CN102628871A

CN102628871A - 甲状腺激素固定载体的液体试剂及其用途

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Publication number: CN102628871A
Application number: CN2012100281966A
Authority: CN
Inventors: 大沼直嗣
Original assignee: Arkray Inc
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 2011-02-03
Filing date: 2012-02-03
Publication date: 2012-08-08
Anticipated expiration: 2032-02-03
Also published as: US20120202230A1; US9551723B2; CN102628871B; EP2485053B1; EP2485053A1; JP2012177683A; JP5997446B2

Abstract

本发明提供了经稳定的甲状腺激素固定载体的液体试剂及其用途，其能低成本、简便并且短时间地实现甲状腺激素的测定。本发明的甲状腺激素固定载体的液体试剂的特征在于，含有甲状腺激素固定载体和溶剂，含有上述甲状腺激素固定载体的上述溶剂的pH处于8.7～11.5的范围。使用了本发明的液体试剂的甲状腺激素的检测可以通过使抗甲状腺激素抗体与样品中的甲状腺激素和上述液体试剂的甲状腺激素固定载体竞争性结合，检测上述甲状腺激素固定载体和上述抗甲状腺激素抗体的复合体来进行。根据本发明，通过将上述液体试剂的pH设为上述规定的范围，由于可以稳定上述甲状腺激素固定载体，因此可以长时间保存。另外，不需要在每次测定时制备甲状腺激素固定载体，可以低成本、简便并且短时间地测定甲状腺激素。

Description

甲状腺激素固定载体的液体试剂及其用途

相关申请的交叉引用

本申请主张以2011年2月3日申请的日本申请特愿2011-21593为基础的优先权，将其公开内容全部并入本文。

技术领域

本发明涉及甲状腺激素固定载体的液体试剂及其用途，更详细地说，涉及溶剂中的甲状腺激素固定载体的稳定方法、甲状腺激素固定载体的液体试剂的制造方法、甲状腺激素的检测方法、甲状腺激素的检测试剂盒。

甲状腺激素是由甲状腺分泌、具有作用于全身的细胞提高细胞的代谢率等作用的激素。所述甲状腺激素例如已知三碘甲状腺原氨酸(T3)以及甲状腺素(T4)。近年，过剩分泌甲状腺激素的甲状腺功能亢进症(例如，Basedow病等)、以及甲状腺激素分泌不足甲状腺功能减退症(例如，桥本病等)等甲状腺功能异常症的患者在增加。因此，在临床检查等中，正确测定甲状腺激素是很重要的。

在测定甲状腺激素时，例如，广泛采用使用抗甲状腺激素抗体的竞争性免疫测定法(参见特开平9-89889号公报及特开2010-53118号公报、Kathmandu University Medical Journal(2005)Vol.3，No.1，Issue 9，91-93)。上述测定法是使样品中的甲状腺激素和试剂中的甲状腺激素竞争性地与抗甲状腺激素抗体反应的测定系统。上述测定法中一般使用三试剂系试剂盒。上述试剂盒由作为第一试剂的标记抗体、作为第二试剂的生物素化甲状腺激素和作为第三试剂的亲和素固定载体构成，各试剂单独保存。使用了上述三试剂系试剂盒的测定例如如下所述地进行。即，首先，将样品和上述标记抗体混合，使上述样品中的甲状腺激素和上述标记抗体结合。接着，再在上述混合物中混合上述生物素化甲状腺激素和上述亲和素固定载体。由此，未与上述样品中的甲状腺激素结合的未反应的标记抗体、上述生物素化甲状腺激素、上述亲和素固定载体通过抗原抗体反应和亲和素-生物素结合，形成复合体。然后，分离上述复合体，检测上述复合体中的上述标记抗体。上述样品中的甲状腺激素和上述生物素化甲状腺激素与上述标记抗体竞争性结合。因此，通过检测上述复合体中的标记抗体，能够测定与上述样品中的甲状腺激素结合的标记抗体，由此能够间接测定上述样品中的甲状腺激素。但是，上述三试剂系由于每次测定时都需要混合三种试剂，因此操作复杂，花费时间，成本高。

背景技术

因此，考虑预先将结合了上述生物素化甲状腺激素和上述亲和素固定载体的甲状腺激素固定载体作为试剂，使用该试剂和标记抗体的两试剂系。但是，上述甲状腺激素固定载体由于稳定性低，因此例如在作为试剂长期保存的情况下，存在与保存前相比，活性降低的问题。

因此，本发明目的在于提供低成本、简便并且短时间地实现甲状腺激素的测定的、经稳定的甲状腺激素固定载体的液体试剂及其用途。

为了达到上述目的，本发明的甲状腺激素固定载体的液体试剂的特征在于，含有甲状腺激素固定载体和溶剂，含有上述甲状腺激素固定载体的上述溶剂的pH处于pH8.7～11.5的范围。

本发明的溶剂中的甲状腺激素固定载体的稳定方法的特征在于，将含有甲状腺激素固定载体的溶剂的pH设定为pH8.7～11.5。

本发明的甲状腺激素固定载体的液体试剂的制造方法的特征在于，包括对溶剂中的甲状腺激素固定载体的稳定步骤，上述稳定步骤通过上述本发明的稳定方法来实施。

本发明的甲状腺激素的检测方法的特征在于，包括使样品中的甲状腺激素和上述本发明的液体试剂的甲状腺激素固定载体与抗甲状腺激素抗体竞争性结合的结合步骤、以及、检测上述甲状腺激素固定载体与上述抗甲状腺激素抗体的复合体的步骤。

本发明的甲状腺激素的检测试剂盒的特征在于，其包括上述本发明的甲状腺激素固定载体的液体试剂以及抗甲状腺激素抗体，并且在上述本发明的检测方法中使用。

根据本发明，通过将上述液体试剂的pH设置为上述规定范围，能够稳定上述甲状腺激素固定载体，因此例如能够长期保存上述甲状腺激素固定载体。因此，根据本发明，例如不需要像以往那样，每次测定时制备甲状腺激素固定载体，能够低成本、简便并且短时间地测定甲状腺激素。因此，本发明在临床检查等中是极其有用的。

发明内容

<甲状腺激素固定载体的液体试剂>

如前所述，本发明的甲状腺激素固定载体的液体试剂的特征在于，包括甲状腺激素固定载体和溶剂，含有上述甲状腺激素固定载体的上述溶剂的pH处于pH8.7～11.5的范围。

本发明中，上述溶剂的pH的意思是上述液体试剂的全体组成成分包含在上述溶剂中的状态下的上述溶剂的pH。以下，将含有上述甲状腺激素固定载体的上述溶剂的pH称为“上述液体试剂的pH”。上述液体试剂的pH的下限为8.7，例如为8.8、9。上述液体试剂的pH的上限为11.5，优选是11，更优选是10.5、9.5、9.4、9.2。上述液体试剂的pH的范围如前所述为8.7～11.5，优选是8.7～11的范围，更优选是8.7～10.5的范围。另外，上述pH的范围例如是8.7～9.5的范围，8.7～9.4、8.7～9.2的范围。另外，上述pH的范围例如为8.8～11的范围、9～11的范围，优选是8.8～10.5、9～10.5的范围，9～9.5的范围、9～9.4的范围、9～9.2的范围。

上述液体试剂的上述溶剂中，除了上述甲状腺激素固定载体之外，例如还可以含有其他成分。上述其他成分无特别限制，例如可以是表面活性剂、分散剂、防腐剂、盐、金属盐、蛋白质、糖、氨基酸、螯合剂等。

上述溶剂无特别限制，例如可以是水、缓冲液、血清、血浆等。上述溶剂例如因为可以容易地将上述液体试剂的pH调节到上述范围，所以优选上述缓冲液。上述缓冲液无特制限，例如可以是Tris缓冲液、磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、硼酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、巴比妥缓冲液、各种GOOD缓冲液等。在上述溶剂为上述缓冲液的情况下，上述液体试剂中的上述缓冲液的浓度例如为0.1～2000mmol/L，优选1～1000mmol/L，更优选10～500mmol/L。

上述甲状腺激素固定载体中，上述固定的甲状腺激素例如可以是甲状腺素(以下称为T4)、3，3’，5-L-三碘甲状腺原氨酸(以下称为T3)、它们的衍生物。本发明中，上述固定的甲状腺激素只要能够相对于抗甲状腺激素抗体，与样品中的甲状腺激素竞争并结合即可。因此，上述衍生物例如可以是针对上述抗甲状腺激素抗体的T4和T3的抗原表位或者具有抗原表位的物质。上述衍生物例如可以是3-碘-L-酪氨酸、3-碘-L-甲腺原氨酸、3，5-二碘-L-酪氨酸、3，5-二碘-D-酪氨酸、3，5-二碘-L-甲腺原氨酸、3，5-二碘-D-甲腺原氨酸、3，3’，5-D-三碘甲状腺原氨酸、3，3’，5’-L-三碘甲状腺原氨酸(反T3)、D-甲状腺素等。上述固定的甲状腺激素的种类无特别限制，例如可以根据检测目标甲状腺激素的种类确定，例如可以是T3和T4中任何一者，可以是其衍生物，可以是T3和T4两者，也可以是从T3、T4和它们的衍生物中选择的两个以上的组合。

上述甲状腺激素固定载体中，固定在每一个载体上的上述甲状腺激素的数量无特别限制，可以是1个分子，但优选固定2个分子以上的多个分子。每个上述载体的固定的甲状腺激素的分子数的下限例如为1个分子，优选的是10个分子，更优选的是100分子，其上限无特别限制，例如，为1×10²⁰分子，优选的是1×10¹⁵分子，更优选的是1×10¹⁰分子。

上述载体无特别限制，其材质、形状、大小等可以适宜设定。上述载体的材质例如优选不溶于检测上述甲状腺激素时使用的溶剂。上述材质例如可以是磁性材料、硅酸质无机材料、有机材料、金属材料等。上述磁性材料例如可以是镍、钴、铁、钐、钕以及它们的合金等。上述硅酸质无机材料例如可以是玻璃、硅胶、膨润土、陶瓷、硅等。上述有机材料例如可以是塑料、葡聚糖、滤纸、海绵、乳胶、脂质体、活性炭、碳纤维等。上述金属材料例如可以是金、银、铂、钯、镍以及它们的合金等。其中，例如由于能够使用磁石等简便操作，因此优选上述磁性材料。另外，上述载体可以起标记的作用，例如可以是荧光粒子等的荧光载体。上述载体的上述形状例如可以是粒子状、棒状、片状、多孔状等，其中优选粒子状。上述载体的大小无特别限制，例如，在粒子状时，平均粒径优选0.001～10000μm，更优选的是0.01～1000μm，特别优选的是0.1～100μm。上述载体可以单独使用一种，也可以并用两种以上。

上述甲状腺激素固定载体例如可以是上述甲状腺激素直接固定在上述载体上的载体，也可以是间接固定的载体。上述间接固定无特别限制，例如可以是上述甲状腺激素和上述载体经由连接子(linker)结合的方式。上述连接子优选为相互具有特异的结合性的连接子的组合。上述甲状腺激素固定载体例如优选上述甲状腺激素和上述载体经由第一连接子和与第一连接子结合的第二连接子的结合而结合。上述第一连接子和上述第二连接子的组合例如可以例示为生物素和亲和素的组合、生物素和链亲和素的组合等。例如上述第一连接子和上述第二连接子的任何可以是生物素。本发明中，上述生物素例如除生物素之外，也可以是其衍生物，上述亲和素例如除亲和素之外，也可以是其衍生物，上述链亲和素例如除上述链亲和素之外，也可以是其衍生物。另外，上述连接子例如可以是分子，也可以是蛋白质。上述蛋白质例如可以是白蛋白、球蛋白等。

上述甲状腺激素固定载体例如优选通过生物素-亲和素结合或者生物素-链亲和素结合，将上述甲状腺激素固定在上述载体上。上述甲状腺激素固定载体例如可以是添加了上述第一连接子的甲状腺激素与添加了上述第二连接子的载体的复合体，具体例例如可以是生物素化甲状腺激素与亲和素固定载体的复合体、生物素化甲状腺激素与链亲和素固定载体的复合体、亲和素化甲状腺激素与生物素化固定载体的复合体、链亲和素化甲状腺激素与生物素化固定载体的复合体等。

上述甲状腺激素固定载体的制备方法无特别限制。上述甲状腺激素固定载体例如可以通过使上述甲状腺激素和上述载体反应来制备。具体而言，例如，如前所述，通过使添加了上述第一连接子的甲状腺激素和添加了上述第二连接子的载体反应，使上述第一连接子和上述第二连接子结合来制备。添加了上述第一连接子的甲状腺激素和添加了上述第二连接子的载体的组合无特别限制，例如可以是生物素化甲状腺激素和亲和素固定载体的组合，生物素化甲状腺激素和链亲和素固定载体的组合、亲和素化甲状腺激素和生物素化固定载体的组合，链亲和素化甲状腺激素和生物素化固定载体的组合等。添加了上述第一连接子的甲状腺激素和添加了上述第二连接子的载体例如可以使用市售品，也可以通过公知的方法制备。作为具体例，上述链亲和素固定载体例如可以使用Dynal Biotech公司生产的商品名“Dynabeads(注册商标)MyOne^TMStreptavidin T1”等。另外，上述甲状腺激素或者上述载体的生物素化例如使用市售的试剂盒来进行，具体例例如可以为同仁化学研究所公司生产的商品名“Biotin Labeling Kit-NH2”等。

添加了上述第一连接子的甲状腺激素和添加了上述第二连接子的载体的反应例如可以在溶剂中进行。上述溶剂无特别制限，例如可以使用水、缓冲液等。上述缓冲液无特别限制，例如可以是Tris缓冲液、磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、硼酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、巴比妥缓冲液、各种GOOD缓冲液等。上述反应液中的上述缓冲液的浓度例如为0.1～2000mmol/L，优选1～1000mmol/L，更优选10～500mmol/L。上述反应液的pH例如为4～11，优选5～10，更优选6～9。上述溶剂除了添加了上述第一连接子的甲状腺激素和添加了上述第二连接子的载体之外，例如可以含有其他的成分。上述其他的成分无特别限制，例如可以是表面活性剂、分散剂、防腐剂、盐、金属盐、蛋白质、糖、氨基酸、螯合剂等。

添加了上述第一连接子的甲状腺激素和添加了上述第二连接子的载体的反应条件无特别限制，例如上述连接子的组合可以根据上述载体的种类适宜决定。上述反应温度例如优选0～50℃，更优选4～40℃，反应时间例如为5～360分钟，优选30～120分钟。上述反应液中，添加了上述第一连接子的甲状腺激素和添加了上述第二连接子的载体的添加比例无特别限制，上述第一连接子的摩尔数(A)和上述第二连接子的摩尔数(B)的比(A∶B)优选1∶0.01～1∶100，更优选的是1∶0.1～1∶10。

如前所述，在固定在每一个上述载体的甲状腺激素的数量为多个分子的情况下，优选例如在每一个上述载体上添加多个上述第二连接子，将甲状腺激素经由上述第一连接子结合至上述第二连接子的各个。

在上述液体试剂中，上述甲状腺激素固定载体的浓度无特别限制。上述浓度例如为1～10000μg/mL的范围，优选5～5000μg/mL的范围，更优选10～1000μg/mL的范围。上述液体试剂例如可以含有一种上述甲状腺激素固定载体，也可以含有两种以上的上述甲状腺激素固定载体。在后者的情况下，各甲状腺激素固定载体的浓度无特别限制，例如，可以是各甲状腺激素固定载体的浓度为前述范围，也可以是各甲状腺激素固定载体的合计浓度为前述范围。

上述液体试剂的制备方法无特别限制，例如，可以通过将含有上述甲状腺激素固定载体的上述溶剂的pH的范围设定为前述范围来进行。上述pH的调节方法无特别限制。例如，可以预先在设定为前述pH的范围的、具有缓冲能力的溶剂(缓冲液)中，添加上述甲状腺激素固定载体和根据需要的其他的成分，利用上述溶剂的缓冲能力，可以将上述液体试剂的pH设定为前述范围。另外，例如，可以通过向上述溶剂中添加上述甲状腺激素固定载体和根据需要的其他成分，通过pH调节试剂调节上述溶剂的pH，来将上述液体试剂的pH设定为前述范围。上述pH调节试剂例如可以为酸、碱、缓冲剂等。

根据本发明的液体试剂，例如，在37℃保存上述液体试剂的情况下，可以在大约7天内维持上述甲状腺激素固定载体的活性。具体而言，在假设制造时的上述液体试剂中的上述甲状腺激素固定载体的活性为100％的情况下，例如，37℃下保存7天之后的上述活性维持在例如80％以上，优选85％以上，更优选90％以上。

上述液体试剂例如在治疗或诊断等临床检查中的甲状腺激素的测定等中是极其有用的。上述液体试剂的用途不限于上述临床检查，例如，除诊断和治疗之外，还适用于生化学等广泛的领域中很难过的甲状腺激素的检测中。以下相同。

<甲状腺激素固定载体的稳定方法>

本发明的溶剂中的甲状腺激素固定载体的稳定方法如前文所述，特征在于，将含有甲状腺激素固定载体的溶剂的pH设定为pH8.7～11.5。本发明的稳定方法的特征在于将含有上述甲状腺激素固定载体的上述溶剂的pH设定为前述范围，其他的步骤和条件无任何限制。上述溶剂的pH的设定例如可以引用前述的本发明的液体试剂的说明。

<甲状腺激素固定载体的液体试剂的制造方法>

本发明的甲状腺激素固定载体的液体试剂的制造方法如前文所述，特征在于，包括溶剂中的甲状腺激素固定载体的稳定步骤，上述稳定步骤通过上述本发明的稳定方法来实施。本发明的制造方法的特征在于通过上述本发明的稳定方法进行稳定步骤，其他的步骤和条件无任何限制。本发明的制造方法例如，可以引用前述本发明的液体试剂和本发明的稳定方法的说明。

<甲状腺激素的检测方法>

本发明的甲状腺激素的检测方法如前文所述，特征在于，包括使样品中的甲状腺激素和上述本发明的液体试剂的甲状腺激素固定载体与抗甲状腺激素抗体竞争性结合的结合步骤、以及、检测上述甲状腺激素固定载体与上述抗甲状腺激素抗体的复合体的步骤。

本发明中，“竞争性结合”不仅是指，例如，使样品中的甲状腺激素和上述液体试剂中的甲状腺激素固定载体与上述抗甲状腺激素抗体同时结合的意思，还含有使上述样品中的甲状腺激素和上述液体试剂中的上述甲状腺激素固定载体中的任何一者与上述抗甲状腺激素抗体结合之后，使另一者与游离的上述抗甲状腺激素抗体结合的意思。

上述检测步骤中，上述甲状腺激素固定载体与上述抗甲状腺激素抗体的复合体的检测方法无特别限制。上述复合体的检测例如可以使用标记抗甲状腺激素抗体作为上述抗甲状腺激素抗体，检测上述复合体中的上述标记抗甲状腺激素抗体的上述标记。另外，上述复合体的检测例如可以使用前述那样的起标记的作用的载体作为上述甲状腺激素固定载体中的载体，将上述复合体中的上述甲状腺激素固定载体的载体作为上述标记进行检测。此时，上述抗甲状腺激素抗体例如可以是标记抗体，也可以是未标记抗体。起标记的作用的上述载体例如可以是前述那样的荧光粒子等荧光载体等。

作为本发明的检测目标的甲状腺激素例如可以是T4、T3、其衍生物。上述衍生物例如可以是前述那样的物质。本发明中，检测目标甲状腺激素例如可以是一种，也可以是两种以上。本发明例如可以根据检测目标甲状腺激素的种类，选择上述抗甲状腺激素抗体、上述甲状腺激素固定载体的固定甲状腺激素。

上述样品无特别限制，例如可以是生物试样等试样，上述生物试样例如可以是血液等。上述血液例如可以是全血、血清、血浆等。上述样品例如可以直接使用上述试样，也可以作为溶剂中悬浮、分散或者溶解了上述试样的稀释液等使用。上述溶剂例如可以使用前述物质。上述样品例如因为处理容易所以优选液状的样品。

上述抗甲状腺激素抗体中，上述抗体无特别限制，只要是具有与上述甲状腺激素的结合性的抗体即可。上述抗体的种类无特别限制，例如，可以是IgG、IgA、IgM、IgD、IgE和IgY等免疫球蛋白分子以及这些的Fab、Fab’、F(ab’)₂等抗体片段(以下也称抗原结合片段)等。上述抗体的来源无特别限制，例如可以来源于人或者鼠、兔、牛、猪、马、羊和山羊等非人哺乳类动物、鸡等鸟类等动物物种。上述抗体例如可以从免疫动物的血清中利用以往公知的方法制备，也可以使用市售的抗体。上述抗体例如，可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。

上述抗甲状腺激素抗体例如如前文所述，可以使用标记抗甲状腺激素抗体。标记上述抗甲状腺激素抗体的标记无特别限制，只要能够检测即可。上述标记例如可以通过检测来源于上述标记的发色、发光、荧光等信号来进行检测。上述标记例如可以是能够直接检测的物质，也可以是能够间接检测的物质。前者例如可以是放射性同位元素、荧光色素等，后者例如可以是酶、过渡金属络合物、核酸等。

上述酶例如可以通过与底物反应，检测上述底物的发色、发光、荧光等，来间接检测。上述酶无特别限制，例如可以是过氧化物酶、碱式磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶等。上述底物无特别限制，例如可以根据上述酶的种类适宜决定。上述底物例如可以为2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)、3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)、二氨基联苯胺(DAB)、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)、4-甲基伞形酮基-β-D-半乳糖苷(4MUG)、3-(2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3”-β-D-半乳吡喃糖基)苯基-1，2-二氧环乙烷(AMGPD)、4-甲基伞形酮磷酸、o-苯二胺、N，N-二甲苯胺、4-氯酚、N-乙基-N-磺酸苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺酸)-m-甲苯胺、p-羟基苯基丙酸、4-氯化硝基四氮唑蓝(NBT)等。

上述过渡金属络合物例如优选通过带电而发生氧化还原反应而发光的物质。上述过渡金属络合物例如可以是钌络合物、锇络合物等。上述钌络合物例如优选三(2，2’-联吡啶)钌(II)等钌吡啶络合物。

由上述抗甲状腺激素抗体的上述标记进行的标记无特别限制，可以通过公知的方法来进行。在上述标记为碱式磷酸酶的情况下，例如可以使用同仁化学研究所社制的商品名碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(AlkalinePhosphatase Labeling Kit-SH)，制备标记抗甲状腺激素抗体。

本发明中，上述结合步骤如前文所述，是使样品中的甲状腺激素和上述甲状腺激素固定载体与上述抗甲状腺激素抗体竞争性结合的结合步骤。上述结合步骤例如为复合体形成步骤，具体而言，优选为形成上述抗甲状腺激素抗体与上述样品中的甲状腺激素的第一复合体、以及、上述抗甲状腺激素抗体与上述甲状腺激素固定载体的第二复合体的复合体形成步骤。上述第一复合体由上述抗甲状腺激素抗体与上述样品中的甲状腺激素的抗原抗体反应而形成。上述第二复合体由上述抗甲状腺激素抗体与上述甲状腺激素固定载体中的上述甲状腺激素的抗原抗体反应而形成。

上述复合体形成步骤例如可以在反应液中进行。上述反应液的溶剂无特别限制，例如可以是Tris缓冲液、磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、硼酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、巴比妥缓冲液、各种GOOD缓冲液等。上述反应液的pH无特别限制，例如，优选4～11的范围，更优选的是6～9的范围，特别优选的7～8的范围。

上述复合体形成步骤中，使用上述本发明的液体试剂作为上述甲状腺激素固定载体。上述抗甲状腺激素抗体可以是干燥的形态，也可以是潮湿的形态，例如，因为处理容易，所以优选使用液体试剂。上述抗甲状腺激素抗体的液体试剂例如为溶剂中含有上述抗甲状腺激素抗体的形态。上述溶剂无特别限制，例如可以是水、缓冲液等，上述缓冲液例如可以是与前述相同的物质。上述抗甲状腺激素抗体的液体试剂的pH无特别限制，例如，优选4～11的范围，更优选6～9的范围，特别优选7～8的范围。对于上述抗甲状腺激素抗体的液体试剂，例如上述溶剂中除了上述抗甲状腺激素抗体之外，还含有其他的成分。

上述复合体形成步骤例如通过使上述样品和上述抗甲状腺激素抗体、上述甲状腺激素固定载体与上述抗甲状腺激素抗体接触来进行。其接触顺序无特别限制。具体而言，上述复合体形成步骤例如可以是下述(A1)、(A2)或(A3)的步骤。

(A1)在反应液中，使上述样品、上述抗甲状腺激素抗体和上述液体试剂同时接触，形成上述第一复合体和上述第二复合体的复合体形成步骤

(A2)在反应液中，使上述样品和上述抗甲状腺激素抗体接触，形成上述第一复合体，然后在上述反应液中添加上述液体试剂，形成上述第二复合体的复合体形成步骤

(A3)在反应液中，使上述液体试剂和上述抗甲状腺激素抗体接触，形成上述第二复合体，然后，向上述反应液中添加上述样品，形成上述第一复合体的复合体形成步骤

上述(A1)步骤中，在上述反应液中，例如，上述样品中的甲状腺激素和上述液体试剂中的甲状腺激素固定载体同时与上述抗甲状腺激素抗体竞争性结合。由此，形成上述抗甲状腺激素抗体与上述样品中的甲状腺激素的第一复合体、以及、上述抗甲状腺激素抗体与上述甲状腺激素固定载体的第二复合体。

上述(A2)步骤中，在上述反应液中，例如，首先，上述样品中的甲状腺激素与上述抗甲状腺激素抗体结合，形成上述第一复合体。接着，在上述反应液中，未与上述样品中的甲状腺激素结合的游离的上述抗甲状腺激素抗体和上述液体试剂中的甲状腺激素固定载体结合，形成上述第二复合体。

上述(A3)步骤中，在上述反应液中，例如，首先，上述液体试剂中的甲状腺激素固定载体与上述抗甲状腺激素抗体结合，形成上述第二复合体。接着，在上述反应液中，未与上述甲状腺激素固定载体结合的游离的上述抗甲状腺激素抗体和上述样品中的甲状腺激素结合，形成上述第一复合体。

本发明中，上述检测步骤如前文所述，是检测上述甲状腺激素固定载体与上述抗甲状腺激素抗体的复合体的步骤。在使用上述标记抗甲状腺激素抗体作为上述抗甲状腺激素抗体，检测上述标记的情况下，上述检测步骤例如也可以说是检测上述第二复合体中的上述标记抗甲状腺激素抗体的上述标记的步骤。另外，在作为上述甲状腺激素固定载体，使用起标记的作用的载体，将上述载体作为标记进行检测的情况下，上述检测步骤例如，也可以说是检测上述第二复合体中的上述甲状腺激素固定载体的上述载体的步骤。

上述标记的检测方法无特别限制，例如，可以根据上述标记的种类适宜决定。上述标记如前文所述，例如可以通过检测来源于上述标记的发色、发光、荧光等信号来进行。上述信号的检测例如可以目视进行，也可以通过光学手法进行。在后者的情况下，例如，使用光学分析机器等测定反射率、透过率、吸光度、荧光强度等。上述标记的检测例如可以是定性，也可以是定量。通过上述标记的检测，例如可以检测上述甲状腺激素固定载体与上述抗甲状腺激素抗体的复合体，可以基于其结果而间接检测上述样品中的甲状腺激素。

上述复合体形成步骤中，例如，上述第二复合体的形成量取决于上述样品中的甲状腺激素量。即，例如，随着上述样品中的甲状腺激素量的增加，上述第二复合体的形成量相对减少，随着上述样品中的甲状腺激素量的减少，上述第二复合体的形成量相对增加。因此，例如，通过使用表示来源于上述标记(对应于上述第二复合体的形成量)的信号强度和甲状腺激素量的相关关系的标准曲线，来对上述样品中的甲状腺激素量进行定量。上述标准曲线例如可以使用已知量的甲状腺激素，在相同的条件下，形成上述第一复合体和上述第二复合体，检测来源于上述第二复合体中的来源于上述标记的信号强度，基于上述甲状腺激素量和上述标记的信号强度而制成。

本发明的检测方法在上述结合步骤之后，即在上述复合体形成步骤之后，在上述检测步骤之前，优选还包括回收结合了上述甲状腺激素固定载体的上述标记抗甲状腺激素抗体的步骤。上述回收步骤例如也可以说是上述甲状腺激素固定载体与上述标记抗甲状腺激素抗体的复合体，即上述第二复合体的回收步骤。通过回收上述第二复合体，例如，可以将上述第二复合体从上述第一复合体和未反应的上述标记抗甲状腺激素抗体等中分离。由此，例如，排除上述第一复合体的上述标记抗甲状腺激素抗体的标记和未反应的上述标记抗甲状腺激素抗体的标记的检测，可以更准确地检测上述第二复合体的上述标记抗甲状腺激素抗体的上述标记。

上述第二复合体的回收方法无特别限制，例如，可以根据上述载体的种类适宜设定。上述第二复合体例如可以从上述反应液中回收。上述回收方法例如可以是捕获上述第二复合体中的上述甲状腺激素固定载体的上述载体的方法、离心处理、过滤处理、沉淀处理、膜分离处理、吸附处理等。在上述载体由上述磁性材料形成的情况下，例如，可以通过磁石等的磁力来回收上述第二复合体。

本发明的检测方法例如，可以在回收上述第二复合体之后，还含有洗涤上述第二复合体的步骤。由此，例如，在含有上述第二复合体的级分中包含上述第一复合体和上述未反应的上述标记抗甲状腺激素抗体的情况下，充分将其除去。

本发明的检测方法在使用前述那样起标记的作用的载体，检测上述第二复合体中的上述甲状腺激素固定载体的载体作为上述标记的情况下，作为上述抗甲状腺激素抗体，例如可以使用固定在容器和板等基板上的上述抗甲状腺激素抗体。在这种情况下，本发明的检测方法例如在上述结合步骤之后，即上述复合体形成步骤之后，在上述检测步骤之前，还含有洗涤上述固定抗甲状腺激素抗体的步骤。通过上述洗涤，例如除去未与上述固定抗甲状腺激素抗体结合的成分。因此，例如，可以排除未与上述固定抗甲状腺激素抗体结合的上述甲状腺激素固定载体的上述载体的检测，更准确地检测与上述固定抗甲状腺激素抗体结合的上述甲状腺激素固定载体的上述载体作为标记。

以下，以使用磁性粒子作为上述甲状腺激素固定载体的载体、使用酶作为上述标记抗甲状腺激素抗体的标记为例，说明本发明的检测方法。其仅为示例而已并不限制本发明。

首先，混合液体的样品和上述标记抗甲状腺激素抗体，在该反应液中，使上述样品中的甲状腺激素和上述标记抗甲状腺激素抗体结合，形成上述第一复合体。

反应pH例如为4～11，优选6～9，更优选7～8。反应温度例如为4～60℃，优选20～50℃，更优选30～40℃。反应时间例如为1～30分钟，更优选2～20分钟，更优选5～10分钟。每1mL上述反应液的上述标记抗甲状腺激素抗体的添加量例如为0.05～5μg，优选的是0.1～1μg。

接着，向上述反应液中，添加上述甲状腺激素固定载体的液体试剂。上述液体试剂使用pH8.7～11.5的条件下保存的本发明的液体试剂。并且，在上述反应液中，使未与上述样品中的甲状腺激素结合的未反应的上述标记抗甲状腺激素抗体和上述甲状腺激素固定载体结合，形成上述第二复合体。

反应pH例如为4～11，优选6～9，更优选7～8。反应温度例如为4～60℃，优选20～50℃，更优选30～40℃。反应时间例如为1～30分钟，优选2～20分钟，更优选5～10分钟。每1mL上述反应液的上述甲状腺激素固定载体的添加量例如为0.001～5mg，优选的是0.01～1mg。

使用上述磁石，利用磁力，回收含有上述甲状腺激素固定载体的上述第二复合体并保持。此时，将磁石配置在加入了上述反应液的容器的外部，经由上述容器的壁回收上述第二复合体。如此，在保持上述第二复合体的状态下，除去上述容器内的反应液。由此可以除去未反应的上述标记抗甲状腺激素抗体。该分离方法一般称为结合(B)/游离(F)分离。

接着，释放磁力，重新向反应液中添加上述第二复合体。上述反应液中，例如在上述第二复合体的添加前或者添加后，优选添加针对上述标记抗甲状腺激素抗体的上述标记酶的底物。上述底物的种类例如可以根据上述标记酶的种类适宜决定。上述反应液的条件例如可以根据上述标记酶和上述底物的种类适宜确定。

在上述反应液中，进行上述第二复合体中的上述标记抗甲状腺激素抗体的上述标记酶的酶反应，测定由酶反应产生的信号的强度。上述反应条件无特别限制，反应pH例如为4～12，优选的是6～11，更优选的是8～10。反应温度例如为4～60℃，优选20～50℃，更优选30～40℃。反应时间例如为1～30分钟，优选2～20分钟，更优选5～10分钟。

然后基于预先制成的表示甲状腺激素的量和信号强度的相关关系的标准曲线确定上述样品中的甲状腺激素的量。

另外，在使用上述过渡金属络合物作为上述标记抗甲状腺激素抗体的标记的情况下，例如可以如下所述地进行检测。除非特别指出，与前述相同。

上述过渡金属络合物例如通过供给电能来电化学发光。因此，例如，通过对前述那样分离的上述第二复合体供给电能，来使上述过渡金属络合物发光，如果通过检测该发光信号来检测作为上述标记的过渡金属络合物，则能够基于该测定结果，检测上述样品中的甲状腺激素。

在使用上述过渡金属络合物的情况下，由于如前述地供给电能，因此优选在电极上向上述第二复合体供给电能。上述电极例如可以是工作电极。

上述过渡金属络合物例如优选钌络合物，其中，优选前述那样的钌络合物。在使用上述过渡金属络合物作为上述标记的情况下，优选并用三丙胺(TPA)。通过如此并用TPA，可以如下所述地使得从上述第二复合体发光。首先，通过向上述电极给予正电位，上述第二复合体中的钌络合物从2价氧化到3价，同时上述TPA也被氧化。氧化的上述TPA由于脱氢而转变成TPA自由基，还原上述3价的钌络合物，变成激发状态的2价钌络合物。然后，钌络合物在从不稳定的激发状态过渡到稳定的2价的状态时发光。通过再次给予正电位，恢复到稳定状态的2价的钌络合物反复进行以上的激发发光。

<甲状腺激素的检测试剂盒>

本发明的甲状腺激素的检测试剂盒的特征在于，其含有上述本发明的甲状腺激素固定载体的液体试剂以及抗甲状腺激素抗体，在上述本发明的检测方法中使用。本发明的检测试剂盒例如可以引用前述本发明的液体试剂和本发明的检测方法的说明。上述检测试剂盒由于含有上述甲状腺激素固定载体作为试剂，因此例如与以往那样的上述3试剂系相比，试剂数少，成本低。

本发明的检测试剂盒中，上述抗甲状腺激素抗体例如如前文所述，可以是干燥状态，也可以是潮湿状态，例如因为处理容易所以优选前述那样的液体试剂。本发明的检测试剂盒中，上述抗甲状腺激素抗体和上述甲状腺激素固定载体优选分别收纳在单独的容器中。上述检测试剂盒例如还可以含有使用说明书。

具体实施方式

接下来，说明本发明的实施例。另外，本发明不限于下述实施例。

[实施例1]

本例中，制备甲状腺激素固定载体的液体试剂，评价保存稳定性。

(1)甲状腺激素固定载体的液体试剂的制备

将L-甲状腺素(Nacalai Tesque公司制造)生物素化，获得生物素化T4。上述生物素化使用生物素标记试剂盒(Biotin Labeling Kit)-NH2(商品名，同仁化学研究所公司制造)根据其使用说明书进行。然后，混合上述生物素化T4和被覆有链亲和素的磁性微粒子(Dynal Biotech公司制造的商品名Dynabeads(注册商标)MyOne^TM Streptavidin T1)，使上述生物素化T4的生物素与被覆有上述链亲和素的磁性微粒子结合，获得固定了T4的T4固定磁性粒子。上述生物素与链亲和素的结合在Tris缓冲液溶剂中、37℃、60分钟、pH7.4的条件下进行。上述溶剂中的上述生物素化T4和上述被覆有链亲和素的磁性微粒子的添加比例为相对于总链亲和素量为过剩量的生物素化T4。

将上述T4固定磁性粒子与下述缓冲液1混合，使之为50μg/mL，制备pH不同的液体试剂。上述液体试剂的pH分别为8.7、8.8、9.0、9.2、9.4、9.5、10.5。将上述T4固定磁性粒子与下述缓冲液2混合使之为50μg/mL，制备pH不同的液体试剂。上述液体试剂的pH分别为7.0、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6。将pH8.7～10.5的上述液体试剂作为实施例1的液体试剂，将pH7.0～8.6的试剂作为比较例1的液体试剂。

(缓冲液1：pH8.7～10.5)

50mmol/L Tris

150mmol/L NaCl

0.1％BSA

0.05％NaN₃

(缓冲液2：pH7.0～8.6)

50mmol/L Tris

150mmol/L NaCl

0.1％BSA

0.05％NaN₃

(2)由竞争性酶免疫测定进行甲状腺激素的测定

将抗T4鼠单克隆抗体用酶标记，获得酶标记抗体。上述酶标记使用Alkaline Phosphatase Labeling Kit-SH(商品名，同仁化学研究所公司生产)，按照其使用说明书进行。然后，将上述酶标记抗体与下述缓冲液3混合使之为0.2μg/mL，制备酶标记抗体液。

(缓冲液3：pH7.0)

50mmol/L Tris

150mmol/L NaCl

0.1％ BSA

0.05％ NaN₃

0.025mmol/L ZnCl₂

5mmol/L MgCl₂

使用游离T4浓度已知的人血清(n＝2)作为上述样品。将上述酶标记抗体液100μL和上述样品10μL在1.5mL试管(商品代码MCT-150-L-C、Axygen公司生产)内混合，于37℃孵育5分钟。孵育之后，在上述混合液中混合上述实施例1或者上述比较例1的液体试剂100μL，于37℃孵育5分钟。然后，在上述试管的外壁配置磁石，利用磁力将上述混合液中的上述T4固定磁性粒子捕获到上述试管的内壁侧，在该状态下，除去上述试管内的液体。接着，释放上述磁力，向上述试管内添加洗涤液，与上述T4固定磁性粒子混合。将该洗涤步骤进行3次。上述洗涤液使用含有0.05％的Tween20(注册商标)的Tris缓冲液。再次捕获上述T4固定磁性粒子，除去上述试管内的液体，添加0.6mmol/L 4-4-甲基伞形酮磷酸液500μL，与上述T4固定磁性粒子混合之后，于37℃孵育10分钟。孵育之后，与前述同样地捕获上述T4固定磁性粒子，回收上述试管内的液体。在向上述液体中添加2mol/L NaOH 50μL之后，测定生成的4-甲基伞形酮的荧光强度(测定波长：450nm)。测定进行两次，将其平均值作为测定值。

(3)保存稳定性的评价

将上述实施例1和上述比较例1的液体试剂分别于37℃保存7日。并且，在保存开始前(0日)、以及、从保存开始起7日后对各液体试剂进行上述(2)所示的竞争性酶免疫测定，测定样品中的游离T4。

然后，将使用了保存开始前的液体试剂的测定值(X₀)和保存了7日之后的液体试剂的测定值(X₇)，代入下述式(I)中，求出上述T4固定磁性粒子的活性的残存率(％)。

活性的残存率(％)＝(X₇/X₀)×100 (I)

下述表1中示出上述液体试剂的pH和上述活性的残存率的关系。如表1所示，将pH设定为8.7以上的实施例1的液体试剂与将pH设定为小于8.7的比较例1的液体试剂相比，保存后的活性残存率较高。由该结果可知，通过将液体试剂的pH设定为8.7以上，液体状态下的T4固定磁性粒子的稳定性提高。

【表1】

如以上所述，根据本发明，通过将上述液体试剂的pH设为上述规定范围，能够使上述甲状腺激素固定载体稳定，因此例如可以长期保存上述甲状腺激素固定载体。因此，根据本发明，例如不需要如以往那样，在每次测定时都要制备甲状腺激素固定载体，可以低成本、简便并且短时间地测定甲状腺激素。因此，本发明在临床检查等中是极其有用的。此外，本发明不仅限于临床检查，例如，可以适用于生物化学等广泛的领域中的甲状腺激素的检测。

本发明可以在不违背其精神或实质的情况下以其他形式实现。本申请中公开的实施方式应被认为在各个方面都是阐述性的而并非限制性的。本发明的范围由所附权利要求而不是由前述说明书来指示，并且权利要求的含义之内以及权利要求的等价范围之内的所有改变均包含在内。

Claims

1.甲状腺激素固定载体的液体试剂，其特征在于，

包括甲状腺激素固定载体和溶剂，

含有上述甲状腺激素固定载体的上述溶剂的pH处于pH8.7～11.5的范围。

2.根据权利要求1所述的液体试剂，含有上述甲状腺激素固定载体的上述溶剂的pH处于pH8.7～10.5的范围。

3.根据权利要求1或2所述的液体试剂，上述甲状腺激素固定载体为通过生物素-亲和素结合或者生物素-链亲和素结合而固定了甲状腺激素的载体。

4.根据权利要求1至3中任意一项所述的液体试剂，

上述甲状腺激素固定载体为亲和素固定载体或链亲和素固定载体与生物素化甲状腺激素的复合体。

5.根据权利要求1至4中任意一项所述的液体试剂，上述甲状腺激素固定载体的载体为磁性粒子。

6.根据权利要求1至5中任意一项所述的液体试剂，上述甲状腺激素为甲状腺素(T4)或者3，3’，5-L-三碘甲状腺原氨酸(T3)。

7.溶剂中的甲状腺激素固定载体的稳定方法，其特征在于，将含有甲状腺激素固定载体的溶剂的pH设定为pH8.7～11.5。

8.根据权利要求7所述的稳定方法，将含有上述甲状腺激素固定载体的上述溶剂的pH设定为pH8.7～10.5。

9.根据权利要求7或8所述的稳定方法，上述甲状腺激素固定载体为通过生物素-亲和素结合或者生物素-链亲和素结合而固定了甲状腺激素的载体。

10.根据权利要求7至9中任意一项所述的稳定方法，上述甲状腺激素固定载体为亲和素固定载体或者链亲和素固定载体与生物素化甲状腺激素的复合体。

11.根据权利要求7至10中任意一项所述的稳定方法，上述甲状腺激素固定载体的载体为磁性粒子。

12.甲状腺激素固定载体的液体试剂的制造方法，其特征在于，包括对溶剂中的甲状腺激素固定载体的稳定步骤，上述稳定步骤通过权利要求7至11中任意一项所述的稳定方法实施。

13.甲状腺激素的检测方法，其特征在于，包括：

使样品中的甲状腺激素和权利要求1至6中任意一项所述的液体试剂的甲状腺激素固定载体与抗甲状腺激素抗体竞争性结合的结合步骤，以及，

检测上述甲状腺激素固定载体与上述抗甲状腺激素抗体的复合体的步骤。

14.根据权利要求13所述的检测方法，上述结合步骤为形成上述抗甲状腺激素抗体与上述样品中的甲状腺激素的第一复合体、以及、形成上述抗甲状腺激素抗体与上述甲状腺激素固定载体的第二复合体的复合体形成步骤。

15.根据权利要求14所述的检测方法，上述复合体形成步骤为下述(A1)、(A2)或(A3)的任何步骤：

(A1)在反应液中，使上述样品、上述抗甲状腺激素抗体和上述液体试剂同时接触，形成上述第一复合体和上述第二复合体的复合体的形成步骤，

(A2)在反应液中，使上述样品和上述抗甲状腺激素抗体接触，形成上述第一复合体，然后在上述反应液中添加上述液体试剂，形成上述第二复合体的复合体形成步骤，

(A3)在反应液中，使上述液体试剂和上述抗甲状腺激素抗体接触，形成上述第二复合体，然后，向上述反应液中添加上述样品，形成上述第一复合体的复合体形成步骤。

16.根据权利要求13至15中任意一项所述的检测方法，还包括回收与上述甲状腺激素固定载体结合了的上述抗甲状腺激素抗体的步骤。

17.甲状腺激素的检测试剂盒，其特征在于：含有权利要求1至6中任意一项所述的甲状腺激素固定载体的液体试剂以及抗甲状腺激素抗体，

并在权利要求13至16中任意一项所述的检测方法中使用。