ES2553235T3 - Utilización de EF-1 y sus homólogos, para detectar una proteína retroviral p24 o un homólogo de ésta - Google Patents

Abstract

Utilización, in vitro o ex vivo, de al menos una sub-unidad α de una proteína Factor de Elongación de la traducción 1, EF-1, de un homólogo de EF-1, presentando dicho homólogo de EF-1 al menos el 80% de homología con EF-1 y una actividad biológica similar, o de un fragmento C-terminal de estos que comprende una secuencia de aminoácidos que varía de 150 a 250 aminoácidos contiguos del extremo C-terminal de la sub-unidad o de su homólogo, como agente de detección de una proteína retroviral p24, o de un homólogo de ésta, presentando dicho homólogo de p24 al menos el 80% de homología con p24 y una actividad biológica similar.

Description

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DESCRIPCION

Utilización de EF-1 y sus homólogos, para detectar una proteína retroviral p24 o un homólogo de esta La presente Invención se refiere al campo del diagnóstico biológico.

Más precisamente, la invención se refiere a la utilización de una sub-unidad de una proteína Factor de Elongación de la traducción 1, o EF-1, o de un homólogo de esta, o de una porción de estos, como agente de captura para la detección de una proteína retroviral. La invención se refiere también a un procedimiento y a un kit de detección de una proteína retroviral.

El Síndrome de la Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) es una enfermedad infecciosa que se debe al Virus de la inmunodeficiencia Humana (VIH), que se caracteriza en particular por la destrucción de las células inmunitarias en el individuo infectado, y que tiene frecuentemente como consecuencia final la muerte del paciente, debido a enfermedades oportunistas.

Según las estimaciones de la United Nations Programme on HIV/AIDS (UNAIDS), más de 33 millones de personas en el mundo padecerían SIDA. Transmisible por vías sexual y sanguínea, y también de madre a hijo, esta enfermedad infecta a unos de 2 a 3 millones de nuevas personas cada año. Muy frecuentemente, la transmisión se lleva a cabo mientras la persona infectada no está diagnosticó como tal, y en consecuencia no ha tomado las medidas de precaución necesarias para prevenir la contaminación de otras personas. Un diagnóstico tardío de esta enfermedad en una persona recientemente infectada es por lo tanto una de las razones principales que conducen al aumento y a la renovación de la población mundial infectada por el VIH.

Es así primordial poder diagnosticar la presencia del VIH en un individuo lo más rápidamente posible después de su infección.

Actualmente, muchas infecciones virales, y en particular el VIH, son diagnosticadas por detección de proteínas virales y/o de anticuerpos que detectan estas proteínas virales, en una muestra biológica, como la sangre, del individuo ensayado. A titulo de ejemplo de proteínas virales utilizadas para este fin, se puede citar la proteína retroviral p24, o su homologa p26, procedente de la escisión de la poliproteína GAG, y constitutiva de la cápside de algunos virus, tal como el VIH-1, VIH-2 y los virus HTLV-1 (Human T-Lymphotropic Virus) y HTLV-2.

El documento US20040005548 describe un procedimiento de diagnostico de una infección por VIH mediante anticuerpos dirigidos contra el antfgeno p24 del VIH-1 y/o contra el antfgeno p26 del VIH-2.

Los ensayos de diagnóstico comercialmente disponibles para la detección del VIH se basan, en su mayoría, en la detección de anticuerpos dirigidos contra una de las proteínas del virus, p24, gp41, gp120, gp160 o gp105. Estos ensayos presentan, no obstante, el inconveniente de no poder dar un resultado positivo con un buen intervalo de confianza antes de un periodo de al menos 3 semanas desde la supuesta fecha de la infección. Este periodo de tiempo es necesario para el desarrollo de una respuesta inmunitaria suficiente para que pueda ser detectable.

Otros ensayos denominados de diagnóstico rápido (TDR) o de 4a generación (TDR 4G) se basan en la detección combinada de anticuerpos anti-VIH-1 o anti-VIH-2 y de la proteína retroviral p24. Permiten la obtención de un resultado en aproximadamente 15 minutos. Sin embargo, su sensibilidad es relativamente baja, y no pueden generalmente detectar la proteína retroviral p24 a concentraciones inferiores a aproximadamente 50 pg/ml. Un resultado positivo con un intervalo de confianza razonable requiere la presencia de la proteína retroviral p24 a concentraciones superiores a aproximadamente 100 pg/ml. Estos resultados pueden por lo tanto dar falsos negativos para pacientes infectados poco tiempo antes del diagnóstico, por ejemplo menos de 15 días o menos de un mes. Por lo tanto, deben ser repetidos de nuevo vahas semanas después de la obtención de un resultado negativo a fin de confirmar o invalidar éste. Esto puede traducirse por un aumento sustancial de los costes relacionados a las políticas sanitarias y de prevención de la enfermedad.

Otros ensayos de diagnóstico se basan en la detección de la presencia de ADN o de ARN virales, por ejemplo por PCR o RT-PCR. Aunque tiene mejor sensibilidad que los ensayos anteriores, tienen un coste más elevado, y necesitan locales y una instalación específicos. Por lo tanto son poco accesibles en los países en vías de desarrollo que no tienen los recursos y las infraestructuras adecuadas para su implantación. Por otra parte, implican unas manipulaciones precisas y largas, habitualmente de 48 horas, entre la extracción de la muestra a ensayar y la obtención del resultado.

A la vista de lo anterior, parece que sigue habiendo la necesidad de disponer de un ensayo de detección de una infección viral que sea rápido, sencillo, con un nivel de sensibilidad que permita un diagnóstico precoz, y de bajo coste.

Sigue habiendo también la necesidad de disponer de un ensayo de detección de una infección viral fiable que sólo requiera la detección de una proteína retroviral.

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Existe también una necesidad de disponer de una nueva herramienta de detección de proteínas retrovirales que sea sólida y de buena sensibilidad.

Existe también una necesidad de disponer de una nueva herramienta de captura de proteínas retrovirales.

Existe también una necesidad de disponer de un ensayo de detección de proteínas retrovirales sencillo, rápido, reproducible, sensible, sólido y poco costoso.

Existe también una necesidad de disponer de un ensayo de diagnóstico que permita la detección precoz de una infección viral.

Finalmente, existe una necesidad de un ensayo de diagnóstico del VIH fiable, rápido, sensible, sólido, reproducible y poco costoso.

La presente invención tiene por objeto satisfacer estas necesidades.

Según un primer objeto, la presente invención se refiere a la utilización de al menos una sub-unidad de una proteína de factor de elongación de la traducción 1, EF-1, de un homólogo de EF-1, presentando dicho homólogo de EF-1 al menos el 80% de homología con EF-1 y una actividad biológica similar o de un fragmento C-terminal de estos que comprenden una secuencia de aminoácidos que varía de 150 a 250 aminoácidos contiguos del extremo C-terminal de la sub-unidad o de su homólogo, como agente de detección de una proteína retroviral p24 o de un homólogo de ésta, presentando dicho homólogo de p24 al menos el 80% de homología con p24 y una actividad biológica similar.

Salvo que se indique lo contrario, a continuación, cuando se utiliza el término "EF-1" solo, se pretende designar, indistintamente, la proteína EF-1, un homólogo de EF-1, una sub-unidad de estos, o un fragmento C-terminal de una sub-unidad.

De manera inesperada, y como se detallará en los ejemplos, los inventores han observado que la proteína EF-1, y en particular la sub-unidad EF-1 a, puede enlazarse a una proteína retroviral p24 del VIH, y formar con ella un complejo proteico. Esta propiedad es ventajosamente aprovechada para la captura y la detección de proteínas retrovirales. Además, los inventores han observado que la asociación de EF-1 con una poliproteína viral GAG mejora la captura de la proteína p24, y por lo tanto la sensibilidad de la detección de esta proteína.

Así, la invención saca provecho de una propiedad nuevamente observada de EF-1, a saber su fuerte afinidad frente a proteínas retrovirales, y más particularmente frente a GAG y p24. Esta propiedad permite la detección, con una buena confianza, de la proteína retroviral p24 con muy bajas concentraciones, por ejemplo Inferior a 100 pg/ml, incluso inferior a 50 pg/ml, incluso también inferior a 3 pg/ml.

La presente invención permite por lo tanto realizar una detección precoz, sensible, rápida, fiable y poco costosa de una infección por un virus que expresa una proteína p24, o un homólogo de ésta. Ventajosamente, el diagnóstico de una infección viral mediante un método según la invención puede sólo requerir la detección de la proteína retroviral p24, o de un homólogo de ésta.

Según otro objeto, la presente invención se refiere a un procedimiento para detectar, en una muestra biológica, la presunta presencia de una proteína retroviral p24, o de un homólogo de esta, presentando dicho homólogo de p24 al menos el 80% de homología con p24 y una actividad biológica similar, comprendiendo dicho procedimiento al menos las etapas que consiste en:

a- poner en contacto dicha muestra con una cantidad eficaz de al menos una sub-unidad de una proteína factor de elongación de la traducción 1, EF-1, de un homólogo de EF-1, presentando dicho homólogo de EF-1 al menos el 80% de homología con EF-1 y una actividad biológica similar o de un fragmento C-terminal de estos que comprende una secuencia de aminoácidos que varía de 150 a 250 aminoácidos contiguos del extremo C-terminal de la sub- unidad o de su homólogo, en condiciones apropiadas a la formación de al menos un complejo proteico entre la sub- unidad de EF-1, el homólogo de EF-1, o el fragmento C-terminal de estos, y al menos una proteína retroviral p24 o el homólogo de esta,

b- poner en contacto el complejo proteico de la etapa a- con una entidad bi-funcional, estando dicha entidad dotada de un grupo capaz de enlazarse específicamente al menos a una proteína retroviral p24, o el homólogo de ésta, en dicho complejo, y de un grupo apto para ser detectable, directa o indirectamente, por un modo de detección, siendo efectuada la puesta en contacto en condiciones apropiadas para el establecimiento de un enlace entre dicha proteína retroviral y dicha entidad bi-funcional,

c- detectar dicha entidad bi-funcional, siendo la detección de dicha entidad bi-funcional enlazada indicadora de la presencia de la proteína retroviral p24, o del homólogo de esta.

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Según un modo de realización, una utilización o un procedimiento de la invención pueden realizarse in vivo, in vitro o ex vivo, y preferentemente in vitro o ex vivo.

Según también otro objeto, la presente invención se refiere a un kit de detección de al menos una proteína retroviral p24, o un homólogo de ésta, presentando dicho homólogo de p24 al menos el 80% de homología con p24 y una actividad biológica similar, que comprende:

- al menos un primer receptáculo que comprende al menos una sub-unidad de una proteína factor de elongación de la traducción 1, EF-1, un homólogo de EF-1, presentando dicho homólogo de EF-1 al menos el 80% de homología con EF-1 y una actividad biológica similar, o un fragmento C-terminal de estos, que comprende una secuencia de aminoácidos que varía de 150 a 250 aminoácidos contiguos del extremo C-terminal de la sub-unidad y de su homólogo, y

- al menos un segundo receptáculo que comprende una entidad bi-funcional dotada de un grupo capaz de enlazarse específicamente al menos a dicha proteína retroviral p24, o dicho homólogo de ésta, susceptible de estar presente en un complejo proteico formado con la sub-unidad de EF-1, el homólogo de EF-1 o el fragmento C-terminal de estos, y un grupo capaz de ser detectable, directa o indirectamente, por un modo de detección.

Ventajosamente, la invención permite una mejora de la sensibilidad, de la rapidez y de la fiabilidad del diagnóstico de infecciones por unos virus que expresan una proteína retroviral p24, o un homólogo de esta.

Más ventajosamente, la invención permite proponer un diagnóstico precoz de una infección por el VIH.

Más ventajosamente, la invención permite proponer unos ensayos y unos dispositivos para el diagnóstico de infecciones por retrovirus, poco costoso, sencillos, rápidos y que permiten satisfacer las diferentes exigencias en el campo, tanto en el plano económico como en el plano de la salud pública y de la seguridad sanitaria. Tales ensayos pueden permitir la aportación de una mejor garantía en cuanto a las transfusiones sanguíneas humanas, establecer un diagnóstico precoz de las infecciones virales, y optimizar los tratamientos terapéuticos correspondientes.

En el sentido de la Invención, por "agente de detección" de una molécula, se entiende designar un compuesto dotado de la propiedad de enlazar, por ejemplo por afinidad, dicha molécula cuando se pone en contacto con esta

en condiciones apropiadas.

Según la invención, por "muestra biológica" se entiende designar cualquier extracción procedente de un mamífero, en particular humano, o de líquidos biológicos, o de tejidos o de células eucariotas, cultivados in vitro o ex vivo, y susceptibles de estar infectados por un retrovirus que contiene una proteína retroviral p24. Por ejemplo, una muestra biológica puede ser una extracción de un fluido corporal, tal como la sangre, el plasma, los extractos leucocitarios, la saliva, la orina, la bilis, las lágrimas, o la leche materna, o también un sobrenadante de medio de cultivo, un lisado o un extracto celular o tisular.

Un tejido biológico en cultivo puede ser un tejido reconstituido in vitro o ser un tejido extraído de un mamífero y cultivado ex vivo.

Los cultivos de células consideradas por la invención pueden ser unos cultivos de células primarias o unos cultivos de líneas celulares. Pueden ser idénticos o de diferentes naturalezas, como por ejemplo unas células dendríticas, unos leucocitos, unos linfocitos, unos monocitos, unos macrófagos, etc., infectadas o no por el VIH.

Un mamífero considerado por la invención puede ser cualquier mamífero susceptible de ser infectado por un retrovirus que comprende una proteína retroviral p24, o un homólogo de ésta, tal como un gato o un primate, y en particular un ser humano.

Una "infección viral" puede ser cualquier infección de una célula, de un tejido o de un individuo, en particular de un ser humano, por un virus que posee y/o es capaz de hacer producir por la célula, el tejido o el individuo infectado, una proteína retroviral p24, o un homólogo de ésta.

Según la invención, por "homólogo" se entiende designar, frente a una primera secuencia de aminoácidos, cualquier secuencia de aminoácidos que presenta al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98%, al menos el 99%, de homología con esta primera secuencia de aminoácidos, y que presenta una actividad biológica similar.

Una homología de secuencia puede ser identificada mediante cualquier técnica habitualmente utilizada en el campo por el experto en la técnica. A título de ejemplo, una homología de secuencia puede ser determinada mediante la utilización de la interfaz informática BLAST disponible en la página web NCBI en la dirección
http://blast.ncbi-nlm- nih-gov configurada con los parámetros por defecto.

Un homólogo de una primera secuencia de aminoácidos puede diferir de esta, por ejemplo, por una o varias

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deleción(es), y/o inserción(es) y/o una o varias sustitución(es) de un aminoácido. Estas modificaciones pueden ser combinadas. Un homólogo de una primera secuencia de aminoácidos puede comprender una o varias sustituciones conservadoras de aminoácidos. Las modificaciones presentadas anteriormente pueden ser denominadas, de manera general, "mutación". Así, los homólogos de la invención se refieren también a los mutantes y a las variantes de secuencias de aminoácidos de la invención.

A título de ejemplo de mutaciones que se pueden considerar en la presente invención, se puede mencionar la sustitución de uno o varios residuos de aminoácidos por unos residuos de aminoácidos que tienen un índice hidropático similar, sin afectar por ello de manera sustancial a las propiedades biológicas de la proteína, y en particular a su propiedad de interacción con su proteína asociada. El índice hidropático es un índice atribuido a los aminoácidos en función de su hidrofobicidad y de su carga (Kyte y Doolittle (1982), J. Mol. Biol., 157: 105).

Por "homólogo" en el sentido de la invención, se entiende también cubrir unas secuencias de aminoácidos procedentes de otra especie distinta de la retenida para la primera secuencia de aminoácidos, pero que poseen el grado de homología requerido y manifiestan las propiedades necesarias para la realización de la invención. A título de ejemplo de homólogos considerados por la invención, se puede citar con respecto a un fragmento de EF-1a, un fragmento de EF-Tu presente en los procariotas, y con respecto a la proteína retroviral p24 del VIH-1, las proteínas p24 de HTLV-1 y HTLV-2, y la proteína retroviral p26 del VIH-2.

Las secuencias de aminoácidos que son convenientes para la invención pueden ser naturales o sintéticas, llegado el caso, susceptibles de ser obtenidas por síntesis química o biológica, o por extracción a partir de un tejido biológico, que expresa naturalmente o después de una transducción, la secuencia, así como las diferentes formas post- traduccionales, los homólogos, los mutantes o los fragmentos de ésta. Se puede obtener mediante cualquier procedimiento conocido por el experto en la técnica, en particular como se describe por SAMBROOK et al. (Molecular Cloning: A laboratory Manual, Ed. Coid Spring Harbor, 2001).

En el sentido de la invención, por "aproximadamente" se entiende indicar que el valor que sigue este término se verifica teniendo en cuenta los límites de errores experimentales aceptables para el experto en la materia.

En el sentido de la invención, "cantidad eficaz" significa la cantidad mínima y suficiente para observar la aparición de un efecto buscado, a saber, por ejemplo, la formación de un complejo que comprende al menos una proteína retroviral p24, o un homólogo de ésta, asociada a EF-1.

Proteína factor de elongación de la traducción 1 (proteína EF-1)

La proteína Factor de Elongación de la traducción 1, o proteína EF-1, está implicada en la fase de elongación de la síntesis proteica dentro de todas las células. Interviene en el enlace GTP-dependiente de los aminoacil-ARNts con los ribosomas. Esta proteína, ubiquitaria, de denomina proteína EF-1 en las eucariotas y proteína EF-Tu en las procariotas.

La proteína EF-1 más particularmente considerada en la presente invención puede ser la proteína EF-1 humana.

La proteína EF-1 está constituida de cuatro sub-unidades, a saber EF-1a, EF-1 (3, EF-1y y EF-18.

La presente invención puede utilizar al menos una sub-unidad de EF-1, un homólogo de EF-1, o un fragmento C- terminal de estos.

Según un modo de realización, se puede utilizar al menos una sub-unidad de la proteína EF-1, incluso la proteína EF-1 entera, que comprende las 4 sub-unidades mencionadas anteriormente.

Una sub-unidad de la proteína EF-1 conveniente para la invención se puede seleccionar entre EF-1a, EF-1 p, EF-1y y EF-18. Preferentemente, una sub-unidad utilizada puede ser EF-1a.

Las sub-unidades EF-1 a, EF-ip, EF-1y y EF-18 consideradas en la invención pueden ser representadas por las secuencias identificadas por las referencias SwissProt respectivas P68104, P24534, P26641 y P29692, o un homólogo de estas.

Un homólogo de EF-1 conveniente para la invención presenta el grado de homología anteriormente definido, y una actividad biológica similar. Una actividad biológica similar considerada para un homólogo de EF-1 puede ser una actividad de factor de elongación y/o una capacidad para enlazarse a una proteína retroviral p24, o un homólogo de ésta, y/o una proteína retroviral GAG, o un homólogo de ésta. Preferentemente, un homólogo de EF-1 conveniente para la invención posee, llegado el caso, a un grado diferente, estas tres capacidades.

El grado de homología conforme a la invención entre EF-1 y un homólogo de ésta puede ser satisfecho sobre una porción sólo de las secuencias de aminoácidos consideradas, y preferentemente en la porción C-terminal.

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Un fragmento C-terminal de EF-1 conveniente para la invención es de longitud suficiente para estar necesariamente dotado de la propiedad de enlazar, por ejemplo por afinidad, una proteína retroviral p24 o un homólogo de esta. Esta propiedad se puede determinar mediante cualquier método conocido por el experto en la técnica. Por ejemplo, un fragmento C-terminal de una sub-unidad de la proteína EF-1 a ensayar puede estar fijado sobre un soporte, tal como una superficie plástica. Una proteína retroviral p24 se pone después en contacto con el fragmento C-terminal, y su enlace con el fragmento se puede detectar después por medio de un anticuerpo antl-p24 luminiscente.

Un fragmento C-terminal de una sub-unidad de la proteína EF-1 conveniente para la invención comprende una secuencia de aminoácidos que varía de 150 a 250, incluso de 160 a 240, y preferentemente de 170 a 230 aminoácidos contiguos del extremo C-terminal de la sub-unidad, entendiéndose que los aminoácidos se descuentan a partir del último aminoácido de la secuencia de aminoácidos considerada. Un fragmento C-terminal puede comprender 150, 160, 170, 180, 190 0 200 aminoácidos contiguos del extremo C-terminal de una sub-unidad de la proteína EF-1.

Como se ha indicado anteriormente, es posible utilizar un fragmento C-terminal de una de las sub-unidades de la proteína EF-1. Preferentemente, se puede utilizar un fragmento C-terminal de la sub-unidad EF-1oc.

Así, puede ser conveniente para la invención un homólogo de un fragmento C-terminal de EF-1a representado por un fragmento C-terminal de la proteína procarlótlca de factor de elongación de la traducción EF-Tu.

Puede también ser conveniente para la Invención la proteína procariótico de factor de elongación de la traducción EF-Tu.

A título de ejemplo de proteínas EF-Tu convenientes para la invención, se pueden citar las proteínas EF-Tu Geobacillus stearothermophilus representadas por la secuencia 050306 (Swiss-Prot).

Pollproteína viral GAG

Según un modo de realización, EF-1 puede ser utilizado en una forma asociada a una poliproteína viral GAG, o un homólogo de ésta, presentando dicho homólogo de GAG al menos el 80% de homología con GAG y una actividad

biológica similar.

Tal utilización permite ventajosamente aumentar la sensibilidad de captura y de detección de la proteína retroviral p24 o de un homólogo de esta. Asimismo, tal utilización permite disminuir el ruido de fondo de los procedimientos de inmunocaptura.

La poliproteína viral GAG está expresada por los retrovirus, y en particular por los lentivirus. Esta proteína es escindida durante su maduración para dar la proteína de matriz p17, la proteína de cápside p24, la proteína de nucleocápside p7, y las proteínas p1, p2 y p6. Esta poliproteína está más particularmente descrita por Ganser- Pornillos et al. (Curr. Opin. Struct. Biol., 2008, 18:203).

Preferentemente, una poliproteína viral GAG conveniente para la invención puede ser de la misma especie o cepa de virus que la proteína p24, o el homólogo de ésta. Así, una poliproteína viral GAG conveniente para la invención se puede seleccionar entre las poliproteínas virales GAG de VIH, en particular del VIH-1 o del VIH-2, o del HTLV, en particular del HTLV-1 o HTLV-2. Más particularmente, puede estar representada por una secuencia de aminoácidos identificada por las referencias SwissProt P04591 o P18095, o un homólogo de estas.

Un homólogo de una poliproteína viral GAG conveniente para la invención presenta el grado de homología anteriormente definido y una actividad biológica similar. Una actividad biológica de una poliproteína GAG a considerar por la invención es, preferentemente, su capacidad para enlazarse, en condiciones apropiadas, a EF-1 y a una proteína p24, o a un homólogo de ésta. Un homólogo de una poliproteína viral GAG presenta al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98%, incluso al menos el 99% de homología con las secuencias indicadas anteriormente.

Según un modo de realización, EF-1 y la poliproteína viral GAG, o un homólogo de ésta, pueden ser utilizados según una relación ponderal GAG/EF-1, inferior o igual a 1, y preferentemente inferiora 1.

Proteína retroviral detectable

Una proteína retroviral detectable por medio de la invención es una proteína retroviral p24, o un homólogo de ésta.

La proteína retroviral p24 desempeña un papel principal en numeroso lentivirus, y más particularmente en el VIH-1 y los virus HTLV-1 y HTLV-2 (Human Y-Lymphotophiv Virus), constituyendo la cápside que contiene la información genética (ARN) del virus. Esta proteína está descrita en los documentos "p24 Antigen Capture Assay for Quantification of Human Immunodeficiency Virus Using Readily Available Inexpensive Reagents", Methods, agosto

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de 1997; 12(4): 288-293, y "Biochemical and Immunological Analysis of Human Immunodeficiency Virus GAG Gene Products p17 and p24", J. Virol., marzo de 1998; 62(3): 795-801.

A título de ejemplo de protéina retrovirales p24 detectables por la invención, se pueden citar las proteínas representadas por una secuencia de aminoácidos identificada por las referencias SwissProt P04591 o P18095, o un homólogo de estas.

A título de homóloqo de la proteína retroviral p24, se pueden considerar más particularmente la proteína retroviral p26 del VIH-2.

Una proteína retroviral p24, o un homólogo de ésta, detectable por medio de la invención se puede seleccionar entre las proteínas retrovirales p24 del VIH-1, del HTLV-1 o del HTLV-2 y p26 del VIH-2.

Un virus que comprende una proteína retroviral detectable por la invención se puede seleccionar entre el VIH de tipo 1 o de tipo 2, y los virus HTLV-1 y HTLV-2. Preferentemente, un virus que comprende una proteína retroviral detectable por la invención puede ser el VIH, en particular el VIH-1.

Procedimiento de detección

Un procedimiento de la invención para detectar la presunta presencia de una proteína retroviral p24, o de un homólogo de ésta, en una muestra biológica se basa en la formación de un complejo proteico entre EF-1 y una proteína retroviral p24, o el homólogo de ésta.

Así, un procedimiento de la invención para detectar, en una muestra biológica, la presunta presencia de una proteína retroviral p24, o de un homólogo de ésta, comprende al menos las etapas que consisten en:

a- poner en contacto dicha muestra con una cantidad eficaz de al menos una sub-unidad de una proteína factor de elongación de la traducción 1, EF-1, de un homólogo de EF-1, o de un fragmento C-terminal de estos, en condiciones apropiadas para la formación de al menos un complejo proteico entre la sub-unidad de EF-1, el homólogo de EF-1, o el fragmento C-terminal de estos, y al menos una proteína retroviral p24, o un homólogo de ésta.

b- poner en contacto el complejo proteico de la etapa a- con una entidad bl-funclonal, estando dicha entidad dotada de un grupo capaz de enlazarse específicamente a al menos una proteína retroviral p24, o a un homólogo de ésta, en dicho complejo, y de un grupo capaz de ser detectable, directa o indirectamente, mediante un modo de detección, siendo la puesta en contacto efectuada en condiciones apropiadas para el establecimiento de una unión entre dicha proteína retroviral y dicha entidad bi-funcional,

c- detectar dicha entidad bi-funcional, siendo la detección de dicha entidad bi-funcional enlazada indicadora de la presencia de la proteína retroviral p24, o del homólogo de ésta.

Ventajosamente, EF-1 puede estar inmovilizado sobre un soporte, tal como se describe a continuación.

La muestra biológica puede ser utilizada en bruto o preparada, por ejemplo por dilución, purificación o adición de diversos reactivos destinados, por ejemplo, a neutralizar unas actividades enzimáticas susceptibles de ser deletéreas para un procedimiento de la invención. La muestra biológica se lleva después al contacto con EF-1 (etapa a-), y se deja Incubar durante un tiempo suficiente para la formación del complejo proteico EF-1-proteína p24 (o un homólogo de ésta). Un tiempo de incubación conveniente para la invención puede variar de algunos minutos, por ejemplo 10, 20, 30 o 60 minutos, hasta algunas horas, por ejemplo 2, 3 o 4 horas.

Un procedimiento de la Invención puede prever una etapa adicional que consiste en eliminar el exceso de muestra biológica, por ejemplo por aclarado.

Después de la formación del complejo, una entidad bifuncional que lleva un primer grupo funcional que permite su enlace con la proteína p24 (o el homólogo de ésta) en el complejo proteico y un segundo grupo funcional que permite, directa o indirectamente, su detección, se lleva al contacto con el complejo proteico (etapa b-). El tiempo de incubación de la entidad bifuncional con el complejo proteico depende de la afinidad de la entidad frente a la proteína p24 (o un homólogo de ésta) y puede variar desde algunos minutos a algunas horas. Por ejemplo, el tiempo de incubación puede ser de 10, 20, 30 o 60 minutos, o de 2, 3 o 4 horas.

Un procedimiento de la invención puede comprender, preferentemente, al menos una etapa suplementaria después de la etapa b- y antes de la etapa c-, que consiste en eliminar la entidad bifuncional no enlazada a la proteína viral p24, o a un homólogo de ésta, en la etapa b-.

El complejo proteico EF-1/p24 (o un homólogo de ésta) que enlazó la entidad bifuncional se somete después a una etapa de detección conveniente para la detección del segundo grupo funcional (etapa c-). Esta se puede efectuar

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directamente, si el segundo grupo funcional es capaz por sí mismo de emitir una señal detectable, como una señal luminiscente, radioactiva o coloreada, o indirectamente si el segundo grupo debe ser puesto en contacto y/o a reaccionar con una o más entidad(es) adicionales, tales como unas enzimas, unos sustratos cromogénicos o luminiscentes, o unos anticuerpos en sí mismos marcados, para formar un conjunto capaz de emitir una señal detectable. El medio de detección utilizado está naturalmente adaptado a la naturaleza de la señal a detectar.

Inmovilización de EF-1 sobre un soporte

EF-1 puede ser inmovilizado sobre cualquier soporte habitualmente utilizado en el campo de la fijación y de la detección de las proteínas. Un soporte de la invención puede ser cualquier material sólido, elástico, flexible o rígido, sobre o en el que EF-1 puede ser enlazado, absorbido, o sintetizado in situ.

Un soporte conveniente para la invención puede ser de naturaleza orgánica o inorgánica, o también ser una combinación de material orgánico e inorgánico. Ventajosamente, un soporte de la invención puede estar constituido de un material de celulosa, de nitrocelulosa, de plástico, de vidrio, de cerámica, de sílice o de resina polimérica.

Tal soporte puede presentarse en cualquier forma adecuada para la invención. Por ejemplo, un soporte de la invención puede estar en forma de partículas, de geles, de hojas, de tubos, de esferas, por ejemplo huecas o microporosas, de capilares, de puntas, de películas de placas de pocilios, de tiras, o de columnas.

En particular, un soporte según la invención puede ser representado por una placa de pocilio, una bola de látex, una bola de vidrio, una bola de plástico, una tira de papel, un microtubo, una membrana de nitrocelulosa, una membrana de nylon, un chip de sílice, un chip recubierto de nanopartículas de oro o de nanopartículas imantadas, una lámina de vidrio, una superficie porosa, un sistema microfluídico o una nanopartícula imantada.

Preferentemente, un soporte conveniente para la invención puede ser una membrana de nitrocelulosa o cualquier superficie conveniente para la realización de un ensayo de tipo ELISA, tal como una placa de pocilios.

La inmovilización de EF-1 sobre un soporte puede efectuarse de manera directa mediante uno o más enlace(s) covalente(s) o por adsorción. El método de inmovilización de EF-1 al soporte se selecciona naturalmente de manera que no afecte a las propiedades de ésta para enlazarse a la proteína p24, o un homólogo de ésta y, llegado el caso, a su capacidad para enlazarse a una poliproteína viral GAG (o un homólogo de ésta). EF-1 puede ser inmovilizado sobre un soporte solo o previamente asociado a la poliproteína viral GAG (o a un homólogo de ésta).

Según un modo de realización preferido, la inmovilización se efectúa de manera directa por adsorción.

EF-1 puede también ser inmovilizado sobre un soporte por enlace covalente. Un enlace covalente puede resultar de la reacción de al menos uno de los aminoácidos de EF-1 que tienen una función reactiva con una función reactiva del soporte. Una función reactiva llevada por un aminoácido puede, por ejemplo, ser una función -SH, -OH o -COOH. Estas funciones pueden, por ejemplo, llevar a la formación de puentes disulfuro por reacción con una función tiol del soporte, o de función éster o amida por reacción respectivamente con una función ácida, alcohol, o aminada del soporte.

Las funciones reactivas pueden ser llevadas naturalmente por los aminoácidos y/o el soporte, o pueden haber sido introducidas en los aminoácidos y/o el soporte, mediante cualquier proceso de modificación conocido por el experto en la técnica.

Alternativamente, EF-1 puede ser inmovilizado sobre un soporte de manera indirecta, es decir por medio de un espaciador.

La selección de un espaciador para la realización de la invención se efectuará naturalmente a fin de no alterar la capacidad de EF-1 para enlazarse o a favorecer la captura de la proteína retroviral a detectar.

Según su naturaleza, un espaciador conveniente para la invención puede ser fijado a EF-1 por reacción química, por generación de una proteína de fusión EF-1-espaciador, o por afinidad. El espaciador puede ser fijado al soporte mediante cualquier tipo de interacciones o de enlaces apropiados.

Un espaciador puede ser una secuencia proteica, que puede preferentemente comprender de 1 a 200 aminoácidos, preferentemente de 6 a 100 aminoácidos, preferiblemente de 10 a 50 aminoácidos. En tal modo de realización, el enlace EF-1-espaciador se puede realizar por preparación de una proteína de fusión EF-1-espaciador o por un enlace de afinidad entre EF-1 y el espaciador.

Una proteína de fusión EF-1-espaciador se puede preparar por producción de una proteína recombinante por medio de cualquier herramienta de biología molecular conocida por el experto en la técnica. Una proteína de fusión conveniente para la invención puede ser una proteína EF-1 -polihistidina. El grupo polihistidina puede estar enlazado al soporte por medio de iones. Asimismo, puede ser conveniente para la invención una proteína de fusión EF-1 con

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la estreptavidina. Esta proteína de fusión puede ser inmovilizada sobre el soporte por interacción con la biotina, previamente fijada al soporte, por adsorción o enlace covalente.

De manera más preferida, un espaciador conveniente para la invención puede ser un anticuerpo específico de EF-1. El anticuerpo puede estar enlazado al soporte por adsorción. A título de ejemplo de anticuerpos capaces de enlazarse a EF-1 y que son convenientes como espaciador, se pueden citar los anticuerpos anti-EF-1a sc-68481 y sc-68482 (SANTA CRUZ).

Tal realización puede particularmente se conveniente para el desarrollo del ensayo en forma ELISA (Enzyme Lincked ImmunoSorbent Assay).

Entidad bifuncional

Una entidad bifuncional de la invención es capaz de enlazarse a al menos una proteína detectable por la invención en un complejo tal como el definido anteriormente.

Una entidad bifuncional conveniente puede ser preferentemente un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.

La entidad bifuncional puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal, de tipo IgG, IgA, IgM o IgE. Un anticuerpo conveniente para la invención se puede seleccionar entre unos anticuerpos de ratón, de rata, de conejo, de cabra, de caballo, de llama, de humano o de otro primate.

Puede también ser conveniente para la invención un fragmento de anticuerpo que tiene las propiedades de enlace definidas anteriormente. Por "fragmento de anticuerpo" se entiende designar una porción de un anticuerpo tal como Fab, Fab1, F(ab)2, F(ab')2, y de otros fragmentos similares. Estos términos incluyen también cualquier proteína sintética o genéticamente modificada que puede actuar como un anticuerpo enlazándose con una proteína detectable de la invención, en un complejo proteico tal como el definido anteriormente.

Un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo conveniente para la invención puede ser preparado mediante cualquier procedimiento conocido por el experto en la materia en el campo, como se describe, por ejemplo, en «Making and using antibodies: a practical handbook» (Floward & Kaser, Ed. CRC, 2006).

Un anticuerpo conveniente para la invención puede no ser específico de un virus dado, pero puede reconocer una familia de proteínas retrovirales p24 u homologas de ésta que pertenece a una familia de virus. Alternativamente, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo puede ser específico de una proteína detectable por la invención que pertenece a una especie de virus dado. Por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo puede ser específico de una proteína retroviral p24 de VIH, en particular del VIH-1.

Una entidad bifuncional conforme a la invención comprende un grupo capaz de conferirle la propiedad de ser detectable, directa o indirectamente, por un modo de detección. Un grupo detectable puede ser propicio a una detección luminiscente, colorimétrica, o radioactiva.

Un grupo detectable "directamente" es un grupo capaz de generar una señal, por ejemplo colorimétrica, luminiscente, en particular fluorescente, o radioactiva, susceptible de ser detectada directamente.

Un grupo luminiscente, y en particular fluorescente, conveniente para la invención puede ser cualquier marcador habitualmente utilizado en el campo, por ejemplo de la fluoresceína, el BODIPY, las sondas fluorescentes de tipo ALEXA, la cumarina y sus derivados, la ficoeritrina y sus derivados, o unas proteínas fluorescentes tales como la GFP o el DsRed.

Un grupo radioactivo conveniente para la invención puede ser, por ejemplo, 3H, 121l, 123l, el "mTc, el 14C o 32P.

Un grupo detectable "indirectamente" es un grupo que necesita la presencia de una o más entidad(es) adicionale(s), tales como unas enzimas, unos sustratos cromogénicos o luminiscentes, o unos anticuerpos en sí mismos marcados, para formar un conjunto capaz de emitir una señal detectable.

Un grupo detectable indirectamente puede ser una porción Fe desnuda o que lleva un marcador de afinidad, tal como un tag polihistidina, una biotina, o una estreptavidina, o que lleva una enzima, o un sustrato enzimático capaz de generar una señal por hidrólisis. La detección de este grupo se puede efectuar, respectivamente, mediante la utilización de un anticuerpo secundario que lleva un grupo detectable y capaz de reconocer la porción Fe o el marcador de afinidad, o por utilización, según el caso, de un grupo biotina o de un grupo estreptavidina que lleva un grupo detectable, o por utilización de un sustrato específico de la enzima y capaz de emitir una señal detectable por hidrólisis, o por utilización de una enzima específica del sustrato.

Según un modo de realización preferido, un procedimiento de la invención puede utilizar un anticuerpo anti-proteína retroviral que lleva un grupo funcional detectable directa o indirectamente, como se ha definido anteriormente.

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Ventajosamente, un procedimiento de la invención que comprende la utilización de una entidad bifuncional, que comprende un grupo funcional detectable indirectamente puede comprender la utilización de un anticuerpo que lleva un sustrato enzimático cromogénico o una enzima capaz de hidrolizar el sustrato enzimático cromogénico, o puede comprender la utilización de un par anticuerpo primario-anticuerpo secundario. El anticuerpo primario puede comprender una porción Fe desnuda o que lleva un marcador reconocido por el anticuerpo secundario. El anticuerpo secundario puede comprender un grupo detectable directamente tal como se ha definido anteriormente o puede comprender un sustrato enzimático cromogénico o una enzima capaz de hidrolizar el sustrato enzimático cromogénico.

Según un modo de realización particular, una enzima conveniente para la invención puede ser una fosfatasa alcalina, unatirosina, una peroxidasa, o una glucosidasa.

Depende de los conocimientos del experto en la materia determinar el sustrato cromogénico conveniente según la enzima considerada.

Cuando la enzima es una fosfatasa alcalina, un sustrato cromogénico conveniente para la invención puede entonces ser el BCIP/MBT (sal p-toluidina de 5-bromo-4-cloro-3'-indolilfosfato - cloruro de tetrazollo nltroazul).

Un grupo detectable conveniente para la invención puede ser fijado mediante cualquier método apropiado a nivel de la entidad bifuncional. Su localización sobre la entidad bifuncional se selecciona de manera que no afecta a la capacidad de ésta para enlazarse a una proteína retroviral p24 (o a un homólogo de ésta) en un complejo proteico de la Invención.

Modo de detección

El modo de detección de una entidad bi-funcional enlazada a un complejo de la Invención será naturalmente adaptado al grupo detectable utilizado.

Por "modo de detección" se entiende cualquier sistema capaz de detectar la emisión de una señal por una entidad bi-funcional de la Invención.

Así, un modo de detección de la invención puede utilizar, por ejemplo, un sistema de detección en colorimetría visible, tal como a simple vista, un sistema de detección por radioquímica o por medicina nuclear, tal como la gammagrafía, un sistema de detección por tratamiento de imágenes, por resonancia (IRM), por rayos X, por difusión de luz, por espectrometría de masas, por espectroscopia, por ejemplo por fluorescencia o por UV-visible, por ultrasonidos, por radioactividad, por refractometría, óptica, piezoeléctrica, acústica, por electroquímica, por conductividad, por pHmetría o también por vía biológica.

Según un modo de realización, un modo de detección más particularmente considerado por la invención se apoya en un sistema de detección en colorimetría visible, más particularmente a simple vista.

La detección puede llevarse a cabo de manera cuantitativa o cualitativa.

Una detección cualitativa puede llevar a la conclusión simplemente de la presencia o a la ausencia de la proteína retroviral buscada. Una detección cuantitativa puede permitir un ensayo de la proteína buscada en la muestra biológica ensayada.

La cuantificación de la señal obtenida puede efectuarse por comparación de su intensidad con la obtenida con una muestra control carente de la proteína retroviral buscada y, llegado el caso, con la obtenida con una muestra control que comprende la proteína retroviral buscada a una concentración conocida.

De manera preferida, es posible realizar una serie de muéstreos controles de concentraciones conocidas, y crecientes, de la proteína retroviral buscada a fin de establecer una curva de calibración frente a la cual se comparará la Intensidad de la señal medida en la muestra a ensayar. Los valores de referencia de la muestra control y de las muestras testigos pueden ser determinados simultáneamente a la medición de la muestra de ensayo o ser determinados anterior o posteriormente. Cuando los valores de referencia son determinados anteriormente, estos pueden ser almacenados en una base de datos y ser utilizados para una serie de mediciones de muestras de ensayo.

Kit

La presente invención se refiere también a un kit de detección de al menos una proteína retroviral p24, o un homólogo de ésta, que comprende:

- al menos un primer receptáculo que comprende al menos una sub-unidad de una proteína factor de elongación de

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la traducción 1, EF-1, un homólogo de EF-1, o un fragmento C-term¡nal de estos, y

- al menos un segundo receptáculo que comprende una entidad bi-funcional dotada de un grupo capaz de enlazarse específicamente a al menos dicha proteína retroviral p24, o a dicho homólogo de ésta, susceptible de estar presente en un complejo proteico formado con la sub-unidad de EF-1, el homólogo de EF-1, o el fragmento C-terminal de estos, y un grupo capaz de ser detectable, directa o indirectamente, por un modo de detección.

Según un modo de realización, un kit de la invención puede además comprender una poliproteína viral GAG o un homólogo de ésta.

La poliproteína viral GAG o el homólogo de esta puede estar dispuesta en un receptáculo suplementario o en el mismo receptáculo que el que comprende EF-1.

Un kit de la invención puede además comprender al menos un receptáculo que comprende una proteína p24, o un homólogo de ésta, en una cantidad o concentración conocida. Este modo de realización puede permitir la realización de un control positivo o de una curva de calibración en proteína p24 (u homólogo de ésta).

Un kit de la invención puede comprender además al menos una instrucción de utilización de EF-1, llegado el caso asociada a GAG (o a un homólogo de ésta), y de la entidad bifuncional para detectar la presunta presencia de una proteína retroviral p24 (o de un homólogo de ésta) en una muestra biológica.

EF-1, GAG, la entidad bifuncional, p24, y sus homólogos son ventajosamente tales como se han definido anteriormente.

Según un aspecto de la invención, EF-1 se puede utilizar como agente de captura de una proteína retroviral p24 o de uno de sus homólogos. Este aspecto de la invención puede ser utilizado con fines de purificación de una muestra biológica, o de enriquecimiento de una muestra en proteína p24.

En tal realización, la utilización de una entidad bifuncional tal como se ha definido anteriormente no es necesaria.

Después de la formación de un complejo proteico EF-1/p24 (u homólogo de ésta), se puede llevar a cabo una etapa de precipitación o de separación del complejo obtenido, mediante cualquier medio conocido por el experto en la técnica. El complejo se disocia después para recuperar la proteína retroviral. La etapa de disociación se puede efectuar mediante cualquier método conocido en el campo, tal como la utilización de un tampón salino adecuado.

Ventajosamente, este modo de realización se puede efectuar por utilización de una columna de cromatografía funcionalizada mediante EF-1.

En la descripción anterior, la expresión "comprendido entre" o "que va de" debe entenderse con los límites incluidos. Los ejemplos siguientes se dan únicamente a título ilustrativo de la invención.

Leyendas de las figuras

Figura 1: ilustra las variaciones de la intensidad de la señal colorimétrica, en % de la señal máxima obtenida por hidrólisis del sustrato BCIP-NBT por la fosfatasa alcalina del anticuerpo secundario fijado al anticuerpo primario de ratón anti-proteína retroviral p24 enlazado al complejo EF-1a/proteína p24, en función de la concentración de ésta. La curva continua representa la transformación logarítmica de los resultados.

Figura 2: ilustra las variaciones de la intensidad de la señal colorimétrica, en % de la señal máxima resultante de la hidrólisis del sustrato BCIP-NBT por la fosfatasa alcalina del anticuerpo secundario fijado al anticuerpo primario de ratón anti-p24 fijado al complejo EF-1a/GAG/p24 en función de la concentración en proteína p24. EF-1a y GAG son utilizadas, respectivamente, a razón de 100 ng/pl y 50 ng/pl. La curva continua representa la transformación logarítmica de los resultados obtenidos.

Figuras 3 y 4: ilustran la variación de la intensidad de la señal colorimétrica en porcentaje de la señal máxima obtenida durante el experimento, que resulta de la hidrólisis de BCIP-NBT por la fosfatasa alcalina de un anticuerpo secundario fijado al anticuerpo primario de ratón anti-p24, él mismo fijado al complejo EF-1ot/GAG/p24 en función de la concentración en proteína retroviral p24 y en función de la concentración en poliproteína viral GAG utilizada a razón de 25 ng/pl /figura 3) y 100 ng/pl (figura 4). La concentración en EF-1 a utilizada es constante, a 100 ng/pl.

Figura 5: ilustra la variación de la señal colorimétrica, en porcentaje de la señal máxima obtenida, por hidrólisis de los sustratos BCIP-NBT por la fosfatasa alcalina del anticuerpo secundario fijado al anticuerpo primario anti-p24 él mismo fijado al complejo EF-1a/GAG/p24 en función de la concentración en proteína p24 y de la naturaleza del anticuerpo primario utilizado. EF-1 a y GAG son utilizadas, respectivamente, a razón de 100 ng/pl y 50 ng/pl. Los

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anticuerpos primarios de ratones utilizados son, respectivamente sc-69 728 (rombo), sc-65 462 (cuadrado), sc-57 827 (triángulo) y sc-73 300 (cruz), todos de SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY. El anticuerpo secundario es un anticuerpo de cabra anti-anticuerpo de ratón marcado con alcalina fosfatasa diluida (SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY SC.-2008)

Figuras 7 y 8: ¡lustran la variación de la Intensidad de la señal colorimétrica, en porcentaje de la señal máxima, después de la hidrólisis del sustrato BCIP-NBT por la fosfatasa alcalina del anticuerpo secundarlo fijado al anticuerpo primarlo antlo-p24, el mismo fijado al complejo EF-1a/GAG/p24 en función de la concentración en proteína p24, y según la naturaleza, por un lado, del anticuerpo primario y, por otro lado, del anticuerpo secundarlo. Los anticuerpos primarlos de ratones utilizados son, respectivamente, sc-69728 (rombo), sc-65462 (cuadrado), sc-57 827 (triángulo), sc-73300 (cruz), todos de SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY. Los anticuerpos secundarlos de cabra anti-ratón ensayados son respectivamente S3721 de PROMEGA (Figura 7) y sc-15065 de SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY (Figura 8).

Ejemplos

Ejemplo 1

Interacción entre una sub-unidad EF-1a y una proteína retrovlral p24

La sub-unidad EF-1a de la proteína EF-1 humana es adsorbida en la superficie de una membrana de nitrocelulosa por depósito de 1 pl de una solución que comprende 100 ng/pl de proteína EF-1a humana (PROSPEC referencia PRO-773). Los depósitos, o puntos, se efectúan en línea sobre la membrana y espaciados cada uno por aproximadamente 1 cm.

La membrana se deja secar, y los sitios de enlace no específicos de la membrana son saturados por incubación durante 1 hora en una solución de saturación (5% de leche desnatada en Tris Buffer Saline-2,5 % Tween 20 (TBS- T), vendido por la compañía Sigma-Aldrich), a temperatura ambiente.

Unas muestras (1 pl) de plasma o de suero humano que comprende cada una una concentración dada de proteína retrovlral p24 (FITZGERALD INDUSTRIES) de, respectivamente, 0,75 pg/ml, 1,35 pg/ml, 3 pg/ml, 27 pg/ml, 58 pg/ml, 60 pg/ml, 89 pg/ml, 93 pg/ml, 121 pg/ml, 352 pg/ml, y 400 pg/ml son depositadas sobre la membrana de nitrocelulosa. Cada muestra se deposita en un punto diferente.

La membrana se aclara después y se pone a incubar en una solución de anticuerpo primario de ratón anti-p24 VIH-I diluida al 1/50a (SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, SC.-69728).

La membrana se aclara en TBS-T y después se pone a incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente en una solución de anticuerpo secundario de cabra anti-anticuerpo de ratón marcado al alcalina fosfatasa diluida al 1/25003 (SANTACRUZ BIOTECHNOLOGY SC.-2008).

La membrana se aclara de nuevo en una solución de TBS-T, después en una solución de TBS (Tris Buffer Saline).

La membrana se deja después incubar en una solución de BCIP/NBT (sal p-toluidina de 5-bromo-4-cloro-3'- indolilfosfato - cloruro de tetrazolio nitroazul) (Sigma-Aldrich) hasta la aparición de la coloración aproximadamente en 5 a 15 minutos.

Finalmente, la membrana se aclara con agua destilada y después se lee la intensidad de la coloración de los diferentes puntos cualitativamente a simple vista.

Los resultados son expresados en porcentaje de intensidad con respecto a la señal máxima obtenida en el experimento. Un valor que corresponde al 50% de la señal máxima es considerado como que indica positivamente la presencia de la proteína viral p24.

Los resultados obtenidos presentados en la figura 1 muestran, por un lado, que la sub-unidad EF-1a de la proteína EF-1, y la proteína retroviral p24 interactúan la una con la otra. El complejo formado puede ser detectado con una buena sensibilidad, a muy bajas concentraciones en proteína retroviral p24 (50% de la señal máxima de aproximadamente 3 pg/ml). Esta buena sensibilidad de detección permite ventajosamente diagnosticar de manera precoz una infección en un individuo por un virus que expresa una proteína retroviral de tipo p24 tal como el VIH-1 (o p26 n el VIH-2).

Ejemplo 2

Interacción entre una sub-unidad EF-1a/poliproteína GAG y una proteína retroviral p24

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El protocolo implementado en este ejemplo es similar al del ejemplo 1, con la diferencia que comprende una etapa suplementaria de depósito sobre los puntos de EF-1a de una solución de poliproteína viral GAG (50 ng/pl; Mllllpoe).

Los anticuerpos primarios y secundarios utilizados son los mismos que los del ejemplo 1 y se utilizan a la misma concentración.

La revelación de la señal colorimétrica se realiza también como se indica en el ejemplo 1.

Los resultados, presentados en la figura 2, muestran que la formación de un complejo sub-unidad EF-1a/pol¡proteína GAG favorece el enlace de la proteína p24, que permite un aumento significativo de la sensibilidad de la detección de esta proteína.

En efecto, el 50% de la señal máxima se obtiene esa vez a partir de 1,10 pg/ml de proteína retrovlral p24.

Tal concentración es representativa de una fase muy precoz de infección por un virus, que generalmente no es detectable por otros ensayos de diagnóstico actualmente disponibles, en particular estos se apoyan en la detección de la p24, y son potencialmente más precoces que los basados en la detección de la presencia de ADN o de ARN viral.

Ejemplo 3

Efecto de la relación sub-unidad EF-1a/poliproteína viral GAG sobre la detección de una proteína retroviral p24.

El procedimiento utilizado es similar al del ejemplo 2.

La proteína GAG se ensayó a la concentración, respectivamente, de 25 ng/pl (figura 3) y 100 ng/pl (figura 4), conservando al mismo tiempo constante la concentración en sub-unidad EF-1a (100 ng/pl). Como lo muestra la comparación de las figuras 2 (GAG 50 ng/pl), 3 (GAG 25 ng/pl) y 4 (GAG 100 ng/pl) una relación ponderal GAG/EF- 1a inferior a 1 lleva al mejor resultado, y permite la detección de la proteína retroviral p24 a muy bajas concentraciones.

Sin embargo, para una relación ponderal GAG/EF-1a igual a 1, la sensibilidad de detección está reducida (límite del 50% de la señal colorimétrica alcanzada para las concentraciones superiores a 121 pg/ml). Sin embargo, este límite de detección sigue siendo conveniente para la realización de un ensayo de diagnóstico.

Ejemplo 4

Efecto de la variación de la naturaleza del anticuerpo primario sobre la detección de una proteína retroviral p24 mediante el complejo sub-unidad EF-1a/poliproteína viral GAG.

El procedimiento utilizado es similar al del ejemplo 1.

Los anticuerpos ensayados son unos anticuerpos monoclonales de ratones anti-proteína p24 del VIH-1, sc-69728, sc-65462, sc-57827, sc-73300 (SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY). Las concentraciones utilizadas son las del ejemplo 1. El anticuerpo secundario es también el del ejemplo 1.

Los resultados ¡lustrados por la figura 5 muestran una excelente reproducibilidad de la detección y del límite de detección de la proteína p24, sea cual sea la naturaleza del anticuerpo primario utilizado sc-69728 (rombo), sc- 65162 (cuadrado), sc-57 827 (triángulo), o sc-73300 (cruz). Estos resultados revelan la fiabilidad del ensayo de diagnóstico de la invención.

Ejemplo 5

Efecto de la variación de la naturaleza del anticuerpo secundario sobre la detección de una proteína retrovlral p24 mediante el complejo EF-1a/pol¡proteína viral GAG

El procedimiento utilizado es similar al de los ejemplos 1 y 4.

Los anticuerpos primarios de ratones utilizados son, respectivamente, sc-69728 (rombo), sc-65462 (cuadrado), sc- 57827 (triángulo) y sc-73300 (cruz), todos de SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY.

Se utilizaron dos anticuerpos secundarios de cabra, acoplados a la fosfatasa alcalina, anti-antlcuerpos de ratones, a saber S 3721 (PROMEGA; Figura 6) y sc-15065 (SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY; Figura 7). Estos anticuerpos se utilizaron como se ha indicado en los ejemplos anteriores, a saber diluidos al 1 /2500a.

La comparación de las figuras 7 y 8 muestran que la naturaleza del anticuerpo secundario no afecta sustancialmente a la detección de la proteína p24, ni al límite de detección, realizado mediante diferentes anticuerpos primarios anteriormente ensayados.

5 Estos resultados demuestran también la fiabilidad y la reproducibilidad del ensayo de detección de la proteína retroviral p24, así como de sus homólogos tal como la proteína retroviral p26 del VIH-2.

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   REIVINDICACIONES

   1.Utilización, in vitro o ex vivo, de al menos una sub-unidad a de una proteína Factor de Elongación de la traducción

   1. EF-1, de un homólogo de EF-1, presentando dicho homólogo de EF-1 al menos el 80% de homología con EF-1 y una actividad biológica similar, o de un fragmento C-terminal de estos que comprende una secuencia de aminoácidos que varía de 150 a 250 aminoácidos contiguos del extremo C-terminal de la sub-unidad o de su homólogo, como agente de detección de una proteína retroviral p24, o de un homólogo de ésta, presentando dicho homólogo de p24 al menos el 80% de homología con p24 y una actividad biológica similar.
2. 2. Utilización según la reivindicación anterior, en la que la sub-unidad de EF-1, el homólogo de EF-1, o el fragmento C-terminal de estos, tales como se definen en la reivindicación 1, se utiliza en forma asociada a una poliproteína viral GAG, o a un homólogo de ésta, presentando dicho homólogo de GAG al menos el 80% de homología con GAG y una actividad biológica similar.
3. 3. Utilización según la reivindicación 1 o 2, en la que EF-1 es una proteína EF-1 humana.
4. 4. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la proteína retroviral p24, o un homólogo de esta tal como se define en la reivindicación 1, se selecciona entre las proteínas retrovirales p24 del VIH-1, del HTLV-1 o del HTLV-2 y p26 del VIH-2.
5. 5. Procedimiento, in vitro o ex vivo, para detectar la presunta presencia de una proteína retroviral p24, o de un homólogo de esta, presentando dicho homólogo de p24 al menos el 80% de homología con p24 y una actividad biológica similar, en una muestra biológica, comprendiendo dicho procedimiento al menos las etapas que consisten en:

   a- poner en contacto dicha muestra con una cantidad eficaz de al menos una sub-unidad a de una proteína factor de elongación de la traducción 1, EF-1, de un homólogo de EF-1, presentando dicho homólogo de EF-1 al menos el 80% de homología con EF-1 y una actividad biológica similar o de un fragmento C-terminal de estos que comprende una secuencia de aminoácidos que varía de 150 a 250 aminoácidos contiguos del extremo C-terminal de la sub- unidad o de su homólogo, en condiciones apropiadas a la formación de al menos un complejo proteico entre la sub- unidad de EF-1, el homólogo de EF-1, o el fragmento C-terminal de estos, y al menos una proteína retroviral p24 o el homólogo de ésta,

   b- poner en contacto el complejo proteico de la etapa a- con una entidad bi-funcional, estando dicha entidad dotada de un grupo capaz de enlazarse específicamente al menos a una proteína retroviral p24, o al homólogo de ésta, en dicho complejo, y de un grupo capaz de ser detectable, directa o indirectamente, por un modo de detección, siendo la puesta en contacto efectuada en condiciones apropiadas para el establecimiento de un enlace entre dicha proteína retroviral y dicha entidad bi-funcional,

   c- detectar dicha entidad bi-funcional, siendo la detección de dicha entidad bi-funcional enlazada indicadora de la presencia de la proteína retroviral p24, o del homólogo de ésta.
6. 6. Procedimiento según la reivindicación anterior, que comprende al menos una etapa suplementaria, después de la etapa b- y antes de la etapa c-, consistiendo dicha etapa suplementaria en eliminar la entidad bi-funcional no enlazada a la proteína viral p24, o al homólogo de ésta tal como se define en la reivindicación 5, en la etapa b-.
7. 7. Procedimiento según la reivindicación anterior, en el que la sub-unidad de EF-1, el homólogo de EF-1, o el fragmento C-terminal de estos, tales como se definen en la reivindicación 5, se inmoviliza en un soporte orgánico o

   inorgánico.
8. 8. Procedimiento según la reivindicación anterior, en el que el soporte está constituido de un material de celulosa, de nitrocelulosa, de plástico, de vidrio, de cerámica, de sílice, o de resina polimérica.
9. 9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en el que dicha entidad bi-funcional es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.
10. 10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en el que dicho grupo detectable es un grupo propicio para una detección luminiscente, colorimétrica, o radioactiva.
11. 11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en el que la sub-unidad de EF-1, el homólogo de EF-1, tal como se ha definido en la reivindicación 5, o el fragmento C-terminal de estos, tal como se define en la reivindicación 5, se utiliza en forma asociada a una poliproteína viral GAG, o a un homólogo de ésta, presentando dicho homólogo de GAG al menos el 80% de homología con GAG y una actividad biológica similar.
12. 12. Kit de detección de al menos una proteína retroviral p24, o un homólogo de ésta, presentando dicho homólogo de p24 al menos el 80% de homología con p24 y una actividad biológica similar, que comprende:

    - al menos un primer receptáculo que comprende al menos una sub-unldad a de una proteína factor de elongación de la traducción 1, EF-1, un homólogo de EF-1, presentando dicho homólogo de EF-1 al menos el 80% de homología con EF-1 y una actividad biológica similar, o un fragmento C-terminal de estos que comprende una

    5 secuencia de aminoácidos que varía de 150 a 250 aminoácidos contiguos del extremo C-termlnal de la sub-unldad o de su homólogo, y

    - al menos un segundo receptáculo que comprende una entidad bi-funcional dotada de un grupo capaz de enlazarse específicamente a al menos dicha proteína retroviral p24, o dicho homólogo de ésta, susceptible de estar presente

    10 en un complejo proteico formado con la sub-unidad de EF-1, el homólogo de EF-1, o el fragmento C-termlnal de estos, y un grupo capaz de ser detectable, directa o indirectamente, por un modo de detección.
13. 13. Kit según la reivindicación anterior, que comprende además una poliptoreína viral GAG o un homólogo de esta, presentando dicho homólogo de GAG al menos el 80% de homología con GAG y una actividad biológica similar.

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