CN110988342B - 幽门螺杆菌磁微粒化学发光法检测试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物学检测技术领域，尤其涉及幽门螺杆菌磁微粒化学发光法检测试剂。本发明提供的幽门螺杆菌磁微粒化学发光法检测试剂盒，包括包被Hp抗原的磁微粒，所述Hp抗原为天然抗原。本发明所述试剂盒以血浆或血清为样品，皆能够准确分辨Hp与其他病原菌，并具有良好的重复性以及抗干扰能力。与溶液选择不当的对照组相比，本发明提供的试剂盒灵敏度与特异性皆更优秀。而对照组即便采用特异性更强的抗原仍无法获得更好的效果。本发明试剂盒检测结果不涉及Hp分型。

Description

幽门螺杆菌磁微粒化学发光法检测试剂
技术领域
本发明涉及生物学检测技术领域，尤其涉及幽门螺杆菌磁微粒化学发光法检测试剂。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter.Pylori，Hp)是目前发现的人胃中生存的唯一微生物种类，常见感染途径主要是口-口传播和粪-口传播。幽门螺杆菌感染是一个全球性的卫生问题，在不同国家和地区，幽门螺杆菌的感染率各不相同，总体而言，发展中国家感染率要高于发达国家。
幽门螺杆菌感染是胃炎及消化性溃疡的最主要因素，同时也能诱发胃癌发生，与非消化性溃疡的发生也有密切关系。感染后大部分患者出现不同程度的慢性炎症，部分人群会发生消化性溃疡，只有极少数会出现胃部恶性肿瘤。世界卫生组织于1994年正式将幽门螺杆菌列为一类生物致癌因子。
幽门螺杆菌表型分型主要分为两类，I型和Ⅱ型；其中I型菌株具有CagA和(或)VacA，Ⅱ型菌株不具有CagA和VacA。幽门螺杆菌基因高度变异，因此表型分型不完全适用于Hp分型，基因分型逐渐成为幽门螺杆菌分型的主要手段。例如根据CagA3’端EPIYA结构中酪氨酸磷酸化程度可将Hp分为四种类型：EPIYA-A，EPIYA-B，EPIYA-C，EPIYA-D。其中EPIYA-A和EPIYA-B为东西方共有，而EPIYA-C则主要集中在欧洲、北美和澳大利亚等地，EPIYA-D则常见于东亚地区(中国、韩国、日本等地)，并且EPIYA-D的毒性及致癌性要高于EPIYA-C。VacA基因结构可分为信号区s(s1a、s1b、s1c、s2)、中区m(m1、m2)、中间区i(i1、i2)。不同基因结构的Hp菌株在致病性上也有所不同。s1/m1型Hp菌株毒素量大，具有更高的空泡毒性，能够引发胃癌和消化性溃疡。而s1/m2型Hp菌株产中等量毒素，s2/m2或s2/m1型Hp菌株毒素产量少或不产毒素。而在自然状态下，s1/m1和s2m2型Hp菌株其i型只有i1或者i2；s1/m2型Hp菌株i型不同，并且i型决定VacA空泡活性，i1型的VacA与胃腺癌的发生相关。
现有检测幽门螺杆菌感染的方法主要分为两大类：侵入式和非侵入式。其中侵入式主要利用胃镜取材进行相关检测，常见方法有细菌培养、快速尿素酶检测、组织学检测等，非侵入式方法主要有13C/14C呼气试验、粪便抗原检测和血清学抗体检测等，其中呼气试验是目前临床检测幽门螺杆菌最为推荐的方法。但呼气试验14C放射性较强，不适用于孕妇和老人儿童等群体；13C无放射性，适用于所有人群，但价格昂贵。
磁微粒化学发光法是化学发光分析技术与磁性微粒分离技术相结合形成的一种检测方法，近几年快速发展，具有灵敏度高，特异性强，线性范围宽，简单快速，安全无毒，重复性均较高的特点。在磁微粒上偶联Hp抗原，则可利用磁微粒化学发光法可实现对Hp的快速、准确检测。但在检测过程中，各种缓冲液对检测结果的影响比较大，不当的缓冲液会使阳性样品的荧光值降低从而难以与阴性样本区分，因此，目前尚没有良好的以磁微粒化学发光检测Hp抗体的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供幽门螺杆菌磁微粒化学发光法检测试剂，该试剂能够实现对幽门螺杆菌的快速、准确检测。
本发明基于间接法，以幽门螺杆菌Hp抗原为包被抗原，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG抗体作为酶结合物，建立了幽门螺杆菌IgG抗体的磁微粒化学法检测试剂盒。
本发明提供的幽门螺杆菌磁微粒化学发光法检测试剂盒，其包括包被Hp抗原的磁微粒，所述Hp抗原为天然抗原。
所述Hp抗原为提取自幽门螺杆菌的蛋白，分子量为100kDa，主要组成为Ure、HSP。
本发明中，所述包被Hp抗原的磁微粒为经过活化的羧基磁微粒。
所述磁微粒的活化采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和N-N-羟基琥珀酰亚胺。所述活化中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，浓度为20mg/ml；N-N-羟基琥珀酰亚胺，浓度为20mg/ml，磁微粒的密度为30mg/mL。
磁珠与抗原的比例影响包被的结果，最终影响检测效果。本发明中，所述Hp抗原与磁微粒的质量比为(2～3):2。一些具体实施例中，所述Hp抗原与磁微粒的质量比为2.83:2。
所述包被Hp抗原的磁微粒的制备方法为：将Hp抗原与活化后的羧基磁微粒混合，于酸性溶液中孵育，获得包被的磁微粒。
本发明中，所述酸性溶液为pH 4.75的醋酸钠水溶液。具体的，醋酸钠溶液中醋酸钠的浓度为0.05mol/L。
本发明中，所述包被Hp抗原的磁微粒以封闭液悬浮；
所述封闭液由水和如下组分组成：
Figure BDA0002322045540000031
本发明所述的封闭液有利于维持包被Hp抗原的磁微粒的稳定，且能够减少非特异吸附，提高检测的特异性和灵敏性。本发明中，以封闭液悬浮包被Hp抗原的磁微粒至其浓度为1mg/ml。
本发明所述的试剂盒中还包括酶标记物溶液；所述酶标记物为辣根过氧化酶标记的抗人IgG抗体；所述酶标记物存放于酶稀释液中，所述酶稀释液由水和如下组分组成：
Figure BDA0002322045540000032
所述酶标记物的制备方法包括：活化的辣根过氧化酶与抗人IgG抗体混合孵育，其中，抗人IgG抗体的浓度为50μg/L，辣根过氧化酶浓度为1mg/L。酶标记物溶液中，酶标记物的浓度为0.1μg/L。
本发明所述的试剂盒中还包括样本稀释液，所述样本稀释液由水和如下组分组成：
Figure BDA0002322045540000033
Figure BDA0002322045540000041
该样本稀释液不仅能够提高检测的特异性，降低本底，避免假阳性产生，还能够提高灵敏度、降低血液样本中血红蛋白、甘油三酯等物质对结果产生的干扰。
本发明所述的试剂盒中还包括还包括：发光底物液A和发光底物液B，
所述发光底物液A由0.1mol/LPBS缓冲液、5mmol/L过氧化脲和10mmol/L羟基喹啉组成；
所述发光底物液B由0.1mol/LPBS缓冲液和1g/L鲁米诺组成。
本发明还提供了幽门螺杆菌的磁微粒化学发光检测方法，其以本发明所述的试剂盒对待测样本进行检测。
本发明提供的幽门螺杆菌的磁微粒化学发光检测方法包括：
将待测样本、包被Hp抗原的磁珠悬液和样本稀释液混合，37℃反应10～20min，然后以PBS缓冲液洗涤；加入酶标记物溶液，37℃反应10～20min，然后以PBS缓冲液洗涤；加入发光底物液A和发光底物液B于37℃反应5min检测发光值。根据发光值判断样本是否为Hp阳性。
所述待测样本、包被Hp抗原的磁珠悬液和样本稀释液的体积比为5:2:5。
具体实施例中，所述待测样本、包被Hp抗原的磁珠悬液和样本稀释液混合后形成的反应体系的体积为120μL。
所述酶标记物溶液的体积与样本稀释液的体积比为2:1。
所述发光底物液A和发光底物液B的体积比为1:1。
所述发光底物液A和发光底物液B的体积之和与酶标记物溶液体积相等。
本发明中，所述待测样本为血清或血浆。
本发明提供的幽门螺杆菌磁微粒化学发光法检测试剂盒，包括包被Hp抗原的磁微粒，所述Hp抗原为天然抗原。本发明所述试剂盒以血浆或血清为样品，皆能够准确分辨Hp与其他病原菌，并具有良好的重复性以及抗干扰能力。与溶液选择不当的对照组相比，本发明提供的试剂盒灵敏度与特异性皆更优秀。而对照组即便采用特异性更强的抗原仍无法获得更好的效果。本发明试剂盒检测结果不涉及Hp分型。
具体实施方式
本发明提供了幽门螺杆菌磁微粒化学发光法检测试剂，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
所述HP天然抗原提取自幽门螺杆菌的蛋白，分子量为100kDa，主要组成为Ure、HSP，本发明实施例中使用的Hp天然抗原购自郑州伊美诺生物技术有限公司。
所述重组HP抗原片段为CagA、VacA，采用基因工程方法以大肠杆菌为表达菌株诱导表达获得。
所述抗人IgG抗体为鼠抗人IgG抗体。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1试剂盒的制备：
1、磁微粒的包被
将特异性抗原氨基与磁微粒羧基共价偶联的方式连接到磁珠上的过程,称为磁微粒包被；制备得到的磁微粒抗原的结合物称为磁微粒包被物。包被的基本原理为抗原或抗体表面的氨基或羧基或巯基与磁珠表面的化学基团，在化学交联剂的作用下，发生化学反应，形成抗原或者抗体-磁微粒的共价结合物，该共价结合物经过洗涤和封闭，去除未反应的抗原或抗体，以及封闭非特异性结合的位点，最终制备成试剂盒中的磁珠包被物，具体步骤包括：
1.1将磁珠混匀悬浮，取1倍体积的羧基修饰的磁珠原液用70倍体积的洗涤液清洗后，置于磁铁上分离磁珠；
1.2分离出的磁珠中加入溶解的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和N-N-羟基琥珀酰亚胺活化；
1.3将1.2活化后的磁珠加入pH4.75的0.05mol/L醋酸钠水溶液和1倍体积的幽门螺杆菌Hp抗原(天然抗原)，使溶液中，抗原浓度为2.83mg/ml；磁珠浓度：2mg/ml，进行18-25℃孵育30min；
1.4分离1.3得到的磁珠，用封闭液悬浮至磁珠密度为1mg/mL；
封闭液为：Tris-HCl缓冲液，0.02mol/L；BSA，30g/L；ADP，1g/L；硫柳汞钠盐，0.2g/L；吐温20，1g/L。
2、酶标记物的制备
将抗人IgG抗体通过共价偶联的方式结合到辣根过氧化物酶上的过程，称为酶标记；辣根过氧化物酶标记物可以通过常规的酶标记的方法获得；酶标记物存放于酶稀释液中。
具体步骤为：辣根过氧化物酶(HRP)用常规改良过碘酸钠法活化后，加入浓度为抗人IgG抗体，溶液中抗人IgG抗体浓度为50μg/L，辣根过氧化酶浓度为1mg/L，2～8℃反应过夜，加硼氢化钠还原酶结合物，透析去除未反应的试剂，存放于酶稀释液至酶标记物浓度为0.1μg/L。
酶稀释液组成为：Tris-HCl缓冲液，0.02mol/L；ADP，1g/L；吐温20，1g/L；硫柳汞钠盐，0.2g/L。
3、配制样本稀释液和发光底物液
样本稀释液：Tris-HCl缓冲液，0.02mol/L；ADP，1g/L；吐温20，1g/L；硫柳汞钠盐，0.2g/L；Casein 1g/ml；
发光底物液A：0.1mol/LPBS缓冲液；过氧化脲，5mmol/L；羟基喹啉，10mmol/L；
发光底物液B：0.1mol/LPBS缓冲液；鲁米诺，浓度为1g/L。
如上制得的，磁微粒悬液、酶标记物溶液、样本稀释液、发光底物液A、发光底物液B分别独立包装，制得试剂盒。
实施例2
选取通过13C呼气试验检测方法确诊为Hp阳性和Hp阴性的样本各15份对实施例1制得的试剂盒进行验证。
样本为血清。具体的检测方法为：
样本(50μl)+包被Hp抗原的磁珠悬液(20μl)+样本稀释液(50μl)，37℃反应10～20min，0.1mol/L PBS缓冲溶液洗涤，加入酶标记物溶液(100μl)，37℃反应10～20min，0.1mol/L PBS缓冲溶液洗涤，加入发光底物液A和B各50μl于37℃反应5min检测发光值。建立了参考值，依据参考值判定样本检测结果。上述检测方法配合郑州安图生物工程股份有限公司生产的全自动化学发光仪AutoLumo A2000或AutoLumo A2000Plus使用。
采用上述试剂配方、方法及反应模式检测了临床幽门螺杆菌阳性样本15例和临床幽门螺杆菌阴性样本15例，结果如下：
表1样本检测结果
Figure BDA0002322045540000071
表中结果表明，本试剂盒检测临床幽门螺杆菌阴性和阳性样本，阳性样本信号值远高于阴性样本信号值，阴性样本与阳性样本信号值差异明显，本试剂采用的配方及检测方法能够准确、有效区分临床阴性样本与阳性样本。
对比例1
制备方法与实施例1相同，但磁微粒的包被步骤中，磁微粒表面包被抗原为重组抗原，各试剂中不含有吐温20以及Casein。
即样品稀释液为：Tris-HCl缓冲液，0.02mol/L；ADP，1g/L；硫柳汞钠盐，0.2g/L。
封闭液为：Tris-HCl缓冲液，0.02mol/L；BSA，30g/L；ADP，1g/L；硫柳汞钠盐，0.2g/L。
酶稀释液组成为：Tris-HCl缓冲液，0.02mol/L；ADP，1g/L；硫柳汞钠盐，0.2g/L。
实施例3：试剂盒性能评价
1.选取通过13C呼气试验检测方法确诊为Hp阳性和Hp阴性的血清样本各150份，采用实施例1和对比例1的试剂盒对所选样本进行检测，方法与实施例2相同，结果如下表；
表2.临床确诊样本与本试剂盒检测结果对比
Figure BDA0002322045540000081
从表2中可知，本试剂盒灵敏度和特异性较好，与临床符合率较高。
2.重复性
选用4份不同浓度的幽门螺杆菌Hp IgG抗体阳性样本(样本1、样本2、样本3、样本4)，重复20次；结果见表3；结果表明，实施例1的试剂盒检测不同浓度Hp IgG抗体阳性样本结果变异系数小，重复性好，结果可靠。
表3重复性验证结果
Figure BDA0002322045540000082
Figure BDA0002322045540000091
3.交叉反应
选取临床确诊的含如下病原体感染的Hp阴性样本各10例，病原体包括弯曲菌属、芽孢杆菌属、埃希菌属、肠杆菌属、变形杆菌属、白色念珠菌、肠球菌属、克雷伯氏菌属；检出结果见表4。结果表明实施例1的试剂盒与上述病原体无交叉反应性。
表4.交叉反应评估
病原体 阴性样本检出 阳性样本检出
弯曲菌属 10 0
芽孢杆菌属 10 0
埃希菌属 10 0
肠杆菌属 10 0
变形杆菌属 10 0
白色念珠菌 10 0
肠球菌属 10 0
克雷伯氏菌属 10 0
4.干扰试验
4.1分别在Hp阴性样本(血清)中分别添加纯品血红蛋白(样本中终浓度为100mg/dl、150mg/dl、250mg/dl、500mg/dl、1000mg/ml)、甘油三酯(样本中终浓度为100mg/dl、500mg/dl、1500mg/dl、3000mg/dl、5000mg/dl)、胆红素(10mg/dl、20mg/dl、30mg/dl、40mg/dl、50mg/dl)；以实施例1提供的试剂盒进行检测，检测结果见表5；
表5.血红蛋白、甘油三酯和胆红素对阴性样本干扰验证
Figure BDA0002322045540000092
Figure BDA0002322045540000101
4.2在6份Hp阳性样本(2份弱阳性、3份中强阳性、1份强阳性)中分别添加纯品：血红蛋白、甘油三酯和胆红素进行检测，使样本中终浓度分别为血红蛋白250mg/dl、甘油三酯1500mg/dl、胆红素30mg/dl，检测结果见表6。对10份类风湿因子(RF)阳性和10份抗核抗体(ANA)阳性检测，结果见表7。
表6.血红蛋白、甘油三酯和胆红素对阳性性样本干扰验证
Figure BDA0002322045540000102
表7类风湿因子和抗核抗体对检测干扰的验证
Figure BDA0002322045540000103
Figure BDA0002322045540000111
结果表明血红蛋白、甘油三酯、胆红素不影响本试剂盒对阴性结果判定，对阳性样本干扰率小于15％，本试剂盒对上述三种物质干扰可以接受。类风湿因子和抗核抗体对本试剂盒检测无干扰。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.幽门螺杆菌磁微粒化学发光法检测试剂盒，其特征在于，
包括包被Hp抗原的磁微粒、酶标记物溶液、样本稀释液
所述Hp抗原为分子量为100kDa的天然抗原；所述Hp抗原与磁微粒的质量比为(2～3):2；所述包被Hp抗原的磁微粒以封闭液悬浮；
所述封闭液由水和如下组分组成：
Figure FDA0003282035950000011
所述酶标记物为辣根过氧化酶标记的抗人IgG抗体；所述酶标记物存放于酶稀释液中，所述酶稀释液由水和如下组分组成：
Figure FDA0003282035950000012
所述样本稀释液由水和如下组分组成：
Figure FDA0003282035950000013
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述包被Hp抗原的磁微粒的制备方法为：将Hp抗原与活化后的羧基磁微粒混合，于酸性溶液中孵育，获得包被的磁微粒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述酸性溶液为pH4.75的醋酸钠水溶液。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述磁微粒的活化采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和N-N-羟基琥珀酰亚胺。
5.根据权利要求1～4任一项所述的试剂盒，其特征在于，其中还包括：发光底物液A和发光底物液B，
所述发光底物液A由0.1mol/LPBS缓冲液、5mmol/L过氧化脲和10mmol/L羟基喹啉组成；
所述发光底物液B由0.1mol/LPBS缓冲液和1g/L鲁米诺组成。
6.非诊断目的的幽门螺杆菌的磁微粒化学发光检测方法，其特征在于，以权利要求1～5的试剂盒对待测样本进行检测。
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