WO2010142829A1 - Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico diferencial de la enfermedad de chagas, y para evaluar la respuesta al tratamiento - Google Patents

Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico diferencial de la enfermedad de chagas, y para evaluar la respuesta al tratamiento Download PDF

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WO2010142829A1 PCT/ES2010/070376 ES2010070376W WO2010142829A1 WO 2010142829 A1 WO2010142829 A1 WO 2010142829A1 ES 2010070376 W ES2010070376 W ES 2010070376W WO 2010142829 A1 WO2010142829 A1 WO 2010142829A1
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chagas disease
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Manuel Carlos LÓPEZ LÓPEZ
M. Carmen Thomas Carazo
Ana FERNÁNDEZ VILLEGAS
Concepción MARAÑÓN LIZANA
Manuel SEGOVIA HERNÁNDEZ
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Fundacion para la Formacion e Investigacion Sanitarias de la Region de Murcia
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Fundacion para la Formacion e Investigacion Sanitarias de la Region de Murcia
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease

Definitions

  • the present invention is within the medicine, molecular biology, immunology and parasitology, and refers to a method of obtaining useful data for the diagnosis of Chagas disease, as well as to evaluate the response to the treatment of said disease, which allows the establishment of a specific individual (qualitative and quantitative) recognition pattern, which is different depending on the state of the disease and is modified post-treatment, allowing the establishment of groups of patients, as well as early diagnosis in cases of vertical transmission.
  • Chagas disease (Chagas-Mazza disease, Chagas disease or American trypanosomiasis), is a tropical parasitic disease mainly from Central and South America, usually chronic, and whose etiologic agent is the Trypanosoma cruzi protozoan. It is estimated to result in about 21,000 deaths each year (WHO, 2002, 2005), with approximately 50,000-200,000 new cases diagnosed per year (Tarleton RL, 2007. PLoS Med 4 (12): e332). Although the disease has traditionally been confined to Latin America, it is currently expanding as a result of migratory processes, so it has been necessary to implement diagnostic tests in blood banks and health centers in those countries with high immigrant population rate from endemic areas.
  • T. cruzi is a flagellated protozoan, belonging to the Kinetoplastid Order, being the only one of the trypanosomes that presents an obligatory phase of intracellular multiplication in the vertebrate host.
  • the parasite transmitted to the vertebrate host in the feces of the vector insect is called at this stage metacyclic trypomastigote, which is visible in the blood as a fusiform trypomastigote, in the form of "C" or "S” 20 ⁇ m long by 1 ⁇ m wide, and has no replicative capacity.
  • the scourge is shortened and transformed into a round amastigote of 2 to 5 ⁇ m in diameter and with a very short or non-existent external scourge, it multiplies by means of binary fission forming "clusters" or “nests” that accumulate in the host cell until it breaks.
  • the parasites released from the cell become blood trypomastigotes, which are released into the circulating blood, are of a total size that varies between 15 and 20 ⁇ m, have a free flagellum, a bulky, terminal or underground cinetoplast, and an oval nucleus. These trypomastigotes can infect other cells to repeat the cycle, but they are not able to multiply in the blood since the only replicative form in the vertebrate is the intracellular amastigote form.
  • Invertebrate hosts acquire the parasite by feeding on man or infected domestic or wild animals.
  • the trypomastigotes migrate to the midgut of the insect where they become epimastigotes, wide flagellates, very mobile, with the kinetoplast between the nucleus and the free scourge. There they divide a large number of times, leaving the insect infected for life.
  • the epimastigotes become metacyclic trypomastigotes and migrate to the posterior intestine from where they are excreted with feces at the time of the bite.
  • the disease presents two severe states: the acute phase, shortly after the infection, invisible in most cases, which causes death in approximately 10% of the individuals, and the chronic phase that can develop even after more than ten years, and is characterized by the appearance of cardiomegaly, electrocardiographic abnormalities, arrhythmias (chronic Chagas with cardiac involvement), aperistalsis, megaesophagus and megacolon (Chronic Chagas with digestive involvement), and can cause death.
  • Chagas disease is routinely diagnosed by various commercial serological methods, using ELISA, indirect immunofluorescence, or hemagglutination techniques, in which complete or semi-purified protein extracts of the epimastigote forms of the Trypanosoma cruzi parasite are used, or mixtures of recombinant proteins or synthetic peptides corresponding to antigens or antigen fragments of the parasite (Umezawa et al., 1996. J. Clin Microbiol. 34: 2143-2147; da Silveira et al., 2001. Trend Parasite !. 17: 286-291) .
  • Other serological diagnostic methods developed are the so-called ID-PaGIA-Chagas (Rabello et al., 1999.
  • the serological diagnostic systems allow obtaining high titres in sera of chronic patients, but they are not very useful to evaluate the evolution of the patients under treatment, since the titres persist stably for a long time.
  • the treatment induces the decrease of the concentration of some antibodies due to the decrease of the parasitic load but, at the same time, the destruction of the parasite leads to the exposure to the immune system of components resulting from the parasitic destruction, with the consequent induction of antibodies with other specificities.
  • These two conjugated effects increase in the titer of some antibodies and decrease in others
  • T cruzi is 2-10% (Torrico et al., 2004. Am J Trop Med Hyg 70: 201-209) however, early diagnosis is complicated in the absence of a clear clinic, given that all children of mothers With positive serology they are also seropositive at birth due to a phenomenon of passive transmission. Increasing or the clear non-decrease in titres in consecutive months may indicate transmission, but it is often necessary to wait at least two years to confirm the diagnosis, probably due to the compensated increase and decrease effect of the different antibodies similar to exposed above.
  • the differential diagnosis that distinguishes the stage of the disease, as well as monitoring the course of the disease is still essential to eliminate or minimize the pathological processes that cause negative and even lethal effects in the patients, as well as early diagnosis in the case of vertical transmission.
  • the only two medications available for the treatment of Chagas disease are Nifurtimox, developed in 1960 by Bayer, and Benznidazole, developed in 1974 by Roche.
  • Nifurtimox developed in 1960 by Bayer
  • Benznidazole developed in 1974 by Roche.
  • the therapeutic advantage of these drugs in the chronic phases of the disease remains controversial, and in addition, both have high rates of undesirable effects. Therefore, it is also necessary to evaluate the evolution of the patients under treatment.
  • the present invention provides a method of obtaining useful data for the diagnosis of Chagas disease, as well as for evaluating the response to the treatment of said disease, allowing the establishment of groups of patients, as well as early diagnosis in cases of vertical transmission. .
  • a first aspect of the invention refers to a method of obtaining useful data for the diagnosis and monitoring of Chagas disease, hereinafter the first method of the invention, comprising: a) obtaining an isolated biological sample of an individual, and b) detect the amount of antibodies against at least two of the antigens that are selected from the list comprising KMP11, HSP70, PFR2 and / or TGP63, in the biological sample isolated from (a).
  • Fig. 1 these antigens can be visualized by electrophoretic analysis in polyacrylamide gels in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE).
  • the first method of the invention further comprises: c) comparing the amounts obtained in step (b) with a reference amount.
  • step (b) comprises detecting the amount of antibodies against at least three of the antigens that are selected from the list comprising KMP11, HSP70, PFR2 and / or TGP63, in The biological sample isolated from (a).
  • step (b) comprises detecting the amount of the antibodies against the KMP11, HSP70, PFR2 and TGP63 antigens, in the biological sample isolated from (a).
  • steps (b) and / or (c) of the methods described above can be totally or partially automated, for example, by means of a robotic sensor device for the detection of the amount in step (b) or the computerized comparison in step (c).
  • diagnosis to the ability to discriminate between individuals infected or not by the parasite T. cruzi. It also refers, but not limited to, the ability to discriminate between samples from patients who have different states of Chagas disease: the acute phase, shortly after infection, the undetermined phase and the chronic phase.
  • other subclassifications could be established within this principal, thus facilitating the choice and establishment of suitable therapeutic regimens.
  • This discrimination as understood by an expert in the field, is not intended to be correct in 100% of the samples analyzed. However, it requires that a statistically significant amount of the analyzed samples be classified correctly.
  • the amount that is significantly statistical can be established by an expert in the field through the use of different statistical tools, for example, but not limited, through the determination of confidence intervals, determination of the p-value, Student's test or discriminant functions of Fisher
  • the confidence intervals are at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 98% or at least 99%.
  • the value of p is less than 0.1, 0.05, 0.01, 0.005 or 0.0001.
  • the present invention makes it possible to correctly detect the disease differentially by at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90% of the subjects of a certain group or population analyzed.
  • an "isolated biological sample” includes, but is not limited to, cells, tissues and / or biological fluids of an organism, obtained by any method known to a person skilled in the art.
  • the isolated biological sample is a biological fluid, such as, but not limited to, blood, plasma or blood serum. More preferably, the biological fluid is blood serum.
  • the detection of antibodies against the KMP11, HSP70, PFR2 and TGP63 antigens in an isolated biological sample of an individual is indicative of has been or continues to be parasitized by T. cruzi.
  • the individual is less than two years old. In another particular embodiment, the individual is a newborn.
  • the organisms of the species Trypanosoma cruzi belong to the Superukine Eukaryota, Order Kinetoplastida, Family Trypanosomatidae, Genus Trypanosoma and subgenus Schizotrypanum.
  • An antigen or immunogen is a substance capable of producing an adaptive immune system response through lymphocyte activation.
  • the antigens are usually proteins or polysaccharides. Lipids and nucleic acids are antigenic only when combined with proteins and polysaccharides.
  • the KMP11 antigen or "kinetoplastid membrane protein 11KDa”, is an exclusive protein of kinetoplastids, and is expressed in all stages of the parasite's life cycle. It is associated with both membrane and cytoskeleton and flagellar cavity (Thomas et al., 2000. DNA. CeII Biol 19: 47-57) and has a high immunogenic capacity (Thomas et al., 2001. Clin Exp Immunol 123: 465 -471) and immunoprotective (Planelles et al., 2001. Infec ⁇ Immun 69: 6558-6563). Its amino acid sequence is found with access number in GenBank (NCBI) CAA03901; and / or in SEQ ID NO: 1).
  • KMP11 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the protein collected in SEQ ID NO: 1, and which would comprise various variants from: a) acid molecules nucleic encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, b) nucleic acid molecules whose complementary chain hybrid with the polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / b) due to the degeneracy of the genetic code, d) nucleic acid molecules that encode a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with the SEQ ID NO: 1, and in which the Polypeptide encoded by said nucleic acids has the activity and structural characteristics of the KMP11 protein.
  • HSP70 antigen or "Heat shock protein 70KDa”
  • Heat shock protein 70KDa is a highly conserved protein in all species throughout the evolution. A strong humoral response has been found against protein peptides
  • HSP70 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the protein collected in SEQ ID NO: 2, and which would comprise various variants from: a) acid molecules nucleic encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, b) nucleic acid molecules whose complementary chain hybrid with the polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / b) due to the degeneracy of the genetic code, d) nucleic acid molecules that encode a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 2, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids has the activity and structural characteristics of the HSP70 protein.
  • the PFR2 antigen or "paraflagellar rod protein” is a protein highly conserved in trypanosomatids that is located exclusively in the scourge of the parasite. It has also been shown that in experimental infection (murine model) CD8 + T lymphocytes are generated against this protein, (Wrightsman et al., 2002. Parasite Immunol 24: 401-412), and that immunization with DNA vaccines encoding PFR2 is protective (Morell et al., 2006. Vaccine 24: 7046-7055).
  • PFR2 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the protein found with access number in GenBank (NCBI) AAA30221 and / or in SEQ ID NO : 3, and which would comprise various variants from: a) nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, b) nucleic acid molecules whose hybrid complementary chain with
  • nucleic acid molecules that encode a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 3, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids has the activity and structural characteristics of the protein PFR2.
  • the TGP63 protein is a fragment of the GP63 protein or "leishmanolysin", described in Leishmania infantum. This fragment participates in the union of the parasite with the macrophage (Olivier et al., 2005. Clin Microbio! Rev 18: 293-305). The recognition of said protein by sera of cutaneous leishmaniasis patients has been described (Jensen et al., 1996. Am J Trop Med Hyg 55: 490-495). Its amino acid sequence is found in SEQ ID NO: 4)
  • TGP63 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the protein collected in SEQ ID NO: 4, and which would comprise various variants from: a) molecules of nucleic acid encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, b) nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code, d) nucleic acid molecules that encode a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 4, and in which the polypeptide encoded by said acids Nucleic has the activity and structural characteristics of the TGP63 protein.
  • the detection of the antibodies against the KMP11, HSP70, PFR2 and / or TGP63 antigens can be carried out by any means known in the state of the art.
  • the authors of the present invention have shown that the detection of the quantity or concentration of these antibodies semi-quantitatively or quantitatively allows differentiating between the different stages of the disease. In this way, a differential diagnosis can be established in individuals affected by Chagas disease, which allows them to subclassify them.
  • the measurement of the amount or concentration can be carried out directly or indirectly.
  • the direct measurement refers to the measurement of the amount or concentration of the antibodies, based on a signal that is obtained directly from the antibodies, and that is directly correlated with the number of antibody molecules present in the sample.
  • Said signal - to which we can also refer to as an intensity signal - can be obtained, for example, by measuring an intensity value of a chemical or physical property of said antibodies.
  • the indirect measurement includes the measurement obtained from a secondary component or a biological measurement system (for example, the measurement of cellular responses, ligands, "labels" or enzymatic reaction products).
  • Quantity refers to, but is not limited to, the absolute or relative quantity of the antibodies, as well as any other value or parameter related to them or that may be derived from them.
  • Said values or parameters comprise intensity values of the signal obtained from any of the physical or chemical properties of the antibodies obtained by direct measurement. Additionally, said values or parameters include all those obtained by indirect measurement, for example, any of the measurement systems described elsewhere in this document.
  • the term "comparison”, as used in the description, refers but is not limited to the comparison of the amount of antibodies against the KMP11, HSP70, PFR2 and / or TGP63 antigens of the biological sample to be analyzed, Also called a biological problem sample, with an amount of antibodies against the KMP11, HSP70, PFR2 and / or TGP63 antigens of one or several desirable reference samples described elsewhere in this description.
  • the reference sample can be analyzed, for example, simultaneously or consecutively, together with the problem biological sample.
  • the comparison described in section (c) of the method of the present invention can be performed manually or assisted by a computer.
  • reference amount refers to the absolute or relative amount of antibodies against the KMP11, HSP70, PFR2 and / or TGP63 antigens that allows discriminating a certain stage of the disease of Chagas from other stadiums.
  • Suitable reference amounts can be determined by the method of the present invention from a reference sample that can be analyzed, for example, simultaneously or consecutively, together with the problem biological sample.
  • the reference sample may be the negative controls, that is, the amounts detected by the method of the invention in samples of individuals that have not been parasitized by T. cruzi.
  • the reference amount would be the amount of anti-HSP70, anti-PFR2 and / or anti-TGP63 antibodies detected in patients with undetermined Chagas disease.
  • the reference amount could be, but not limited to, the amount of these antibodies (anti-KMP11, anti-HSP70, anti-PFR2 and / or anti-TGP63 ) detected in a biological sample of the same individual obtained previously.
  • the reference amount can also be obtained, but not limited to, from the values detected in the mother, particularly in the case of diagnosis or follow-up of individuals under two years of age.
  • the sample or reference samples can be, for example, obtained from the serum of a patient with Chagas disease in a certain clinical phase.
  • the reference amount is obtained from a reference sample.
  • the reference amount can also be obtained, for example, from the limits of normal distribution of an amount found in samples obtained from a population of patients with Chagas disease in different phases, by means of well-known statistical techniques.
  • antibody refers to immunoglobulin molecules and immunologically active portions of immunoglobulin molecules, that is, molecules that contain an antigen binding site that specifically binds (immunoreacts) with proteins.
  • (antigens) KMP11, HSP70, PFR2 or TGP63 There are five isotypes or major classes of immunoglobulins: IgM, IgD, IgG, IgA and IgE.
  • Antibodies that recognize the KMP11, HSP70, PFR2 and TGP63 antigens or certain fragments thereof are described in the examples herein.
  • the antibodies that recognize the proteins KMP11, HSP70, PFR2 and TGP63 can be used to carry out the methods of the present invention, for example, but not limited, by immunoblot, ELISA or immunhistochemistry.
  • the immunoassay is an enzyme-linked immunosorbent assay or ELISA.
  • antibody against the KMP11 antigen refers to an antibody capable of reacting with the KMP11 protein, with a variant of the KMP11 protein or with a fragment thereof, as long as said variant or said fragment is functionally equivalent.
  • antibody against the KMP11 antigen refers to an immunoglobulin G (IgG).
  • antibody against the HSP70 antigen refers to an antibody capable of reacting with the HSP70 protein, with a variant of the HSP70 protein or with a fragment thereof, as long as said variant or said fragment is functionally equivalent.
  • antibody against HSP70 antigen refers to an immunoglobulin G (IgG).
  • antibody against the PFR2 antigen refers to an antibody capable of reacting with the PFR2 protein, with a variant of the PFR2 protein or with a fragment thereof, as long as said variant or said fragment is functionally equivalent.
  • autoantibody against the PFR2 antigen refers to an immunoglobulin G
  • antibody against the TGP63 antigen refers to an antibody capable of reacting with the TGP63 protein, with a variant of the TGP63 protein or with a fragment thereof, as long as said variant or said fragment is functionally equivalent.
  • autoantibody against TGP63 antigen refers to an immunoglobulin G
  • variant refers to a protein substantially homologous to any of the KMP11, HSP70, PFR2 and TGP63 proteins. In general, a variant includes additions, deletions or amino acid substitutions. The term “variant” also includes proteins resulting from posttranslational modifications such as, but not limited to, glycosylation, phosphorylation or methylation.
  • a protein is "substantially homologous" to any of the KMP11, HSP70, PFR2 and TGP63 proteins, when its amino acid sequence has a good alignment with the amino acid sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 respectively; that is, when its amino acid sequence has a degree of identity with respect to the amino acid sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 respectively of at least 50 %, typically at least 80%, advantageously at least 85%, preferably at least 90%, more preferably at least 95%, and, even more preferably, at less, 99%.
  • the sequences homologous to any of the KMP11, HSP70, PFR2 and TGP63 proteins can be easily identified by one skilled in the art, for example, with the help of an appropriate computer program to compare sequences.
  • the detection of the amount of the antibodies against at least two, preferably three, and even more preferably the four antigens KMP11, HSP70, PFR2 and TGP63 is carried out by means of an immunoassay.
  • immunoassay refers to any analytical technique that is based on the reaction of the conjugation of an antibody with an antigen. Examples of immunoassays known in the state of the art are, for example, but not limited to: immunoblot, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), linear immunoassay (LIA), radioimmunoassay (RIA), immunofluorescence, x-map or protein chips .
  • the immunoassay is an enzyme-linked immunosorbent assay or ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).
  • ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
  • the ELISA is based on the premise that an immunoreactive (antigen or antibody) can be immobilized on a solid support, then putting that system in contact with a fluid phase containing the complementary reagent that can bind to a marker compound.
  • ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay.
  • the ELISA is an indirect ELISA, and more preferably comprises the following steps:
  • step (a) coating a solid support with at least two, preferably three, and more preferably the four KMP11, HSP70, PFR2 and / or TGP63 antigens, a variant of the KMP11, HSP70, PFR2 and / or TGP63 proteins or a fragment of the themselves; (b) incubating the coated support of step (a) with a biological sample obtained from the subject under conditions that allow the formation of an immunocomplex of the antibodies against at least two, preferably three, and more preferably the four KMP11, HSP70 antigens , PFR2 and / or TGP63 present in the sample, with at least two, preferably three, and more preferably the four KMP11 antigens,
  • the individual from whom he obtains the biological sample isolated from step (a) is less than two years of age. In another more preferred embodiment, the individual from whom the biological sample is obtained isolated from step (a) is a newborn or infant and the mother is HIV positive.
  • marker compound refers to a compound capable of giving rise to a chromogenic, fluorogenic, radioactive and / or chemiluminescent signal that allows the detection and quantification of the amount of antibodies against to the KMP11, HSP70, PFR2 and / or TGP63 antigens.
  • the marker compound is selected from the list comprising radioisotopes, enzymes, fluorophores or any molecule capable of being conjugated with another molecule or detected and / or quantified directly. This marker compound can bind to the antibody directly, or through another compound.
  • directly binding marker compounds are, but are not limited to, enzymes such as alkaline phosphatase or peroxidase, radioactive isotopes such as 32 P or 35 S, fluorochromes such as fluorescein or metal particles, for direct detection by colorimetry, auto-radiography. , fluorimetry, or metallography respectively.
  • enzymes such as alkaline phosphatase or peroxidase
  • radioactive isotopes such as 32 P or 35 S
  • fluorochromes such as fluorescein or metal particles
  • another aspect of the invention relates to a method of diagnosis of Chagas disease, hereafter referred to as the second method of the invention, which comprises steps (a) - (c) of the first method of the invention, and It also includes assigning the individual according to step (a) to the group of individuals with Chagas disease, when it presents an amount of antibodies against the KMP11, HSP70, PFR2 and / or TGP63 antigens detected in step (b) greater and statistically significant to the reference amount of (c), the reference amount being one or more negative controls .
  • the detection of the amount of antibodies against at least two, preferably three, and more preferably the four KMP11, HSP70, PFR2 and / or TGP63 antigens is carried out by means of an immunoassay.
  • the immunoassay is an enzyme-linked immunosorbent assay or ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), and in another even more preferred embodiment, the ELISA is an indirect ELISA.
  • Another aspect of the invention refers to a method of differential diagnosis of Chagas disease, hereinafter the third method of the invention, comprising steps (a)
  • step (c) also includes assigning an individual according to step (a) to the group of individuals with undetermined Chagas disease or with cardiac or digestive pathology, when presenting an amount of antibodies against the KMP11, HSP70 and / or antigens PFR2 detected in step (b) greater and statistically significant compared to a reference amount, the reference amount being one or several negative controls.
  • the third method of the invention also comprises assigning an individual according to step (a) to the group of individuals with chronic digestive Chagas disease when presenting a amount of antibodies against the TGP63 antigen detected in step (b) greater and statistically significant compared to a reference amount, when the reference amount is one or more negative controls.
  • the third method of the invention also comprises assigning an individual according to step (a) to the group of individuals with advanced chronic cardiac Chagas disease when presenting a quantity of antibodies against HSP70 antigens, PFR2 and / or TGP63 detected in step (b) minor and statistically significant compared to a reference amount, the reference amount being the amount detected of these antibodies in patients with undetermined Chagas (Table I).
  • the current chemotherapy is very effective in the early stages of the infection, because it prevents the parasite from entering tissues and gives rise to its chronicity.
  • the occurrence of adverse effects correlates negatively with the age of the patient. That is why, currently, the children of seropositive mothers against Chagas disease are parasitological and serological diagnosis at birth. If the parasitological test is positive (which is very rare because the rate of parasites that pass through the placenta is low), there is no major problem because it is treated immediately.
  • the serological being more sensitive does not normally allow differentiating between antibodies from the mother or those generated by the child.
  • the clinical protocol establishes keeping the child under surveillance for 24 months, carrying out continuous parasitological and serological tests to detect the parasite or a strong seroconversion that indicates its presence.
  • the method of the present invention allows to analyze the antibody pattern of the mother versus that of the post-birth child and at short time of the latter and to identify if the antibodies present in the child are from the mother or generated by the son by the presence of the parasite. This analysis will allow significantly the beginning of treatment and, therefore, favor non-tissue infection by parasites and thus prevent the establishment of the disease. Therefore, in an even more preferred embodiment of this aspect of the invention, the mother of the individual from whom the biological sample isolated from step (a) is obtained is seropositive against Chagas.
  • another aspect of the invention relates to a method of monitoring the evolution of Chagas disease in chagasic individuals, henceforth the fourth method of the invention, which comprises: a) taking an isolated biological sample from an individual , b) detect the amount of antibodies against at least two, preferably three, and more preferably the four antigens KMP11, HSP70, PFR2 and / or TGP63, present in the biological sample isolated from (a), c) compare the amounts obtained in step (b) with a reference amount, and d) repeat at least twice the sequence of steps (a) - (c) in samples obtained from the same individual according to step (a), not simultaneously.
  • the fourth method of the invention also comprises assigning an individual according to step (a) to the group of individuals with undetermined Chagas disease, when the amount of antibodies against the TGP63 antigen, detected in the step (b), decreases after treatment (Fig. 5A).
  • the fourth method of the invention also comprises assigning an individual according to step (a) to the group of individuals with chronic cardiac Chagas disease, when the amount of antibodies against HSP70 and / or antigens PFR2, detected in step (b), decreases after treatment (Fig. 5B).
  • the fourth method of the invention also comprises assigning an individual according to step (a) to the group of individuals with advanced chronic cardiac Chagas disease, when the amount of antibodies against the TGP63 antigen, detected in step (b) increases after treatment (Fig. 5C).
  • the fourth method of the invention also comprises assigning an individual according to step (a), which is in the acute phase, to the group of individuals with therapeutic failure when the amount of antibodies against the antigens KMP11 and HSP70 does not decrease after treatment (Fig. 6).
  • the detection of the amount of antibodies against at least two, preferably three, and more preferably the four KMP11, HSP70, PFR2 and / or TGP63 antigens is carried out by means of an immunoassay.
  • the immunoassay is an assay. Enzyme-linked immunosorbent or ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), and in another even more preferred embodiment, the ELISA is an indirect ELISA.
  • the individual from whom he obtains the biological sample isolated from step (a) is less than two years of age.
  • the individual from whom the biological sample is obtained isolated from step (a) is a newborn or infant and the mother is HIV positive for Chagas.
  • kits or devices comprising the elements necessary to analyze the amount of antibodies against at least two, preferably three, and more preferably the four antigens in the sample obtained in step (a) . More preferably it comprises the means necessary to compare the amount detected in step (b) with a reference amount.
  • the kit of the present invention comprises the elements necessary to carry out any of the methods of the present invention.
  • Said kit may contain all those reagents necessary to analyze the amount of antibodies against at least two, preferably three, and more preferably the four KMP11, HSP70, PFR2 and TGP63 antigens, by means of any of the methods described hereinbefore. as, for example, but not limited to the KMP11, HSP70, PFR2 and TGP63 proteins, a variant or a fragment thereof, antibodies capable of specifically recognizing antibodies against the KMP11, HSP70, PFR2 and / or antigens TGP63, or positive and / or negative controls.
  • the kit can also include, without any limitation, buffers, agents to prevent contamination, inhibitors of protein degradation, etc.
  • the kit can include all the supports and containers necessary for commissioning and optimization.
  • the kit also includes the instructions for carrying out any of the methods of the invention.
  • polynucleotide and “nucleic acid” are used interchangeably herein, referring to polymeric forms of nucleotides of any length, both ribonucleotides (RNA or RNA) and deoxyribonucleotides (DNA or DNA).
  • amino acid sequence refers to a polymeric form of amino acids of any length, which may be coding or non-coding, Chemically or biochemically modified.
  • Fig. 1 Visualization of purified antigens.
  • the recombinant proteins KMP11 (lane 1), HSP70 (lane 2), TGP63 (lane 3), PFR2 (lane 4), as well as the STcA protein extract (lane 5) were visualized by SDS-PAGE in a 12% stained gel with comassie blue.
  • Fig. 2 Recognition of the different antigens by sera of chagasic patients.
  • the levels of specific IgG antibodies of the different antigens were analyzed by means of the ELISA technique as described in Materials and Methods.
  • Fig. 3 Recognition of antigens by chagasic patients in different phases of the disease. Serums from 22 healthy donors (C-), 15 indeterminate patients (Ind), 15 patients with cardiac pathology (Card) and 8 patients with digestive pathology (Dig) were tested, prior to the start of treatment, as in the previous figure. P values are indicated when differences between groups are considered statistically significant (if p ⁇ 0.1).
  • Fig. 4 Dynamics of antigen recognition in chagasic patients treated with benznidazole.
  • the antibody level of 28 sera of chagasic patients against different parasitic antigens was measured before the start of treatment (OT), 3 months (T1), 6 months (12), and 9 months (T3) post-treatment. Means and standard deviations are represented. P values are indicated when differences between groups are considered statistically significant (if p ⁇ 0.1).
  • Fig. 5 Dynamics of recognition of antigens in chagasic patients in different phases of the disease. The dynamics of recognition of the different antigens were measured as before, using sera from (A) 15 patients in an undetermined phase, (B) 11 patients with cardiac pathology, (C) 3 patients with advanced cardiac pathology and (D) 6 negative controls . P values are indicated when differences between groups are considered statistically significant (if p ⁇ 0.1).
  • Fig. 6 Effect of benznidazole or Nifurtimox treatment in pediatric patients in acute phase.
  • Fig. 7 Antigen recognition pattern in chagasic patients under treatment. Patients grouped according to their clinical classification are represented. For each chagasic serum, the variation in time (T1, T2, T3) of the D. O. relative to the value obtained in TO (start of treatment), compared to each of the antigens, was studied. For the calculation of the recognition ratio, the standard deviations of each measure were taken into account.
  • Fig. 8 Antigen recognition pattern in a neonate and his HIV-positive mother for Chagas.
  • the recognition dynamics of the KMP11, HSP70, PFR2 and TGP63 antigens were measured as previously using sera from a baby born to a seropositive mother for Chagas in a period of time between birth (cord), and the start of treatment with benznidazole a at 16 months, as well as 3 months after the start of treatment.
  • the results are compared with the serology of his mother, from pregnancy (five months of gestation), to one year after delivery.
  • KMP11 proteins (Thomas et al., 2000. DNA CeII BIoI 19: 47-57), HSP70 (Maranon et al., 2000. Int Immunol 12: 1685-1693), and PFR2 (Morell et al., 2006. Vaccine 24: 7046-7055) were purified following the protocols already published.
  • the TGP63 fragment of Leishmania infantum was cloned into plasmid pQE30 and overexpressed in E. coli strain M 15 with 0.1 mM isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) 1.5 hours at 37 0 C.
  • T. cruzi antigens mixtures of amastigotes and trypomastigotes (1: 1) obtained after infection of LLC-MK2 cell monolayers were used.
  • the parasites were washed with 1x PBS, and the pellet was resuspended in NET-2 (50 mM Tris HCI, pH 7.4, 50 mM NaCI, 0.05% Nonidet P-40, 1 ⁇ g / ml leupeptin, 1 mM PMSF ). After sonication, it was centrifuged 20 minutes at 10,000 rpm and 4 0 C and the supernatant was collected. The different fractions were checked in denaturing gels SDS-page at 12 % (Fig 1). The purity of the recombinant proteins was always greater than 90%.
  • the different antigens were grouped in homogeneous batches, which were aliquoted at -2O 0 C until use.
  • the levels of specific IgG antibodies against the different proteins used were determined in chagasic sera and normal sera following the protocols described in (Thomas et al., 2001. Clin Exp Immunol 123: 465-471). The sera were tested in triplicate and in two dilutions. The corresponding positive and negative controls were included in each test, and those tests in which the optical densities of the controls were more than 20% different from the expected values were discarded. The analysis was performed with sera diluted 1/1600 for HSP70, PRF2 and TGP63, 1/3200 for KMP11 and 1/12800 for STcA.
  • the SPSS 15.0 program was used. Statistically significant differences between different groups of patients were analyzed using the non-parametric Mann-Withney test. The analysis of the post-treatment longitudinal differences was performed with the non-parametric Wilcoxon method. The differences were considered statistically significant if the confidence interval was at least 90% (p ⁇ 0.1)
  • HSP70 and KMP11 proteins were analyzed. The samples were obtained in a period less than one month after Ia infection. The effect of treatment with benznidazole or nifurtimox was evaluated 70 days after the end of treatment. The results obtained show a significant decrease in the level of antibodies against the KMP11 antigen (Fig 6A). Interestingly, the only patient in which no decrease was observed, but on the contrary, increase in the recognition of KMP11 (patient 868) presented a new acute episode of Chagas, with the presence of blood parasites, evidencing a clear therapeutic failure. The recognition of the HSP70 protein also showed a tendency to decrease.

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Abstract

Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas, así como para evaluar la respuesta al tratamiento de dicha enfermedad, que permite el establecimiento de un patrón individual de reconocimiento (cuali- y cuantitativo) específico, que es diferente dependiendo del estado de la enfermedad y se ve modificado post-tratamiento, permitiendo el establecimiento de grupos de pacientes, así como el diagnóstico precoz en casos de transmisión vertical. Kit que comprende los medios necesarios para llevar a cabo los métodos de la invención.

Description

MÉTODO DE OBTENCIÓN DE DATOS ÚTILES PARA EL DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS, Y PARA EVALUAR LA RESPUESTA AL TRATAMIENTO.
La presente invención se encuentra dentro de Ia medicina, Ia biología molecular, Ia inmunología y Ia parasitología, y se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de Ia enfermedad de Chagas, así como para evaluar Ia respuesta al tratamiento de dicha enfermedad, que permite el establecimiento de un patrón individual de reconocimiento (cuali- y cuantitativo) específico, que es diferente dependiendo del estado de Ia enfermedad y se ve modificado post-tratamiento, permitiendo el establecimiento de grupos de pacientes, así como el diagnóstico precoz en casos de transmisión vertical.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La enfermedad de Chagas (enfermedad de Chagas-Mazza, mal de Chagas o tripanosomiasis americana), es una enfermedad parasitaria tropical principalmente del Centro y Sudamérica, generalmente crónica, y cuyo agente etiológico es el protozoo Trypanosoma cruzi. Se estima que da lugar a unas 21 ,000 muertes cada año (WHO, 2002, 2005), con aproximadamente 50,000- 200,000 nuevos casos diagnosticados por año (Tarleton RL, 2007. PLoS Med 4(12): e332). Aunque tradicionalmente Ia enfermedad se ha visto confinada a Ia América Latina, actualmente se encuentra en expansión como consecuencia de los procesos migratorios, por Io que ha sido necesario Ia implantación de pruebas diagnosticas en bancos de sangre y centros de salud en aquellos países con una alta tasa de población inmigrante proveniente de zonas endémicas. Así, Ia incidencia de Ia enfermedad en dicha población inmigrante es del 16 por 1000 en Australia, 9 por 1000 en Canadá, 25 por 1000 en España y 8 a 50 por 1000 en USA. (Schmunis GA et al, 2007. Mem Inst Oswaldo Cruz. 102 Suppl 1 :75-85). T. cruzi es un protozoo flagelado, perteneciente al Orden Kinetoplástida, siendo el único de los tripanosomas que presenta una fase obligada de multiplicación intracelular en el hospedador vertebrado. El parásito transmitido al hospedador vertebrado en las heces del insecto vector es llamado en esta etapa tripomastigote metacíclico, que es visible en Ia sangre como un tripomastigote fusiforme, en forma de "C" o de "S" de 20 μm de largo por 1 μm de anchura, y no tiene capacidad replicativa. Cuando el parásito infecta las fibras del músculo cardiaco estriado, fagocitos, células del músculo liso, etc .se acorta el flagelo y se transforma en un amastigote redondo de 2 a 5 μm de diámetro y con un flagelo externo muy corto o inexistente, este se multiplica por medio de fisión binaria formando "racimos" o "nidos" que se acumulan en Ia célula huésped hasta que esta se rompe. Los parásitos liberados de Ia célula se convierten en tripomastigotes sanguíneos, que son liberados a Ia sangre circulante, son de un tamaño total que varía entre 15 y 20 μm, tienen flagelo libre, un cinetoplasto voluminoso, terminal o subterminal, y un núcleo oval. Estos tripomastigotes pueden infectar otras células para repetir el ciclo, pero no son capaces de multiplicarse en Ia sangre ya que Ia única forma replicativa en el vertebrado es Ia forma amastigote intracelular.
Los hospedadores invertebrados adquieren el parásito al alimentarse del hombre o de los animales domésticos o silvestres infectados. Los tripomastigotes migran al intestino medio del insecto donde se transforman en epimastigotes, flagelados anchos, muy móviles, con el cinetoplasto entre el núcleo y el flagelo libre. Allí se dividen un gran número de veces, quedando el insecto infectado de por vida. Los epimastigotes, se transforman en tripomastigotes metacíclicos y migran al intestino posterior de donde son excretados con las heces en el momento de Ia picadura.
En el caso de Ia infección causada por Trypanosoma cruzi en el hombre, Ia enfermedad presenta dos estados severos: Ia fase aguda, poco después de Ia infección, inaparente en Ia mayoría de los casos, que ocasiona Ia muerte en aproximadamente el 10% de los individuos, y Ia fase crónica que puede desarrollarse incluso pasados más de diez años, y se caracteriza por Ia aparición de cardiomegalia, anormalidades electrocardiográficas, arritmias (Chagas crónico con afectación cardiaca), aperistalsis, megaesófago y megacolon (Chagas crónico con afectación digestiva), pudiendo llegar a causar Ia muerte. La mayoría de los casos agudos se resuelven en un periodo de dos a tres meses dando lugar a una fase crónica asintomática ahora llamada fase indeterminada, Ia cual se caracteriza por Ia persistencia de Ia infección sin presentar problemas clínicos aparentes, compromete cerca del 40% de los casos serológicamente positivos, y-deriva en un alto porcentaje en una fase crónica sintomática varios años más tarde.
La enfermedad de Chagas es diagnosticada de forma rutinaria mediante diversos métodos serológicos comerciales, empleado las técnicas de ELISA, Inmunofluorescencia indirecta, o hemaglutinación, en los cuales se utilizan extractos completos o semipurificados de proteínas de las formas epimastigotes del parásito Trypanosoma cruzi, o mezclas de proteínas recombinates o péptidos sintéticos correspondientes a antígenos o fragmentos antigénicos del parásito (Umezawa et al., 1996. J. Clin Microbiol. 34:2143-2147; da Silveira et al., 2001. Trend Parásito!. 17:286-291 ). Otros métodos de diagnóstico serológico desarrollados son el denominado ID-PaGIA-Chagas (Rabello et al., 1999. Mem Inst Oswaldo Cruz 94(1 ): 77-82) basado en una reacción de aglutinación en gel usando tres péptidos sintéticos derivados de sendos antígenos de T. cruzi, o el llamado INNO-LIA (Saez-Alquezar et al., 2000. J. Clin Microbiol. 38:851-854), basado en Ia reactividad frente a siete proteínas recombinantes fijadas sobre un soporte de nylon. El kit inmunocromátográfico Stat-Pack utiliza seis proteínas recombinantes y presenta altos niveles de sensibilidad y especificidad (Ponce et al., 2005. J Clin Microbiol 43(10): 5065-5068). Estos métodos han sido especialmente propuestos para Ia obtención de resultados rápidos de seropositividad en screening de bancos de sangre, emergencias médicas, y en casos de transplante de órganos. Sin embargo, sólo permiten obtener un resultado cualitativo (positivo/negativo) y, por tanto, son de baja utilidad para evaluar Ia evolución del paciente chagásico. Recientemente, se ha evaluado Ia eficacia de nueve diferentes sistemas de diagnóstico serológico de Ia enfermedad de Chagas, siete de ellos comerciales (Caballero et al., 2007. Clinical and Vaccine Immunology. 14(8): 1045-1049), mostrando porcentajes de sensibilidad y especificidad que van desde el 75% al 100%, usando como referencia un ensayo de Western blot con antígenos secretores - excretores de formas tripomastigotes de T. cruzi.
En general, los sistemas de diagnóstico serológico permiten obtener títulos elevados en sueros de pacientes crónicos, pero resultan poco útiles para evaluar Ia evolución de los pacientes bajo tratamiento, ya que los títulos persisten de forma estable durante mucho tiempo. Probablemente, el tratamiento induce Ia disminución de Ia concentración de algunos anticuerpos debido a Ia disminución de Ia carga parasitaria pero, al mismo tiempo, Ia destrucción del parásito conduce a Ia exposición al sistema inmune de componentes resultantes de Ia destrucción parasitaria, con Ia consiguiente inducción de anticuerpos con otras especificidades. Estos dos efectos conjugados (aumento del título de algunos anticuerpos y disminución de otros) dan lugar a una aparente estabilidad del título medido frente a usados totales o combinaciones de antígenos. Por tanto, estos kits comerciales no permiten detectar Ia dinámica de respuesta después del tratamiento y, por tanto, reconocer los fallos terapéuticos.
Se han detectado varios casos de Chagas congénito, en los que el parásito se transmitió in útero desde una madre con serología positiva para Chagas fuera de zona endémica (Muñoz et al., 2007. Trans R Soc Trop Med Hyg 101 : 1161-
1162; Flores-Chavez et al., 2008. Cases J 1 : 302; Muñoz et al., 2009. Acta
Trópica 111 : 51-55). Según diversos estudios, Ia tasa de transmisión vertical de
T cruzi es de un 2-10% (Torrico et al., 2004. Am J Trop Med Hyg 70: 201-209) sin embargo, el diagnóstico precoz es complicado en ausencia de una clínica clara, dado que todos los hijos de madres con serología positiva son también seropositivos al nacimiento por un fenómeno de transmisión pasiva. El aumento o la no disminución clara de los títulos en los meses consecutivos puede ser indicio de transmisión, pero a menudo es necesario esperar un al menos dos años para poder confirmar el diagnóstico, probablemente debido al efecto de aumento y disminución compensados de los distintos anticuerpos similar al expuesto anteriormente.
Por tanto, sigue siendo fundamental el diagnóstico diferencial que permita distinguir en qué fase se encuentra Ia enfermedad, así como el seguimiento del transcurso de Ia misma, para eliminar o reducir al mínimo los procesos patológicos que causan efectos negativos, e incluso letales, en los pacientes, así como el diagnóstico precoz en el caso de transmisión vertical. Los dos únicos medicamentos disponibles para el tratamiento de Ia enfermedad de Chagas son el Nifurtimox, desarrollado en 1960 por Bayer, y el Benznidazol, desarrollado en 1974 por Roche. La ventaja terapéutica de estos fármacos en las fases crónicas de Ia enfermedad sigue siendo objeto de controversia, y además, ambos presentan altas tasas de efectos indeseables. Por tanto, también es necesario evaluar Ia evolución de los pacientes bajo tratamiento.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de Ia enfermedad de Chagas, así como para evaluar Ia respuesta al tratamiento de dicha enfermedad, permitiendo el establecimiento de grupos de pacientes, así como el diagnóstico precoz en casos de transmisión vertical.
Por tanto, un primer aspecto de Ia invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico y seguimiento de Ia enfermedad de Chagas, de ahora en adelante primer método de Ia invención, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y b) detectar Ia cantidad de anticuerpos frente a, al menos, dos de los antígenos que se seleccionan de Ia lista que comprende KMP11 , HSP70, PFR2 y/o TGP63, en Ia muestra biológica aislada de (a).
En Ia Fig.1 pueden visualizarse estos antígenos mediante análisis electroforético en geles de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE).
En una realización preferida, el primer método de Ia invención comprende además: c) comparar las cantidades obtenidas en el paso (b) con una cantidad de referencia.
En otra realización preferida de este aspecto de Ia invención el paso (b) comprende detectar Ia cantidad de anticuerpos frente a, al menos, tres de los antígenos que se seleccionan de Ia lista que comprende KMP11 , HSP70, PFR2 y/o TGP63, en Ia muestra biológica aislada de (a). En otra realización más preferida de este aspecto de Ia invención el paso (b) comprende detectar Ia cantidad de los anticuerpos frente a los antígenos KMP11 , HSP70, PFR2 y TGP63, en Ia muestra biológica aislada de (a).
Los pasos (b) y/o (c) de los métodos descritos anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para Ia detección de Ia cantidad en el paso (b) o Ia comparación computerizada en el paso (c).
El término "diagnóstico", tal y como se utiliza en Ia presente invención, a Ia capacidad de discriminar entre individuos infectados o no por el parásito T. cruzi. También se refiere, pero sin limitarnos, a Ia capacidad de discriminar entre muestras procedentes de pacientes que presentan diferentes estados de Ia enfermedad de Chagas: Ia fase aguda, poco después de Ia infección, Ia fase indeterminada y Ia fase crónica. A su vez, atendiendo al primer método de Ia presente invención, se podrían establecer otras subclasificaciones dentro de esta principal, facilitando, por tanto, Ia elección y el establecimiento de regímenes terapéuticos adecuados. Esta discriminación tal y como es entendida por un experto en Ia materia no pretende ser correcta en un 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras analizadas sean clasificadas correctamente. La cantidad que es significativamente estadística puede ser establecida por un experto en Ia materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante Ia determinación de intervalos de confianza, determinación del valor p, test de Student o funciones discriminantes de Fisher. Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el valor de p es menor de 0,1 , de 0,05, de 0,01 , de 0,005 o de 0,0001. Preferiblemente, Ia presente invención permite detectar correctamente Ia enfermedad de forma diferencial en al menos el 60%, en al menos el 70%, en al menos el 80%, o en al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizada.
Una "muestra biológica aislada" incluye, pero sin limitarnos a, células, tejidos y/o fluidos biológicos de un organismo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en Ia materia. Preferiblemente, Ia muestra biológica aislada es un fluido biológico, como por ejemplo, pero sin limitarse, sangre, plasma o suero sanguíneo. Más preferiblemente, el fluido biológico es el suero sanguíneo. La detección de anticuerpos frente a los antígenos KMP11 , HSP70, PFR2 y TGP63 en una muestra biológica aislada de un individuo es indicativa de ha estado o continúa parasitado por T. cruzi. El término "individuo", tal y como se utiliza en Ia descripción, se refiere a animales, preferiblemente mamíferos, y más preferiblemente, humanos. El término "individuo" no pretende ser limitativo en ningún aspecto, pudiendo ser éste de cualquier edad, sexo y condición física. En una realización particular de Ia invención el individuo tiene menos de dos años de edad. En otra realización particular, el individuo es un neonato. Los organismos de Ia especie Trypanosoma cruzi pertenecen al Superreino Eukaryota, Orden Kinetoplastida, Familia Trypanosomatidae, Género Trypanosoma y subgénero Schizotrypanum.
Un antígeno o inmunógeno es una sustancia capaz de producir una respuesta del sistema inmune adaptativo mediante Ia activación de linfocitos. Los antígenos son usualmente proteínas o polisacáridos. Los lípidos y ácidos nucleicos son antigénicos únicamente cuando se combinan con proteínas y polisacáridos.
El antígeno KMP11 , o "kinetoplastid membrane protein 11KDa", es una proteína exclusiva de kinetoplástidos, y se expresa en todos los estadios del ciclo de vida del parásito. Se encuentra asociada tanto a membrana como al citoesqueleto y cavidad flagelar (Thomas et al., 2000. DNA. CeII Biol 19: 47-57) y tiene una alta capacidad inmunogénica (Thomas et al., 2001. Clin Exp Immunol 123: 465-471 ) e inmunoprotectora (Planelles et al., 2001. Infecí Immun 69: 6558-6563). Su secuencia aminoacídica se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI) CAA03901 ; y/o en Ia SEQ ID NO: 1 ).
En el contexto de Ia presente invención, KMP11 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye Ia secuencia codificante de Ia proteína recogida en Ia SEQ ID NO: 1 , y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende Ia secuencia aminoacídica de Ia SEQ ID NO: 1 , b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con Ia secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende Ia secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con Ia SEQ ID NO: 1 , y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee Ia actividad y las características estructurales de Ia proteína KMP11.
El antígeno HSP70, o "Heat shock protein 70KDa", es una proteína altamente conservada en todas las especies a Io largo de toda Ia evolución. Se ha encontrado una fuerte respuesta humoral frente a péptidos de Ia proteína
HSP70, en pacientes chagásicos crónicos (Requena et al., 1993. Mol Immunol
30: 1115-1121 ), que sin embargo no da lugar a un reconocimiento cruzado de
Ia proteína homologa humana (Engman et al., 1989. Mol Biochem Parásito! 37: 285-287). Su secuencia aminoacídica se encuentra en Ia SEQ ID NO: 2)
En el contexto de Ia presente invención, HSP70 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye Ia secuencia codificante de Ia proteína recogida en Ia SEQ ID NO: 2, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende Ia secuencia aminoacídica de Ia SEQ ID NO: 2, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con Ia secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende Ia secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con Ia SEQ ID NO: 2, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee Ia actividad y las características estructurales de Ia proteína HSP70.
El antígeno PFR2, o "paraflagellar rod protein", es una proteína muy conservada en tripanosomátidos que se localiza exclusivamente en el flagelo del parásito. Además se ha comprobado que en infección experimental (modelo murino) se generan linfocitos T CD8+ frente a esta proteína, (Wrightsman et al., 2002. Parasite Immunol 24: 401-412), y que Ia inmunización con vacunas ADN codificando PFR2 es protectiva (Morell et al., 2006. Vaccine 24: 7046-7055).
En el contexto de Ia presente invención, PFR2 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye Ia secuencia codificante de Ia proteína que se encuentra con número de acceso en el GenBank (NCBI) AAA30221 y/o en Ia SEQ ID NO: 3, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende Ia secuencia aminoacídica de Ia SEQ ID NO: 3, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con
Ia secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende Ia secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con Ia SEQ ID NO: 3, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee Ia actividad y las características estructurales de Ia proteína PFR2.
La proteína TGP63 es un fragmento de Ia proteína GP63 o "leishmanolysin", descrita en Leishmania infantum. Este fragmento participa en Ia unión del parásito con el macrófago (Olivier et al., 2005. Clin Microbio! Rev 18: 293- 305). Se ha descrito el reconocimiento de dicha proteína por sueros de pacientes de leishmaniasis cutánea (Jensen et al., 1996. Am J Trop Med Hyg 55: 490-495). Su secuencia aminoacídica se encuentra en Ia SEQ ID NO: 4)
.En el contexto de Ia presente invención, TGP63 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye Ia secuencia codificante de Ia proteína recogida en Ia SEQ ID NO: 4, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende Ia secuencia aminoacídica de Ia SEQ ID NO: 4, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con Ia secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende Ia secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con Ia SEQ ID NO: 4, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee Ia actividad y las características estructurales de Ia proteína TGP63.
La detección de los anticuerpos frente a los antígenos KMP11 , HSP70, PFR2 y/o TGP63 puede realizarse por cualquier medio conocido en el estado de Ia técnica. Los autores de Ia presente invención han demostrado que Ia detección de Ia cantidad o Ia concentración de estos anticuerpos de manera semi- cuantitativa o cuantitativa permiten diferenciar entre los diferentes estadios de Ia enfermedad. De esta manera, se puede establecer un diagnóstico diferencial en individuos afectados por Ia enfermedad de Chagas, que permite subclasificarlos.
La medida de Ia cantidad o Ia concentración, preferiblemente de manera semi- cuantitativa o cuantitativa, puede ser llevada a cabo de manera directa o indirecta. La medida directa se refiere a Ia medida de Ia cantidad o Ia concentración de los anticuerpos, basada en una señal que se obtiene directamente de los anticuerpos, y que está correlacionada directamente con el número de moléculas de anticuerpos presente en Ia muestra. Dicha señal - a Ia que también podemos referirnos como señal de intensidad - puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física de dichos anticuerpos. La medida indirecta incluye Ia medida obtenida de un componente secundario o un sistema de medida biológica (por ejemplo Ia medida de respuestas celulares, ligandos, "etiquetas" o productos de reacción enzimática). El término "cantidad", tal y como se utiliza en Ia descripción, se refiere pero no se limita, a Ia cantidad absoluta o relativa de los anticuerpos, así como a cualquier otro valor o parámetro relacionado con los mismos o que pueda derivarse de éstos. Dichos valores o parámetros comprenden valores de intensidad de Ia señal obtenidos a partir de cualquiera de las propiedades físicas o químicas de los anticuerpos obtenidos mediante medida directa. Adicionalmente, dichos valores o parámetros incluyen todos aquellos obtenidos mediante medida indirecta, por ejemplo, cualquiera de los sistemas de medida descritos en otra parte del presente documento.
El término "comparación", tal y como se utiliza en Ia descripción, se refiere pero no se limita, a Ia comparación de Ia cantidad de anticuerpos frente a los antígenos KMP11 , HSP70, PFR2 y/o TGP63 de Ia muestra biológica a analizar, también llamada muestra biológica problema, con una cantidad de anticuerpos frente a los antígenos KMP11 , HSP70, PFR2 y/o TGP63 de una o varias muestras de referencia deseable descrita en otra parte de Ia presente descripción. La muestra de referencia puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con Ia muestra biológica problema. La comparación descrita en el apartado (c) del método de Ia presente invención puede ser realizada manualmente o asistida por ordenador.
El término "cantidad de referencia", tal y como se utiliza en Ia descripción, se refiere a Ia cantidad absoluta o relativa de anticuerpos frente a los antígenos KMP11 , HSP70, PFR2 y/o TGP63 que permite discriminar un determinado estadio de Ia enfermedad de Chagas de otros estadios. Las cantidades de referencia adecuadas pueden ser determinadas por el método de Ia presente invención a partir de una muestra de referencia que puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con Ia muestra biológica problema. Así, por ejemplo pero sin limitarnos, Ia muestra de referencia pueden ser los controles negativos, esto es, las cantidades detectadas por el método de Ia invención en muestras de individuos que no han sido parasitados por T. cruzi. También, por ejemplo, en el caso de Ia obtención de datos útiles para el diagnóstico diferencial de Ia enfermedad de Chagas crónica cardiaca avanzada, Ia cantidad de referencia sería Ia cantidad de los anticuerpos anti- HSP70, anti-PFR2 y/o anti-TGP63 detectada en pacientes con enfermedad de Chagas indeterminada. Además, en el caso del seguimiento de Ia evolución de Ia enfermedad de Chagas, Ia cantidad de referencia podría ser, pero sin limitarnos, Ia cantidad de estos anticuerpos (anti-KMP11 , anti-HSP70, anti- PFR2 y/o anti-TGP63) detectados en una muestra biológica del mismo individuo obtenida con anterioridad. La cantidad de referencia puede ser obtenida también, pero sin limitarnos, a partir de los valores detectados en Ia madre, particularmente en el caso del diagnóstico o seguimiento de individuos menores de dos años de edad.
Así pues, Ia muestra o muestras de referencia pueden ser, por ejemplo, obtenidas a partir del suero de un paciente con enfermedad de Chagas en una determinada fase clínica. En otra realización preferida de este aspecto de Ia presente invención, Ia cantidad de referencia se obtiene a partir de una muestra de referencia. La cantidad de referencia puede obtenerse también, por ejemplo, de los límites de distribución normal de una cantidad encontrada en muestras obtenidas de una población de pacientes con enfermedad de Chagas en distintas fases, mediante técnicas estadísticas bien conocidas.
El término "anticuerpo" tal como se emplea en esta memoria, se refiere a moléculas de inmunoglobulinas y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas, es decir, moléculas que contienen un sitio de fijación de antígeno que se une específicamente (inmunoreacciona) con las proteínas (antígenos) KMP11 , HSP70, PFR2 o TGP63. Hay cinco isotipos o clases principales de inmunoglobulinas: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Anticuerpos que reconocen a los antígenos KMP11 , HSP70, PFR2 y TGP63 o a determinados fragmentos de las mismas se describen en los ejemplos de Ia presente memoria. Los anticuerpos que reconocen las proteínas KMP11 , HSP70, PFR2 y TGP63 pueden ser empleados para llevar a cabo los métodos de Ia presente invención, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante inmunoblot, ELISA o inmunhistoquímica. En una realización preferida, el inmunoensayo es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas o ELISA.
El término "anticuerpo frente al antígeno KMP11" se refiere a un anticuerpo capaz de reaccionar con Ia proteína KMP11 , con una variante de Ia proteína KMP11 o con un fragmento de Ia misma, siempre y cuando dicha variante o dicho fragmento sea funcionalmente equivalente. Preferiblemente, el término anticuerpo frente al antígeno KMP11 se refiere a una inmunoglobulina G (IgG).
El término "anticuerpo frente al antígeno HSP70" se refiere a un anticuerpo capaz de reaccionar con Ia proteína HSP70, con una variante de Ia proteína HSP70 o con un fragmento de Ia misma, siempre y cuando dicha variante o dicho fragmento sea funcionalmente equivalente. Preferiblemente, el término anticuerpo frente al antígeno HSP70 se refiere a una inmunoglobulina G (IgG).
El término "anticuerpo frente al antígeno PFR2" se refiere a un anticuerpo capaz de reaccionar con Ia proteína PFR2, con una variante de Ia proteína PFR2 o con un fragmento de Ia misma, siempre y cuando dicha variante o dicho fragmento sea funcionalmente equivalente. Preferiblemente, el término autoanticuerpo frente al antígeno PFR2 se refiere a una inmunoglobulina G
(IgG).
El término "anticuerpo frente al antígeno TGP63" se refiere a un anticuerpo capaz de reaccionar con Ia proteína TGP63, con una variante de Ia proteína TGP63 o con un fragmento de las mismas, siempre y cuando dicha variante o dicho fragmento sea funcionalmente equivalente. Preferiblemente, el término autoanticuerpo frente al antígeno TGP63 se refiere a una inmunoglobulina G
(IgG).
En el sentido utilizado en esta descripción, el término "variante" se refiere a una proteína sustancialmente homologa a cualquiera de las proteínas KMP11 , HSP70, PFR2 y TGP63. En general, una variante incluye adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos. El término "variante" incluye también a las proteínas resultantes de modificaciones postranslacionales como, por ejemplo, pero sin limitarse, glicosilación, fosforilación o metilación.
Tal como aquí se utiliza, una proteína es "sustancialmente homologa" a cualquiera de las proteínas KMP11 , HSP70, PFR2 y TGP63, cuando su secuencia de aminoácidos presenta un buen alineamiento con Ia secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 respectivamente; es decir, cuando su secuencia de aminoácidos tiene un grado de identidad respecto a Ia secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 respectivamente de, al menos, un 50%, típicamente de, al menos, un 80%, ventajosamente de, al menos, un 85%, preferentemente de, al menos un 90%, más preferentemente de, al menos, un 95%, y, aún más preferentemente de, al menos, un 99%. Las secuencias homologas a cualquiera de las proteínas KMP11 , HSP70, PFR2 y TGP63 pueden ser identificadas fácilmente por un experto en Ia materia, por ejemplo, con Ia ayuda de un programa informático apropiado para comparar secuencias.
La expresión "funcionalmente equivalente", tal como aquí se utiliza, significa que las proteínas o el/los fragmento/s de la/s proteína/s en cuestión mantiene/n esencialmente las propiedades biológicas o inmunológicas descritas en este documento. Dicha capacidad se puede determinar mediante métodos convencionales tales como los descritos en los ejemplos que acompañan a esta descripción.
En otra realización preferida, Ia detección de Ia cantidad de los anticuerpos frente a al menos dos, preferiblemente tres, y aún más preferiblemente los cuatro antígenos KMP11 , HSP70, PFR2 y TGP63 se realiza mediante un inmunoensayo. El término "inmunoensayo", tal y como se utiliza en Ia presente descripción se refiere a cualquier técnica analítica que se basa en Ia reacción de Ia conjugación de una anticuerpo con un antígeno. Ejemplos de inmunoensayos conocidos en el estado de Ia técnica son, por ejemplo, pero sin limitarse: inmunoblot, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunoensayo lineal (LIA), radioinmunoensayo (RIA), inmunofluoresecencia, x-map o chips de proteína.
En otra realización preferida, el inmunoensayo es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas o ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). El ELISA se basa en Ia premisa de que un inmunorreactivo (antígeno o anticuerpo) puede ser inmovilizado en un soporte sólido, poniendo luego ese sistema en contacto con una fase fluida que contiene el reactivo complementario que puede unirse a un compuesto marcador. Existen diferentes tipos de ELISA: ELISA directo, ELISA indirecto o ELISA sandwich.
En una realización más preferida, el ELISA es un ELISA indirecto, y más preferiblemente comprende los siguientes pasos:
(a) recubrir un soporte sólido con al menos dos, preferiblemente tres, y más preferiblemente los cuatro antígenos KMP11 , HSP70, PFR2 y/o TGP63, una variante de las proteínas KMP11 , HSP70, PFR2 y/o TGP63 o un fragmento de las mismas; (b) incubar el soporte recubierto del paso (a) con una muestra biológica obtenida del sujeto en condiciones que permitan Ia formación de un inmunocomplejo de los anticuerpos frente a, al menos dos, preferiblemente tres, y más preferiblemente los cuatro antígenos KMP11 , HSP70, PFR2 y/o TGP63 presentes en Ia muestra, con al menos dos, preferiblemente tres, y más preferiblemente los cuatro antígenos KMP11 ,
HSP70, PFR2 y/o TGP63, con sus variantes o con sus fragmentos; e (c) incubar con un anticuerpo secundario, que reconoce a los anticuerpos frente a los antígenos KMP11 , HSP70, PFR2 y/o TGP63, conjugados o unidos a un compuesto marcador. En todos los casos los antígenos se fijan sobre el soporte sólido en pocilios diferentes, y/o de manera que puedan identificarse los anticuerpos específicos frente a cada uno de los antígenos de forma independiente. En una realización aún más preferida de este aspecto de Ia invención, el individuo del que obtiene Ia muestra biológica aislada del paso (a) es menor de dos años de edad. En otra realización más preferida, el individuo del que obtiene Ia muestra biológica aislada del paso (a) es un neonato o lactante y Ia madre es seropositiva.
El término "compuesto marcador", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a un compuesto capaz de dar lugar a una señal cromogénica, fluorogénica, radiactiva y/o quimioluminiscente que permita Ia detección y cuantificación de Ia cantidad de anticuerpos frente a los antígenos KMP11 , HSP70, PFR2 y/o TGP63. El compuesto marcador se selecciona de Ia lista que comprende radioisótopos, enzimas, fluoróforos o cualquier molécula susceptible de ser conjugada con otra molécula o detectada y/o cuantificada de forma directa. Este compuesto marcador puede unirse al anticuerpo directamente, o a través de otro compuesto. Algunos ejemplos de compuestos marcadores que se unen directamente son, pero sin limitarse, enzimas como Ia fosfatasa alcalina o Ia peroxidasa, isótopos radiactivos como 32P o 35S, fluorocromos como fluoresceína o partículas metálicas, para su detección directa mediante colorimetría, auto-radiografía, fluorimetría, o metalografía respectivamente.
Los autores de Ia presente invención han visto que el nivel de reconocimiento de los antígenos KMP11 , HSP70, PFR2 y/θ TGP63 por los paciente chagásicos es muy superior comparado con los individuos sanos, con diferencias estadísticamente significativas (Fig. 2). Por tanto, otro aspecto de Ia invención se refiere a un método de diagnóstico de Ia enfermedad de Chagas, de ahora en adelante segundo método de Ia invención, que comprende los pasos (a) - (c) del primer método de Ia invención, y además comprende asignar al individuo según el paso (a) al grupo de individuos con enfermedad de Chagas, cuando presenta una cantidad de anticuerpos frente a los antígenos KMP11 , HSP70, PFR2 y/o TGP63 detectados en el paso (b) mayor y estadísticamente significativa a Ia cantidad de referencia de (c), siendo Ia cantidad de referencia uno o varios controles negativos.
En una realización preferida, Ia detección de Ia cantidad de anticuerpos frente a, al menos dos, preferiblemente tres, y más preferiblemente los cuatro antígenos KMP11 , HSP70, PFR2 y/o TGP63 se realiza mediante un inmunoensayo. En otra realización preferida, el inmunoensayo es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas o ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), y en otra realización aún más preferida, el ELISA es un ELISA indirecto.
Los inventores han demostrado que, cuando se separan los pacientes chagásicos según el estadio de Ia enfermedad, tanto los pacientes con Chagas indeterminado como con patología cardiaca o digestiva mostraron un reconocimiento significativamente superior de KMP11 , HSP70 y PFR2 que los controles negativos (Fig 3 A, B y C). Por tanto, otro aspecto de Ia invención, se refiere a un método de diagnóstico diferencial de Ia enfermedad de Chagas, de ahora en adelante tercer método de Ia invención, que comprende los pasos (a)
- (c), y además comprende asignar a un individuo según el paso (a) al grupo de individuos con enfermedad de Chagas indeterminada o con patología cardiaca o digestiva, cuando presenta una cantidad de anticuerpos frente a los antígenos KMP11 , HSP70 y/o PFR2 detectados en el paso (b) mayor y estadísticamente significativa en comparación con una cantidad de referencia, siendo Ia cantidad de referencia uno o varios controles negativos.
El reconocimiento de Ia proteína TGP63 permite diferenciar los pacientes en fase crónica con patología digestiva de los controles negativos (Fig 3D). Así, en una realización más preferida de este aspecto, el tercer método de Ia invención además comprende asignar a un individuo según el paso (a) al grupo de individuos con enfermedad de Chagas crónica digestiva cuando presenta una cantidad de anticuerpos frente al antígeno TGP63 detectados en el paso (b) mayor y estadísticamente significativa en comparación con una cantidad de referencia, cuando Ia cantidad de referencia son uno o varios controles negativos.
En una realización más preferida de este aspecto, el tercer método de Ia invención además comprende asignar a un individuo según el paso (a) al grupo de individuos con enfermedad de Chagas crónica cardiaca avanzada cuando presenta una cantidad de anticuerpos frente a los antígenos HSP70, PFR2 y/o TGP63 detectados en el paso (b) menor y estadísticamente significativa en comparación con una cantidad de referencia, siendo Ia cantidad de referencia Ia cantidad detectada de estos anticuerpos en pacientes con Chagas indeterminado (Tabla I).
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Tabla I. Reconocimiento de antígenos en pacientes en fase indeterminada y pacientes con patología cardiaca avanzada. Los valores se expresan como Ia media i desviación estándar obtenida con sueros de pacientes en fase indeterminada (n=15) y pacientes con patología cardíaca avanzada (n=3). (a) Se aplicó el método no paramétrico U de Mann Withney. Las diferencias se consideran estadísticamente significativas si p≤0.1 (*).
La quimioterapia actual es muy eficaz en los primeros estadios de Ia infección, pues evita que el parásito entre en tejidos y de lugar a su cronicidad. Además, Ia aparición de efectos adversos correlaciona negativamente con Ia edad del paciente. Es por ello, que actualmente, a los hijos de madres seropositivas frente a Ia enfermedad de Chagas se les realiza el diagnóstico parasitológico y serológico al nacer. Si el parasitológico da positivo (cosa muy infrecuente pues Ia tasa de parásitos que pasan por placenta es baja), no hay mayor problema pues se Ie trata inmediatamente. Sin embargo, el serológico siendo más sensible no permite normalmente diferenciar entre los anticuerpos procedentes de Ia madre o aquellos generados por el hijo. Así, el protocolo clínico establece mantener vigilado al hijo durante 24 meses, realizándole continuos ensayos parasitológicos y serológicos para detectar el parásito o una fuerte seroconversión que indique Ia presencia del mismo. El método de Ia presente invención permite analizar el patrón de anticuerpos de Ia madre versus el del hijo post-nacimiento y a cortos tiempos de éste e identificar si los anticuerpos presentes en el hijo son procedentes de Ia madre o generados por el hijo por Ia presencia del parásito. Este análisis permitirá adelantar significativamente el inicio del tratamiento y, por tanto, favorecer Ia no infección tisular por parte de los parásitos y evitar así el estableciendo de Ia enfermedad. Por tanto, en una realización aún más preferida de este aspecto de Ia invención, Ia madre del individuo del que se obtiene Ia muestra biológica aislada del paso (a) es seropositiva frente a Chagas.
En Ia presente invención se demuestra cómo el tratamiento con benznidazol varía Ia respuesta humoral de los pacientes frente al reconocimiento de estas proteínas (Fig. 4 y Fig. 5). Por tanto, otro aspecto de Ia invención se refiere a un método de seguimiento de Ia evolución de Ia enfermedad de Chagas en individuos chagásicos, de ahora en adelante cuarto método de Ia invención, que comprende: a) tomar una muestra biológica aislada de un individuo, b) detectar Ia cantidad de anticuerpos frente a, al menos dos, preferiblemente tres, y más preferiblemente los cuatro antígenos KMP11 , HSP70, PFR2 y/o TGP63, presentes en Ia muestra biológica aislada de (a), c) comparar las cantidades obtenidas en el paso (b) con una cantidad de referencia, y d) repetir al menos dos veces Ia secuencia de pasos (a) - (c) en muestras obtenidas del mismo individuo según el paso (a), de manera no simultánea.
El término "seguimiento de Ia evolución", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere, a Ia supervisión del desarrollo de Ia enfermedad, como por ejemplo, pero sin limitarse, Ia evaluación de Ia respuesta a un determinado tratamiento de Ia enfermedad de Chagas. Por tanto, en una realización preferida de este aspecto de Ia invención, el seguimiento se realiza post- tratamiento. En otra realización preferida de este aspecto, el cuarto método de Ia invención además comprende asignar a un individuo según el paso (a) al grupo de individuos con enfermedad de Chagas indeterminada, cuando Ia cantidad de anticuerpos frente al antígeno TGP63, detectados en el paso (b), disminuye tras el tratamiento (Fig. 5A). En otra realización preferida de este aspecto, el cuarto método de Ia invención además comprende asignar a un individuo según el paso (a) al grupo de individuos con enfermedad de Chagas crónica cardiaca, cuando Ia cantidad de anticuerpos frente a los antígenos HSP70 y/o PFR2, detectados en el paso (b), disminuye tras el tratamiento (Fig. 5B). En otra realización preferida de este aspecto, el cuarto método de Ia invención además comprende asignar a un individuo según el paso (a) al grupo de individuos con enfermedad de Chagas crónica cardiaca avanzada, cuando Ia cantidad de anticuerpos frente al antígeno TGP63, detectados en el paso (b), aumenta tras el tratamiento (Fig. 5C). En otra realización preferida de este aspecto, el cuarto método de Ia invención además comprende asignar a un individuo según el paso (a), que se encuentra en fase aguda, al grupo de individuos con fallo terapéutico cuando Ia cantidad de anticuerpos frente a los antígenos KMP11 y HSP70 no disminuye tras el tratamiento (Fig. 6).
En una realización preferida, Ia detección de Ia cantidad de anticuerpos frente a, al menos dos, preferiblemente tres, y más preferiblemente los cuatro antígenos KMP11 , HSP70, PFR2 y/o TGP63 se realiza mediante un inmunoensayo. En otra realización preferida, el inmunoensayo es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas o ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), y en otra realización aún más preferida, el ELISA es un ELISA indirecto. En una realización aún más preferida de este aspecto de Ia invención, el individuo del que obtiene Ia muestra biológica aislada del paso (a) es menor de dos años de edad. En otra realización más preferida, el individuo del que obtiene Ia muestra biológica aislada del paso (a) es un neonato o lactante y Ia madre es seropositiva para Chagas.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere a un kit o dispositivo que comprende los elementos necesarios para analizar Ia cantidad de anticuerpos frente a, al menos dos, preferiblemente tres, y más preferiblemente los cuatro antígenos en Ia muestra obtenida en el paso (a). Más preferiblemente comprende los medios necesarios para comparar Ia cantidad detectada en el paso (b) con una cantidad de referencia.
Aún más preferiblemente, el kit de Ia presente invención comprende los elementos necesarios para llevar a cabo cualquiera de los métodos de Ia presente invención.
Dicho kit puede contener todos aquellos reactivos necesarios para analizar Ia cantidad de anticuerpos frente a, al menos dos, preferiblemente tres, y más preferiblemente los cuatro antígenos KMP11 , HSP70, PFR2 y TGP63, por medio de cualquiera de los métodos descritos anteriormente en este documento como, por ejemplo, pero sin limitarse, a las proteínas KMP11 , HSP70, PFR2 y TGP63, una variante o un fragmento de las mismas purificados, anticuerpos capaces de reconocer específicamente a los anticuerpos frente a los antígenos KMP11 , HSP70, PFR2 y/o TGP63, o controles positivos y/o negativos. El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, agentes para prevenir Ia contaminación, inhibidores de Ia degradación de las proteínas, etc. Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo cualquiera de los métodos de Ia invención.
Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (ARN ó RNA) como desoxiribonucleótidos (ADN ó DNA).
Los términos "secuencia aminoacídica", "péptido", "oligopéptido", "polipéptido" y "proteína" se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o no codificantes, química o bioquímicamente modificados.
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Visualización de los antígenos purificados. Las proteínas recombinantes KMP11 (carril 1 ), HSP70 (carril 2), TGP63 (carril 3), PFR2 (carril 4), así como el extracto proteico STcA (carril 5) se visualizaron mediante SDS- PAGE en un gel al 12% teñido con comassie blue.
Fig. 2. Reconocimiento de los diferentes antígenos por sueros de pacientes chagásicos. Los niveles de anticuerpos IgG específicos de los diferentes antígenos se analizó mediante Ia técnica de ELISA como se ha descrito en Materiales y Métodos. Se representa los valores de Ia mediana y cuartiles correspondientes a 22 controles negativos y 38 pacientes chagásicos sin tratamiento. Se indican los valores de p cuando las diferencias entre grupos se consideran estadísticamente significativas (si p≤ 0.1 ).
Fig. 3. Reconocimiento de antígenos por pacientes chagásicos en distintas fases de Ia enfermedad. Se ensayaron sueros de 22 donantes sanos (C-), 15 pacientes indeterminados (Ind), 15 pacientes con patología cardiaca (Card) y 8 pacientes con patología digestiva (Dig), previos al inicio del tratamiento, como en Ia figura anterior. Se indican los valores de p cuando las diferencias entre grupos se consideran estadísticamente significativas (si p≤ 0.1 ).
Fig. 4. Dinámica de reconocimiento de antígenos en pacientes chagásicos tratados con benznidazol. Se midió el nivel de anticuerpos de 28 sueros de pacientes chagásicos frente a distintos antígenos parasitarios antes del inicio de tratamiento (TO), 3 meses (T1 ), 6 meses (12), y 9 meses (T3) posttratamiento. Se representan las medias y desviaciones estándar. Se indican los valores de p cuando las diferencias entre grupos se consideran estadísticamente significativas (si p≤ 0.1 ).
Fig. 5. Dinámica de reconocimiento de antígenos en pacientes chagásicos en distintas fases de Ia enfermedad. La dinámica de reconocimiento de los diferentes antígenos se midió como anteriormente, utilizando sueros de (A) 15 pacientes en fase indeterminada, (B) 11 pacientes con patología cardiaca, (C) 3 pacientes con patología cardiaca avanzada y (D) 6 controles negativos. Se indican los valores de p cuando las diferencias entre grupos se consideran estadísticamente significativas (si p≤ 0.1 ).
Fig. 6. Efecto del tratamiento con benznidazol o Nifurtimox en pacientes pediátricos en fase aguda. La dinámica de reconocimiento de los antígenos
(A) KMP11 y (B) HSP70 se midió como anteriormente utilizando sueros de 11 pacientes en fase aguda antes (pre) y después (post) del tratamiento con benznidazol. Para calcular los valores de p se utilizó el test de Wilcoxon.
Fig. 7. Patrón de reconocimiento de antígenos en pacientes chagásicos bajo tratamiento. Se representan los pacientes agrupados según su clasificación clínica. Para cada suero chagásico se estudió Ia variación en el tiempo (T1 , T2, T3) de Ia D. O. relativa al valor obtenido en TO (inicio del tratamiento), frente a cada uno de los antígenos. Para el cálculo del ratio de reconocimiento se tuvieron en cuenta las desviaciones estándar de cada medida.
Fig. 8. Patrón de reconocimiento de antígenos en un neonato y su madre seropositiva para Chagas. La dinámica de reconocimiento de los antígenos KMP11 , HSP70, PFR2 y TGP63 se midió como anteriormente utilizando sueros de un bebé nacido de madre seropositiva para Chagas en un periodo de tiempo comprendido entre el nacimiento (cordón), y el inicio de tratamiento con benznidazol a los 16 meses, así como 3 meses tras el inicio del tratamiento. Los resultados se comparan con Ia serología de su madre, desde el embarazo (cinco meses de gestación), hasta un año después del parto.
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará Ia invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto Ia especificidad y efectividad de los métodos de Ia invención para obtener datos útiles en el diagnóstico de Ia enfermedad de Chagas, y para el diagnóstico y el seguimiento de dicha enfermedad.
MATERIALES Y MÉTODOS Sujetos del estudio
Pacientes chagásicos y donantes sanos procedentes de distintos países de América Latina, y residentes en España. Los individuos se clasificaron clínicamente según Ia fase de Ia enfermedad en asintomáticos o indeterminados (IND), con patología cardiaca (CARD) o digestiva (DIG). Se les tomaron muestras de suero antes del inicio de tratamiento con benznidazol (TO), y a los 3 (T1 ), 6 (T2) y 9 (T3) meses posteriores al inicio del tratamiento.
Los pacientes pediátricos son residentes en Venezuela y se infectaron por vía oral. El diagnóstico se realizó menos de un mes tras el momento de Ia infección. Por tanto, se trata de pacientes en fase aguda.
Purificación de antígenos
Las proteínas KMP11 (Thomas et al., 2000. DNA CeII BIoI 19: 47-57), HSP70 (Maranon et al., 2000. Int Immunol 12: 1685-1693), y PFR2 (Morell et al., 2006. Vaccine 24: 7046-7055) se purificaron siguiendo los protocolos ya publicados. El fragmento TGP63 de Leishmania infantum se clonó en el plásmido pQE30 y se sobreexpresó en Ia cepa M 15 de E. coli con 0.1 mM de isopropyl-beta-D- thiogalactopyranoside (IPTG) 1.5 horas a 370C. Tras solubilizar Ia proteína mediante sonicación en tampón fosfato a pH 8 (Na2HPO4 50 mM, CINa 30OmM), se procedió a su purificación mediante cromatografía de afinidad con Ia resina Ni2+ NTA (Quiagen). La elución de Ia proteína se realizó a pH 4-5.
Para Ia obtención del lisado de antígenos solubles de T. cruzi (STcA) se utilizaron mezclas de amastigotes y tripomastigotes (1 :1 ) obtenidos tras infección de monocapas de células LLC-MK2. Los parásitos se lavaron con PBS 1x, y el pellet se resuspendió en NET-2 (50 mM Tris HCI, pH 7,4, 50 mM NaCI, 0,05% Nonidet P-40, 1 μg/ml leupeptina, 1 mM PMSF). Tras sonicación, se centrifugó 20 minutos a 10,000 rpm y 40C y se recogió el sobrenadante. Las distintas fracciones se chequearon en geles desnaturalizantes SDS-page al 12 % (Fig 1 ). La pureza de las proteínas recombinantes siempre fue superior al 90%. Los distintos antígenos se agruparon en lotes homogéneos, que se alicuotearon a -2O0C hasta su uso.
ELISA: (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
Los niveles de anticuerpos IgG específicos frente a las distintas proteínas empleadas, se determinaron en sueros chagásicos y sueros normales siguiendo los protocolos descritos en (Thomas et al., 2001. Clin Exp Immunol 123: 465-471 ). Los sueros se ensayaron en triplicado y en dos diluciones. En cada ensayo se incluyeron los correspondientes controles positivos y negativos, y se desecharon aquellos ensayos en los que las densidades ópticas de los controles fueron más de un 20% diferentes a los valores esperados. El análisis se realizó con los sueros diluidos 1/1600 para HSP70, PRF2 y TGP63, 1/3200 para KMP11 y 1/12800 para STcA.
Análisis estadístico
Se utilizó el programa SPSS 15.0. Las diferencias estadísticamente significativas entre los diferentes grupos de pacientes se analizaron utilizando el test no paramétrico de Mann-Withney. El análisis de las diferencias longitudinales post-tratamiento se realizó con el método no paramétrico de Wilcoxon. Se consideró que las diferencias son estadísticamente significativas si el intervalo de confianza fue de al menos un 90% (p < 0.1 )
RESULTADOS
Reconocimiento de KMP11, HSP70, PFR2, TGP63 y STcA en sueros de pacientes chagásicos.
En el presente resumen se muestran los resultados obtenidos para un total de 60 sueros de individuos no tratados: 22 donantes sanos, 15 pacientes chagásicos en fase indeterminada, 15 pacientes crónicos con patología cardiaca y 8 pacientes con patologías digestivas. Se midió el nivel de anticuerpos IgG, mediante Ia técnica ELISA, frente a las proteínas KMP11 , HSP70, PFR2, TGP63, STcA. El nivel de reconocimiento de dichas proteínas por los paciente chagásicos fue muy superior comparado con los donantes sanos, con diferencias estadísticamente significativas (Fig 2). Cuando se separaron los pacientes chagásicos según el estadio de Ia enfermedad, se encontró que tanto los pacientes con chagas indeterminado como con patología cardiaca o digestiva mostraron un reconocimiento significativamente superior de KMP11 , HSP70, PFR2 y STcA que los controles negativos (Fig 3 A, B, C y E). Los donantes sanos mostraron un reconocimiento muy variable de Ia proteína TGP63, y por ello sólo los sueros de pacientes en fase crónica con patología digestiva reconocieron de forma estadísticamente significativa dicha proteína en comparación con los controles negativos (Fig. 3D). Tal como se muestra en Ia Tabla I, los sueros de los pacientes con enfermedad de Chagas crónica cardiaca avanzada presenta una cantidad de anticuerpos frente a los antígenos HSP70, PFR2 y/o TGP63 menor y estadísticamente significativa en comparación con Ia cantidad detectada de estos anticuerpos en pacientes con Chagas indeterminado.
Modificaciones del perfil de anticuerpos tras el tratamiento con benznidazol
26 pacientes chagásicos (15 en fase indeterminada y 11 con patología de tipo cardiaco) fueron tratados con benznidazol durante 60 días, y se realizaron recogidas de muestra de suero a diferentes tiempos post-tratamiento, para estudiar el efecto del benznidazol en Ia respuesta humoral. Mediante Ia técnica de ELISA, se midió el nivel de anticuerpos de tipo IgG, frente a los antígenos KMP11 , HSP70, PFR2, TGP63 y STcA.
Como se puede ver en Ia Fig 4, no se observaron diferencias significativas del reconocimiento de los antígenos totales del parásito (STcA), así como de y TGP63 cuando se analizaron todos los pacientes chagásicos independientemente del estadio de Ia enfermedad. Sin embargo, se observaron disminuciones significativas del reconocimiento de los antígenos a partir de 6 meses para KMP11 y HSP70 y a los tres meses para PFR2.
Cuando se analizaron los pacientes chagásicos por estadio de Ia enfermedad, pudo observarse que Ia disminución significativa del reconocimiento de las proteínas KMP11 , HSP70 y PFR2 se sigue observando en el caso de los sueros de pacientes en fase crónica con patología cardiaca(cardiacos) (Fig 5B). En pacientes en fase indeterminada Ia tendencia a Ia disminución del reconocimiento de KMP11 se mantiene, pero no se observaron disminuciones significativas de los niveles de anticuerpos IgG específicos de HSP70 y PFR2 (Fig 5A). Sin embargo, en este último grupo se observó una disminución transitoria del reconocimiento de Ia proteína TGP63 después de 3 meses de tratamiento. En ningún caso se encontraron variaciones significativas de los niveles de anticuerpos frente a STcA (Fig. 5 A y B). Tal y como se muestra en Ia Fig. 5C, en los individuos con enfermedad de Chagas crónica cardiaca avanzada se observó un aumento, estadísticamente significativo, de Ia cantidad de anticuerpos frente al antígeno TGP63 tras el tratamiento.
Para excluir que las diferencias encontradas no se debieran a las fluctuaciones normales de los niveles de anticuerpos circulantes, se estudió Ia evolución de Ia respuesta inmunológica en individuos sanos; para ello se recogieron muestras de 6 donantes sanos a, al menos 12 meses de intervalo (TO y T4), y se ensayaron frente a KMP11 , HSP70, PFR2, TGP63 y STcA. Se observó que no existían diferencias significativas entre las dos muestras (Fig 5D). Por tanto las diferencias en Ia respuesta inmunológica observadas se deberían al tratamiento con benznidazol.
Asimismo, se analizó el reconocimiento de las proteínas HSP70 y KMP11 por sueros de 11 pacientes chagásicos pediátricos en fase aguda, infectados por vía oral. Las muestras se obtuvieron en un periodo menor a un mes tras Ia infección. El efecto del tratamiento con benznidazol o nifurtimox se evaluó 70 días tras finalizar el tratamiento. Los resultados obtenidos muestran un significativo descenso en el nivel de anticuerpos frente al antígeno KMP11 (Fig 6A). De forma interesante, el único paciente en el que no se observó disminución, sino al contrario, aumento, del reconocimiento de KMP11 (paciente 868) presentó un nuevo episodio agudo de Chagas, con presencia de parásitos en sangre, evidenciándose un claro fallo terapéutico. El reconocimiento de Ia proteína HSP70 también mostró una tendencia a Ia disminución. Aunque esta disminución no fue estadísticamente significativa (Fig 6B), sí Io fue cuando los datos se analizaron excluyendo al mencionado paciente 868, con fallo terapéutico (p=0.028 vs p=0.131 para HSP70 y p=0.005 vs p=0.041 para KMP11 ). En ambos supuestos, dicha seroconversión no fue estadísticamente significativa frente a antígenos totales del parásito (formas epimastigotas).
Patrones individuales de reconocimiento específico
Con el objetivo de estudiar el patrón individual de reconocimiento de cada uno de los pacientes chagásicos se realizó el gráfico mostrado en Ia Fig 7, en Ia que se reflejan las modificaciones del reconocimiento de los distintos antígenos después del tratamiento. En este estudio, además de los pacientes citados anteriormente, también se incluyeron 2 pacientes con patología digestiva. Como puede observarse, existen patrones de reconocimiento muy conservados, como son Ia estabilidad o disminución del reconocimiento de KMP11 , HSP70 y PFR2 por los sueros de los pacientes en fase indeterminada y crónica con patología cardiaca, y Ia estabilidad o aumento del reconocimiento de TGP63 en los pacientes en fase crónica con patología cardiaca. Sin embargo, se observaron pacientes con un patrón anómalo de reconocimiento, como el paciente en fase asintomática 1-0008, que presentó un patrón de reconocimiento similar a los pacientes con patología cardiaca La progresión de Ia patología del paciente 1-0008 está actualmente en análisis. Cuando se analizaron los pacientes con afectación cardiaca, se encontraron varios con un patrón similar a aquéllos en fase indeterminada, y otros claramente diferentes, en los que no se observó disminución del reconocimiento de KMP11 y HSP70, pero sí de TGP63. Estos últimos pacientes se encontraban en fases más avanzadas de Ia enfermedad. Aunque sólo se analizaron muestras de dos pacientes con patología digestiva, el patrón de reconocimiento de antígenos fue muy característico, con un claro aumento del reconocimiento de KMP11 , algo que sólo se había observado en el paciente 3-0161 , clasificado como cardiaco, pero en el que posteriormente se comprobó que también sufría de afectaciones del aparato digestivo.
Todos los hijos de madres chagásicas son seropositivos al nacimiento, y los títulos de anticuerpos frente a antígenos totales van disminuyendo durante el primer año muy lentamente, Io que dificulta un diagnóstico correcto. El estudio diferencial de patrones de reconocimiento de estos antígenos podría permitir un diagnóstico rápido de casos de Chagas congénito. Para confirmar esta hipótesis se estudió el reconocimiento de los diferentes antígenos por parte de un caso de transmisión vertical de Chagas que fue diagnosticado y tratado a los 16 meses de edad. Como se observa en Ia Fig 8, tras el nacimiento puede medirse una disminución del reconocimiento serológico de los antígenos KMP11 , HSP70, PFR2 y TGP63 por parte del neonato. Después de un descenso inicial generalizado debido a Ia pérdida de los anticuerpos procedentes de Ia madre, se observa un aumento del reconocimiento de los antígenos KMP11 y HSP70. Este aumento no puede justificarse por una transferencia pasiva durante Ia lactancia, dado que el reconocimiento de dichos antígenos por parte de Ia madre se encuentra en descenso. De igual modo se observa un patrón de reconocimiento discordante para TGP63, que desciende bruscamente en Ia madre, mientras se conserva en el neonato. Estos datos evidencian Ia producción activa de anticuerpos por parte del bebé debida a una exposición post-natal al parásito. Estos estudios de reconocimiento diferencial podrían acortar sensiblemente el tiempo de diagnóstico y poder iniciar el tratamiento precozmente, para evitar así el establecimiento de Ia enfermedad.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico y seguimiento de Ia enfermedad de Chagas, que comprende: a. obtener una muestra biológica aislada de un individuo, b. detectar Ia cantidad de anticuerpos frente a, al menos dos de los antígenos que se seleccionan de Ia lista que comprende KMP11 , HSP70, PFR2 y/o TGP63, en Ia muestra biológica aislada de (a); y c. comparar las cantidades obtenidas en el paso (b) con una cantidad de referencia.
2. Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico y seguimiento de Ia enfermedad de Chagas según Ia reivindicación anterior, donde el paso (b) comprende detectar Ia cantidad de anticuerpos frente a, al menos tres de los antígenos que se seleccionan de Ia lista que comprende KMP11 , HSP70, PFR2 y/o TGP63, en Ia muestra biológica aislada de (a).
3. Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico y seguimiento de Ia enfermedad de Chagas según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde el paso (b) comprende detectar Ia cantidad de los anticuerpos frente a los antígenos KMP11 , HSP70, PFR2 y TGP63, en Ia muestra biológica aislada de (a).
4. Método de diagnóstico de Ia enfermedad de Chagas que comprende los pasos (a) - (c) según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, y que además comprende asignar al individuo según el paso (a) al grupo de individuos con enfermedad de Chagas, cuando presenta una cantidad de anticuerpos frente a, al menos dos de los antígenos KMP11 , HSP70, PFR2 y/o TGP63 detectados en el paso (b) mayor y estadísticamente significativa en comparación con una cantidad de referencia, siendo Ia cantidad de referencia uno o varios controles negativos.
5. Método de diagnóstico diferencial de Ia enfermedad de Chagas que comprende los pasos (a) - (c) según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, y que además comprende asignar al individuo según el paso (a) al grupo de individuos con enfermedad de Chagas indeterminada o con patología cardiaca o digestiva, cuando presenta una cantidad de anticuerpos frente a los antígenos KMP11 , HSP70 y/o PFR2 detectados en el paso (b) mayor y estadísticamente significativa en comparación con una cantidad de referencia, siendo Ia cantidad de referencia uno o varios controles negativos.
6. Método de diagnóstico diferencial de Ia enfermedad de Chagas según Ia reivindicación anterior, que además comprende asignar al individuo según el paso (a) al grupo de individuos con enfermedad de Chagas crónica digestiva cuando presenta una cantidad de anticuerpos frente al antígeno TGP63 detectados en el paso (b) mayor y estadísticamente significativa en comparación con una cantidad de referencia, cuando Ia cantidad de referencia son uno o varios controles negativos.
7. Método de diagnóstico diferencial de Ia enfermedad de Chagas según Ia reivindicación 5-6, y que además comprende asignar al individuo según el paso (a) al grupo de individuos con enfermedad de Chagas crónica cardiaca avanzada cuando presenta una cantidad de anticuerpos frente a los antígenos HSP70, PFR2 y/o TGP63 detectados en el paso (b) menor y estadísticamente significativa en comparación con una cantidad de referencia, siendo Ia cantidad de referencia Ia cantidad detectada de estos anticuerpos en pacientes con enfermedad de Chagas indeterminada.
8. Método de seguimiento de Ia evolución de Ia enfermedad de Chagas en individuos chagásicos, que comprende realizar al menos dos veces Ia secuencia de pasos (a) - (c) según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en muestras obtenidas de un mismo individuo de manera no simultánea.
9. Método de seguimiento de Ia evolución de Ia enfermedad de Chagas en individuos chagásicos según Ia reivindicación anterior, donde el seguimiento se realiza post-tratamiento.
10. Método de seguimiento de Ia evolución de Ia enfermedad de Chagas según Ia reivindicación anterior, que además comprende asignar al individuo según el paso (a) al grupo de individuos con enfermedad de Chagas indeterminada, cuando Ia cantidad de anticuerpos frente al antígeno TGP63 detectados en el paso (b) disminuye tras el tratamiento.
11. Método de seguimiento de Ia evolución de Ia enfermedad de Chagas según Ia reivindicación 9, que además comprende asignar al individuo según el paso (a) al grupo de individuos con enfermedad de Chagas crónica cardiaca, cuando Ia cantidad de anticuerpos frente a los antígenos HSP70 y/o PFR2 detectados en el paso (b) disminuye tras el tratamiento.
12. Método de seguimiento de Ia evolución de Ia enfermedad de Chagas según Ia reivindicación 9, que además comprende asignar al individuo según el paso (a) al grupo de individuos con enfermedad de Chagas crónica cardiaca avanzada, cuando Ia cantidad de anticuerpos frente al antígeno TGP63 detectados en el paso (b) aumenta tras el tratamiento.
13. Método de seguimiento de Ia evolución de Ia enfermedad de Chagas en individuos chagásicos según Ia reivindicación 9, que además comprende asignar al individuo según el paso (a), que se encuentra en fase aguda, al grupo de individuos con fallo terapéutico cuando Ia cantidad de anticuerpos frente a los antígenos KMP11 y HSP70 detectados en el paso (b) no disminuye tras el tratamiento.
14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1- 13, donde el individuo del que obtiene Ia muestra biológica aislada del paso (a) es menor de dos años de edad.
15. Método según Ia reivindicación anterior, donde el individuo del que obtiene Ia muestra biológica aislada del paso (a) es un neonato o lactante y Ia madre es seropositiva para Chagas.
16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1- 15, donde Ia detección de Ia cantidad de anticuerpos frente a los antígenos KMP11 , HSP70, PFR2 y/o TGP63 del paso (b), en Ia muestra biológica de (a), se realiza mediante un inmunoensayo.
17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1- 16, donde Ia detección de Ia cantidad de anticuerpos frente a los antígenos KMP11 , HSP70, PFR2 y/o TGP63 del paso (b), en Ia muestra biológica de (a), se realiza mediante un ELISA.
18. Método según Ia reivindicación 17, donde el ELISA es un ELISA indirecto.
19. kit o dispositivo que comprende los elementos necesarios para analizar Ia cantidad de al menos dos de los anticuerpos frente a los antígenos KMP11 , HSP70, PFR2 y/o TGP63 en una muestra biológica aislada.
20. Kit según Ia reivindicación anterior que comprende los medios necesarios para llevar a cabo el método según cualquiera de las reivindicaciones 1-18.
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