合成したドデシルアクリルアミドとドーパミンメタクリルアミドの2:1ランダム共重合体(D21)、4:1ランダム共重合体(D41)及び8:1ランダム共重合体(D81)各30mg及びTHF 1mlを添加して更に10分間ホモジナイズした後、最大振とう速度にて12時間、振とうしながら反応させた。反応液をテフロン(登録商標)製遠心管に移し、10,000rpmで15分間遠心分離し、上清を除去した。これにクロロホルム10mlを添加して約30秒間ボルテックスして同様に遠心分離することで3回洗浄した。ペレットにクロロホルムを添加した分散液を再度10 mlの透明バイアルに移し、常温で2時間真空乾燥したのち、重量を測定し、10g/l又は1g/lの粒子濃度のTHF分散液とし、透過型電子顕微鏡(TEM)により粒子を観察すると共にファイバー光学動的光散乱光度計(Fiber-optic Dynamic Light Scattering、FDLS)により粒径分布を測定した。結果を図7−1〜7−3に示す。
末端にピレニル基を有するポリスチレン(PS-Pyr、Mn=3,500、Polymer Source社)の1g/L THF溶液0.5 mL、末端にアミノ基を有するポリブタジエン(PB-NH2、Mn=1,700、Polymer Source社)の1g/L THF溶液0.5 mL、及び調製例2で調製した磁性ナノ粒子の10g/l THF溶液0.5mlを12 mlのシランカップリング剤で処理した褐色疎水化バイアル中で混合した後、水を1ml/分の速度で1.0ml添加し、ボルテックスで撹拌した。得られた混合液を真空オーブン中で常温で2時間加熱してTHFを蒸発させ、冷却後に0.2%の四酸化オスミウム水溶液を添加して15分間染色し、透過型及び走査型電子顕微鏡で粒子を観察した。上記の製造工程を図8に模式的に示す。
実施例1と同様にして、ポリスチレン及びポリブタジエンを0.1mg/mL、1.0mg/mL又は5.0mg/mL THF溶液とした場合に生成する粒子の粒径を確認した。その結果、図10に示すように、他の条件を同一とした場合に、用いる出発ポリマー濃度が高い程粒径が大きくなることが確認された。
実施例1で得られた磁性ヤヌス粒子の一方のポリマー相への蛍光標識物質の結合を確認した。図11A及びBの顕微鏡写真からわかるように、四酸化オスミウムで染色されるポリマー領域(ポリブタジエン)と、ピレニル基からの蛍光が検出されるポリマー領域とは明確に分かれており、ポリスチレンからなるポリマー相が選択的に蛍光標識されていることが確認された。
ポリスチレン(PS、Mn=約1万、Polymer Source社)の1g/L THF溶液0.5 mL、末端にアミノ基を有する1,2-ポリブタジエン(PB820、JSR株式会社)の1g/L THF溶液0.5 mL、及び調製例2で調製した磁性ナノ粒子の10g/l THF溶液0.5mlを12 mlのシランカップリング剤で処理した褐色疎水化バイアル中で混合した後、水を1ml/分の速度で1.0ml添加し、ボルテックスで撹拌した。得られた混合液を真空オーブン中で常温で2時間加熱してTHFを蒸発させ、得られた粒子にFITCを加えて反応させた。得られた粒子を蛍光顕微鏡で観察したところ、粒子の片面のポリブタジエンからなるポリマー相にFITCの蛍光が観察されたことから、部位選択的にFITCが導入出来ることが示された(図12)。
カルボキシ末端ポリスチレン及びアミノ基末端ポリブタジエン(いずれもPolymer Source社)を用い、磁性ナノ粒子を入れない以外は実施例4と同様にして非磁性ヤヌス粒子を製造した。得られた粒子にFITCを加えて反応させ、蛍光顕微鏡で観察したところ、ポリブタジエンからなるポリマー相にFITCの蛍光が観察されたことから、部位選択的にFITCが導入できることが示された(図13)。
磁性ナノ粒子を入れない以外は実施例1と同様にして製造したヤヌス粒子1 mgの水分散液1mLに、J. K. McKenzie及びJ.A. Clements, J. Clin. Endocrinol. Metab., 38(4), 622 (1974)に記載された方法を用いてアルドステロンの3位のみを選択的に修飾したアルドステロン-3-オキシム 5mg/mLメタノール溶液1mLを添加し、縮合剤として1-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]-3-カルボジイミド(EDC)約3mgを用いて、室温で一晩、振とうしながら反応させた。その結果、アルドステロン-CMOがポリブタジエン領域に共有結合し、蛍光物質がポリスチレン領域に存在する非磁性ヤヌス粒子が得られた。
磁性ナノ粒子を入れない以外は実施例1と同様にして製造したヤヌス粒子に、縮合剤の存在下で抗マウスレニン抗体(#AF4277, R&D systems社)を共有結合させ、ヤヌス粒子を調製した。
次いで、上記の抗マウスレニン抗体結合ヤヌス粒子(4×106個/mL, 100μL)を添加し、4℃で一晩インキュベートした。
より具体的には、例えば国内で200-400万人が潜在的にいるとされる高血圧にかかわる原発性アルドステロン症患者のスクリーニング、尿検査による腎症の進行度判断、腫瘍マーカーの診断、空港やクリニックでの病原性微生物の感染症の検査、ボツリヌス毒素、ヒスタミン等の食品中の毒素の検査、家畜やペットの感染症の検査等への利用が可能である。
2 蛍光物質
3 磁性体
4 固相支持体
5 捕捉用試薬
6 検出手段
7 磁場
Claims (19)
- 2種以上のポリマーがそれぞれ集合して形成される2種以上のポリマー相を少なくとも表面上に有する多相ポリマー微粒子であって、第1のポリマー相が検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質に結合可能であり、第2のポリマー相が標識物質を有する、上記微粒子。
- 第1若しくは第2のポリマー相、又は第3のポリマー相が磁性体を含む、請求項1記載の微粒子。
- 請求項1若しくは2記載の微粒子の第1のポリマー相に共有結合した検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質を有する、多相ポリマー微粒子。
- 第2のポリマー相に共有結合した標識物質を有する、請求項3記載の多相ポリマー微粒子。
- 検体物質が、タンパク質若しくはペプチド、糖類、核酸、脂質、又はステロイド化合物である、請求項1〜4のいずれか1項記載の微粒子。
- 標識物質が蛍光色素、化学発光物質又は放射性標識物質である、請求項1〜5のいずれか1項記載の微粒子。
- サンプル中の検体物質を検出する方法であって、以下の工程:
検体物質に特異的に結合する捕捉用試薬を固定化した固相支持体とサンプルとを接触させる工程;
該固相支持体と請求項3〜6のいずれか1項記載の微粒子とを接触させる工程;及び
固相支持体上に結合した微粒子上の標識を検出する工程
を含む、上記方法。 - 微粒子が検体物質に共有結合した微粒子であり、サンプル中の検体物質が未結合の捕捉用試薬と微粒子上に存在する検体物質とが結合する、請求項7記載の方法。
- 微粒子が検体物質と特異的に結合し得る物質に共有結合した微粒子であり、捕捉用試薬に結合したサンプル中の検体物質と微粒子上に存在する上記検体物質と特異的に結合し得る物質とが結合する、請求項7記載の方法。
- 検体物質が生物学的サンプル中に含まれる、請求項7〜9のいずれか1項記載の方法。
- 生物学的サンプルが血液、血漿、又は血清である、請求項10記載の方法。
- 捕捉用試薬が抗体である、請求項7〜11のいずれか1項記載の方法。
- サンプル中の検体物質の捕捉手段と、捕捉された検体物質の検出手段とを含む、サンプル中の検体物質の検出のためのシステムであって、上記捕捉手段が、検体物質と特異的に結合する試薬が固定された固相支持体であって、上記検出手段が、サンプル中の検体物質と未結合の捕捉用試薬又は捕捉用試薬と結合した検体物質と、請求項3〜6のいずれか1項記載の微粒子との結合によって検出可能な標識を検出するものである、上記システム。
- 小型デバイスの形態で提供される、請求項13記載のシステム。
- 固相支持体が、サンプルを通過させるデバイス内のマイクロ流路上に固定されたチップである、請求項14記載のシステム。
- 検出手段が、固相支持体上に捕捉された微粒子からの蛍光を検出するCCDカメラである、請求項14又は15記載のシステム。
- 検体物質の量及び/又は濃度を測定する、請求項13〜16のいずれか1項記載のシステム。
- 少なくとも予め設定した閾値と比較して高濃度又は低濃度である場合に計測結果が表示される、請求項13〜17のいずれか1項記載のシステム。
- 目的の検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質が予め結合された請求項3〜6のいずれか1項記載の微粒子と、サンプル中の検体物質と特異的に結合する捕捉用試薬及び捕捉された検体物質の検出器を有するデバイスと、反応のために必要な試薬とを含む、サンプル中の検体物質の検出のためのキット。
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