ES2971274T3 - Un inmunoensayo para el diagnóstico de la infección por el virus del Zika - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a un polipéptido, preferiblemente un dímero y/o hexámero del mismo, más preferiblemente un dímero, que comprende una secuencia seleccionada del grupo que comprende SEQ ID NO1, SEQ ID NO2, SEQ ID NO3, SEQ ID NO4, SEQ ID NO5, SEQ ID NO6, SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO19 y SEQ ID NO9 o una variante de las mismas, preferiblemente SEQ ID NO1 o una variante de las mismas, para el diagnóstico de una enfermedad, un vehículo útil para el diagnóstico que comprende un medio para capturar específicamente un anticuerpo para SEQ ID N.° 1 en una muestra de un sujeto, un kit que comprende el vehículo útil para el diagnóstico y un método, preferiblemente para diagnosticar una enfermedad, que comprende la etapa de detectar en una muestra de un sujeto la presencia o ausencia de un anticuerpo para SEQ ID N01 DNI N°1. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Un inmunoensayo para el diagnóstico de la infección por el virus del Zika
Aspectos de las presentes invenciones se refieren a un kit que comprende un portador de utilidad diagnóstica que comprende un medio para capturar y un medio para detectar específicamente un anticuerpo de clase IgA frente a la SEC. ID Núm.: 1, y procedimientosin vitropara diagnosticar una infección por el virus del Zika, que comprenden la etapa de detectar en una muestra de un sujeto la presencia o ausencia de un anticuerpo de clase IgA frente a la SEC. ID Núm.: 1. La invención se define por medio de las reivindicaciones adjuntas. Las realizaciones y descripciones que ya no entran en el ámbito de aplicación de las reivindicaciones anexas se consideran meros ejemplos adecuados para la comprensión de la invención.
El virus del Zika (ZIKV) es un flavivirus emergente transmitido por mosquitos que está causando grandes epidemias en Sudamérica, Centroamérica y el Caribe. Está estrechamente relacionado con otros miembros patógenos humanos de la familia de los flavivirus, como el virus del dengue (DENV), el virus del Nilo Occidental (WNV), el virus Powassan (PWV), el virus de la encefalitis japonesa (JEV), el virus Usutsu y el virus de la fiebre amarilla (YFV). Además de su parecido estructural, la mayoría de estos virus comparten una distribución geográfica parcialmente coincidente, las regiones tropicales y subtropicales representan el entorno favorable del principal vector, los mosquitos del géneroAedes.
Clínicamente, la fiebre del Zika se parece al dengue, pero suele ser menos grave. Como más del 80% de las infecciones son asintomáticas, la mayoría de los casos pasan desapercibidos. Los síntomas comprenden fiebre, erupción cutánea, artralgia y conjuntivitis , y las infecciones suelen ser autolimitadas. Por el contrario, en el 5% de las infecciones por DENV, las complicaciones graves conducen al síndrome de shock del dengue o a la fiebre hemorrágica del dengue, con altas tasas de mortalidad. La actual epidemia de ZIKV, en particular en Brasil, ha endurecido las sospechas sobre dos posibles complicaciones graves en las infecciones por ZIKV que se sospecharon inicialmente durante el brote de 2007 en Micronesia. En primer lugar, las infecciones desencadenaron un aumento significativo de los casos del raro síndrome de Guillain-Barré (SGB), una enfermedad autoinmune que provoca daños en la mielina de los nervios periféricos. En segundo lugar, un aumento de 20 veces en los casos de microcefalia en recién nacidos de las regiones altamente endémicas de Brasil, seguido por los primeros informes de detección del genoma del ZIKV en el líquido amniótico de dos mujeres embarazadas, portadoras de fetos con microcefalia, y en el cerebro de un feto abortado tras el diagnóstico intrauterino de microcefalia, proporcionaron un fuerte vínculo causal entre las anomalías fetales y la infección por ZIKV durante el embarazo temprano.
Además de los dos representantes de la familia de los flavivirus, el virus chikungunya (CHIKV), miembro de la familia de los alfavirus, también se debe tener en cuenta en el diagnóstico diferencial. El CHIKV es transmitido por el mismo mosquito vector y es endémico en las mismas regiones. La distribución común y la presentación clínica similar en combinación con las altas variedades en el resultado de la enfermedad y la necesidad de un tratamiento diferenciado de los pacientes infectados por ZIKV, DENV y CHIKV justifican la necesidad de posibilidades de diagnóstico específicas y fiables.
En la actualidad, el diagnóstico de las infecciones por ZIKV es un reto, dado que la única herramienta específica es la prueba directa de la viremia por medio de pruebas basadas en ácidos nucleicos, pero la fase virémica suele durar sólo hasta siete días después de la aparición de los síntomas. De este modo, procedimientos tales como la RT-PCR pueden dar ya resultados negativos cuando el paciente consulta a su médico. Las pruebas de neutralización por reducción de placa (PRNT) pueden medir los anticuerpos neutralizantes específicos del virus y discriminar entre anticuerpos de reacción cruzada. Esto es muy importante en regiones en las que coexisten dos o más flavivirus. Sin embargo, la PRNT requiere mucho tiempo, es difícil de llevar a cabo y no es adecuada para analizar un gran número de sueros. En cambio, la medición basada en ELISA de la respuesta de anticuerpos específicos del virus es un procedimiento rápido, escalable y técnicamente maduro. De acuerdo con lo informado, los anticuerpos IgM se producen a partir de cuatro a siete días tras el inicio de los síntomas y los anticuerpos IgG aparecen algunos días más tarde.
Una limitación importante de los ensayos serológicos convencionales para diagnosticar las infecciones por flavivirus, por ejemplo los basados en la glicoproteína E (gpE), es su amplia reactividad cruzada dentro del género flavivirus. Otra limitación es el hecho de que una serie de pacientes, en particular con antecedentes de infecciones pasadas por flavivirus, parecen ser deficientes en IgM, que es una clase de anticuerpo que puede surgir en la fase inicial de la infección por flavivirus, antes de los niveles detectables de anticuerpos de clase IgG. En estos pacientes, los resultados de las pruebas diagnósticas basadas en IgM, como las que se usan frecuentemente para el diagnóstico de las infecciones por flavivirus, dan un resultado falso negativo, con graves implicaciones para la salud de las pacientes y, si están embarazadas, de sus bebés.
Otra limitación, que afecta a la investigación en el campo de los flavivirus tales como las infecciones por el virus del Zika, por ejemplo el diagnóstico o la terapia de las infecciones por flavivirus o cualquier investigación básica, es que escasean los sueros de pacientes con infecciones confirmadas por el virus del Zika. A menudo no se requiere una sola muestra, sino diversas muestras tomadas en una gama de momentos tras la infección o la aparición de los síntomas, por ejemplo si se investiga la cinética de la enfermedad o se necesitan muestras de control para estudios relacionados con una invención terapéutica en una fase temprana de la infección.
El documento WO 88/03032 A1 menciona la proteína NS1 del virus del dengue.
Charrelet al.(2016,Bull World Health Organ E-pub: 10 feb 2016. doi: http://dx.doi.org/10.2471/BLT.16.171207) mencionan la RT-PCR para detectar el virus del Zika y las pruebas ELISA para detectar anticuerpos IgG e IgM contra el virus del Zika.
El documento WO 2015/095735 A2 menciona composiciones que comprenden proteína NS1 de Flavivirus.
El documento WO 2016/022071 A1 menciona la detección del agente viral (antígeno/genoma) o de anticuerpos contra el virus del dengue.
El documento WO 2017/009873 A1 menciona una composición de vacuna que comprende antígeno recombinante purificado del virus del Zika.
Por lo tanto, el problema subyacente a la presente invención es proporcionar un ensayo de diagnóstico que supere cualquier deficiencia asociada a los ensayos del estado de la técnica para el diagnóstico de flavivirus tales como el virus del Zika, en particular los basados en la detección de anticuerpos frente a antígenos flavivirales.
Otro problema subyacente a la presente invención es proporcionar un ensayo que permita el diagnóstico específico de una infección, preferentemente una infección flaviviral, más preferentemente una infección por el virus del Zika, más específicamente una distinción entre infecciones por el virus del Zika y flavivirus relacionados, tales como los seleccionados del grupo que comprende el virus del dengue, el virus de la fiebre amarilla, el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, el virus Usutu, el virus del Nilo Occidental y el virus de la encefalitis japonesa, preferentemente el virus del dengue.
Otro problema subyacente a la presente invención es proporcionar un ensayo y reactivos para la detección de una infección por flavivirus, en el que se mejore la sensibilidad y/o especificidad en comparación con los ensayos más avanzados, en particular en lo que respecta a la fase temprana de una infección.
También se describe en la presente memoria la provisión de una vacuna contra un flavivirus, preferentemente la infección por el virus del Zika.
Otro problema subyacente a la presente invención es proporcionar una prueba eficiente en cuanto a recursos, pero fiable desde el punto de vista del diagnóstico, para distinguir una infección por flavivirus de otra enfermedad.
Otro problema subyacente a la presente invención es proporcionar una prueba que proporcione una ventana temporal más larga para el diagnóstico.
Otro problema subyacente a la presente invención es proporcionar una prueba que requiera una menor cantidad de muestra del paciente.
Otro problema subyacente a la presente invención es proporcionar un ensayo para distinguir una infección aguda por Flavirus, en particular el virus del Zika, de una vacunación o una infección previa por el mismo u otro Flavivirus, preferentemente el virus del dengue.
Otro problema subyacente a la presente invención es proporcionar una vacuna contra un flavivirus, preferentemente la infección por el virus del Zika.
Otro problema subyacente a la presente invención es proporcionar una prueba eficiente en cuanto a recursos, pero fiable desde el punto de vista del diagnóstico, para distinguir una infección por flavivirus de otra enfermedad.
Otro problema subyacente a la presente invención es proporcionar una prueba que se pueda usar durante un intervalo de tiempo más largo entre la exposición inicial o el inicio de los síntomas y el día en que se obtiene la muestra para el diagnóstico.
Otro problema subyacente a la presente invención es proporcionar una prueba para distinguir entre una infección primaria por Flavivirus, preferentemente con un Flavivirus distinto del virus del Zika, y una infección secundaria por Flavivirus, preferentemente la infección por el virus del Zika, cuyo procedimiento sea diagnósticamente más fiable que los procedimientos del estado de la técnica, en particular con respecto a evitar resultados falsos positivos o negativos, y que se pueda aplicar idealmente a muestras de pacientes que tengan una deficiencia de IgM.
El problema subyacente a la presente invención se resuelve por medio del objeto de las reivindicaciones independientes y dependientes adjuntas.
Se describe en la presente memoria un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que comprende la SEC. ID Núm.: 1, la SEC. ID Núm.: 2, la SEC. ID Núm.: 3, la SEC. ID Núm.: 4, la SEC. ID Núm.: 5, la SEC. ID Núm.: 6, la SEC. ID Núm.: 7, la SEC. ID Núm.: 8, la SEC. ID Núm.: 19 y la SEC. ID Núm.: 9 o una variante de la misma, preferentemente la SEC. ID Núm.: 1 o una variante de la misma, preferentemente un dímero y/o hexámero, más preferentemente un dímero, para el diagnóstico de una enfermedad.
En la presente memoria se describe además un portador de utilidad diagnóstica que comprende un medio para capturar específicamente un anticuerpo de la SEC. ID Núm.: 1 en una muestra de un sujeto.
En una realización preferente, el portador además comprende uno o más de un medio, cuyo medio es para capturar específicamente un anticuerpo contra un antígeno del grupo que comprende la SEC. ID Núm.: 2, la SEC. ID Núm.: 3, la SEC. ID Núm.: 4, la SEC. ID Núm.: 5, la SEC. ID Núm.: 6, la SEC. ID Núm.: 7, la SEC. ID Núm.: 8, la SEC. ID Núm.: 19 y la SEC. ID Núm.: 9.
En una realización preferente, el soporte se selecciona del grupo que comprende una microesfera, preferentemente una partícula paramagnética, una tira reactiva, una placa de microtitulación, una mancha, preferentemente del grupo que comprende western blot, line blot y dot blot, una prueba de flujo lateral, una superficie de vidrio, un portaobjetos, un biochip y una membrana, y es preferentemente una microesfera, una mancha lineal o una placa de microtitulación, más preferentemente una placa de microtitulación.
En un aspecto, el problema se resuelve por medio de un kit como se define en las reivindicaciones anexas que comprende un portador útil para el diagnóstico de acuerdo con la presente invención, así como un medio para detectar específicamente un anticuerpo capturado.
En una realización preferente, el kit comprende el portador de utilidad diagnóstica que además comprende uno o más medios, cuyos medios son para capturar específicamente un anticuerpo frente a uno o más antígenos adicionales del grupo que comprende la SEC. ID Núm.: 2, la SEC. ID Núm.: 3, la SEC. ID Núm.: 4, la SEC. ID Núm.: 5, la SEC. ID Núm.: 6, la SEC. ID Núm.: 7, la SEC. ID Núm.: 8, la SEC. ID Núm.: 19 y la SEC. ID Núm.: 9, en el que los medios para capturar específicamente un anticuerpo contra la SEC. ID Núm.: 1 y los medios para capturar específicamente un anticuerpo contra uno o más antígenos adicionales están revestidos, preferentemente unidos covalentemente a soportes separados.
En una realización preferente, el kit comprende el portador de utilidad diagnóstica que además comprende uno o más medios, cuyos medios son para capturar específicamente un anticuerpo frente a uno o más antígenos adicionales del grupo la SEC. ID Núm.: 2, la SEC. ID Núm.: 3, la SEC. ID Núm.: 4, la SEC. ID Núm.: 5, la SEC. ID Núm.: 6, la SEC. ID Núm.: 7, la SEC. ID Núm.: 8, la SEC. ID Núm.: 19 y la SEC. ID Núm.: 9,
en el que los medios para capturar específicamente un anticuerpo frente a la SEC. ID Núm.: 1 y los medios para capturar específicamente un anticuerpo frente a uno o más antígenos adicionales están revestidos en un portador, preferentemente unido covalentemente a un portador.
En otro aspecto, el problema se resuelve por medio de un procedimientoin vitropara diagnosticar una enfermedad como se define en las reivindicaciones anexas, que comprende la etapa de detectar en una muestra de un sujeto la presencia o ausencia de un anticuerpo frente a la SEC. ID Núm.: 1.
En una realización preferente, el procedimiento además comprende la etapa de detectar en una muestra, preferentemente de sangre o LCR, de un sujeto la presencia o ausencia de un anticuerpo frente a uno o más antígenos adicionales del grupo que comprende la SEC. ID Núm.: 2, la SEC. ID Núm.: 3, la SEC. ID Núm.: 4, la SEC. ID Núm.: 5, la SEC. ID Núm.: 6, la SEC. ID Núm.: 7, la SEC. ID Núm.: 8, la SEC. ID Núm.: 19 y la SEC. ID Núm.: 9.
En una realización preferente, se detecta simultáneamente la presencia o ausencia de un anticuerpo frente a la SEC. ID Núm.: 1 y la presencia o ausencia de un anticuerpo frente a uno o más antígenos adicionales del grupo que comprende la SEC. ID Núm.: 2, la SEC. ID Núm.: 3, la SEC. ID Núm.: 4, la SEC. ID Núm.: 5, la SEC. ID Núm.: 6, la SEC. ID Núm.: 7, la SEC. ID Núm.: 8, la SEC. ID Núm.: 19 y la SEC. ID Núm.: 9.
En una realización preferente, la presencia o ausencia de un anticuerpo frente a la SEC. ID Núm.: 1 y la presencia o ausencia de un anticuerpo frente a uno o más antígenos adicionales se detecta en reacciones de unión espacialmente separadas.
En una realización preferente, la presencia o ausencia de un anticuerpo frente a la SEC. ID Núm.: 1 y la presencia o ausencia de un anticuerpo frente a uno o más antígenos adicionales se detecta en una reacción de un solo recipiente.
En una realización preferente, el procedimiento comprende la etapa que entra en contacto con el portador útil para el diagnóstico de acuerdo con la actual invención con una muestra del tema.
En una realización preferente, el sujeto padece o se sospecha que padece una enfermedad infecciosa, preferentemente una infección viral, más preferentemente una infección por un flavivirus, preferentemente del grupo que comprende Zika, dengue, fiebre amarilla, TBEV, Usutu, Powassan, West Nile y JEV, preferentemente Zika.
En una realización preferente, el anticuerpo es un anticuerpo de mamífero, preferentemente humano, más preferentemente un anticuerpo humano de clase IgA, IgM o IgG, preferentemente IgG.
En la presente memoria se describe además un portador de utilidad diagnóstica configurado para capturar un anticuerpo de clase IgA frente a NS1 de un flavivirus, preferentemente el virus del Zika, en una muestra de un sujeto, preferentemente para diagnosticar una infección por Flavivirus, más preferentemente para distinguir un Flavivirus primario de uno secundario, preferentemente la infección por el virus del Zika.
En una realización preferente, el portador está además configurado para capturar y detectar específicamente un anticuerpo de clase IgM y/o IgG, preferentemente un anticuerpo de clase IgM, frente a NS1 de dicho Flavivirus y/o está además configurado para capturar un anticuerpo contra una glicoproteína de envoltura de un Flavivirus.
En otra realización preferente, el portador de utilidad diagnóstica está en complejo con un anticuerpo de clase IgA frente a NS1 de un Flavivirus.
En otra realización preferente, dicho complejo además comprende el NS1 de un Flavivirus o una variante del mismo, y preferentemente además comprende una etiqueta de detección que se asocia más preferentemente con un anticuerpo que se debe detectar o el NS1 de un Flavivirus o una variante del mismo.
En otra realización preferente, el portador de utilidad diagnóstica comprende un dímero o hexámero del NS1 de dicho Flavivirus.
En la presente memoria se describe además un kit que comprende el portador de utilidad diagnóstica.
En la presente memoria se describe además un procedimiento para diagnosticar una infección por Flavivirus, preferentemente para distinguir una infección primaria de una infección secundaria por Flavivirus, que comprende la etapa de:
a) detectar en una primera muestra de un sujeto un anticuerpo de clase IgA frente a NS1 de dicho Flavivirus.
En otra realización preferente, se usa el portador de utilidad diagnóstica.
En otra realización preferente, el procedimiento además comprende la etapa de:
b) detectar en una segunda muestra de dicho sujeto un anticuerpo de clase IgA frente a NS1 de dicho Flavivirus, en la que la segunda muestra se obtuvo de dicho sujeto al menos tres días más tarde que la primera muestra.
En otra realización preferente, además se detecta un anticuerpo de clase IgM frente a NS1 de dicho Flavivirus como parte de la etapa a) y/o la etapa b), preferentemente la etapa a).
En otra realización preferente, se detecta además un anticuerpo de clase IgG frente a NS1 de dicho Flavivirus en la etapa a) y/o en la etapa b), preferentemente en la etapa a).
En otra realización preferente, además en la etapa a) y/o en la etapa b), preferentemente en la etapa a), se detecta al menos una clase de anticuerpo frente a una glicoproteína de envoltura de dicho Flavivirus,
en el que preferentemente la al menos una clase de anticuerpo frente a una glicoproteína de envoltura de dicho Flavivirus se selecciona del grupo que comprende IgG, IgM e IgA, preferentemente IgA e IgM, o IgA e IgG, o IgM e IgG, más preferentemente IgA.
En otra realización preferente, cada anticuerpo se detecta en reacciones de unión espacialmente separadas, separadas de acuerdo con el antígeno y la clase de anticuerpo a detectar.
En otra realización preferente, el Flavivirus se selecciona del grupo que comprende el virus del Zika, el virus del dengue, el virus de la fiebre amarilla, el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, el virus Usutu, el virus del Nilo Occidental y el virus de la encefalitis japonesa, preferentemente el virus del Zika.
En la presente memoria se describe además el uso de un anticuerpo de clase IgA frente a NS1 de un Flavivirus, preferentemente el virus del Zika, o un portador útil para el diagnóstico para inmovilizar y opcionalmente detectar dicho anticuerpo, para distinguir una infección primaria de una secundaria por Flavivirus, preferentemente la infección por el virus del Zika.
En la presente memoria se describe además el uso de un anticuerpo de clase IgA frente a NS1 de un flavivirus, preferentemente el virus del Zika, o un portador de utilidad diagnóstica para inmovilizar y opcionalmente detectar dicho anticuerpo, para diagnosticar una infección flaviviral, preferentemente una infección por el virus del Zika, en un sujeto con deficiencia de IgM.
En la presente memoria se describe además el uso de un anticuerpo de clase IgA frente a NS1 de un flavivirus, preferentemente el virus del Zika, o un portador útil para el diagnóstico que inmoviliza y opcionalmente detecta dicho anticuerpo, para aumentar la fiabilidad diagnóstica, preferentemente la sensibilidad, de un ensayo diagnóstico para diagnosticar una infección flaviviral, preferentemente una infección por el virus del Zika, más preferentemente en las primeras fases de una infección.
La presente descripción en la que se basa la presente invención establece la detección de un anticuerpo frente a NS1 del virus del Zika (SEC. ID Núm.: 1) como parte de un procedimiento de diagnóstico practicado sobre una muestra de un paciente sospechoso de padecer una infección, preferentemente una infección flaviviral, más preferentemente una infección por el virus del Zika.
Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que una infección por el virus del Zika se puede diagnosticar y distinguir de otras infecciones flavivirales por medio de la detección de anticuerpos en una muestra de un paciente, con un grado sorprendentemente alto de fiabilidad diagnóstica, en particular en relación con los antígenos NS1 derivados de otros flavivirus, con un grado inesperadamente bajo de reactividad cruzada.
Los inventores también han encontrado sorprendentemente que algunos pacientes, a pesar de haber estado expuestos a un Flavivirus, no tienen titulaciones de IgM que permitan monitorizar el curso de la infección, pero tienen titulaciones sorprendentemente dinámicos de IgA a NS1 de dicho Flavivirus que se pueden usar. Y lo que es más sorprendente, estos anticuerpos IgA no muestran un grado de reactividad cruzada, como cabría esperar, que hiciera poco fiable la distinción entre una infección aguda por el virus del Zika y una infección previa por Flavivirus, preferentemente por un Flavivirus distinto del virus del Zika.
Los inventores también han descubierto sorprendentemente que el antígeno NS1 del virus del Zika existe en formas oligoméricas y complejos que tienen propiedades sorprendentes relevantes para su aplicación en ensayos de diagnóstico, entre ellas monómeros, dímeros y hexámeros, y complejación con apolipoproteínas de mamíferos, que, cuando están en complejo con el NS1 del virus del Zika, mejoran la fiabilidad diagnóstica y la estabilidad del antígeno.
La invención se refiere a un soporte de utilidad diagnóstica, que es preferentemente un soporte sólido fabricado a partir de un material artificial tal como el vidrio o el plástico para poner en contacto un medio, que se asocia a dicho soporte, que sirve para capturar específicamente un anticuerpo con una muestra de fluido corporal de un sujeto, preferentemente un sujeto mamífero, más preferentemente un sujeto humano. En una realización preferente, el término “capturado” o “capturado específicamente”, como se usa en la presente memoria, significa que la unión entre los medios para capturar específicamente y el anticuerpo a capturar es más fuerte que una reacción de unión caracterizada por una constante de disociación de 1 * 10-5 M, más preferentemente 1 * 10-7 M, más preferentemente 1 * 10-8 M, más preferentemente 1 * 10-9 M, más preferentemente 1 * 10-10 M, más preferentemente 1 * 10-11 M, más preferentemente 1 * 10-12 M, determinada por resonancia de plasmón de superficie mediante el uso de un equipo Biacore a 25 °C en tampón PBS a pH 7. El portador de utilidad diagnóstica puede comprender uno o más controles, preferentemente seleccionados entre un control que confirme que se ha añadido la muestra y/o un control que confirme que se ha añadido un anticuerpo secundario.
En una realización preferente, el anticuerpo capturado específicamente puede ser un anticuerpo de una determinada clase de anticuerpos, preferentemente seleccionado entre IgG, IgM e IgA, más preferentemente IgA. En otra realización preferente, el anticuerpo capturado específicamente puede ser un anticuerpo frente a un antígeno de Flavivirus, preferentemente seleccionado del grupo que comprende NS1 y Glicoproteína de la envoltura, preferentemente NS1. En una realización más preferente, el anticuerpo capturado específicamente es un anticuerpo de clase IgM o IgA, preferentemente IgA, frente a la SEC. ID Núm.: 1, preferentemente frente a un epítopo de la SEC. ID Núm.: 1 suficientemente largo para ser reconocido por un anticuerpo, cuyo epítopo comprende, con referencia a la SEC. ID Núm.: 1, uno o más aminoácidos del grupo que comprende Arg62, Ile66, Arg 69, Glu72, Glicina73, este último de los cuales se puede sustituir por serina o alanina, preferentemente el péptido que comprende la secuencia Arg 62 a Glicina 73; uno o más aminoácidos del grupo que comprende Gln102, Pro105, este último se puede sustituir con un aminoácido neutro y una cadena lateral corta tal como Ser o Ala, y Glu110; preferentemente el péptido que comprende la secuencia Gln102 a Glu110; el péptido que comprende los residuos Ser121 a Thr129, el péptido que comprende los residuos Asp138 a Lys141, el péptido que comprende los residuos Asp174 a Glu178 y el péptido que comprende Ser322 a Lys326. En una realización preferente, el soporte sólido es un dispositivo de diagnóstico, más preferentemente seleccionado del grupo que comprende una microesfera, preferentemente una partícula paramagnética, una tira reactiva, una placa de microtitulación, una mancha, una superficie de vidrio, un biochip y una membrana, más preferentemente del grupo que comprende una microesfera, una mancha, una tira reactiva y una microplaca de microtitulación.
El soporte de utilidad diagnóstica puede ser una placa de microtitulación que comprenda una serie de pocillos configurados para un inmunoensayo, tal como un ensayo ELISA. En una realización preferente, el término “placa de microtitulación” es un dispositivo de diagnóstico, preferentemente de vidrio o plástico, más preferentemente plástico, que comprende uno o más, preferentemente más de uno, más preferentemente al menos 8 pocillos, en los que las reacciones en tampón líquido se pueden ejecutar por separado sin contaminación cruzada. Al menos uno de los pocillos está revestido con un polipéptido, preferentemente un polipéptido antigénico que se puede usar para capturar específicamente un anticuerpo de utilidad diagnóstica. Si se usa más de un medio para detectar específicamente un antígeno, es preferente que cada medio se encuentre en un pocilio separado de los demás medios. La placa de microtitulación se puede usar para analizar diversas muestras en paralelo, preferentemente de forma automatizada. Los pocillos son preferentemente compatibles con al menos una técnica de detección rutinaria, como la colorimetría, la inmunofluorescencia, la detección de actividad enzimática, la quimioluminiscencia, la radiactividad o similares. Existen en el mercado placas de microtitulación adecuadas. Si el soporte de utilidad diagnóstica es una placa de microtitulación, se prefiere que al menos el 50%, 60%, 70%, 80% o 90%, preferentemente el 50% de cualquier NS1 de Flavivirus, preferentemente NS1 del virus del Zika, sea un hexámero o dímero, preferentemente dímero.
El portador de utilidad diagnóstica puede ser una microesfera configurada para un inmunoensayo que comprende un polipéptido que comprende la SEC. ID Núm.: 1 o una variante del mismo. En una realización más preferente, la microesfera es una micropartícula paramagnética que se puede extraer de una solución y concentrarse, preferentemente en la superficie de un recipiente, por medio de la aplicación de un campo magnético. La microesfera comprende un antígeno unido a la microesfera por medio de un enlace covalente o no covalente. Si se usa más de una perla, se puede hacer una preparación de perlas uniendo covalentemente a las perlas un ligando universal que se une fuertemente a una etiqueta que se puede fusionar a uno o más polipéptidos de acuerdo con la presente invención por medio de ingeniería genética. A continuación, la preparación de perlas se puede dividir en más de un lote, y cada lote se pone en contacto con un polipéptido diferente fusionado a una etiqueta, de forma que se produce una gama de portadores, cada uno con un polipéptido inmovilizado diferente. Se puede hacer una mezcla de microesferas, por ejemplo una de las cuales lleva un polipéptido que comprende la SEC. ID Núm.: 1 o una variante del mismo, y al menos una más que lleva un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que comprende la SEC. ID Núm.: 2, la SEC. ID Núm.: 3, la SEC. ID Núm.: 4, la SEC. ID Núm.: 5, la SEC. ID Núm.: 6, la S<e>C. ID Núm.: 7, la SEC. ID Núm.: 8, la SEC. ID Núm.: 19 y la SEC. ID Núm.: 9. Si el portador de utilidad diagnóstica es una perla, se prefiere que al menos el 50%, 60%, 70%, 80% o 90%, preferentemente el 50% de cualquier NS1 del Flavivirus, preferentemente NS1 del virus del Zika, sea un monómero, hexámero o dímero, preferentemente monómero.
El portador de utilidad diagnóstica puede ser una mancha lineal (Raoult, D., y Dasch, G. A. (1989),The line blot: an immunoassay for monoclonal and other antibodies. Its application to the serotyping of gram-negative bacteria. J. Immunol. Methods,125 (1-2), 57 a 65; el documento WO2013041540). En una realización preferente, el término “line blot”, como se usa en la presente memoria, se refiere a una tira reactiva, más preferentemente de membrana, que ha sido revestida con uno o más medios para capturar un anticuerpo, preferentemente un polipéptido cada uno. Si se usan dos o más medios, es preferente que estén separados espacialmente en el soporte. Preferentemente, la anchura de las bandas es de al menos el 30, más preferentemente el 40, 50, 60, 70 u 80 % de la anchura de la tira reactiva. La tira reactiva puede incluir una o más bandas de control para confirmar que ha estado en contacto con la muestra el tiempo suficiente y en las condiciones adecuadas, en particular en presencia de suero humano, conjugado de anticuerpos o ambos. Existen en el mercado multitud de line blots, por ejemplo, de EUROIMMUN AG, Lübeck, Alemania. Si el portador de utilidad diagnóstica es un blot de línea, se prefiere que al menos el 50%, 60%, 70%, 80% o 90%, preferentemente el 50% de cualquier NS1 de Flavivirus, preferentemente NS1 del virus del Zika, sea un hexámero o dímero, preferentemente un hexámero.
El portador de utilidad diagnóstica puede ser un portaobjetos de vidrio revestido con una célula, preferentemente una célula eucariota, más preferentemente una célula de insecto o mamífero, preferentemente una célula humana que exprese un Flavivirus NS1, preferentemente un polipéptido que comprenda la SEC. ID Núm.: 1. La célula puede ser una célula viva, pero es preferente que sea una célula fija. A continuación, se puede usar la inmunofluorescencia para detectar el anticuerpo. Preferentemente, la célula es una célula recombinante que sobreexpresa el Flavivirus NS1. El Flavivirus NS1 se puede localizar en la membrana celular, preferentemente en la superficie de la célula. Si el portador de utilidad diagnóstica es un portaobjetos de vidrio, se prefiere que al menos el 50%, 60%, 70%, 80% o 90%, preferentemente el 50% de cualquier NS1 de Flavivirus, preferentemente NS1 del virus del Zika, sea un hexámero o dímero, preferentemente un dímero.
De acuerdo con la presente invención, el portador de utilidad diagnóstica está configurado para capturar un anticuerpo frente a un antígeno de Flavivirus. El soporte comprende uno o más medios para capturar específicamente un anticuerpo, preferentemente uno o más, más preferentemente dos o más, más preferentemente tres o más, más preferentemente cuatro o más de tales medios, cada uno de ellos capaz de capturar específicamente un anticuerpo diferente. Alternativamente, se pueden usar uno o más portadores, preferentemente dos o más, tres o más o cuatro o más, cada uno de los cuales comprende un medio para capturar específicamente un anticuerpo. El medio para capturar específicamente un anticuerpo puede ser un anticuerpo que se una a todos los anticuerpos de una determinada clase Ig, preferentemente seleccionados del grupo que comprende IgG, IgM e IgA, más preferentemente anticuerpos de la clase IgA. Dicho medio es preferentemente inmovilizado en dicho portador. En una realización preferente, el medio para capturar específicamente un anticuerpo es un polipéptido, preferentemente un dímero y/o hexámero, más preferentemente un dímero, que comprende o consiste en un antígeno del grupo que comprende la SEC. ID Núm.: 1, la SEC. ID Núm.: 2, la SEC. ID Núm.: 3, la SEC. ID Núm.: 4, la SEC. ID Núm.: 5, la SEC. ID Núm.: 6, la SEC. ID Núm.: 7, la SEC. ID Núm.: 8, la SEC. ID Núm.: 19 y la SEC. ID Núm.: 9 o una variante de los mismos, preferentemente la SEC. ID Núm.: 1, la SEC. ID Núm.: 6, la SEC. ID Núm.: 7, la SEC. ID Núm.: 8 y la SEC. ID Núm.: 9 o una variante de los mismos, y al menos uno, más preferentemente uno de la SEC. ID Núm.: 2, la SEC. ID Núm.: 3, la SEC. ID Núm.: 4, la SEC. ID Núm.: 5 o una variante de los mismos. En otra realización preferente, se usa un polipéptido que comprende la SEC. ID Núm.: 1, un polipéptido que comprende la SEC. ID Núm.: 6, un polipéptido que comprende la SEC. ID Núm.: 7, un polipéptido que comprende la SEC. ID Núm.: 8, y al menos un polipéptido, preferentemente todos los polipéptidos, del grupo que comprende un polipéptido que comprende la SEC. ID Núm.: 2, un polipéptido que comprende la SEC. ID Núm.: 3, un polipéptido que comprende la SEC. ID Núm.: 4 y un polipéptido que comprende la SEC. ID Núm.: 5 o una variante de los mismos. En otra realización preferente, se usa un polipéptido que comprende la SEC. ID Núm.: 1, un polipéptido que comprende la SEC. ID Núm.: 2, un polipéptido que comprende la SEC. ID Núm.: 3, un polipéptido que comprende la SEC. ID Núm.: 4, un polipéptido que comprende la SEC. ID Núm.: 5 y un polipéptido que comprende la SEC. ID Núm.: 6 o una variante de los mismos. Preferentemente, se usan al menos 0,001, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 5, 10 o 100 |jg de polipéptido para cada portador como medio para capturar específicamente un anticuerpo.
En una realización preferente, el portador de utilidad diagnóstica comprende uno o más medios para capturar específicamente un anticuerpo frente a una glicoproteína de envoltura de Flavivirus, preferentemente un polipéptido antigénico que comprende una secuencia seleccionada del grupo que comprende la SEC. ID Núm.: 11, la SEC. ID Núm.: 12, la SEC. ID Núm.: 13, la SEC. ID Núm.: 14, la SEC. ID Núm.: 15, la SEC. ID Núm.: 16, la SEC. ID Núm.: 17, la SEC. ID Núm.: 18 y la SEC. ID Núm.: 27 y una variante de la misma.
El portador de utilidad diagnóstica puede comprender uno o más medios, cada uno para capturar un anticuerpo frente a un antígeno de Flavivirus del grupo que comprende NS1 de un Flavivirus y Glicoproteína de envoltura de un Flavivirus, preferentemente que comprende dos medios para capturar dos anticuerpos, uno frente a NS1 y otro frente a antígenos de glicoproteína de envoltura del mismo Flavivirus, más preferentemente uno frente a nS1 del virus del Zika y otro frente a la glicoproteína de envoltura del virus del Zika (SEC. ID Núm.: 1 y la SEC. ID Núm.: 11, respectivamente).
Dicho antígeno, junto con el portador insoluble al que está unido, se puede separar de una muestra de un sujeto de manera sencilla, por ejemplo, por medio de filtración, centrifugación, magnetismo o decantación. Dicho antígeno se puede inmovilizar de forma reversible o irreversible. Por ejemplo, la inmovilización es reversible si la molécula interactúa con el portador por medio de interacciones iónicas que se pueden enmascarar por medio de la adición de una concentración elevada de sal o si la molécula se une por medio de un enlace covalente escindible o un enlace no covalente. Por el contrario, la inmovilización es irreversible si la molécula está unido al portador por medio de un enlace covalente que no se puede romper en solución acuosa. El polipéptido se puede inmovilizar indirectamente, por ejemplo, por medio de la inmovilización de un anticuerpo u otra entidad que tenga afinidad por el polipéptido, seguido por la adición del polipéptido y la formación de un complejo polipéptido-anticuerpo. Un enlace no covalente se puede llevar a cabo por medio de la unión química de un ligando al portador, preferentemente por medio de un enlace covalente, y fusionando al polipéptido de acuerdo con la presente invención un polipéptido que tenga afinidad por el ligando. En una realización preferente, el ligando se selecciona del grupo que comprende biotina, en cuyo caso el polipéptido que tiene afinidad puede ser estreptavidina o una variante de la misma que se une a biotina, glutatión (polipéptido que tiene afinidad: glutatión-S-transferasa), Níquel (polipéptido que tiene afinidad: etiqueta His), etiqueta de marcador (polipéptido con afinidad: anticuerpo anti-marcador), carbohidrato tal como maltosa o celulosa (polipéptido con afinidad: proteína de unión a maltosa o celulosa), y preferentemente biotina.
El polipéptido de acuerdo con la presente invención que comprende la SEC. ID Núm.: 1 o una variante del mismo o, además un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que comprende la SEC. ID Núm.: 2, la SEC. ID Núm.: 3, la SEC. ID Núm.: 4, la SEC. ID Núm.: 5, la SEC. ID Núm.: 6, la SEC. ID Núm.: 7, la SEC. ID Núm.: 8, la SEC. ID Núm.: 19 y la SEC. ID Núm.: 9 y una variante del mismo, se puede inmovilizar a través del anticuerpo relevante para el diagnóstico que se va a detectar, que se inmoviliza en el portador a través de otro anticuerpo unido directamente al portador. El otro anticuerpo puede ser un anticuerpo específico de clase Ig, preferentemente del grupo que comprende anticuerpos específicos de clase IgM, IgG e IgA, más preferentemente un anticuerpo específico de clase IgA. El sitio de unión de dicho anticuerpo específico de clase, disponible comercialmente, puede ser la región constante de un anticuerpo humano.
Las enseñanzas de la presente invención no sólo se pueden llevar a cabo mediante el uso de polipéptidos, por ejemplo la SEC. ID Núm.: 1, opcionalmente en combinación con uno o más antígenos adicionales tales como la SEC. ID Núm.: 2, la SEC. ID Núm.: 3, la SEC. ID Núm.: 4, la SEC. ID Núm.: 5, la SEC. ID Núm.: 6, la SEC. ID Núm.: 7, la SEC. ID Núm.: 8, la SEC. ID Núm.: 19 y la SEC. ID Núm.: 9, que tengan las secuencias exactas a las que se hace referencia en la presente solicitud explícitamente, por ejemplo, por función, nombre, secuencia o número de acceso, o implícitamente, pero mediante el uso también de variantes de dichos polipéptidos.
En una realización preferente, el término “variante”, como se usa en la presente memoria, se puede referir a al menos un fragmento de la secuencia de longitud completa a la que se hace referencia o a un polipéptido que comprende dicho fragmento, más específicamente a una o más secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos que están, en relación con la secuencia de longitud completa, truncadas en uno o ambos terminales por uno o más aminoácidos. Dicho fragmento comprende o codifica para un péptido que tiene al menos 10, 15, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250 o 300 aminoácidos sucesivos de la secuencia original o para una variante de la misma. La longitud total de la variante puede ser de 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 aminoácidos o más.
En otra realización preferente, el término “variante” se refiere no sólo a al menos un fragmento, sino también a un polipéptido o a un fragmento del mismo que comprende secuencias de aminoácidos, preferentemente un fragmento que comprende al menos 25, más preferentemente 50, más preferentemente 200, más preferentemente 300 aminoácidos sucesivos, que son al menos 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8 o 99,9% idénticos a la secuencia de aminoácidos de referencia a la que se hace referencia o al fragmento de la misma, en los que se suprimen o sustituyen aminoácidos diferentes de los esenciales para la actividad biológica, por ejemplo la capacidad de unirse específicamente a un anticuerpo de interés, o el pliegue o la estructura del polipéptido, y/o se sustituyen uno o más de dichos aminoácidos esenciales de forma conservadora y/o se añaden o suprimen aminoácidos de forma que se preserve, al menos parcialmente, la actividad biológica del polipéptido. Los procedimientos conocidos comprenden varios procedimientos que se pueden usar para alinear dos secuencias dadas de ácidos nucleicos o aminoácidos y calcular el grado de identidad, véase, por ejemplo, Arthur Lesk (2008),Introduction to bioinformatics, Oxford University Press, 2008, 3ra edición. En una realización preferente, el software ClustalW (Larkin, M. A., Blackshields, G., Brown, N. P., Chenna, R., McGettigan, P A., McWilliam, H., Valentin, F., Wallace, I. M., Wilm, A., Lopez, R., Thompson, J. D., Gibson, T J., Higgins, D. G. (2007): Clustal W y Clustal X versión 2.0.Bioinformatics,23, 2947 a 2948) se usa por medio de la aplicación de la configuración por defecto.
En una realización preferente, las variantes pueden, además, comprender modificaciones químicas, por ejemplo, marcadores isotópicos o modificaciones covalentes tales como glicosilación, fosforilación, acetilación, descarboxilación, citrulinación, hidroxilación y similares. Los expertos en la técnica están familiarizados con los procedimientos de modificación de polipéptidos. Además, también se pueden generar variantes por medio de fusión con otros polipéptidos conocidos o variantes de los mismos.
La variante del polipéptido tiene actividad biológica. En una realización preferente, dicha actividad biológica es la capacidad de unirse a, preferentemente capturar específicamente el anticuerpo respectivo si la variante es una variante de una secuencia del grupo que comprende la SEC. ID Núm.: 1, la SEC. ID Núm.: 2, la SEC. ID Núm.: 3, la SEC. ID Núm.: 4, la SEC. ID Núm.: 5, la SEC. ID Núm.: 6, la SEC. ID Núm.: 7, la SEC. ID Núm.: 8, la SEC. ID Núm.: 9, la SEC. ID Núm.: 11, la SEC. ID Núm.: 12, la SEC. ID Núm.: 13, la SEC. ID Núm.: 14, la SEC. ID Núm.: 15, la SEC. ID Núm.: 16, la SEC. ID Núm.: 17, la SEC. ID Núm.: 18, la SEC. ID Núm.: 19 y la SEC. ID Núm.: 27, preferentemente la SEC. ID Núm.: 1. Por ejemplo, una variante de la SEC. ID Núm.: 1 tiene la capacidad de unirse específicamente a un anticuerpo de la<s>E<c>. ID Núm.: 1 en una muestra obtenida de un sujeto sospechoso de padecer una infección viral. Tales variantes tienen al menos un epítopo reconocido por el anticuerpo a capturar, por ejemplo un epítopo en la SEC. ID Núm.: 1 si se captura un anticuerpo de la SEC. ID Núm.: 1. Los expertos en la técnica son capaces de diseñar variantes partiendo de la secuencia original SEC. ID Núm.: 1, por medio de la introducción de modificaciones tales como mutaciones puntuales, truncamientos y similares, y la confirmación posterior de que la variante sigue teniendo actividad biológica probando si dicha variante se une a un anticuerpo contra la SEC. ID Núm.: 1 en una muestra obtenida de un sujeto que padezca la enfermedad a diagnosticar, preferentemente una infección, más preferentemente una infección viral, más preferentemente una infección por un Flavivirus, más preferentemente una infección por un virus del Zika. Se ha publicado la estructura tridimensional de la proteína NS1 del virus del Zika y de flavivirus relacionados, que puede servir de orientación para el diseño de variantes y la elección de las secuencias que se pueden variar sin comprometer la actividad biológica y para distinguirlas de epítopos importantes (por ejemplo, Xuetal., Contribution of intertwined loop to membrane association revealed by Virus del Zika full-length NS1 structure(EMBO J., publicado el 30 de agosto de 2016, acceso abierto; Akeyet al., Flavivirus NS1 structures reveal surfaces for associations with membranes and the immune system, Science21;343(6173):881 a 885. doi: 10.1126/science; el documento WO2015/095735). Por ejemplo, con referencia a la SEC. ID Núm.: 1, las regiones que son exclusivas de Zika NS1 y no se deben sustituir, en particular no de manera no conservadora, incluyen los residuos 62 a73, preferentemente los que comprenden Arg62, Ile66, Arg 69, Glu72, Glicina73 (que se podría sustituir con un aminoácido neutro); 102 a 110, preferentemente Gln102, Pro105 (que se podría sustituir con un aminoácido neutro y una cadena lateral corta tal como Ser o Ala) y Glu110; residuos 121 a129, residuos 138 a 141, 174 a 178 y 322 a 326. La actividad biológica de la apolipoproteína de mamífero, preferentemente bovina, proporcionada y usada es la capacidad de unirse y formar un complejo con un polipéptido que comprende Flavivirus NS1, preferentemente la SEC. ID Núm.: 1. Las variantes se pueden identificar por medio de la identificación de fragmentos naturales de dichas apolipoproteínas derivados de la proteína de longitud completa o de un precursor de la misma, por ejemplo, por medio de la purificación mediante el uso de NS1 como ligando de afinidad seguido por secuenciación N-terminal Edman y/o digestión tríptica en combinación con espectrometría de masas, y el uso para poner en práctica la invención. Se pueden usar sustituciones conservadoras de aminoácidos para todas las variantes.
Si se usa un polipéptido como medio para capturar específicamente un anticuerpo, dicho polipéptido, preferentemente, comprende una o más secuencias seleccionadas del grupo que comprende la SEC. ID Núm.: 1, la SEC. ID Núm.: 2, la SEC. ID Núm.: 3, la SEC. ID Núm.: 4, la SEC. ID Núm.: 5, la SEC. ID Núm.: 6, la SEC. ID Núm.: , la SEC. ID Núm.: 8, , la SEC. ID Núm.: 19, la SEC. ID Núm.: 9, la SEC. ID Núm.: 11, la SEC. ID Núm.: 12, la SEC. ID Núm.: 13, la SEC. ID Núm.: 14, la SEC. ID Núm.: 15, la SEC. ID Núm.: 16, la SEC. ID Núm.: 17, la SEC. ID Núm.: 18, la SEC. ID Núm.: 19 y la SEC. ID Núm.: 27, preferentemente la SEC. ID Núm.: 1, cuando se usan para llevar a cabo las enseñanzas en la presente memoria descritas, se pueden proporcionar en cualquier forma y en cualquier grado de purificación, desde tejidos o células que comprenden dicho polipéptido en una forma endógena, más preferentemente células que sobreexpresan el polipéptido, lisados crudos o enriquecidos de dichas células, hasta polipéptido purificado y/o aislado que puede ser esencialmente puro. En una realización preferente, el término “sobreexpresante”, como se usa en la presente memoria, significa que la célula, preferentemente eucariota, más preferentemente de mamífero o de insecto, más preferentemente de mamífero, más preferentemente humana, más preferentemente una célula HEK293 o HEK293T, ha sido modificada genéticamente de forma que expresa más proteína de interés que una célula de tipo salvaje no modificada. En una realización preferente, el polipéptido es un polipéptido nativo, en la que el término “polipéptido nativo”, como se usa en la presente memoria, se refiere a un polipéptido plegado que comprende al menos 15, 30, 50, 100 150, 200, 300 o 350 aminoácidos, preferentemente más de 30 aminoácidos, más preferentemente a un polipéptido plegado purificado a partir de tejidos o células, más preferentemente a partir de células o tejidos de mamíferos, opcionalmente a partir de tejidos o células no recombinantes. En otra realización preferente, el polipéptido es un péptido lineal que tiene al menos 7, más preferentemente al menos 10 residuos de aminoácidos. Si se usa un polipéptido nativo, es preferente que esté enriquecido en comparación con su estado natural. Un polipéptido recombinante puede comprender una etiqueta C-terminal o N-terminal para purificación por afinidad, inmovilización o detección, tal como una etiqueta His, ejemplificada por la SEC. ID Núm.: 10, o una etiqueta de estreptavidina, preferentemente una estreptavidina, cuya etiqueta se puede eliminar preferentemente por escisión mediante el uso de una proteasa que reconozca un sitio de escisión de proteasa en un enlazador polipeptídico entre la etiqueta y el N-terminal o C-terminal, respectivamente, como parte de la purificación o procedimiento. El polipéptido escindido se puede unir posteriormente a un portador de utilidad diagnóstica para producir el portador de utilidad diagnóstica de acuerdo con la presente invención. En otra realización preferente, el medio para capturar específicamente un anticuerpo es una célula eucariota infectada por el virus del Zika, preferentemente humana. Dicha célula se puede evaluar por medio de microscopía de fluorescencia. Las células se pueden transfectar de forma transitoria o estable, preferentemente de forma transitoria.
De acuerdo con las presentes enseñanzas descritas en la presente memoria, se proporciona un ácido nucleico que codifica el polipéptido de acuerdo con la presente invención, tal como un polipéptido que comprende la SEC. ID Núm.: 1 o una variante del mismo, opcionalmente con un promotor inducible, cuyo polipéptido es preferentemente para uso para el diagnóstico de una enfermedad o la fabricación de un kit o reactivo para dicho uso. Dicho ácido nucleico puede ser un vector, preferentemente para expresar dicho ácido nucleico. También se proporciona una célula eucariota o procariota, preferentemente eucariota, que comprende este vector y preferentemente expresa el polipéptido codificado por el vector. El ácido nucleico, el vector y la célula se pueden usar para la fabricación de un kit de uso tal como el uso de un anticuerpo frente a NS1, preferentemente de clase IgA frente a NS1 de un Flavivirus, preferentemente el virus del Zika, o un portador de utilidad diagnóstica para inmovilizar y opcionalmente detectar dicho anticuerpo, para distinguir una infección primaria de una secundaria, preferentemente la infección por el virus del Zika, uso de un anticuerpo de clase IgA frente al NS1 de un flavivirus, preferentemente el virus del Zika, o un portador de utilidad diagnóstica para inmovilizar y, opcionalmente, detectar dicho anticuerpo, para diagnosticar una infección flaviviral, preferentemente una infección por el virus del Zika, en un sujeto con deficiencia de IgM, tal como el uso de un anticuerpo de clase IgA frente a NS1 de un flavivirus, preferentemente el virus del Zika, o un portador de utilidad diagnóstica para inmovilizar y, opcionalmente, detectar dicho anticuerpo, para aumentar la fiabilidad diagnóstica, preferentemente la sensibilidad, de un ensayo diagnóstico para diagnosticar una infección flaviviral, preferentemente una infección por el virus del Zika, más preferentemente en las primeras fases de una infección, o tal como para distinguir una infección primaria de una secundaria, preferentemente del virus del Zika, o tal como para aumentar la fiabilidad diagnóstica, preferentemente la sensibilidad, de un ensayo diagnóstico para diagnosticar una infección flaviviral, preferentemente una infección por el virus del Zika, más preferentemente en las primeras fases de una infección. El ácido nucleico se puede expresar, el polipéptido codificado purificarse y usarse, preferentemente revestido sobre un portador de utilidad diagnóstica, a fin de fabricar el portador de utilidad diagnóstica de acuerdo con la presente invención. En una realización preferente, el término “fase temprana” se refiere al período de tiempo anterior a los primeros 60, preferentemente los primeros 40 días tras la aparición de los síntomas, en el que más preferentemente no se puede observar ningún aumento de los anticuerpos de clase IgG.
Un polipéptido proporcionado o usado en un procedimiento o como parte de un portador o usado de cualquier otra forma de acuerdo con la presente invención puede estar glicosilado o no glicosilado, preferentemente glicosilado. Un polipéptido glicosilado que comprende la SeC. ID Núm.: 1, la SEC. ID Núm.: 2, la SEC. ID Núm.: 3, la SEC. ID Núm.: 4, la SEC. ID Núm.: 5, la SEC. ID Núm.: 6, la SEC. ID Núm.: 8, la SEC. ID Núm.: 19 o la SEC. ID Núm.: 9 o una variante de los mismos se puede obtener por medio de la purificación del polipéptido a partir de una célula eucariota, preferentemente una célula HEK293 o HEK293T. Un polipéptido homogéneamente glicosilado se puede obtener por medio de la purificación del polipéptido a partir de la fracción citosólica de una célula eucariota, un polipéptido heterogéneamente glicosilado se puede obtener por medio de la purificación del polipéptido a partir del medio sobrenadante de cultivo celular tras el cultivo de una célula eucariota que exprese el polipéptido. Un polipéptido no glicosilado se puede obtener por deglicosilación enzimática de un polipéptido purificado a partir de una célula eucariota o por purificación de un polipéptido expresado en una célula procariota.
En una realización preferente, se puede proporcionar o usar un polipéptido que comprende una secuencia del grupo que comprende la SeC. ID Núm.: 1, la s Ec . ID Núm.: 2, la SEC. ID Núm.: 3, la SEC. ID Núm.: 4, la SEC. ID Núm.: 5, la SEC. ID Núm.: 6, la SEC. ID Núm.: 7, la SEC. ID Núm.: 8, la SEC. ID Núm.: 19 y la SEC. ID Núm.: 9 o una variante de la misma, preferentemente la SEC. ID Núm.: 1 o una variante de la misma, como parte de un portador de utilidad diagnóstica, procedimiento o uso de acuerdo con la presente invención en diversas formas oligoméricas que comprenden uno o más de un monómero, por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 monómeros, y se pueden usar, por ejemplo, como medio para capturar un anticuerpo frente a Flavivirus N1, que comprende preferentemente la SEC. ID Núm.: 1 o una variante del mismo, opcionalmente un anticuerpo de clase IgA frente a un Flavivirus NS1, en forma de monómero, dímero o hexámero, preferentemente un dímero. En una realización preferente, dicho monómero, dímero o hexámero, preferentemente dímero, se ha purificado a partir de una célula eucariota, preferentemente célula eucariota recombinante, tal como una célula HEK293T o HEK293, preferentemente a partir de la fracción citoplasmática, que contiene la forma dimérica, o del medio celular en el que se cultivó la célula, que contiene la forma hexamérica secretada en el medio, preferentemente a partir de la fracción citosólica. En otra realización preferente, se usa una mezcla de formas oligoméricas, preferentemente purificadas a partir de una célula eucariota, en la que la relación molar de dímero a hexámero es de al menos 0,1:1, preferentemente, 0,5:1, 1:1, 1,5:1, 2:1, 5:1 o 10:1. En otra realización preferente, se usa una mezcla de formas oligoméricas, preferentemente purificadas a partir de una célula eucariota, en la que la relación molar de hexámero a dímero es de al menos 0,1:1, preferentemente, 0,5:1, 1:1, 1,5:1, 2:1, 5:1 o 10:1. En una realización preferente, el hexámero se usa como medio para capturar una clase IgG. En otra realización preferente, el dímero se usa para capturar un anticuerpo de clase IgM.
Alternativamente, se puede usar una célula procariota o síntesis química para expresar u obtener y purificar el oligómero polipeptídico, preferentemente dímero o hexámero, opcionalmente por medio de reticulación química y aislamiento del oligómero, preferentemente dímero o hexámero. Los expertos en la técnica está familiarizado con las técnicas para aislar o enriquecer determinadas formas oligoméricas, por ejemplo por medio de cromatografía de exclusión por tamaño. La interfaz de los monómeros en forma oligomérica, que hace que los monómeros se asocien al oligómero, está preferentemente constituida por la SEC. ID Núm.: 1 o una variante de la misma que forma parte de la secuencia de los monómeros en forma oligomérica.
Un oligómero que comprende más de un monómero se puede estabilizar por medio de un enlace no covalente o covalente, preferentemente covalente entre los dos o más monómeros que forman dicho oligómero. En una realización preferente, el oligómero se estabiliza por medio de uno o más enlaces covalentes a través de una o más cadenas laterales de cisteína entre los monómeros. El enlace covalente puede ser un enlace disulfuro o comprender un enlazador que comprende dos grupos funcionales que son reactivos con grupos tiol, cuyo enlazador une dos residuos de cadena lateral tras la reacción de los dos grupos funcionales con dos grupos tiol. En una realización más preferente, este enlace covalente es entre dos residuos de cisteína cadena lateral que normalmente no forman un enlace disulfuro en el nativo, como se menciona en (Xuet al., (Contribution of intertwined loop to membrane association revealed by Zika virus full-length NS1 structure(EMBO J., publicado el 30 de agosto de 2016, acceso abierto), estado natural de la proteína. En otra realización preferente, el oligómero está estabilizado por enlaces no covalentes entre monómeros, y al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11 o 12 residuos de cisteína están oxidados, formando enlaces disulfuro intermonoméricos.
En una realización preferente, la NS1 de Flavivirus, preferentemente la SEC. ID Núm.: 1 o una variante de la misma, está en complejo con un lípido, cuyo lípido se deriva preferentemente de una membrana celular, más preferentemente de una membrana celular Eucariota tal como una membrana celular HEK293.
Se pueden usar formas oligoméricas tales como dímeros o hexámeros, al llevar a la práctica la presente invención, en forma de oligómeros homogéneos o heterogéneos, en los que los oligómeros homogéneos comprenden dos o más monómeros diferentes, opcionalmente derivados de diferentes secuencias de flavivirus del grupo que comprende la SEC. ID Núm.: 1, la SEC. ID Núm.: 2, la SEC. ID Núm.: 3, la SEC. ID Núm.: 4, la SEC. ID Núm.: 5, la SEC. ID Núm.: 6, la SEC. ID Núm.: 7, la SEC. ID Núm.: 8, la SEC. ID Núm.: 19 y la SEC. ID Núm.: 9 o una variante de las mismas, preferentemente de la SEC. ID Núm.: 1 o una variante de la misma. Por ejemplo, un dímero heterogéneo puede comprender un monómero que comprende la SEC. ID Núm.: 1 y un monómero que comprende la SEC. ID Núm.: 2. Por el contrario, los oligómeros heterogéneos comprenden dos monómeros que derivan ambos de la misma secuencia del grupo que comprende la SEC. ID Núm.: 1, la SEC. ID Núm.: 2, la<s>E<c>. ID Núm.: 3, la SEC. ID Núm.: 4, la SEC. ID Núm.: 5, la SEC. ID Núm.: 6, la SEC. ID Núm.: 7, la SEC. ID Núm.: 8, la SEC. ID Núm.: 19 y la SEC. ID Núm.: 9 o una variante de la misma, preferentemente de la SEC. ID Núm.: 1 o una variante de la misma, y son opcionalmente idénticos.
En una realización preferente, el anticuerpo a detectar puede ser un anticuerpo frente a un monómero, dímero y/o hexámero, preferentemente frente a un dímero, de un polipéptido del grupo que comprende la SEC. ID Núm.: 1, la SEC. ID Núm.: 2, la SEC. ID Núm.: 3, la SEC. ID Núm.: 4, la SEC. ID Núm.: 5, la SEC. ID Núm.: 6, la SEC. ID Núm.: 7, la SEC. ID Núm.: 8 y la SEC. ID Núm.: 9 o una variante de los mismos, preferentemente la SEC. ID Núm.: 1 o una variante de la misma. Dicho anticuerpo o un anticuerpo que se une a un polipéptido del grupo que comprende la SEC. ID Núm.: 1, la SEC. ID Núm.: 2, la SEC. ID Núm.: 3, la SEC. ID Núm.: 4, la SEC. ID Núm.: 5, la SEC. ID Núm.: 6, la SEC. ID Núm.: 7, la SEC. ID Núm.: 8, la SEC. ID Núm.: 19 y la SEC. ID Núm.: 9 o una variante del mismo, preferentemente la SEC. ID Núm.: 1 o una variante del mismo independientemente del estado oligomérico, se puede proporcionar como anticuerpo aislado y/o recombinante o fragmento de anticuerpo.
En otra realización preferente, el polipéptido que comprende una secuencia del grupo que comprende la SEC. ID Núm.: 1, la SEC. ID Núm.: 2, la SEC. ID Núm.: 3, la SEC. ID Núm.: 4, la SEC. ID Núm.: 5, la SEC. ID Núm.: 6, la SEC. ID Núm.: 7, la SEC. ID Núm.: 8, la SEC. ID Núm.: 19 y la SEC. ID Núm.: 9 y una variante de la misma, preferentemente la SEC. ID Núm.: 1 o una variante de la misma, preferentemente un dímero y/o hexámero, preferentemente el hexámero, se usa en una mezcla con un polipéptido de mamífero, preferentemente no humano, tal como un polipéptido bovino, tal como la Apolipoproteína A-I de mamífero, más preferentemente humana (Secuencia de Referencia NCBI: NP_000030.1) o Apolipoproteína A-I bovina (GenBank: AAI02942.1; todos los códigos de bases de datos citados en la presente memoria se refieren a la entrada en la base de datos respectiva en la fecha de prioridad), o humana (NCBI: NP_000375.2) o Apolipoproteína B-100 bovina isoforma X1 (NCBI: XP_015329038.1 o una variante de la misma) más preferentemente Apolipoproteína A-I bovina o una variante de la misma. La mezcla puede comprender un complejo del polipéptido que comprende una secuencia del grupo que comprende la SEC. ID Núm.: 1, la SEC. ID Núm.: 2, la s Ec . ID Núm.: 3, la s Ec . ID Núm.: 4, la SEC. ID Núm.: 5, la SEC. ID Núm.: 6, la SEC. ID Núm.: 7, la SEC. ID Núm.: 8, la SEC. ID Núm.: 19 y la SEC. ID Núm.: 9 y una variante de la misma, preferentemente la SEC. ID Núm.: 1 o una variante de la misma, preferentemente un dímero y/o hexámero, preferentemente el hexámero, y, como un segundo componente del complejo, una Apolipoproteína A-I de mamífero, más preferentemente humana (Secuencia de Referencia NCBI: NP_000030.1) o Apolipoproteína A-I bovina (GenBank: AAI02942.1), más preferentemente Apolipoproteína A-I bovina o una variante de la misma, cuyo complejo se puede usar para la práctica de la invención, por ejemplo para el diagnóstico de una enfermedad, más concretamente como medio de captura de un anticuerpo. En la mezcla, preferentemente el complejo, la relación molar entre los monómeros polipeptídicos y la Apolipoproteína A-1 de mamífero puede ser al menos 1:1, 2:1, 5:1, 6:1, 10:1, 50:1 o 100:1.
De acuerdo con la presente invención, el polipéptido puede ser una proteína recombinante, en la que el término “recombinante”, como se usa en la presente memoria, se refiere a un polipéptido producido mediante el uso de enfoques de ingeniería genética en cualquier etapa del proceso de producción, por ejemplo, por medio de la fusión de un ácido nucleico que codifica el polipéptido a un promotor fuerte para la sobreexpresión en células o tejidos o por medio de la ingeniería de la secuencia del propio polipéptido. Los expertos en la técnica están familiarizados con los procedimientos de ingeniería de ácidos nucleicos y polipéptidos codificados (por ejemplo, los descritos en Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T (1989),Molecular Cloning,CSH o en Brown T A. (1986),Gene Cloning - an introduction,Chapman & Hall) y para producir y purificar polipéptidos nativos o recombinantes (por ejemplo, Handbooks“Strategies for Protein Purification", “Antibody Purificaron",publicados por GE Healthcare Life Sciencesy en Burgess, R. R., Deutscher, M. P (2009):Guide to Protein Purification).En otra realización preferente, el polipéptido usado para las diversas realizaciones de la presente invención es un polipéptido aislado, en el que el término “aislado”, como se usa en la presente memoria, significa que el polipéptido ha sido enriquecido en comparación con su estado de producción mediante el uso de un enfoque biotecnológico o sintético y es preferentemente puro, es decir, al menos el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 99 por ciento del polipéptido en la muestra respectiva consiste en dicho polipéptido de acuerdo con lo juzgado por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS seguida por tinción con azul de Coomassie e inspección visual.
El sujeto de acuerdo con la presente invención es un organismo productor de anticuerpos, preferentemente anticuerpos de clase IgA, IgM y/o IgG, más preferentemente de un mamífero, más preferentemente de un ser humano. De acuerdo con la presente invención, los anticuerpos de clase IgM e IgG frente a la SEC. ID Núm.: 1 se pueden detectar en reacciones de ensayo separadas, por ejemplo para determinar el momento en que el sujeto se infectó por primera vez.
Dentro del alcance de la presente invención se encuentra un portador de utilidad diagnóstica que comprende un medio para capturar específicamente un anticuerpo frente a un antígeno tal como la SEC. ID Núm.: 1. En una realización preferente, el término “capturar específicamente un anticuerpo”, como se usa en la presente memoria, se refiere a la capacidad de unirse específicamente al anticuerpo de interés, preferentemente un anticuerpo de clase IgA, IgM o IgG, con el efecto de que se une y se elimina de la muestra, mientras que otros anticuerpos, preferentemente de la misma clase y/o de otro antígeno, esencialmente no se unen y permanecen en la muestra. El anticuerpo es preferentemente un anticuerpo que se une únicamente al antígeno de interés tal como el representado por la SEC. ID Núm.: 1, pero no a otros antígenos homólogos de otros virus tales como los representados por la SEC. ID Núm.: 1, la SEC. ID Núm.: 2, la SEC. ID Núm.: 3, la SEC. ID Núm.: 4, la SEC. ID Núm.: 5, la SEC. ID Núm.: 6, la SEC. ID Núm.: 7, la SEC. ID Núm.: 8 y la SEC. ID Núm.: 9.
El portador de utilidad diagnóstica de acuerdo con la invención sirve como andamiaje para uno o más medios para capturar específicamente un anticuerpo, preferentemente un anticuerpo de relevancia diagnóstica frente a un antígeno de Flavivirus tal como el representado por la SEC. ID Núm.: 1. Dicho soporte es adecuado para llevar a cabo un procedimiento de diagnóstico. Al usar un portador en lugar de medios libres y solubles para capturar específicamente un anticuerpo, es más sencillo aislar y separar de la muestra un complejo que comprende los medios y el anticuerpo y lavar dicho complejo, por ejemplo a fin de eliminar cualquier molécula que se una de forma no específica a los medios, al complejo o al portador. En una realización preferente, el portador de utilidad diagnóstica es un dispositivo de diagnóstico, preferentemente seleccionado del grupo que comprende una perla, preferentemente una partícula paramagnética, una tira reactiva, una placa de microtitulación, una mancha y una membrana, y es preferentemente una mancha lineal o una placa de microtitulación, más preferentemente una placa de microtitulación.
una realización preferente, el dispositivo de utilidad diagnóstica es una placa de microtitulación que comprende un pocillo revestido con un medio para capturar específicamente un anticuerpo contra la SEC. ID Núm.: 1, cuyo medio es preferentemente un polipéptido que comprende la SEC. ID Núm.: 1 o una variante del mismo. Además, dicho pocilio comprende un medio para detectar un anticuerpo contra al menos una de la SEC. ID Núm.: 2, la SEC. ID Núm.: 3, la SEC. ID Núm.: 4 y la SEC. ID Núm.: 5, preferentemente todas ellas, preferentemente un polipéptido que comprenda al menos una de las SEC. ID Núm.: 2, la SEC. ID Núm.: 3, la SEC. ID Núm.: 4 y la Se C. iD Núm.: 5 o una variante de las mismas. Además, dicho pocillo comprende medios para capturar específicamente un anticuerpo para cada una de la SEC. ID Núm.: 6, la SEC. ID Núm.: 7, la SEC. ID Núm.: 8 y la SEC. I<d>Núm.: 9, preferentemente un polipéptido que comprende la SEC. ID Núm.: 6 o una variante de la misma, la SEC. ID Núm.: 7 o una variante de la misma, la SEC. ID Núm.: 8 o una variante de la misma y la SEC. ID Núm.: 9 o una variante de la misma. Además, un pocillo separado puede incluir uno o más antígenos para detectar una infección por el virus chikungunya.
En una realización preferente, el término “detectar específicamente un anticuerpo capturado”, como se usa en la presente memoria, significa que el anticuerpo que se une específicamente a los medios para capturar específicamente el anticuerpo, preferentemente un polipéptido que comprende la SEC. ID Núm.: 1 o una variante del mismo, tras la captura, se detecta en lugar de cualquier otro anticuerpo presente en la muestra. La unión específica significa preferentemente que la reacción de unión es más fuerte que una reacción de unión caracterizada por una constante de disociación de 1 * 10-5 M, más preferentemente 1 * 10-7 M, más preferentemente 1 * 10-8 M, más preferentemente 1 * 10-9 M, más preferentemente 1 * 10-10 M, más preferentemente 1 * 10-11 M, más preferentemente 1 * 10-12 M, determinada por resonancia de plasmón de superficie mediante el uso de un equipo Biacore a 25 °C en tampón PBS a pH 7.
En una realización preferente, los medios para capturar específicamente un anticuerpo frente a la SEC. ID Núm.: 1 y los medios para capturar específicamente un anticuerpo frente a uno o más antígenos adicionales, preferentemente seleccionados del grupo que comprende la SEC. ID Núm.: 2, la SEC. ID Núm.: 3, la SEC. ID Núm.: 4, la SEC. ID Núm.: 5, la SEC. ID Núm.: 6, la SEC. ID Núm.: 7, la SEC. ID Núm.: 8, la SEC. ID Núm.: 19 y la SEC. ID Núm.: 9, se encuentran en soportes separados. Esto significa que los medios no están fijados a un único soporte, sino a uno o más soportes separados y/o separables sin dañarlos. Por ejemplo, los medios para capturar específicamente un anticuerpo de la SEC. ID Núm.: 1 pueden estar unidos a una primera tira reactiva, y los medios para capturar específicamente un anticuerpo de la SEC. ID Núm.: 2 están unidos a otra tira reactiva que está separada de la primera tira reactiva.
En una realización preferente, los medios para capturar específicamente un anticuerpo frente a la SEC. ID Núm.: 1 y los medios para capturar específicamente un anticuerpo frente a uno o más antígenos adicionales, preferentemente seleccionados del grupo que comprende la SEC. ID Núm.: 2, la SEC. ID Núm.: 3, la SEC. ID Núm.: 4, la SEC. ID Núm.: 5, la SEC. ID Núm.: 6, la SEC. ID Núm.: 7, la SEC. ID Núm.: 8, la SEC. ID Núm.: 19 y la SEC. ID Núm.: 9, están en uno, preferentemente unidos covalentemente a un portador. Esto significa que los medios están fijados a un soporte que no se puede desmontar sin dañarlo, de forma que los medios están en soportes separados. Por ejemplo, los medios pueden estar todos revestidos en una tira reactiva, en particular en forma de mancha lineal.
De acuerdo con la presente invención, se proporciona un medio para detectar específicamente un anticuerpo capturado, opcionalmente como parte de un kit.
Las enseñanzas inventivas proporcionan un kit, preferentemente para diagnosticar una infección, más preferentemente para diagnosticar una infección por flavivirus, más preferentemente una infección por el virus del Zika. Un kit de este tipo es un recipiente que comprende reactivos específicos necesarios para llevar a la práctica el procedimiento inventivo, en particular el portador útil para el diagnóstico de acuerdo con la presente invención, opcionalmente además de una o más soluciones o reactivos necesarios para llevar a la práctica el procedimiento inventivo, preferentemente seleccionados de entre o todos del grupo que comprende el tampón de dilución de la muestra, el tampón de lavado y el tampón que comprende un medio para detectar cualquier anticuerpo capturado específicamente, tal como un anticuerpo secundario y opcionalmente un medio para detectar el anticuerpo específicamente capturado, que opcionalmente se puede unir al anticuerpo secundario, por ejemplo un marcador fluorescente, enzimáticamente activo, radioactivo, quimioluminiscente, preferentemente electroquimioluminiscente o un marcador de espín. El kit puede comprender una solución química para llevar a cabo una reacción de detección, tal como 3,3',5,5'-tetrametilbencidina, p-nitrofenilfosfato, ácido 2,2'-azinobis [3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico o dihidrocloruro de o-fenilendiamina para una reacción colorimétrica tripropilamina para una reacción de electroquimioluminiscencia. Además, puede comprender instrucciones que detallen cómo usar el kit y el portador inventivo de utilidad diagnóstica para poner en contacto el polipéptido inventivo con una muestra de fluido corporal de un sujeto, preferentemente un sujeto humano, por ejemplo una mancha lineal, en la que el medio inventivo para capturar específicamente la SEC. ID Núm.: 1, preferentemente un polipéptido que comprende la SEC. ID Núm.: 1 o una variante del mismo, está inmovilizado en la mancha lineal. Además, el kit puede comprender un control positivo, por ejemplo un anticuerpo recombinante que se sabe que se une a la SEC. I<d>Núm.: 1, y un control negativo, por ejemplo una proteína que no tiene afinidad detectable por la SEC. ID Núm.: 1. Por último, el kit puede comprender una solución estándar que comprenda un anticuerpo de unión a la SEC. ID Núm.: 1 para preparar una curva de calibración. En una realización preferente, el kit comprende un dispositivo, preferentemente un dispositivo basado en blot, tal como un blot lineal revestido con un medio para capturar específicamente un anticuerpo frente a la SEC. ID Núm.: 1 y, opcionalmente, un anticuerpo frente a uno o más antígenos adicionales tal como la SEC. ID Núm.: 2, la SEC. ID Núm.: 3, la SEC. ID Núm.: 4, la SEC. ID Núm.: 5, la SEC. ID Núm.: 6, la SEC. ID Núm.: 7, la SEC. ID Núm.:
8, la SEC. ID Núm.: 19 y/o la SEC. ID Núm.: 9. El kit puede comprender uno o más controles adicionales seleccionados entre un control que confirme que se ha añadido la muestra y/o un control que confirme que se ha añadido un anticuerpo secundario.
De acuerdo con la invención, se puede usar un medio para detectar el uno o más anticuerpos capturados. Los expertos en la técnica conoce muchos procedimientos que se pueden usar, que también se describen en el estado de la técnica, por ejemplo en Zane, H. D. (2001),Immunology - Theoretical & Practical Concepts in Laboratory Medicine,W. B. Saunders Company, en particular en el capítulo 14. En una realización preferente, se usa un anticuerpo secundario que se une a la región constante de uno o más anticuerpos capturados, que es el anticuerpo primario correspondiente, cuyo anticuerpo secundario puede estar asociado a una etiqueta que sea fácil de detectar. Alternativamente, un polipéptido antigénico, preferentemente del grupo de polipéptidos que comprenden una secuencia del grupo que comprende la SEC. iD Núm.: 1, la SEC. ID Núm.: 2, la SEC. ID Núm.: 3, la SEC. ID Núm.: 4, la SEC. ID Núm.: 5, la SEC. ID Núm.: 6, la SEC. ID Núm.: 7, la SEC. ID Núm.: 8, la SEC. ID Núm.: 19 y la SEC. ID Núm.: 9 y una variante de los mismos, preferentemente la SEC. ID Núm.: 1, o una variante de la misma se pueden usar para detectar el anticuerpo relevante para el diagnóstico, preferentemente tras su inmovilización, en el que dicho polipéptido comprende preferentemente una etiqueta que es fácil de detectar. Dicho polipéptido antigénico se puede unir a cualquier anticuerpo inmovilizado de utilidad diagnóstica para permitir la detección específica. La etiqueta fácil de detectar se puede seleccionar del grupo que comprende una etiqueta fácil de detectar, por ejemplo una etiqueta fluorescente, quimioluminiscente tal como la electroquimioluminiscente, radiactiva, de espín o enzimáticamente activa, esta última puede catalizar una reacción quimioluminiscente, o puede provocar la generación de una molécula detectable o una señal tal como un fotón por medio de colorimetría, detección de fluorescencia tal como microscopía de fluorescencia, fotomultiplicación o espectroscopia u otro procedimiento analítico.
En una realización preferente, el término “diagnóstico”, como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier tipo de procedimiento destinado a obtener información instrumental en la evaluación de si un paciente sufre o es probable o más probable que el promedio o un sujeto comparativo, este último preferentemente con síntomas similares, de sufrir cierta enfermedad o trastorno en el pasado, en el momento del diagnóstico o en el futuro, para averiguar cómo está progresando la enfermedad o es probable que progrese en el futuro o para evaluar la capacidad de respuesta de un paciente con respecto a un determinado tratamiento, por ejemplo la administración de medicamentos adecuados, tales como medicamentos para la desensibilización de pacientes alérgicos. En otras palabras, el término “diagnóstico” comprende no sólo el diagnóstico, sino también el pronóstico y/o el seguimiento del curso de una enfermedad o trastorno.
Por lo tanto, el término “diagnóstico” no implica preferentemente que los procedimientos o agentes de diagnóstico de acuerdo con la presente invención sean definitivos y suficientes para finalizar el diagnóstico sobre la base de una sola prueba, y mucho menos de un parámetro, sino que se puede referir a una contribución a lo que se denomina “diagnóstico diferencial”, es decir, un procedimiento de diagnóstico sistemático que considera la probabilidad de una serie de posibles afecciones sobre la base de una serie de parámetros de diagnóstico. El término “diagnóstico” también se puede referir a un procedimiento o agente usado para seleccionar el régimen de tratamiento más prometedor para un paciente. En otras palabras, el procedimiento o agente puede estar relacionado con la selección de un régimen de tratamiento para un sujeto.
La presente invención se refiere a un procedimiento que comprende la etapa de detectar en una muestra de un sujeto la presencia o ausencia de un anticuerpo contra un polipéptido antigénico tal como un polipéptido que comprende una SEC ID Núm. 1 o una variante de la misma. Este procedimiento comprende preferentemente la inmovilización de dicho anticuerpo seguida de la detección específica de dicho anticuerpo, por ejemplo por medio de las etapas a) proporcionar una muestra de un sujeto, b) poner en contacto la muestra con el portador de utilidad diagnóstica de acuerdo con la presente invención en condiciones compatibles con la formación de un complejo que comprenda el portador de utilidad diagnóstica y el anticuerpo, más específicamente los medios para capturar específicamente el anticuerpo y el anticuerpo, c) aislar dicho complejo, por ejemplo retirando la muestra, d) opcionalmente lavar dicho complejo, y e) opcionalmente detectar dicho complejo. El procedimiento es un procedimientoin vitro.La detección del complejo para el pronóstico, diagnóstico, procedimientos o kit de prueba comprende el uso de un procedimiento seleccionado del grupo que comprende las técnicas de inmunodifusión, las técnicas inmunoelectroforéticas, los inmunoensayos de dispersión de la luz, las técnicas de aglutinación, los inmunoensayos marcados tales como los del grupo que comprende los inmunoensayos radiomarcados, los inmunoensayos enzimáticos tales como los ensayos colorimétricos, los inmunoensayos de quimioluminiscencia, preferentemente electroquimioluminiscencia, inmunoensayos y las técnicas de inmunofluorescencia. Los expertos en la técnica están familiarizados con estos procedimientos, que también se describen en el estado de la técnica, por ejemplo en Zane, H. D. (2001):Immunology - Theoretical & Practical Concepts in Laboratory Medicine,W. B. Saunders Company, en particular en el Capítulo 14. El procedimiento puede comprender además la comprobación de la avidez de anticuerpos contra la SEC. ID Núm.: 1 en la muestra, preferentemente de anticuerpos contra la SEC. ID Núm.: 1.
Un producto obtenido al llevar a la práctica el procedimiento es un portador de utilidad diagnóstica que comprende un medio para detectar específicamente un anticuerpo de la SEC. ID Núm.: 1 en complejo con el anticuerpo de la SEC. ID Núm.: 1 y opcionalmente un medio para detectar específicamente el anticuerpo de la SEC. ID Núm.: 1 tal como un anticuerpo secundario. Si el anticuerpo de la SEC. iD Núm.: 1 es un anticuerpo de clase IgM, el anticuerpo secundario es un anticuerpo marcado que se une a una región constante de anticuerpos de clase IgM. Si el anticuerpo de la SEC. ID Núm.: 1 es un anticuerpo de clase IgG, el anticuerpo secundario es un anticuerpo marcado que se une a una región constante de anticuerpos de clase IgG. Si el anticuerpo de la SEC. ID Núm.: 1 es un anticuerpo de clase IgA, el anticuerpo secundario es un anticuerpo marcado que se une a una región constante de anticuerpos de clase IgA. El soporte de utilidad diagnóstica puede ser una placa de microtitulación con uno o más de un pocillo, un pocillo que comprende un medio para capturar específicamente un anticuerpo frente a la SEC. ID Núm.: 1, y al menos uno o más, dos o más, tres o más para o más pocillos cada uno de los cuales comprende un medio para capturar específicamente un anticuerpo frente a una secuencia del grupo que comprende la SEC. ID Núm.: 2, la SEC. ID Núm.: 3, la SEC. ID Núm.: 4, la SEC. ID Núm.: 5, la SEC. ID Núm.: 6, la SEC. ID Núm.: 7, la SEC. ID Núm.: 8, la SEC. ID Núm.: 19 y/o la SEC. ID Núm.: 9.
En numerosos casos, la detección de la ausencia o presencia de un anticuerpo, que opcionalmente significa determinar si la concentración del anticuerpo está por encima de un cierto umbral, a menudo sugerido por el límite de detección, en la muestra, es suficiente para el diagnóstico. Si se puede detectar el anticuerpo, podría ser una información usada para el diagnóstico del clínico e indica una mayor probabilidad de que el paciente padezca una enfermedad. En una realización preferente, se puede determinar la concentración relativa del anticuerpo en el suero, en comparación con el nivel que se puede encontrar en un sujeto sano promedio. En una realización preferente, el término “detectar la presencia”, como se usa en la presente memoria, significa que basta con comprobar si se puede detectar una señal suficientemente por encima de cualquier nivel de fondo mediante el uso de un procedimiento de detección complejo adecuado que indique que el anticuerpo de interés está presente o que hay más anticuerpo de interés presente del que habría en un sujeto sano. En una realización más preferente, esto puede implicar determinar si la concentración es al menos 0,1, preferentemente 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 25, 50, 100, 200, 500, 1000, 10000 o 100000 veces mayor que la concentración del anticuerpo de interés encontrada en el sujeto sano promedio. La enfermedad a diagnosticar es una infección, preferentemente viral, más preferentemente por Flavivirus, y más preferentemente por el virus del Zika. Preferentemente, una infección por el virus del Zika se puede distinguir de otra infección por Flavivirus, más preferentemente de una infección por un Flavivirus seleccionado del grupo que comprende el virus del dengue, el virus de la fiebre amarilla, el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, el virus Usutu, el virus del Nilo Occidental y el virus de la encefalitis japonesa o todos ellos, preferentemente del virus del dengue.
La invención se puede usar para proporcionar un pronóstico sobre la probabilidad de que el recién nacido de una mujer embarazada sufra una deformidad si se analiza la muestra de la mujer embarazada. Preferentemente, la mujer embarazada puede presentar síntomas que sugieran que puede padecer una infección flaviviral o puede padecer realmente una infección.
La invención se puede usar para diagnosticar si las deformidades de un niño, tal como la microcefalia, son consecuencia de una infección previa por el virus del Zika o no.
La invención se puede usar para diagnosticar si un sujeto padece o puede padecer, tras el inicio de la infección, una enfermedad autoinmune tal como el síndrome de Guillan Barré. Más concretamente, si se detectan anticuerpos contra la SEC. ID Núm.: 1 en una muestra de un sujeto, dicho sujeto tiene más probabilidades de padecer una enfermedad autoinmune que un sujeto que no tenga anticuerpos contra la SEC. ID Núm.: 1.
La invención se puede usar para analizar muestras que contengan anticuerpos autoinmunes, tales como los autoanticuerpos ANA, que pueden oscurecer los resultados obtenidos por medio de ensayos convencionales, por lo que se puede usar en combinación con un procedimiento que comprenda la etapa de detección en una muestra de un sujeto de autoanticuerpos ANA. Para la detección de ANA se pueden usar kits comerciales, por ejemplo EUROPLUS ANA Mosaic 20A, ANA screen 11, ANA Profile 3 o Anti-ENA ProfilePlus. Esto puede permitir distinguir una enfermedad autoinmune de una infección viral o un anticuerpo relacionado con una enfermedad autoinmune y los relacionados con una infección viral.
La invención se puede usar para distinguir infecciones por Flavivirus de otras infecciones virales, preferentemente infecciones por alfavirus, más preferentemente una infección por el virus chikungunya.
La invención se puede usar para analizar la sangre de donantes de sangre en busca de infecciones previas.
En una realización preferente, la ausencia o presencia de dos o más anticuerpos tales como un anticuerpo contra la SEC. ID Núm. 1, se detecta simultáneamente, es decir, al mismo tiempo. Esto es conveniente en términos de procedimientos de diagnóstico eficientes, dado que se obtiene un máximo de información de diagnóstico en un período de tiempo determinado. Por supuesto, un requisito previo es que se disponga de capacidad suficiente para ejecutar todas las reacciones.
En una realización preferente, la ausencia o presencia de al menos dos anticuerpos, tales como un anticuerpo contra la SEC. ID Núm.: 1 y uno y más anticuerpos contra un antígeno del grupo que comprende la SEC. ID Núm.: 2, la SEC. ID Núm.: 3, la SEC. ID Núm.: 4, la SEC. ID Núm.: 5, la SEC. ID Núm.: 6, la SEC. ID Núm.: 7, la SEC. ID Núm.: 8, la SEC. ID Núm.: 19, la SEC. ID Núm.: 9, la SEC. ID Núm.: 10, la SEC. ID Núm.: 11, la SEC. ID Núm.: 12, la SEC. ID Núm.: 13, la SEC. ID Núm.: 14, la SEC. ID Núm.: 15, la SEC. ID Núm.: 16, la SEC. ID Núm.: 17, la SEC. ID Núm.: 18 y la SEC. ID Núm.: 27, se detecta en reacciones espacialmente separadas. Esto significa que estas reacciones se ejecutan en diferentes mezclas de reacción en recipientes separados, por ejemplo, pocilios separados de una placa de microtitulación o compartimentos separados cada uno con una microesfera diferente o el mismo compartimento usado posteriormente con más de una microesfera.
Si se va a detectar más de un anticuerpo, el procedimiento se puede llevar a cabo, en otra realización preferente, en una reacción de un solo recipiente. Preferentemente, el término “reacción en un solo recipiente”, como se usa en la presente memoria, significa que dos o más, preferentemente todas las reacciones llevadas a cabo con el fin de detectar la presencia o ausencia de un anticuerpo se llevan a cabo en la misma mezcla de reacción en un recipiente de reacción, sin barreras físicas entre las reacciones, en contraste con los ajustes experimentales que contemplan que al menos dos reacciones se lleven a cabo en soluciones y recipientes de reacción separados.
Las enseñanzas en la presente memoria descritas proporcionan una composición farmacéutica o una vacuna, cuya composición o composición inmunogénica tal como una vacuna comprende un polipéptido que comprende la SEC. ID Núm.: 1 o una variante del mismo, opcionalmente en combinación con uno o más antígenos adicionales tales como uno o más seleccionados del grupo que comprende la SEC. ID Núm.: 2, la SEC. ID Núm.: 3, la SEC. ID Núm.: 4, la SEC. ID Núm.: 5, la SEC. ID Núm.: 6, la SEC. ID Núm.: 7, la SEC. ID Núm.: 8, la SEC. ID Núm.: 19 y/o la SEC. ID Núm.: 9, preferentemente además de antígenos usados anteriormente tales como una glicoproteína de la envoltura del virus del Zika, preferentemente que comprenda la secuencia AHL16749.1 (base de datos UNIPROT en línea en la fecha de prioridad) o una variante de la misma o la SEC. ID Núm.: 11, preferentemente la SEC. ID Núm.: 11 o una variante de la misma, y/o un virus del Zika. Además, la composición o composición inmunogénica puede comprender un antígeno que comprende una secuencia seleccionada del grupo que comprende la SEC. ID Núm.: 12, la SEC. ID Núm.: 13, la SEC. ID Núm.: 14, la SEC. ID Núm.: 15, la SEC. ID Núm.: 16, la SEC. ID Núm.: 17, la SEC. ID Núm.: 18, la SEC. ID Núm.: 19 y la SEC. ID Núm.: 27 y una variante de la misma o una variante de la misma. Una composición inmunogénica o vacuna puede comprender componentes para inactivar un virus o bacteria y estabilizar la vacuna, ayudando a preservar la vacuna y evitar que pierda su potencia con el tiempo. Los adyuvantes se añaden a las vacunas para simular la producción de anticuerpos contra la vacuna y hacerla más eficaz. Un coadyuvante puede ser orgánico o inorgánico. Los adyuvantes inorgánicos más comunes para las vacunas humanas incluyen el fosfato de aluminio y el hidróxido de aluminio. Los adyuvantes orgánicos se podrían basar en el compuesto orgánico escualeno y se puede usar un adyuvante de aceite [escualeno] en agua. Una composición inmunogénica puede comprender estabilizadores que ayuden a la vacuna a mantener su eficacia durante el almacenamiento, por ejemplo, MgCh, MgSO4, lactosa-sorbitol o sorbitol-gelatina, y conservantes para prevenir el crecimiento bacteriano y fúngico, por ejemplo, tiomersal, formaldehído o derivados fenólicos, antibióticos. La composición es preferentemente adecuada para su administración a un sujeto, preferentemente un sujeto mamífero, más preferentemente a un ser humano. Dicha composición farmacéutica puede comprender un portador aceptable para uso farmacéutico. La composición farmacéutica se puede administrar, por ejemplo, por vía oral, parenteral, inhalatoria, tópica, en colirio, rectal, nasal, bucal, vaginal o a través de un reservorio implantado, en el que el término “parenteral”, como se usa en la presente memoria, comprende las técnicas de inyección o infusión subcutánea, intracutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, instrasternal, intratecal, intralesional e intracraneal. La composición farmacéutica se puede suministrar en formas de dosificación adecuadas, por ejemplo cápsulas, comprimidos y suspensiones y soluciones acuosas, preferentemente en forma estéril. Se puede usar en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad, que comprende la administración de una cantidad eficaz del polipéptido a un sujeto.
El procedimiento para diagnosticar una infección por Flavivirus, preferentemente para distinguir una infección primaria de una secundaria por Flavivirus, puede comprender la etapa de detectar en una primera muestra de un sujeto un anticuerpo de clase IgA frente a NS1 de un Flavivirus, opcionalmente además comprende detectar en dicha primera muestra un anticuerpo de clase IgM y/o IgG, preferentemente de clase IgM frente a NS1 de un Flavivirus, más preferentemente la SEC. ID Núm.: 1. En una realización preferente, el procedimiento además comprende la etapa de detectar en una segunda muestra obtenida de dicho sujeto un anticuerpo de clase IgA frente a NS1 de dicho Flavivirus, opcionalmente además comprende detectar en dicha segunda muestra un anticuerpo de clase IgM y/o IgG, preferentemente de clase IgM frente a NS1 de un Flavivirus tal como la SEC. ID Núm.: 1, opcionalmente además comprende detectar en dicha primera muestra un anticuerpo de clase IgM y/o IgG, preferentemente de clase IgM frente a NS1 de un Flavivirus, más preferentemente la SEC. ID Núm.: 1.
Una titulación dinámica de anticuerpos de clase IgA o IgM, preferentemente IgA, frente a NS1 de un Flavivirus, preferentemente frente a la SEC. ID Núm.: 1, que aumenta y disminuye significativamente en relación con el fondo antes de la aparición de anticuerpos de clase IgG (es decir, seroconversión), puede indicar una infección aguda por Zika, que es una infección primaria por Flavivirus. Por el contrario, un aumento paralelo de IgA e IgG (aunque esta última en niveles más altos) puede indicar una infección aguda por Zika, que es una infección secundaria por Flavivirus. En una realización preferente, la primera muestra se obtiene al menos 3, 4, 5, 6 días, 1, 23 o 4 semanas después de la exposición o sospecha de exposición del sujeto a un Flavivirus. En una realización preferente, la primera muestra se toma en las dos semanas siguientes a la aparición de los síntomas. Se puede determinar la presencia o ausencia de anticuerpos, así como sus niveles relativos a lo largo del tiempo. La segunda muestra se puede obtener al menos 3, 4, 5, 6 días, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20, 24, 28 o 32 semanas más tarde que la primera muestra, preferentemente al menos 3 días, más preferentemente al menos 7 días. Se puede tomar un número total de al menos 2, 3, 4, 5 o seis muestras, preferentemente al menos 2 muestras, opcionalmente cada muestra al menos 1 día, 3 días, una semana, preferentemente una semana después de la muestra anterior. Además, se pueden determinar las concentraciones totales de IgG, IgM y/o IgA, preferentemente IgM, por ejemplo para descartar insuficiencias. De este modo, las titulaciones de los respectivos anticuerpos se pueden controlar a lo largo del tiempo.
En una realización preferente, la titulación de IgM, IgG y/o IgA, preferentemente IgA e IgG, más preferentemente IgA frente a NS1, preferentemente frente a la SEC. ID Núm.: 1, se monitoriza por medio de la detección de la presencia o ausencia o, preferentemente el nivel relativo a lo largo del tiempo durante un período de al menos 3, 4, 5, 6, 10, 14, 21, 28, 35 o 42 días, preferentemente al menos 6 días, tomándose la primera muestra al menos cinco días, preferentemente al menos 7 días tras el inicio de los síntomas. La seroconversión se puede detectar por medio de la monitorización de la presencia o ausencia o el nivel relativo a lo largo del tiempo de anticuerpos de clase IgG frente a NS1, preferentemente la SEC. ID Núm.: 1. Esto puede ayudar a identificar la ventana temporal en la que cabría esperar el aumento y la disminución de anticuerpos de clase IgM y/o IgA o a concluir que esta ventana temporal ha pasado.
El procedimiento, el kit y los portadores se pueden usar para distinguir entre una infección por Flavivirus primaria y una secundaria. En una realización preferente, el término “infección primaria”, como se usa en la presente memoria, se refiere a una infección de una persona que nunca ha tenido una infección con dicho Flavivirus u otro Flavivirus, preferentemente dicho Flavivirus, más preferentemente el virus del Zika, en contraste con una infección secundaria en un paciente que ha estado expuesto a un virus o composiciones inmunogénicas derivadas del mismo anteriormente. En una realización preferente, esto puede implicar distinguir una infección primaria por el virus del Zika de una infección secundaria por otro Flavivirus, preferentemente seleccionado del grupo que comprende el virus del dengue, el virus de la fiebre amarilla, el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, el virus Usutu, el virus del Nilo Occidental y el virus de la encefalitis japonesa, preferentemente el virus del dengue.
La presente invención se ilustra además por medio de los siguientes ejemplos, secuencias y figuras de los que se pueden extraer otras características, realizaciones, aspectos y ventajas de la presente invención. Todos los procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria se pueden usar en la práctica o en las pruebas de la presente invención, en la presente memoria se describen los procedimientos y materiales adecuados. En la presente memoria se mencionan diversas publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias, así como las solicitudes prioritarias EP16000422.2, EP16000442.0, EP16000454.5 y EP16000454.5. Además, los materiales, procedimientos y ejemplos son meramente ilustrativos y no pretenden ser limitativos, a menos que se especifique lo contrario.
LaFig. 1muestra SDS-PAGE y tinción de Coomassie de 1 |jg de sNS1 y mNS1 recombinante purificada, esta última pura y en complejo con Apolipoproteína A1 bovina. Para cada carril, se separó 1 jg de proteína en un gel NuPage Bis-Tris desnaturalizante al 4 a 12%, documentando una elevada pureza proteica. Los marcadores de peso molecular se indican a la izquierda.
LaFig. 2muestra el análisis de las características operativas del receptor (ROC) del ELISA para la detección de IgM e IgG anti-ZIKV. El panel A muestra el rendimiento diagnóstico de las infecciones por ZIKV (n=29) frente a las infecciones o vacunaciones con otros flavivirus (DENV, n=38; YFV, n=12; WNV, n=34; JEV, n=25). El panel B muestra el rendimiento diagnóstico de las infecciones por ZIKV (n=29) frente a controles sanos (mujeres embarazadas, n=100; donantes de sangre argentinos, n=99; donantes de sangre estadounidenses, n=100; donantes de sangre alemanes; n=500). AUC, área bajo la curva.
LaFig. 3muestra la reactividad anti-ZIKV en diferentes cohortes determinada por ELISA. Se analizaron sueros de pacientes infectados por ZIKV, DENV, WNV, JEV o CHIKV o vacunados contra YFV, así como muestras de mujeres embarazadas (PREG), donantes de sangre argentinos (BD1), donantes de sangre estadounidenses (BD2) y donantes de sangre alemanes (BD3) para detectar IgM anti-ZIKV (panel A) e IgG anti-ZIKV (panel B) por medio de ELISA basado en el antígeno NS1. Los puntos de datos trazados representan relaciones (extinción de la muestra del paciente / extinción del calibrador). Los valores de corte para resultados limítrofes (>0,8) y positivos (£1,1) se indican por medio de líneas horizontales discontinuas. Los casos positivos y totales se indican entre paréntesis. Los triángulos indican los pacientes con infección por ZIKV confirmada que tenían una proporción de IgM o IgG anti-ZIKV por debajo del punto de corte (<1,1), pero un resultado positivo correspondiente en las pruebas de IgG o IgM, respectivamente. El panel C muestra una comparación entre la detección de IgM e IgG anti-ZIKV en la cohorte de pacientes infectados por el ZIKV. El panel D muestra la evolución temporal de los niveles de anticuerpos IgM e IgG contra el ZIKV en el suero de un paciente representativo infectado por el ZIKV.
LaFig. 4muestra los resultados de la filtración en gel con el objetivo de aislar los oligómeros de Zika NS1, como se llevó a cabo en el Ejemplo 2.
LaFig. 5muestra la generación de monómeros y dímeros de Zika NS1 (resistentes al SDS) en diversas condiciones.
LaFig. 6muestra la reacción de los sueros de dos pacientes con mNS1 y sNS1 monomérico y dimérico. Se ha demostrado que el NS1 dimérico es más sensible.
LaFig. 7muestra los resultados de los estudios de estabilidad, más concretamente la exposición a duras condiciones de intercambio tampón. Un complejo formado por sNS1 y apolipoproteína bovina AI es más estable que la NS1 que no forma parte de dicho complejo. La mNS1 y la sNS1 solas se pueden granular parcialmente tras la incubación en hielo o a temperatura ambiente, lo que indica que de 30 a 50% de la cantidad total de proteína forma agregados.
LaFig. 8muestra los resultados de un ELISA para comparar la reactividad de varias preparaciones de NS1. Se pudo demostrar una mayor reactividad de mNS1 y sNS1+ApoAI en comparación con sNS1.
LaFig. 9.Reactividad anti-ZIKV en pacientes con infección por ZIKV confirmada por medio de RT-PCR (n = 27) y sospechada (n = 85), determinada por medio de ELISA para (A) IgM e (B) IgGa; análisis de la evolución temporal de los niveles de anticuerpos anti-ZIKV en muestras de seguimiento de (C) un paciente alemán que regresó de Colombia (probable infección primaria por ZIKV)b y (D) un paciente colombiano con infección por ZIKV confirmada por medio de RT-PCR (probable infección secundaria por flavivirus)c
RT-PCR: transcripción inversa-PCR; US: Estados Unidos; OMS: Organización Mundial de la Salud; ZIKV: Virus del Zika.
a Por paciente, se examinó una muestra para anticuerpos IgM e IgG anti-ZIKV. Los puntos de datos trazados representan valores de relación (extinciónmuestra/extincióncalibrador). Los valores de corte para resultados limítrofes (> 0,8 a < 1,1) y positivos (> 1,1) se indican por medio de líneas horizontales discontinuas. Los casos positivos y totales se indican entre paréntesis. Los triángulos indican muestras con una proporción de IgM o IgG anti-ZIKV inferior al punto de corte (< 1,1), pero con un resultado positivo correspondiente en las pruebas de IgG o IgM, respectivamente.
b Las muestras fueron proporcionadas por el Centro Colaborador de la OMS para la Referencia e Investigación de Arbovirus y Fiebre Hemorrágica, Hamburgo, Alemania. Relación de corte: > 1,1.
c Las muestras fueron facilitadas por Biomex US LLC, Coconut Creek, Florida, EE.UU. Relación de corte: > 1,1. LaFig. 10.Reactividad anti-ZIKV en muestras potencialmente reactivas cruzadas (n = 252) y controles sanos (n = 1.015) determinada por ELISA para (A) IgM y (B) IgGde, estudio de evaluación de un nuevo ELISA basado en NS1, Alemania 2016
ARG: Argentina; CHIKV: virus chikungunya; CHIL: niños; DENV: virus del dengue; GER: Alemania; JEV: Virus de la encefalitis japonesa; NS: proteína no estructural; PLAS:Plasmodium;PREG: mujeres embarazadas; US: Estados Unidos;<w>NV: Virus del Nilo Occidental; YFV: Virus de la fiebre amarilla; ZIKV: Virus del Zika; ZIM: Zimbabue. d Los puntos de datos trazados representan valores de relación (extinciónmuestra/extincióncalibrador); un punto de datos por paciente. Los valores de corte para resultados limítrofes (> 0,8 a < 1,1) y positivos (> 1,1) se indican por medio de líneas horizontales discontinuas. Los casos positivos y totales se indican entre paréntesis.
e Para obtener niveles elevados de anticuerpos IgM e IgG anti-DENV potencialmente reactivos cruzados, los pacientes infectados por DENV se dividieron en dos grupos: DENVa, relación mediana alta (3,9) anti-DENV IgM, relación anti-DENV IgM > 3,0 en el 79% de los casos (recuadro Panel A); DENVb, relación mediana alta (3,9) anti-DENV IgG, relación anti-DENV IgG > 3,0 en el 80% de los casos (recuadro Panel B). Coeficiente de corte (ELISA anti-DENV, EUROIMMUN): > 1,1.
LasFigs. 11Ay11Bmuestran mediciones de anticuerpos IgG, IgA e IgM contra el antígeno ZIKV-NS1 en las muestras secuenciales de los dos pacientes colombianos.
LaFig. 12muestra los resultados del ELISA de captura de IgM del Zika y del ELISA anti virus del Zika basado en NS1 IgM e IgG.
SEC. ID Núm. 1 Antígeno NS1 del virus del Zika
SEC. ID Núm. 2 antígeno NS1 del virus del dengue 1
SEC. ID Núm. 3 antígeno NS1 del virus del dengue 2
SEC. ID Núm. 4 antígeno NS1 del virus del dengue 3
SEC. ID Núm. 5 antígeno NS1 del virus del dengue 4
SEC. ID Núm. 6 Antígeno NS1 del virus del Nilo Occidental
SEC. ID Núm. 7 Antígeno NS1 del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas
SEC. ID Núm. 8 Antígeno NS1 del virus de la encefalitis japonesa
SEC. ID Núm. 9 Antígeno NS1 del virus de la fiebre amarilla
SEC. ID Núm. 10 Antígeno NS1 del virus del Zika con etiqueta His C-terminal
SEC. ID Núm. 11 Glicoproteína de la envoltura del virus del Zika
SEC. ID Núm. 12 Glicoproteína de la envoltura del virus del dengue 1
SEC. ID Núm. 13 Glicoproteína de la envoltura del virus del dengue 2
SEC. ID Núm. 14 Glicoproteína de la envoltura del virus del dengue 3
SEC. ID Núm. 15 Glicoproteína de la envoltura del virus del dengue 4
SEC. ID Núm. 16 Glicoproteína de la envoltura del virus del Nilo Occidental
SEC. ID Núm. 17 Glicoproteína de la envoltura del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas
SEC. ID Núm. 18 Glicoproteína de la envoltura del virus de la encefalitis japonesa
SEC. ID Núm. 19 Antígeno NS1 del virus Powassan
SEC. ID Núm. 20 Antígeno NS1 del virus del Zika con etiqueta His C-terminal y péptido fusionado adicional SEC. ID Núm. 21 Epítopo NS1 del virus del Zika
SEC. ID Núm. 22 Epítopo NS1 del virus del Zika
SEC. ID Núm. 23 Epítopo NS1 del virus del Zika
SEC. ID Núm. 24 Epítopo NS1 del virus del Zika
SEC. ID Núm. 25 Epítopo NS1 del virus del Zika
SEC. ID Núm. 26 Epítopo NS1 del virus del Zika
SEC. ID Núm. 27 Glicoproteína de la envoltura del virus de la fiebre amarilla
Ejemplo 1: Estudio del rendimiento diagnóstico de la prueba ELISA basada en NS1 del Zika Procedimientos
Muestras de suero humano
En este estudio se examinaron muestras de suero de pacientes con infección por ZIKV (n=29) y de pacientes con otras infecciones flavivirales o no flavivirales, así como de vacunados contra la fiebre amarilla (n=128). Los sueros de mujeres embarazadas sanas (n=100) y de donantes de sangre residentes en áreas endémicas y no endémicas de flavivirus (n=699) sirvieron como controles negativos. Las muestras de seguimiento de un paciente alemán con infección por ZIKV confirmada clínica y serológicamente, contraída durante una estancia en Colombia, fueron analizadas por el Centro Colaborador de la OMS para la Referencia e Investigación de Arbovirus y Fiebre Hemorrágica (Hamburgo, Alemania) y usadas para el análisis del curso temporal de los niveles de anticuerpos anti-ZIKV. Todos los sueros se almacenaron a -20 °C hasta su análisis. Las muestras se usaron de forma anónima para mantener la confidencialidad y el protocolo del estudio se ajustó a las recomendaciones del Comité Ético Central de Alemania.
Expresión y purificación de proteínas
LaNS1[ZIKV] recombinante se expresó en células HEK293T mediante el uso de procedimientos estándar de clonación y expresión basados en el plásmido pTriEx-1 con una secuencia señal artificial y una etiqueta His C-terminal (SEC. ID Núm.: 20). Las células transfectadas se cultivaron a 37 °C y 8,5% de CO2 en medio de Eagle modificado de Dulbecco con 10% de suero fetal de ternera, 100 U/ml de penicilina y 0,1 mg/ml de estreptomicina durante tres a cinco días. Las células fueron recolectadas, se resuspendieron en 20 mM Tris-HCI pH 7,4, 10% (p/v) de sacarosa, 5 mM de EDTA, 1 mM de PMSF y se almacenaron a -80 °C hasta su uso posterior.
Las células se resuspendieron en 20 mmol/l de cloruro de tris, pH 8,0, 600 mmol/l de cloruro de sodio, 20 mmol/l de cloruro de magnesio, 20 mmol/l de imidazol, 1 mmol/l de PMSF, 0,5 mmol/l de ditiotreitol, 0,1% de Triton X-100 y se lisaron por homogeneización. Los restos celulares se eliminaron por centrifugación durante 60 minutos a 100.000xg, 4 °C. La fracción de proteína soluble se aplicó a un Rapid Run de níquel (Agarose Bead Technologies, Miami, FL, EE.UU.) equilibrado con 5 mmol/l de cloruro de tris pH 8,0, 150 mmol/l de cloruro de sodio, 0,015 % (p/v) de Triton X-100, 0,5 mmol/l de ditiotreitol, 20 mmol/l de imidazol y se eluyó por medio del aumento de la concentración de imidazol a 150 mmol/l. Los eluidos se mezclaron, se diluyeron con dos volúmenes de 20 mmol/l de cloruro de tris, pH 8,5, 5 mmol/l de EDTA, 1 mmol/l de PMSF, 0,015 % (p/v) de Triton X-100, 1 mmol/l de ditiotreitol y se aclararon por centrifugación a 100.000xg y 4 °C durante 60 minutos. El sobrenadante se cargó en una columna HiTrap Q FF (GE Lifesciences, Friburgo, Alemania) equilibrada con cloruro de tris 20 mmol/l pH 8,5, 2,5 mmol/l EDTA, 1 mmol/l PMSF, 0015 % (p/v) de Tritón X-100, 1 mmol/l de ditiotreitol, 50 mmol/l de cloruro de sodio, lavada y eluida con 20 mmol/l de cloruro de tris, pH 8,5, 2,5 mmol/l de EDTA, 1 mmol/l de PMSF, 0,015 % (p/v) de Tritón X-100, 1 mmol/l de ditiotreitol, con un aumento gradual de cloruro de sodio de 50 a 1000 mmol/l. Todas las fracciones que contenían SEQ ZIKV NO3 se agruparon y concentraron por ultrafiltración (VivaSpin, Sartorius, Gottingen, Alemania). La preparación final se almacenó a -80 °C hasta su uso posterior.
Ensayo inmunoenzimático
Se usaron microplacas revestidas de NS1 (Nunc, Roskilde, Dinamarca) y reactivos estandarizados del ELISA Anti Virus del Zika IgG e IgM disponible comercialmente (EUROIMMUN, Lübeck, Alemania) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. En resumen, los sueros diluidos 1:101 en PBS más caseína al 0,1% (p/v) se añadieron a los pocillos y se dejaron reaccionar durante 60 minutos a 37 °C. En caso de detección de IgM, los sueros se preincubaron con absorbente de factor reumatoide durante 10 minutos. Los anticuerpos unidos se detectaron por medio de la aplicación de conjugado de peroxidasa IgG antihumana de conejo o conjugado de peroxidasa IgM antihumana de cabra durante 30 min, seguido por tinción con tetrametilbencidina durante 15 min. La reacción enzimática se detuvo por medio de la adición de un volumen de ácido sulfúrico 0,5 mol/l. La densidad óptica se determinó fotométricamente a 450 nm (referencia 620 nm). A menos que se indique lo contrario, todos los procedimientos de ensayo se llevaron a cabo a temperatura ambiente.
El punto de corte para la positividad se validó y optimizó por medio de las características operativas del receptor (ROC). Se diluyó un suero de paciente índice altamente positivo para generar un calibrador de corte que se incubó en cada experimento. Se calculó la relación entre el valor de extinción de la muestra del paciente y el valor de extinción del calibrador.
Estadísticas
Los análisis estadísticos se llevaron a cabo con GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EE.UU.) y el software de análisis SigmaPlot 13.0 (SSI, San Jose, CA, EE.UU.). Los intervalos de confianza (IC 95%) se calcularon de acuerdo con el procedimiento de Wald modificado.
Resultados
Expresión eucariótica y purificación de NS1 específica de ZIKV
La NS1 específica del ZIKV se expresó en la línea celular humana HEK293T y se purificó a partir del lisado celular (mNS1) o del sobrenadante de cultivo (sNS1). Cuando se separaron por SDS-PAGE, mNS1 y sNS1 migraron esencialmente de acuerdo con su masa molecular predicha (43,9 kDa;Fig. 1).
Desarrollo de una prueba ELISA anti-ZIKV basada en NS1
Se usaron mNS1 y sNS1 recombinantes purificados como antígenos en fase sólida en ELISA para la detección de IgM e IgG anti-ZIKV, respectivamente. Se llevaron a cabo análisis ROC a partir de 29 sueros de pacientes con infección por ZIKV y 908 controles, incluidos 109 pacientes con infecciones por flavivirus o vacunados, 100 mujeres embarazadas y 699 donantes de sangre. Las áreas bajo la curva (IgM, > 0,979; IgG, >0,956) indicaron un excelente rendimiento diagnóstico(Fig. 2). La relación de corte [ODmuestra del paciente / ODcalibrador] para la positividad del ensayo se fijó en >1,1 para cualquiera de las clases de Ig. Este umbral supera el nivel de corte con la máxima suma de sensibilidad y especificidad para garantizar una elevada especificidad del ensayo. Los cocientes en el intervalo de >0,8 a <1,1 se clasificaron como limítrofes.
Rendimiento diagnóstico de la prueba ELISA anti-ZIKV
Sensibilidad: De 29 muestras de suero de pacientes con infección por ZIKV confirmada clínica y serológicamente, 24 (82,8%) fueron positivas para IgM anti-ZIKV, 20 (69,0%) para IgG y 28 (96,6%) para IgM y/o IgG(Fig. 3A y 3B). 16 sueros mostraron reactividad positiva tanto para IgM como para IgG, mientras que 12 sueros fueron positivos para IgM o IgG. En consecuencia, la mayor sensibilidad diagnóstica se consigue por medio de pruebas paralelas de ambas clases de Ig(Fig. 3C). Este enfoque también permite categorizar a los pacientes por estado de la enfermedad (infección aguda o pasada). Por ejemplo, el análisis de muestras de seguimiento de un paciente que presentó síntomas clínicos tras regresar de una estancia en Colombia reveló una disminución de los niveles de IgM anti-ZIKV y un aumento significativo de los niveles de IgG durante un período de 16 semanas, lo que confirma la infección aguda(Fig.3D).
Especificidad: Entre 799 controles sanos, sólo 1/99 (1,0 %) donantes de sangre argentinos y 1/500 (0,2 %) alemanes resultaron positivos a la IgM anti-ZIKV, mientras que 100 donantes de sangre estadounidenses sanos y 100 mujeres embarazadas sanas resultaron negativos. La IgG anti-ZIKV estaba presente en 1/100 (1,0%) donantes de sangre estadounidenses y 1/500 (0,2%) alemanes, pero ausente en las cohortes de donantes de sangre argentinos sanos y mujeres embarazadas. De este modo, la especificidad global ascendió al 99,7% para cualquiera de las dos clases de Ig(Fig. 3A y 3B).
Reactividad cruzada: Se analizaron paneles de suero de 128 pacientes o vacunados clínica y serológicamente bien caracterizados con titulaciones elevados de anticuerpos de clase IgM y/o IgG contra flavivirus (DENV, YFV, WNV o JEV) y CHIKV. Se detectó reactividad IgM anti-ZIKV en 1/34 (2,9%) pacientes infectados por WnV e IgG anti-ZIKV en 1/25 (4,0%) pacientes infectados por VJE(Fig. 3A y 3B). En ambos casos, no se puede excluir una doble infección, por lo que sigue sin estar claro si la positividad del ELISA se debió a reacciones cruzadas con anticuerpos contra otros flavivirus (falso positivo) o a una coinfección con el ZIKV (verdadero positivo). Considerando una tasa de positividad global de 1/128 (0,8%) para cualquiera de las clases de Ig, la reactividad cruzada se puede excluir casi por completo cuando se usa el ELISA basado en NS1.
Ejemplo 2: Preparación del antígeno Zika NS1
La NS1[ZIKV] recombinante se expresó en células HEK293T mediante el uso de procedimientos estándar de clonación y expresión basados en el plásmido pTriEx-1 con una secuencia señal artificial y una etiqueta His C-terminal (SEC. ID Núm.: 20). Las células transfectadas se cultivaron a 37 °C y 8,5% de CO2 en medio de águila modificado de Dulbecco con 10% de suero fetal de ternera, 100 U/ml de penicilina y 0,1 mg/ml de estreptomicina durante tres a cinco días. El sobrenadante del cultivo celular se decantó y se almacenó hasta su uso posterior. Las células fueron recolectadas, se resuspendieron en 20 mM Tris-HCI pH 7,4, 10% (p/v) de sacarosa, 5 mM de EDTA, 1 mM de PMSF y se almacenaron a -80 °C hasta su uso posterior.
Para preparar mNS1, las células se resuspendieron en 20 mmol/l de cloruro de tris, pH 8,0, 600 mmol/l de cloruro de sodio, 20 mmol/l de cloruro de magnesio, 20 mmol/l de imidazol, 1 mmol/l de PMSF, 0,5 mmol/l de ditiotreitol, 0,1% de Triton X-100 y se lisaron por homogeneización. Los restos celulares se eliminaron por centrifugación durante 60 minutos a 100.000xg, 4 °C. La fracción de proteína soluble se aplicó a un Rapid Run de níquel (Agarose Bead Technologies, Miami, FL, EE.UU.) equilibrado con 5 mmol/l de cloruro de tris pH 8,0, 150 mmol/l de cloruro de sodio, 0,015% (p/v) de Triton X-100, 0,5 mmol/l de ditiotreitol, 20 mmol/l de imidazol y se eluyó por medio del aumento de la concentración de imidazol a 150 mmol/l. Los eluidos se mezclaron, se diluyeron con dos volúmenes de 20 mmol/l de cloruro de tris, pH 8,5, 5 mmol/l de EDTA, 1 mmol/l de PMSF, 0,015% (p/v) de Triton X-100, 1 mmol/l de ditiotreitol y se aclararon por centrifugación a 100.000xg y 4 °C durante 60 minutos. El sobrenadante se cargó en una columna HiTrap Q FF (GE Lifesciences, Friburgo, Alemania) equilibrada con cloruro de tris 20 mmol/l pH 8,5, 2,5 mmol/l EDTA, 1 mmol/l PMSF, 0015 % (p/v) de Tritón X-100, 1 mmol/l de ditiotreitol, 50 mmol/l de cloruro de sodio, lavada y eluida con 20 mmol/l de cloruro de tris, pH 8,5, 2,5 mmol/l de EDTA, 1 mmol/l de PMSF, 0,015% (p/v) de Tritón X-100, 1 mmol/l de ditiotreitol, con un aumento gradual de cloruro de sodio de 50 a 1000 mmol/l. Todas las fracciones que contenían SEQ ZIKV NO3 se agruparon y concentraron por ultrafiltración (VivaSpin, Sartorius, Gottingen, Alemania). La preparación final se almacenó a -80 °C hasta su uso posterior.
Para preparar la sNS1, el sobrenadante del cultivo celular se ajustó a 5 mmol/I de cloruro de tris, pH 8,0, 164 mmol/I de cloruro de sodio, 50 mmol/I de cloruro de magnesio, 20 mmol/I de imidazol, 0,1% de Tritón X-100, se aclaró por centrifugación durante 30 minutos a 17.600xg, 4 °C, se aplicó a Nickel Rapid Run (Agarose Bead Technologies, Miami, FL, USA) equilibrado con 5 mmol/I de cloruro de tris, pH 8.0, 300 mmol/I de cloruro de sodio, 20 mmol/I de imidazol y se eluyó por medio del aumento de la concentración de imidazol a 150 mmol/I. Todas las fracciones que contenían SEQ ZIKV NO3 se agruparon y concentraron por ultrafiltración (VivaSpin, Sartorius, Gottingen, Alemania). La preparación final se almacenó a -80 °C hasta su uso posterior.
Para preparar la sNS1, en complejo con la apolipoproteína AI bovina, el sobrenadante del cultivo celular se ajustó a 5 mmol/I de cloruro de tris, pH 8,0, 164 mmol/I de cloruro de sodio, 50 mmol/I de cloruro de magnesio, 20 mmol/I de imidazol, se aclaró por centrifugación durante 30 minutos a 17.600xg, 4 °C, se aplicó a Nickel Rapid Run (Agarose Bead Technologies, Miami, FL, USA) equilibrado con 5 mmol/I de cloruro de tris, pH 8.0, 300 mmol/I de cloruro de sodio, 20 mmol/I de imidazol y se eluyó por medio del aumento de la concentración de imidazol a 150 mmol/I. Todas las fracciones que contenían Complejos NS1[ZIKV]/Apo AI[Bos taurus] se agruparon y concentraron por ultrafiltración (VivaSpin, Sartorius, Gottingen, Alemania). La preparación final se almacenó a -80 °C hasta su uso posterior.
Cuando se separó por SDS-PAGE, la NS1 migró esencialmente de acuerdo con su masa molecular prevista (43,9 kDa). La identidad de las proteínas se verificó por espectrometría de masas.
Ejemplo 3: Preparación de oligómeros de NS1
Las preparaciones de proteínas de mNS1 y sNS1 preparadas como en el Ejemplo 2 se analizaron por filtración analítica en gel mediante el uso de una columna Superdex 200 pg (GE Healthcare, Munich, Alemania) en 20 mmol/l de cloruro de tris pH 8.5, 2,5 mmol/l EDTA, 1 mmol/l PMSF, 0,015% (p/v) Triton X-100, 1 mmol/l ditiotreitol, 300 mmol/l cloruro de sodio o 5 mmol/l cloruro tris pH 8,0, 300 mmol/l cloruro de sodio, 150 mmol/l imidazol. Las mezclas de proteínas con pesos moleculares conocidos se analizaron por separado y se usaron como calibrador. Los tiempos de retención de los picos individuales se usaron para calcular el peso molecular de las poblaciones NS1 observadas y las fracciones eluidas se analizaron por medio de electroforesis en gel desnaturalizante/no desnaturalizante en condiciones reductoras, seguida por tinción de plata.
LaFig. 4muestra los resultados de una filtración en gel representativa. Los tiempos de retención de los picos principales de mNS1 y sNS1 revelan un peso molecular de 212 kDa (mNS1) y 227 kDa (sNS1) que concuerda bien con las poblaciones hexaméricas (MW[NS1monomérica] = 43,9 kDa). mNS1 muestra un pico adicional a 44 kDa, que muy probablemente se asemeja a su forma monomérica. Esta interpretación se basa en la movilidad electroforética de la fracción: tanto la alícuota desnaturalizada por calor como la no desnaturalizada migran a la misma posición por debajo de 50 kDa, mientras que la NS1 dimérica migraría a 70 kDa en la alícuota no desnaturalizada por calor si estuviera presente en esta población.
La preparación proteica final de la sNS1 se trató con o sin 16 mmol/I de ditiotreitol y se incubó a 70 °C o a temperatura ambiente durante 10 minutos, seguido por electroforesis en gel SDS y tinción de Coomassie. LaFig. 5muestra la generación de monómeros y dímeros (resistentes al SDS) en diversas condiciones.
Las poblaciones diméricas mNS1 o sNS1 también se podrían generar por medio del tratamiento con detergentes de la población hexamérica, por ejemplo, 0,1% Triton X-100 o 0,2% dodecilsulfato de sodio. La filtración analítica en gel mostró claramente que mNS1 y sNS1 existen principalmente como hexámerosin vitrocon una masa molecular ligeramente superior a 200 kDa, sin embargo, sólo el dímero resistente al SDS, que migra con una masa molecular aparente de 70 kDa, se pudo visualizar en un gel que contenía SDS. El dímero se convirtió en monómero (M<w>[NS1 monomérica] = 43,9 kDa) por desnaturalización térmica. Este proceso es independiente de los enlaces disulfuro.
Ejemplo 4: Los monómeros y dímeros de NS1 se pueden usar para detectar anticuerpos en el suero del paciente por medio de Western blotting
Las preparaciones proteicas de mNS1 y sNS1 preparadas como en el Ejemplo 2 se trataron con o sin 16 mmol/l de ditiotreitol y se incubaron durante 10 min a 70 °C o a temperatura ambiente para conseguir NS1 monomérica u oligomérica. Ambas poblaciones se mezclaron y separaron por medio de electroforesis SDS seguida por transferencia a una membrana de nitrocelulosa. Las proteínas se tiñeron de forma inespecífica por medio de tinción de Ponceau S para demostrar la NS1 en forma monomérica y dimérica o se incubaron con anticuerpo anti-His como control positivo, tampón desprovisto de suero como control negativo y cuatro sueros humanos (dilución 1:51), dos de ellos procedentes de donantes de sangre sanos y dos de pacientes que sufrían infección por el virus del Zika.
LaFig. 6muestra que los sueros de ambos pacientes reaccionan con mNS1 y sNS1 monoméricos y diméricos, pero el NS1 dimérico es más sensible. La reducción de la NS1 monomérica con ditiotreitol conduce a la desnaturalización y reduce aún más la sensibilidad. Como se demostró en un experimento posterior, la sensibilidad analítica de los monómeros reducidos de NS1 es al menos 10 veces menor que la de los monómeros no reducidos en un Western blot.
Ejemplo 5: La estabilidad del antígeno NS1 aumenta en presencia de apolipoproteína bovina AI
El siguiente experimento muestra que un complejo de un polipéptido que comprende la SEC. ID Núm.: 1 y apolipoproteína de mamífero es más estable en una solución que el polipéptido por sí mismo. Por lo tanto, se puede usar una apolipoproteína de mamífero para estabilizar el polipéptido y los dispositivos y kits que lo comprenden. Las preparaciones proteínicas de mNS1, sNS1 y un complejo formado por sNS1 y apolipoproteína bovina AI, este último llevado a cabo por medio de la preparación de la proteína como en el Ejemplo 1 seguido por la adición de fracciones cromatográficas que comprenden la apolipoproteína, se transfirieron a 50 mmol/l de fosfato de sodio pH 7,4, 150 mmol/l de cloruro de sodio mediante el uso de columnas de centrifugación desalinizadoras (Zeba Spin, ThermoFisher Scientific, Waltham, EE.UU.). Una alícuota de cada preparación se mantuvo en hielo o a temperatura ambiente durante la noche para permitir la precipitación de las proteínas no solubles en PBS. Las alícuotas se centrifugaron durante 30 min a 4 °C y 100.000xg, y los sobrenadantes y pellets (resuspendidos en un volumen equivalente de 50 mmol/l de fosfato de sodio pH 7,4, 150 mmol/l de cloruro de sodio, 8 mol/l de urea) se analizaron por medio de electroforesis en gel desnaturalizante en condiciones reductoras, seguida por tinción de Coomassie. Se eligieron condiciones duras de intercambio tampón para provocar la agregación de proteínas potencialmente inestables.
LaFig. 7muestra que la mNS1 y la sNS1 solas pueden ser parcialmente peletizadas después de la incubación en hielo o a temperatura ambiente, lo que indica que el 30 a 50% de la cantidad total de proteína forma agregados. Por otra parte, la totalidad de la sNS1 en complejo con la apolipoproteína bovina AI permanece en el sobrenadante tras la centrifugación, lo que indica un efecto estabilizador de la sNS1.
Ejemplo 6: Comparación de la reactividad de varios preparados de NS1
El siguiente experimento se llevó a cabo para evaluar la reactividad de diferentes preparaciones del antígeno NS1 del virus del Zika en un ELISA indirecto para la detección de anticuerpos anti-virus del Zika en suero humano. Demuestra que la complejación con una apolipoproteína de mamífero aumenta la reactividad de la NS1 y, por lo tanto, la sensibilidad del ensayo.
Preparación de placas de microtitulación revestidas
Se usaron tres preparaciones diferentes de NS1 del Zika: sNS1 (NS1 soluble purificada a partir de sobrenadante de cultivo celular), mNS1 (NS1 membranosa purificada a partir de células), sNS1+ApoAI (NS1 soluble purificada a partir de sobrenadante de cultivo celular, en complejo con ApoAI bovina).
Para su uso en ELISA de microtitulación, estas tres preparaciones de NS1 se diluyeron en PBS hasta concentraciones finales de 0,5, 1,0 y 2,0 pg/ml, respectivamente. Las placas de microtitulación se revistieron con 100 pl de dilución de antígeno por pocillo.
Incubación de las muestras:
Se usó un conjunto de sueros humanos IgM anti-Zika-NS1 positivos o negativos para evaluar la reactividad de las diferentes preparaciones de antígenos. Todos los reactivos usados durante la incubación se incluyen en cada kit de prueba<e>U<r>OIMMUN IgM ELISA para diagnóstico infeccioso (por ejemplo, EI 2668-9601 M). Los sueros se diluyeron 1:101 en tampón de muestra IgM que contenía absorbente IgG/RF y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 min para absorber los factores reumatoides y la IgG. Las muestras se aplicaron a placas de microtitulación y se incubaron de acuerdo con lo descrito para la prueba comercial EUROIMMUN ELISA anti-virus del Zika (IgM) (EI 2668-9601 M). En resumen: 60 min a 37 °C; 3 etapas de lavado mediante el uso de tampón de lavado EUROIMMUN; adición de 100 pl de conjugado anti-IgG humana (cabra) por pocillo; incubación durante 30 min a 37 °C; 3 etapas de lavado mediante el uso de tampón de lavado EUROIMMUN; adición de 100 |jl de solución de cromógeno/sustrato (TMB/H2O2) por pocillo; incubación durante 30 min a temperatura ambiente; adición de 100 j l de solución de parada (ácido sulfúrico 0,5 M); medición de la densidad óptica a 450 nm.
Interpretación de los resultados:
LaFig. 8muestra los resultados, más concretamente una mayor reactividad de mNS1 y sNS1+ApoAI en comparación con sNS1. mNS1 y sNS1+ApoAI muestran una reactividad comparable en relación con los sueros positivos. Con respecto a los sueros negativos, sNS1+ApoAI muestra una menor reactividad en comparación con mNS1 (incluso en las concentraciones de revestimiento más altas aplicadas), lo que sugiere una mayor especificidad del antígeno complejado. También se pudo demostrar que NS1 forma un complejo con la apolipoproteína bovina B-100 isoforma X1, que también se puede usar para estabilizar el antígeno.
Ejemplo 7: Un estudio de múltiples cohortes sobre el rendimiento del ensayo ELISA basado en NS1 muestra la ausencia de reactividad cruzada con los anticuerpos del virus del dengue
La eficacia diagnóstica del ensayo en la presente memoria descrito se examinó mediante el uso de sueros de viajeros que regresaban y de pacientes procedentes de áreas endémicas de ZIKV con infección por ZIKV confirmada por laboratorio, muestras potencialmente reactivas cruzadas de pacientes con infecciones flavivirales y de otro tipo, así como paneles de control de donantes de sangre de diferentes edades y origen geográfico.
Procedimientos
Sueros humanos
El estudio incluyó muestras de suero de 27 pacientes que habían dado positivo para el ARN del ZIKV por medio de PCR de transcripción inversa (RT-PCR); Grupo 1: viajeros que regresaban de áreas endémicas (n = 8); Grupo 2: residentes en áreas endémicas para el ZIKV (n = 19). Sobre la base de la detección directa del genoma del patógeno, estos casos se denominaron con infección por ZIKV confirmada por RT-PCR. Las muestras de otros 85 pacientes habían sido precaracterizadas por medio del ensayo de inmunofluorescencia indirecta anti-ZIKV (IIFA; EUROIMMUN, Lübeck, Alemania) basado en el antígeno del virus completo, mostrando reactividad para IgM y/o IgG anti-ZIKV; Grupo 3: viajeros que regresaban de áreas endémicas (n = 26); Grupo 4: residentes en áreas endémicas de ZIKV (n = 59). Dado que no se pueden excluir los resultados falsos positivos debidos a la reactividad cruzada de este IIFA, se consideró que estos casos tenían sospecha de infección por ZIKV(Tabla 1).
La clasificación en tres estadios de la infección por ZIKV se llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Organización Panamericana de la Salud (OPS)/Organización Mundial de la Salud (OMS) sobre la vigilancia del ZIKV en las Américas: < 5 días tras la aparición de los síntomas, fase inicial; 6 a 20 días tras la aparición de los síntomas, fase activa; > 20 días tras la aparición de los síntomas, fase tardía. Las muestras de los viajeros que regresaban de áreas endémicas fueron proporcionadas por los institutos de diagnóstico (enumerados en laTabla 1) a los que habían sido enviados para pruebas de diagnóstico rutinarias. Las muestras de pacientes residentes en Latinoamérica (es decir, República Dominicana y Colombia) se adquirieron en Boca Biolistics (Coconut Creek, Florida, Estados Unidos [e E.UU.]), Allied Research Society (Miami Lakes, Florida, EE.UU.) y Biomex GmbH (Heidelberg, Alemania). De acuerdo con confirmaron estos institutos y empresas, se había obtenido el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes y no existían restricciones legales o éticas para usar las muestras.
Para evaluar la reactividad cruzada, se usaron muestras de 252 pacientes con un estado de vacunación posterior al VFY (n = 12), o con otras infecciones flavivirales (DENV = 93; WNV = 34, JEV = 25), no flavivirales (CHIKV = 19) yPlasmodiumspp. (PLAS: n = 69). En las muestras de pacientes infectados por el DENV, la confirmación del DENV como agente infeccioso se basó en la detección del antígeno NS1. Los sueros de 1.015 individuos sanos (mujeres embarazadas, donantes de sangre y niños) que vivían en áreas endémicas y no endémicas de flavivirus sirvieron como controles negativos. Los datos previos a la caracterización de todas las cohortes de control figuran en laTabla 2. Por lo que saben los autores, ninguna de estas muestras había sido analizada en estudios anteriores.
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anonimizado al Instituto de Inmunología Experimental (afiliado a EUROIMMUN). Todos los sueros se almacenaron a -20 °C hasta su análisis. El estudio se llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones del Comité Ético Central de Alemania [29].
Ensayos inmunoenzimáticos
Las pruebas ELISA IgM e IgG contra el virus del Zika (EUROIMMUN) se usaron siguiendo las recomendaciones del fabricante. Estos ensayos en kit se basan en reactivos estandarizados y placas de microtitulación revestidas con ZIKV-NS1 recombinante. Brevemente, los sueros diluidos 1:101 en tampón de muestra se añadieron a los pocillos y se dejaron reaccionar durante 60 min a 37 °C. Antes de la detección de IgM, los sueros se preincubaron con tampón de muestra que contenía absorbente de IgG/factor reumatoide (RF) (EUROIMMUN) para eliminar los anticuerpos de clase IgG y los RF de clase IgM de la muestra. Esta etapa evita que la IgG específica desplace a la IgM del antígeno (dando lugar a falsos resultados IgM-negativos) y que la RF-IgM reaccione con la IgG unida específicamente (dando lugar a falsos resultados IgM-positivos). Los anticuerpos unidos se detectaron por medio de la aplicación de conjugado de peroxidasa IgM antihumana de cabra o conjugado de peroxidasa IgG antihumana de conejo durante 30 min a temperatura ambiente, seguido por tinción con tetrametilbencidina durante 15 min. La reacción enzimática se detuvo por medio de la adición de un volumen de ácido sulfúrico 0,5 mol/L. Con el kit de prueba se suministró un calibrador (anticuerpo quimérico ZIKV pollo-humano con una concentración ajustada para dar un valor de extinción que define el límite superior del intervalo de referencia de las personas no infectadas), así como controles positivos y negativos, que se analizaron con cada serie de pruebas. La intensidad de color de las reacciones enzimáticas se determinó fotométricamente a 450 nm (referencia 620 nm), obteniéndose valores de extinción. Para cada muestra se calculó una relación señal/corte (extinciónmuestra/extincióncalibrador).
El fabricante llevó a cabo un análisis de características operativas del receptor (ROC) basado en el conjunto de datos de validación inicial de muestras positivas y negativas para evaluar el rendimiento del ensayo en cada punto de corte posible, demostrando una sensibilidad y especificidad óptimas en valores de relación de 0,8 (IgM) y 0,6 (IgG). Para garantizar una alta especificidad, se estableció el intervalo límite (> 0,8 a < 1,1) entre la muestra de validación más alta negativa y la más baja positiva, lo que dio lugar a un punto de corte de positividad de > 1,1. Se usaron ELISA IgM e IgG anti-Virus del Dengue (EUROIMMUN).
Estadísticas
Los análisis estadísticos se llevaron a cabo con GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc., La Jolla, California, EE.UU.) y SigmaPlot 13.0 (SSI, San José, California, EE.UU.). La sensibilidad se calculó como la proporción de pacientes con ZIKV (referidos a los grupos 1 a 4 de acuerdo con lo indicado) identificados como positivos por el ensayo. La especificidad se calculó como la proporción de resultados negativos obtenidos entre los controles sanos. Se calcularon intervalos de confianza (IC) del 95% de acuerdo con el procedimiento de Wald modificado. El estudio se llevó a cabo de conformidad con la declaración de Estándares para Informes de Precisión Diagnóstica (STARD).
Resultados
Sensibilidad de la prueba inmunoenzimática
Se evaluó la sensibilidad de la nueva prueba ELISA anti-ZIKV basada en NS1 en sueros de 27 pacientes con infección por ZIKV confirmada por medio de RT-PCR que habían sido subagrupados en viajeros que regresaban de áreas endémicas de ZIKV y residentes en áreas endémicas. Entre los ocho viajeros infectados que regresaban de áreas en las que el ZIKV era endémico (grupo 1), se halló reactividad antiZIKV IgM e IgG positiva en siete (87,5%) y tres (37,5%) casos, respectivamente. De los 19 residentes infectados en áreas endémicas (grupo 2), seis (31,6%) dieron positivo para IgM anti-ZIKV y 15 (79,0%) para IgG. Además, se examinaron los sueros de 85 pacientes con sospecha de infección por ZIKV. Aquí, de 26 viajeros infectados que regresaban de áreas endémicas de ZIKV (grupo 3), 21 (80,8%) fueron positivos para IgM anti-ZIKV y 18 (69,2%) para IgG, mientras que entre 59 residentes infectados en áreas endémicas (grupo 4), seis (10,2%) mostraron reactividad positiva para IgM anti-ZIKV y 53 (89,9%) para IgG. Para el total de casos confirmados por RT-PCR y sospechosos, la sensibilidad combinada del ELISA (IgM y/o IgG) ascendió a 23/27 (85,2%) y 78/85 (91,8%), respectivamente.
Limitando el momento de la evaluación serológica a la fase activa y tardía de la infección por ZIKV, es decir, > 6 días tras el inicio de los síntomas, se observó reactividad IgM anti-ZIKV en 10/17 (58,8%) pacientes con RT-PCR positiva para ZIKV y en 3/38 (7,9%) pacientes con sospecha de infección por ZIKV, mientras que la IgG anti-ZIKV fue detectable en 15/17 (88,2%) y 34/38 (89,5%) casos, respectivamente. De este modo, la sensibilidad combinada (IgM y/o IgG) alcanzó 17/17 (100%) entre los casos confirmados por RT-PCR y 34/38 (89,5%) entre los casos sospechosos(Tabla 3).
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Al comparar los viajeros infectados por el ZIKV que regresaban de áreas endémicas (grupos 1 y 3) con los residentes infectados en estas áreas (grupos 2 y 4), se observó una tendencia de cinética de anticuerpos contra el ZIKV distinta: en la mayoría de los viajeros que regresaban, los valores del cociente IgM eran elevados (mediana 5,6; rango intercuartílico [IQR]): 4,6 a 6,9,) y relaciones moderadas de IgG (mediana 2,2; IQR 0,9 a 2,8) fueron detectables en la fase activa de la infección (proporción de corte: 1,1). Por el contrario, la mayoría de los residentes de áreas endémicas tenían infecciones con relaciones IgG muy altos (mediana 4,8; IQR 3,3 a 5,9) durante la fase activa, mientras que las relaciones IgM eran variables, pero predominantemente negativos o bajos (mediana 0,5; IQR 0,2 a 1,3)(Fig. 9Ay9B).
El análisis de la evolución temporal de un paciente alemán que presentó síntomas clínicos tras regresar de una estancia en Colombia reveló unos coeficientes IgM anti-ZIKV muy elevados en la primera prueba (día 10 tras el inicio de los síntomas), mientras que los coeficientes IgG aumentaron hasta niveles moderados durante la fase aguda de la infección y posteriormente(Fig. 9C). Por otra parte, las muestras de seguimiento tomadas de un residente colombiano con infección por ZIKV confirmada por RT-PCR indicaron un aumento significativo de la respuesta IgG específica del ZIKV entre los días 3 y 15 tras el inicio de los síntomas, seguido por una lenta disminución, mientras que la IgM anti-ZIKV fue negativa 3 días tras el inicio de los síntomas y se mantuvo por debajo del umbral de detección durante 14 semanas(Fig. 9D).
Reactividad cruzada del ensayo inmunoenzimático
La reactividad cruzada se analizó en primer lugar en sueros de 93 pacientes infectados por el DENV cuyo diagnóstico se había asegurado por medio de la detección positiva del DENV-NS1. Esta cohorte se dividió en un grupo (DENVa) con alta IgM anti-DENV (mediana de la proporción 3,9) y otro grupo (DENVb) con alta IgG anti-DENV (mediana de la proporción 3,9), asegurando la presencia de altos niveles de anticuerpos potencialmente reactivos cruzados. En ambos grupos, la reactividad anti-ZIKV fue inferior al umbral, lo que indica la ausencia de reactividad cruzada en estas muestras. Las pruebas complementarias incluyeron 159 sueros de pacientes positivos para IgM y/o IgG frente a YFV, WNV, JEV, CHIKV o PLAS. La IgM anti-ZIKV fue positiva en 1/34 (2,9%) pacientes infectados por WNV y en 1/69 (1,4%) pacientes infectados por PLAS. Se encontró IgG anti-ZIKV en 1/25 (4,0%) pacientes infectados por JEV (Figura G). Para el total de 252 muestras potencialmente reactivas cruzadas, la tasa global de positividad ascendió a 2/252 (0,8%) para IgM y 1/252 (0,4%) para IgG(Tabla 4).
Especificidad de la prueba inmunoenzimática
La especificidad de la prueba se evaluó por medio del análisis de 1.015 sueros de controles sanos. Sólo 1/99 (1,0%) donantes de sangre argentinos y 1/500 (0,2%) alemanes resultaron positivos a la IgM anti-ZIKV, mientras que los 128 donantes de sangre zimbabuenses y los 100 estadounidenses, así como las 100 embarazadas alemanas y los 88 niños alemanes resultaron negativos. La IgG anti-ZIKV estaba presente en 1/100 (1,0%) donantes de sangre estadounidenses y 1/500 (0,2%) alemanes, pero ausente en las cohortes de donantes de sangre zimbabuenses y argentinos, mujeres embarazadas y niños. De este modo, la especificidad global ascendió al 99,8% para cualquiera de las dos clases de Ig(Tabla 4, Figs. 10Ay10B).
Debate
El diagnóstico serológico de las infecciones por ZIKV ha supuesto un reto debido a las reacciones cruzadas con otros flavivirus, las infecciones secundarias y las vacunaciones previas, que complican la interpretación y a veces conducen a resultados poco fiables o falsos positivos. Aquí, evaluamos un ELISA recientemente desarrollado con la proteína recombinante ZIKV-NS1 como antígeno en fase sólida. Huzlyet al.(2016 Abr 21; 21(16). doi: 10.2807/1560 a 7917) ha demostrado recientemente que este ensayo es altamente específico, como se ha demostrado en un número limitado de pacientes europeos con infección por DENV, YFV, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV) o virus de la hepatitis C. En el presente estudio, las pruebas llevadas a cabo en muestras recolectadas > 6 días tras el inicio de los síntomas (es decir, después de la fase virémica) revelaron una sensibilidad combinada (IgM/IgG) del 100% para los casos confirmados por RT-PCR de infección por ZIKV con una especificidad del 99,8%. Entre los casos sospechosos de ZIKV, la sensibilidad combinada ascendió al 89,5%. Cabe destacar que en nuestro análisis sólo incluimos una muestra de suero de cada uno de los pacientes estudiados, excepto para el análisis de la evolución temporal. Sin embargo, para el diagnóstico serológico de los pacientes, la evaluación de las muestras de seguimiento es importante y se recomienda para demostrar la seroconversión o un aumento de 4 veces en la titulación de anticuerpos. En cuatro de los 27 casos de ZIKV confirmados por RT-PCR, las muestras fueron negativas tanto para IgM como para IgG contra ZIKV-NS1, presumiblemente porque todas ellas se tomaron sólo < 4 días tras el inicio de los síntomas, es decir, cuando los anticuerpos aún no habían alcanzado niveles detectables. Entre los 85 pacientes con sospecha de infección por ZIKV, la toma de muestras demasiado temprana puede explicar dos casos con IgM e IgG negativas, mientras que los cinco casos restantes con doble negativo se podrían deber a la ausencia de infección por ZIKV (déficits en la caracterización previa) o a resultados falsos negativos. La reactividad cruzada con anticuerpos DENV de alto nivel no fue detectable y, de acuerdo con un análisis preliminar con una cantidad limitada de muestras, no había indicios de diferencias dependientes del serotipo del DENV en la reactividad cruzada (datos no mostrados). Para juzgar mejor el rendimiento del ensayo en áreas endémicas, se deben incluir en evaluaciones posteriores muestras de residentes endémicos que hayan sufrido múltiples infecciones por DENV (y otros flavivirus), dado que estas muestras tienen un potencial de reactividad cruzada mayor. El análisis de todas las muestras potencialmente reactivas cruzadas dio como resultado unas tasas positivas del 0,8% (IgM) y del 0,4% (IgG) causadas por un caso de WNV y un caso de PLAS con un nivel bajo de IgM anti-ZIKV y un caso de EJ con un nivel bajo de IgG anti-ZIKV. En estos casos, sin embargo, no se pueden excluir las infecciones dobles, por lo que sigue sin estar claro si la positividad del ELISA se debió a la presencia de anticuerpos contra el ZIKV debido a la coinfección con el ZIKV (positivo verdadero) o a la reactividad cruzada (positivo falso). En caso de infección por PLAS, la activación policlonal de células B inducida por PLAS puede causar la producción de anticuerpos potencialmente reactivos cruzados. Entre los pacientes con infección actual por PLAS, se notificaron hasta un 30% de reacciones falsas positivas o dudosas mediante el uso del ELISA basado en NS1 presentado, lo que contrasta con sólo un 1,4% en el presente estudio y probablemente se explica por el hecho de que nuestra cohorte estaba compuesta principalmente por individuos con un estado de infección por PLAS en el pasado. Por lo tanto, se deben tener en cuenta las posibles interferencias al aplicar el ensayo.
En sueros de viajeros que regresaban de áreas endémicas de ZIKV, observamos una tendencia de la IgM específica de ZIKV a aparecer en relaciones elevadas durante la fase activa de la infección, paralela a un aumento moderado de la IgG. En cambio, la mayoría de los residentes en áreas endémicas presentaban valores elevados de IgG anti-ZIKV y bajos/negativos de IgM, independientemente de que sus muestras se hubieran tomado durante la fase inicial, activa o tardía de la infección. Las respuestas IgM en los viajeros que regresaban de áreas en las que el ZIKV era endémico tendían a ser más elevadas en comparación con los residentes en dichas áreas, mientras que la tasa de positividad IgG era mayor en este último subgrupo. Estas diferencias en la cinética de los anticuerpos contra el ZIKV también se ilustraron por medio del análisis de la evolución temporal de los niveles de anticuerpos en dos pacientes representativos, lo que posiblemente refleja que los viajeros que regresan de países en los que el ZIKV es endémico tuvieron predominantemente una infección primaria por flavivirus/ZIKV, mientras que la mayoría de los residentes probablemente contrajeron el ZIKV como una infección secundaria por flavivirus. Se han descrito cinéticas similares para infecciones primarias y secundarias en la epidemia de ZIKV de Micronesia y para pacientes infectados por DENV, lo que sugiere que la detección tanto de IgM como de IgG específicas es importante desde el punto de vista diagnóstico y relevante para diferenciar las infecciones primarias de las secundarias. En cuanto a nuestra comparación de pacientes residentes en países endémicos frente a viajeros, sin embargo, no se pueden excluir diferencias sistemáticas en los antecedentes de estas poblaciones (por ejemplo, genéticas, étnicas).
Otra limitación de nuestro estudio es que no incluye pruebas paralelas con ensayos adicionales, tales como el Zika MAC-ELISA (Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades [CDC], Atlanta, Georgia, EE. UU.) o PRNT, para proporcionar datos comparativos sobre estas pruebas actuales. Además, la ausencia no deliberada de una norma de referencia serológica uniforme para la caracterización previa de todas las muestras de ZIKV dio lugar a un elevado número de casos sospechosos de infección por ZIKV.
Aunque el ZIKV suele causar infecciones más bien leves, existen pruebas convincentes de su relación causal con alteraciones neuronales, tales como la microcefalia neonatal y el<s>G<b>[37]. Además, se han llevado a cabo estudios que demuestran que los anticuerpos NS1 del DENV tienen el potencial de inducir autoanticuerpos en infecciones secundarias, probablemente mediados por la unión reactiva cruzada de antígenos en plaquetas y células endoteliales, seguida por daño celular y activación inflamatoria. Se necesita investigación básica para dilucidar plenamente las relaciones causales entre los trastornos neuronales y la infección por ZIKV. La evaluación epidemiológica de las mujeres embarazadas y sus bebés, y de los viajeros que regresan de áreas endémicas, la vigilancia de la sangre donada y la investigación de la prevalencia del ZIKV en áreas endémicas y no endémicas pueden proporcionar información crucial. Estos estudios necesitan pruebas diagnósticas fiables, rápidas y fáciles de manejar, que tengan una baja reactividad cruzada y permitan un diagnóstico definitivo.
En conclusión, nuestro estudio reveló que el ELISA anti-ZIKV basado en NS1 es una herramienta sensible y altamente específica para el serodiagnóstico de infecciones por ZIKV, eliminando las reacciones cruzadas con anticuerpos frente a DENV y otros flavivirus. El formato del ensayo es adecuado para su uso en laboratorios de rutina de todo el mundo, lo que permite llevar a cabo pruebas de alto rendimiento en entornos epidémicos. La identificación serológica de las infecciones por ZIKV se maximiza por medio de pruebas paralelas de IgM e IgG. Serán necesarios más estudios para determinar la exactitud de este y otros ensayos actuales en un conjunto más amplio de muestras bien definidas, y para aclarar cómo la infección por ZIKV desencadena el SGB, la microcefalia del recién nacido y otras manifestaciones neurológicas.
Ejemplo 8: La IgA contra el virus del Zika puede indicar una infección aguda en pacientes con IgM contra el virus del Zika negativa
Este ejemplo muestra que la IgA de acuerdo con la SEC. ID Núm.: 1 y los reactivos y procedimientos relacionados se pueden usar para distinguir una infección aguda de una pasada y, por lo tanto, una infección primaria de una secundaria.
Procedimientos
Se tomaron muestras de suero en diversos momentos de dos colombianos con antecedentes de infecciones por flavivirus y de dos viajeros alemanes, todos ellos con infecciones confirmadas por ZIKV. Las titulaciones de IgM e IgG anti-ZIKV se midieron mediante el uso de un ELISA comercial anti-virus del Zika basado en NS1 (Euroimmun AG, Alemania). Para la medición de IgM se usó adicionalmente una prueba de inmunofluorescencia indirecta (Arbovirus Fever Mosaic 2, IgM, corte > 1:10, Euroimmun AG, Alemania) basada en células infectadas con ZIKV. Para la determinación de la IgA anti-ZIKV, se adaptó un ELISA correspondiente, por medio de la aplicación de una IgA anti-humana conjugada con peroxidasa. En todos los ensayos, el punto de corte se fijó en una proporción de 1,1.
Resultados
En los viajeros alemanes, se detectó IgM anti-ZIKV el día 9 y el día 16, respectivamente, independientemente del procedimiento. Las infecciones activas se confirmaron posteriormente por seroconversión de IgG anti-ZIKV. Las mediciones de IgA fueron superiores a 1,1 en todas las muestras excepto en una, mostrando un aumento inicial y una disminución posterior(Tabla 5)
En las muestras secuenciales de los dos pacientes colombianos (resultados mostrados en lasFigs. 11Ay11B), las mediciones de anticuerpos IgM contra el antígeno ZIKV-NS1 se mantuvieron persistentemente por debajo del punto de corte. De acuerdo con esto, las pruebas de IgM contra el virus del Zika completo fueron negativas en todas las muestras excepto en una, débilmente positiva (1:10). La IgG anti-ZIKV fue positiva ya en la primera semana en ambos pacientes. La IgA, sin embargo, mostró un aumento de la titulación, alcanzando un máximo por encima del punto de corte en la tercera y cuarta semana antes de volver a caer por debajo del umbral.
Conclusión
Cuando la IgM específica no es detectable ni con los ensayos basados en NS1 ni en el virus completo, como se observó en los pacientes colombianos, la medición de la IgA anti-ZIKV puede permitir la discriminación de las infecciones agudas de las pasadas.
empo 9<:>usenca e g espec ca en a sexa semana ras a aparc n e os sn omas en un pacen e con infección confirmada por el virus del Zika
Este ejemplo muestra que la detección de la presencia o ausencia tanto de IgG como de IgM para la SEC. ID Núm.: 1 y los reactivos y procedimientos relacionados se pueden usar para aumentar la fiabilidad diagnóstica de un ensayo para diagnosticar una infección por el virus del Zika en comparación con los ensayos basados en la detección de Ig de una sola clase.
Introducción
Tras el grave brote de infecciones por el virus del Zika (ZIKV) en las Américas, los CDC recomiendan llevar a cabo pruebas de ácido nucleico en muestras recolectadas en las dos semanas siguientes a la aparición de los síntomas. Las muestras de suero recolectadas después del día 14 y hasta el día 84 se deben analizar para detectar anticuerpos IgM antiZIKV, suponiendo que éstos estén presentes en cualquier momento desde cerca del cuarto día tras el inicio de los síntomas hasta las doce semanas.
Sin embargo, se ha notificado con frecuencia la ausencia de IgM específica en pacientes con infecciones secundarias por el virus del dengue (DENV), dado que el DENV y el ZIKV son flavivirus relacionados la respuesta inmunológica puede ser comparable en las infecciones por ZIKV.
Procedimientos
Una mujer colombiana de 42 años con infección por ZIKV confirmada por RT_PCR cinco días después de la aparición de los primeros síntomas fue sometida a pruebas adicionales de anticuerpos IgM e IgG específicos. Las muestras de suero tomadas el quinto y el cuadragésimo primer día tras la aparición de los síntomas se analizaron por medio del ELISA de captura de IgM del ZIKV, basado en el antígeno completo del virus (relación de corte 1,8; InBios, EE.UU.) y el ELISA anti virus del Zika IgM basado en NS1, así como IgG (relación de corte 1,1; Euroimmun AG, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Resultados
Los resultados se muestran en laFig. 12y laTabla 6. Las dos muestras de suero revelaron resultados negativos en ambas pruebas de IgM. Las relaciones en el ELISA de captura de IgM oscilaron entre 0,81 (día 5) y 0,12 (día 41), y las mediciones con el ELISA IgM ant-virus del Zika revelaron relaciones de 0,1 (día 5) y 0,4 (día 41). Por el contrario, las pruebas de IgG arrojaron resultados positivos el día 5 (relación 1,9) y el día 41 (relación 5,6).
Conclusión
Las dos muestras de suero disponibles de este paciente databan del período de tiempo sugerido de IgM-positivo anti-ZIKV (12 semanas), pero resultaron IgM-negativas independientemente del sustrato antigénico usado: virus completo o NS1.
En cambio, las dos muestras revelaron un aumento de la titulación de IgG, lo que sugiere que se deberían llevar a cabo pruebas paralelas de IgM e IgG anti-ZIKV en dos muestras de suero consecutivas para detectar la seroconversión o un aumento significativo de la titulación de IgG, a fin de evitar que se pierdan pacientes con IgM-negativo anti-ZIKV.
Tabla 6:
Claims (18)
1. Un kit que comprende un portador de utilidad diagnóstica,
en el que el kit comprende un medio para detectar específicamente un anticuerpo capturado,
en el que el portador de utilidad diagnóstica es un portador que comprende un medio para capturar específicamente un anticuerpo de clase IgA frente a la SEC. ID Núm.: 1 en una muestra de un sujeto, en el que el medio para capturar específicamente el anticuerpo de clase IgA es un polipéptido que comprende la SEC. ID Núm.: 1 o una variante del mismo, en la que la variante tiene al menos 10 aminoácidos sucesivos de la SEC. ID Núm.: 1 y tiene la capacidad de unirse específicamente a un anticuerpo de clase IgA de la SEC. ID Núm.: 1 en una muestra obtenida de un sujeto sospechoso de padecer una infección por el virus del Zika y tiene al menos un epítopo de la SEC. ID Núm.: 1,
y en el que el medio para detectar específicamente un anticuerpo capturado es un anticuerpo secundario que se une a la región constante de anticuerpos humanos de clase IgA o
un kit que comprende un portador de utilidad diagnóstica y un polipéptido,
en el que el portador de utilidad diagnóstica comprende un medio para captar específicamente todos los anticuerpos de clase IgA, que es un anticuerpo que se une a todos los anticuerpos de clase IgA, en el que el polipéptido es un medio para detectar específicamente un anticuerpo capturado de la SEC. ID Núm.: 1 y es un polipéptido recombinante que comprende la SEC. ID Núm.: 1 o una variante del mismo, en la que la variante tiene al menos 10 aminoácidos sucesivos de la SEC. ID Núm.: 1 y tiene la capacidad de unirse específicamente a un anticuerpo de clase IgA de la SEC. ID Núm.: 1 en una muestra obtenida de un sujeto sospechoso de padecer una infección por el virus del Zika y tiene al menos un epítopo de la SEC. ID Núm.: 1,
y en el que el polipéptido comprende preferentemente una etiqueta.
2. Un procedimientoin vitropara diagnosticar una enfermedad que comprende la etapa de detectar en una muestra de sangre de un sujeto la presencia o ausencia de un anticuerpo contra la SEC. ID Núm.: 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humano de clase IgA, en el que la enfermedad es una infección por el virus del Zika.
3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, que además comprende la etapa de detectar la presencia o ausencia de un anticuerpo contra la SEC. ID Núm.: 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo de clase IgM y/o IgG.
4. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, en el que la presencia o ausencia de un anticuerpo contra la SEC. ID Núm.: 1 y la presencia o ausencia de un anticuerpo contra uno o más antígenos adicionales se detecta en reacciones de unión espacialmente separadas.
5. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que el procedimiento comprende capturar el anticuerpo, en el que el anticuerpo capturado se detecta mediante el uso de un anticuerpo secundario que se une a la región constante del anticuerpo de clase IgA.
6. Un procedimientoin vitropara diagnosticar una enfermedad que comprende la etapa de detectar en una muestra de sangre de un sujeto la presencia o ausencia de un anticuerpo de clase IgM, IgG e IgA frente a la SEC. ID Núm.: 1,
en el que los anticuerpos son capturados específicamente,
en el que un polipéptido antigénico que comprende la SEC. ID Núm.: 1 o una variante del mismo se usa para detectar cualquier anticuerpo de clase IgG, IgM e IgA capturado de la SEC. ID Núm.: 1, en el que dicho polipéptido comprende una etiqueta que es fácil de detectar,
y en el que la variante tiene al menos 10 aminoácidos sucesivos de la SEC. ID Núm.: 1 y tiene la capacidad de unirse específicamente a un anticuerpo de clase IgA de la SEC. ID Núm.: 1 en una muestra obtenida de un sujeto sospechoso de padecer una infección por el virus del Zika y tiene al menos un epítopo de la SEC. ID Núm.: 1,
y en el que la enfermedad es una infección por el virus del Zika.
7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el anticuerpo se detecta por medio de técnicas de aglutinación.
8. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en el que además se detecta la concentración total de IgM a la SEC. ID Núm.: 1.
9. El kit de acuerdo con la reivindicación 1 o el procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en el que el anticuerpo es un mamífero, preferentemente un anticuerpo humano.
10. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, que comprende la etapa de contacto de un portador de utilidad diagnóstica con una muestra del sujeto.
11. El kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 9 el procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, en el que el portador se selecciona del grupo que comprende una perla, preferentemente una perla paramagnética, una tira reactiva, una placa de microtitulación, una membrana, preferentemente del grupo que comprende western blot, line blot y dot blot, una prueba de flujo lateral, una superficie de vidrio, un portaobjetos, un biochip y una membrana.
12. El kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 9 y 11, además comprende uno o más, preferentemente todos, del grupo que comprende un tampón de dilución de muestra, un tampón de lavado y un tampón que comprende un medio para detectar cualquier anticuerpo capturado específicamente, una solución química para llevar a cabo una reacción de detección, un control positivo, un control negativo, y una solución estándar que comprende un anticuerpo de unión a la SEC. ID Núm.: 1 para preparar una curva de calibración.
13. Un uso de un anticuerpo de clase IgA de la SEC. ID Núm.: 1 para el diagnóstico de una infección por el virus del Zika.
14. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11 o el uso de acuerdo con la reivindicación 13 comprende detectar a) un anticuerpo de clase IgA frente a la SEC. ID Núm.: 1 o b) un anticuerpo de clase IgA, IgM e IgG frente a la SEC. ID Núm.: 1 en una muestra de sangre de un sujeto.
15. Un uso de un kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 9 y 11 a 12 o un anticuerpo de clase IgA de la SEC. ID Núm.: 1 o el procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11 y 14 para distinguir una infección primaria de una secundaria por el virus del Zika.
16. Un uso de un kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 9 y 11 a 12 o un anticuerpo de clase IgA de acuerdo con la SEC. ID Núm.: 1 para aumentar la fiabilidad del diagnóstico, preferentemente en una fase temprana de la infección.
17. El kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 9 y 11 a 12, el procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, 8 a 11 y 14 o el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en el que el anticuerpo se detecta mediante el uso de un procedimiento seleccionado del grupo que comprende inmunoensayos marcados tales como los del grupo que comprende inmunoensayos radiomarcados, inmunoensayos enzimáticos tales como ensayos colorimétricos, quimioluminiscencia, preferentemente electroquimioluminiscencia, inmunoensayos y técnicas de inmunofluorescencia.
18. El kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 9, 11 a 12 y 17 o el procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, 14 y 17, en el que la etiqueta es fluorescente, quimioluminiscente, preferentemente electroquimioluminiscente, radiactiva, enzimáticamente activa o de espín.
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