ES2712474T3

ES2712474T3 - Método de diagnóstico para la detección de una enfermedad autoinmune y materias relacionadas

Info

Publication number: ES2712474T3
Application number: ES13762461T
Authority: ES
Inventors: Josep Dalmau
Original assignee: Institucio Catalana de Recerca i Estudis Avancats ICREA; Institut dInvestigacions Biomediques August Pi i Sunyer IDIBAPS
Current assignee: Institucio Catalana de Recerca i Estudis Avancats ICREA; Institut dInvestigacions Biomediques August Pi i Sunyer IDIBAPS
Priority date: 2012-09-11
Filing date: 2013-09-11
Publication date: 2019-05-13
Anticipated expiration: 2033-09-11
Also published as: CN104640877B; WO2014041035A1; EP2895507B1; EP2895507A1; CA2884282A1; SI2895507T1; US20150247847A1; US9719993B2; CN104640877A; CA2884282C; PL2895507T3

Abstract

Uso de un polipéptido o proteína que comprende uno o varios epítopos de proteína-6 similar a dipeptidil-peptidasa en un método in vitro de diagnóstico de un trastorno autoinmune del sistema nervioso en un sujeto.

Description

DESCRIPCION

Metodo de diagnostico para la deteccion de una enfermedad autoimmune y materias relacionadas

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere al diagnostico de trastornos autoinmunes recien identificados, proporcionando un polipeptido o protema que comprende al menos un epftopo derivado de un nuevo autoantigeno de superficie celular y los medios y metodos asociados para la deteccion de dicho trastorno autoimmune.

Antecedentes de la invencion

El descubrimiento de que la imeimoria, el coimportaimiento, la cognicion, y los procesos del pensamiento pueden ser alterados por autoanticuerpos ha cambiado el enfoque al diagnostico y tratamiento de los trastornos neuropsiquiatricos considerados previamente idiopaticos. Desde 2007, se han identificado siete de dichos anticuerpos (anti-NMDAR, AMPAR, GABA(B), LG11, Caspr2, GlyR y mGluR5), todos apuntando a las protemas de la superficie celular involucradas en la transmision sinaptica, la plasticidad, o la excitabilidad nerviosa, y asociadas con smdromes a menudo severos, pero que a menudo responden a la inmunoterapia1. Los pacientes pueden estar comatosos durante varios meses, con comportamientos extranos, movimientos anormales, o convulsiones refractarias y se recuperan con inmunoterapia y amplia atencion2 Considerando que hasta hace poco estos trastornos eran desconocidos, la frecuencia relativamente alta de algunos ha sido sorprendente. Por ejemplo, en un centro enfocado al diagnostico y epidemiologfa de la encefalitis (California Encephalitis Project) la frecuencia de la encefalitis anti-NMDAR supero a la de cualquier encefalitis vftica individual3. Por estas razones, mecanismos inmunes similares son consideran cada vez mas en pacientes que desarrollan rapidamente smtomas neuropsiquiatricos progresivos en el contexto de encefalitis de etiologfa desconocida, una situacion que ocurre frecuentemente. Hoy en dfa aproximadamente el 70% de las encefalitis de etiologfa poco clara permanecen no diagnosticadas tras una evaluacion extensiva de etiologfas infecciosas4 En este contexto, la identificacion de autoanticuerpos frente a antfgenos de superficie de celula neuronal cambia la gestion al uso de inmunoterapia y puede extender el apoyo de cuidados intensivos en casos que de otro modo podnan ser considerados inutiles.

El documento WO 2005/108997 A1 da a conocer el enzima humano dipeptidil aminopeptidasa (DPP6/DPPX), pero no da a conocer el uso de este enzima para el uso en un metodo de diagnostico de una enfermedad autoinmune del sistema nervioso central en un sujeto. Este documento se refiere a una larga lista de enfermedades no relacionadas y los autores especulan que la expresion o actividad de DPP6 en ciertos tejidos puede ser relevante, pero no menciona si un incremento o disminucion en la expresion o actividad indica que es probable que el sujeto sufra o desarrolle cierta enfermedad.

En vista de lo anterior, el problema subyacente en la presente invencion reside en proporcionar medios para el diagnostico de una encefalitis autoinmune previamente no identificada, o encefalitis de etiologfa desconocida, respectivamente.

Resumen de la invencion

Este problema es solucionado por el sujeto de las reivindicaciones, en particular mediante el uso de un polipeptido o protema que comprende al menos un epftopo derivado de DPPX, un autoantfgeno novedoso para la deteccion de un trastorno autoinmune, en particular encefalitis, un acido nucleico o vector que codifica dicho polipeptido o protema, una celula que comprende dicho vector, y un kit de ensayo o una composicion farmaceutica que comprende dicho polipeptido o protema.

Una ventaja de la presente invencion reside en el hecho de que el diagnostico de encefalitis de etiologfa desconocida permite la identificacion de la enfermedad como encefalitis autoinmune, distincion de otras formas (no autoinmunes) de encefalitis u otras enfermedades o smtomas relacionados, respectivamente.

Breve descripcion de las figuras

Figura 1 muestra la inmunoprecipitacion de DPPX;

Figura 2 muestra la expresion de DPPX en el plexo mienterico;

Figura 3 muestra el analisis de anticuerpos DPPX usando un ensayo basado en celulas;

Figura 4 muestra una comparacion de la reactividad de suero de pacientes usando cerebro de raton mutante DPPX-nulo y tipo salvaje;

Figura 5 muestra una inmunotincion de cerebro de rata con suero de un paciente;

Figura 6 muestra un analisis de anticuerpos de un paciente usando un ensayo basado en celulas expresando un mutante (DPPXed-myc) con el dominio extracelular de DPPX borrado; y

Figura 7 muestra el analisis de anticuerpos de un paciente usando un ensayo basado en celulas expresando Kv4.2

Descripcion detallada de la invencion

Un “polipeptido”, de acuerdo con la presente invencion, se entiende que es un poftmero de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho o mas aminoacidos, el cual puede incluir aminoacidos estandar, as ^como aminoacidos no estandar. Los terminos polipeptido, peptido y protema se usan aqm de forma intercambiable.

El termino “enfermedad autoinmune”, en lo referente a la presente invencion se refiere a enfermedades que estan asociadas con la emergencia de anticuerpos contra DPPX. Como se indica aqm, los pacientes que presentan dicha enfermedad autoinmune sufren, por ejemplo, de smtomas que incluyen convulsiones, disfuncion cognitiva, alucinaciones, smtomas psiquiatricos, agitacion, confusion, temblor en reposo y mioclono. La mayona de estos smtomas estan asociados con un trastorno neuronal. Asf, de acuerdo con una realizacion preferida de la invencion, una enfermedad autoinmune es una enfermedad autoinmune del sistema nervioso. Ademas, los smtomas listados aqm estan asociados al menos en parte con defectos en el sistema nerviosos central. Por consiguiente, de acuerdo con otra realizacion de la invencion, la enfermedad autoinmune es una encefalitis autoinmune. Aun mas, cierto conjunto de smtomas, como el temblor, tambien pueden ser resultado de defectos en el sistema nervioso periferico, p. ej. por enfermedades autoinmunes que afectan las neuronas motoras. Correspondientemente, de acuerdo con otra realizacion de la presente invencion, la enfermedad autoinmune es una enfermedad autoinmune del sistema nervioso periferico. Ademas, se observo diarrea severa, estrenimiento y perdida de peso en pacientes aquejados de las enfermedades descritas aqm, indicando que tambien otros tejidos, tales como tejidos de tracto digestivo, pueden estar afectados por dichas enfermedades autoinmunes. Por lo tanto, de acuerdo con una realizacion de la presente invencion, la enfermedad autoinmune es una enfermedad autoinmune del sistema nervioso autonomo. Los terminos trastorno y enfermedad se usan aqm de forma intercambiable.

Un “epftopo”, dentro del alcance de la presente invencion, se entiende que es una parte de un polipeptido el cual puede ser reconocido espedficamente (es decir, unido) por un anticuerpo. El epftopo puede ser un epftopo conformacional, compuesto por secciones discontinuas de la secuencia de aminoacidos del polipeptido, o un epftopo lineal, compuesto por secciones continuas de la secuencia de aminoacidos del polipeptido.

El termino “derivado”, referido a epftopos, dentro del alcance de la presente invencion se refiere a epftopos formados a partir de secciones discontinuas o continuas de la secuencia del aminoacido primario de un polipeptido o protema. Es conocido en la tecnica, que uno o varios aminoacidos en epftopos pueden sustituirse p. ej. mediante sustitucion conservadora de aminoacidos (p. ej. glutamato a aspartato E^-D, glutamina a asparaginas Q^-N, fenilalanina a tirosina F ^Y , leucina a isoleucina L ^ I) sustancialmente sin cambiar la fuerza o especificidad de la union a anticuerpos. Correspondientemente, el termino “derivado” se refiere tambien a aquellos epftopos que, mientras presentan diferencias en la secuencia de aminoacido, muestran una fuerza o especificidad de la union a anticuerpos sin cambios o sustancialmente sin cambios en comparacion con los epftopos con la secuencia de aminoacidos original.

“Acido nucleico”, de acuerdo con la presente invencion, se refiere a poftmeros de ADN o ARN incluyendo tambien derivados qmmicos de los mismos o analogos sinteticos como acidos peptidonucleicos o acidos morfolinonucleicos. Es conocido en la tecnica, debido a la degeneracion del codigo genetico, que ciertos cambios del codigo del acido nucleico no tienen como resultado cambios de la secuencia peptfdica codificada en su interior. Por lo tanto, el termino “acido nucleico” tambien abarca secuencias de acidos nucleicos que difieren en su secuencia de las secuencias de acido nucleico originales mientras codifiquen por la misma secuencia peptfdica.

Un “vector” de acuerdo con la presente invencion se entiende que es una secuencia de acidos nucleicos circular o lineal que incluye un inserto, por ejemplo, una secuencia genica o de acido nucleico que codifica una protema deseada, y otras caractensticas tales como las secuencias necesarias para la replicacion vectorial, la expresion del inserto, la seleccion positiva de las celulas huesped portadoras de vectores o la expresion de protemas marcador. Dichos vectores y secuencias son conocidos extensivamente por la tecnica anterior.

Una “celula” dentro del alcance de la presente invencion es cualquier celula huesped procariota o eucariota capaz de ser transformada con un vector. Por ejemplo, una celula puede ser tanto una celula bacteriana como una celula de Escherichia coli o una celula eucariota como un cultivo celular humano inmortalizado. Un ejemplo de un cultivo celular humano inmortalizado es una celula HEK293.

El termino “DPPX” se refiere a la protema-6 similar a dipeptidil-peptidasa (DPP6 o DPPX), una subunidad auxiliar de la superficie celular de los canales de potasio Kv4.2. Los sinonimos de DPPX incluyen la protema relacionada con dipeptidilaminopeptidasa, dipeptidil peptidasa 6, la protema similar a dipeptidil peptidasa IV, y dipeptidil peptidasa VI. DPPX esta altamente conservada de manera que incluso DPPX de especies relacionadas solo a distancia con los humanos es apropiada para provocar la union espedfica con anticuerpos anti-DPPX humanos. Esto se considera verdad para todas las isoformas humanas de la protema DPPX. Ademas, se sabe que, por ejemplo, los epftopos de clase I MHC lineales tienen una longitud de unos 8 a 11 aminoacidos. Por lo tanto, en un homologo de DPPx , las regiones de entre 8 y 11 aminoacidos de longitud, conservadas entre las respectivas especies y los humanos, en principio ya son suficientes para obtener union espedfica de anticuerpos anti-DPPX humanos. En conexion con esto, las secuencias conservadas que componen un epftopo conformacional pueden ser incluso mas cortas. En consecuencia, “DPPX” con respecto a la presente invencion se refiere a cualquier isoforma conocida de la protema DPPX partiendo de eucariotas, preferentemente mairftferos, mas preferentemente Homo sapiens o Rattus norvegicus.

Ademas, la union espedfica a anticuerpos anti-DPPX humanos puede obtenerse tambien con homologos de DPPX, como los homologos de DPPX existentes de forma natural. Tambien estan incluidos los homologos de DPPX existentes de forma no natural, como los homologos derivados de homologos de DPPX existentes de forma natural, por ejemplo, por eliminacion o intercambio de aminoacidos individuales o multiples o incluso de motivos o dominios de protemas. En consecuencia, “DPPX” con respecto a la presente invencion se refiere a homologos de DPPX existentes de forma natural y no-natural.

Aqu se informa sobre 4 pacientes con un trastorno autoinmune novedoso caracterizado por desarrollo subagudo de disfuncion cognitiva, agitacion, alucinaciones, confusion, temblor en reposo y mioclono en asociacion con anticuerpos contra DPPX, una unidad auxiliar de superficie celular del canal de potasio Kv4.2. En tres pacientes, los smtomas neurologicos estuvieron precedidos o superpuestos con diarrea severa y perdida de peso hasta el punto de que dos pacientes se sometieron a extensivas biopsias endoscopicas sin un diagnostico claro. El apoyo para una etiologfa autoinmune de este trastorno es proporcionado por la presencia de pleocitosis cerebroespinal (FCS), mdice IgG aumentado o bandas oligoclonales, y la respuesta neurologica a la inmunoterapia intensiva o persistente. Usando anticuerpos de pacientes, tres conjuntos de experimentos establecieron DPPX como el antfgeno principal: inmunoprecipitacion de DPPX de cultivos de neuronas disociadas de hipocampo de rata; inmunotincion de DPPX en un ensayo basado en celulas; e inmunotincion de cerebro comparativa de ratones tipo salvaje y DPPX-nulo, mostrando abrogacion de la reactividad de los anticuerpos de los pacientes con el cerebro de raton DPPX-nulo, y revelando en un paciente anticuerpos adicionales para un antfgeno desconocido.

DPPX tiene un papel cntico “poniendo a punto” los canales Kv4.2 mediante la remodelacion de la puerta del canal5. Este tipo de canal de potasio pertenece a la familia del canal Shal K+ mairnfero6 el cual tiene diferentes propiedades comparado con la familia Shaker K+ (Kv1), considerada previamente la diana de la encefalitis lfmbica asociada a anticuerpos, la neuromiotonia, o el smdrome de Morvan (los autoantfgenos principales son LGI1 y Caspr2).78 Los canales Kv4.2 operan en el intervalo por debajo del umbral de potenciales de membrana.5 Esta corriente K+ tipo A somatodendntica por debajo del umbral (/^sa) es un componente cntico del conjunto de corrientes ionicas controladas por voltaje que determinan la integracion de la senal somatodendntica.9 En muchas neuronas, los potenciales de accion que empiezan en el cono axonico se propagan hacia abajo por el axon pero tambien hacia atras en las dendritas. En el arbol dendntico, estos potenciales de accion sirven como senales que indican el estado de la salida de la neurona. La corriente transitoria por debajo del umbral /^saen las dendritas atenua esta propagacion trasera de los potenciales de accion. Bajo condiciones de reposo /^sacierra el potencial de accion al intentar extenderse en las regiones distales del arbol dendntico. Sin embargo, cuando las entradas sinapticas excitadoras y los potenciales de accion somatica estan emparejados dentro de cierta ventana de tiempo, la consiguiente despolarizacion por debajo del umbral en las dendritas distales inactiva /^sa, y la atenuacion de la propagacion trasera del potencial de accion se reduce sustancialmente6. Se cree que esta interaccion proporciona un mecanismo de deteccion de coincidencia que juega un papel importante en la senalizacion Ca++ dendntica, la integracion de la senal y la plasticidad sinaptica.569

La funcion de los canales Kv4 depende de dos subunidades auxiliares, las protemas intracelulares que interaccionan con el canal Kv (KChIPs),10 y el DPPX extracelular que se expresa predominantemente en las neuronas piramidales del hipocampo y el cerebelo, o DPP10 que tiene un perfil de expresion cerebral diferente y tambien esta presente un el pancreas.1112 DPPX esta compuesto por un extremo N-terminal citoplasmatico corto, un dominio transmembrana individual, y un extremo C-terminal extracelular grande. Dependiendo de la longitud del dominio citoplasmatico, dos formas adultas, DPPX-S y DPPX-L, han sido identificadas.1314 Consistente con la presencia de anticuerpos frente a epttopos extracelulares, nuestro suero de 4 pacientes y FCS reconocieron igualmente DPPX-S y DPPX-L, pero dos pacientes tuvieron anticuerpos adicionales frente a los epttopos intracelulares presentes en una construccion mutante en la cual se elimino el extremo C-terminal extracelular.

La evaluacion extensiva y el seguimiento prolongado de tres pacientes indican que este trastorno es severo, resultando en hospitalizaciones prolongadas o multiples recafdas que ocurrieron normalmente cuando la inmunoterapia se redujo. El paciente # 1 fue capaz de volver a casa 15 meses despues del inicio de los smtomas, y tuvo una recafda clmica cuando se redujo la prednisona. El paciente #2 paso 10 meses en el hospital y actualmente continua recibiendo tratamientos de rituximab cuando la cuenta de CD19 aumenta al 1%. En una ocasion el retraso del tratamiento resulto en recurrencia sintomatica. El paciente #3 tuvo 7 recafdas en 5 anos, la mayona relacionadas con intentos de reducir la dosis de esteroides.

Los smtomas principales de este trastorno incluyen, agitacion, mioclono, temblor, y convulsiones, que aunque no son caractensticas de un smdrome espedfico, son compatibles don hiperexcitabilidad neuronal, y consistentes con el aumento de excitabilidad observada en estudios electrofisiologicos de DPPX-knock outs.15 Curiosamente, una mutacion de truncamiento de Kv4.2 identificada en un paciente con epilepsia del lobulo temporal tuvo como resultado excitabilidad aberrante de las celulas que expresan el canal mutante.16 En conjunto, todos estos hallazgos sugieren que la alteracion genetica o inmunologica del complejo DPPX-Kv4.2 conduce a hiperexcitabilidad neuronal.

En la practica clmica, la combinacion de los smtomas neurologicos indicados arriba con diarrea severa y anticuerpos no espedficos de organos (p. ej. ANA) puede conducir a un amplio diagnostico diferencial que incluye entre otros la enfermedad de Whipple o el lupus eritematoso, como ocurrio en nuestros pacientes.

En este momento el significado de la diarrea no esta claro, pero este smtoma es notable porque fue severo, duro varias semanas y solo ocurrio en el episodio inicial de encefalitis. Ademas, la revision de nuestra experiencia con la encefalitis sospechosa de ser autoimmune sugiere una relacion entre la diarrea y la encefalitis asociada al anticuerpo DPPX. De hecho, entre 1429 casos de encefalitis de etiologfa poco clara examinados entre 2009 y 2012, solo 11 tuvieron diarrea severa al inicio de los smtomas. Tres de estos 11 pacientes corresponden a los casos presentados aqm, y los otros 8 no teman anticuerpos DPPX; ninguno de los 1418 casos sin diarrea tuvo reactividad cerebral en suero o FCS como la mostrada en las muestras positivas de anticuerpo DPPX (vease la Figura 5A). Una explicacion plausible para la asociacion de diarrea y encefalitis asociada a anticuerpo DPPX es que en algunos pacientes la respuesta immune puede resultas de imiimetisimo molecular entre DPPX y un agente infeccioso aun desconocido. Este paradigma sena similar al mecanismo que desencadena los anticuerpos GM1 en pacientes con smdrome de Guillain-Barre e infeccion de Campylobacter jejuni. Ademas, la expresion robusta de DPPX por neuronas de plexo mienterico apoya la posibilidad de que los anticuerpos de los pacientes puedan alterar la funcion del plexo dando como resultado hiperactividad gastrointestinal, similar a la hiperexcitabilidad del SNC que se produce cuando DPPX es ablacionado en el cerebro.15

Sobre este trasfondo, la presente invencion proporciona un polipeptido o protema para el uso en el diagnostico o tratamiento de una enfermedad autoinmune en un sujeto, cuyo polipeptido o protema esta caracterizado por comprender uno o varios epttopos derivados de la protema DPPX.

En varias realizaciones de la invencion el polipeptido o protema de acuerdo con la invencion incluye o tiene la secuencia de aminoacidos de acuerdo con SEC. ID. N°: 2, correspondiente al dominio extracelular comun a DPPX-S y DPPX-L de Rattus norvegicus. Alternativamente o adicionalmente, el polipeptido o protema de acuerdo con la invencion puede incluir o tiene la secuencia de aminoacidos de acuerdo con SEC. ID. N°: 3, correspondiente al dominio intracelular y transmembrana de DPPX-L de Rattus norvegicus. En otras realizaciones de la invencion, el polipeptido o protema de acuerdo con la invencion, alternativamente o adicionalmente a lo anterior, incluye o tiene la secuencia de aminoacido de acuerdo con SEC. ID. N°: 4, correspondiente al dominio intracelular y transmembrana de DPPX-S de Rattus norvegicus.

De acuerdo con otras realizaciones de la invencion, el polipeptido o protema para el uso de acuerdo con la invencion incluye o tiene una secuencia con al menos 70, al menos 75, al menos 80, al menos 90, al menos 92, al menos 94, al menos 96, al menos 98 o al menos 99% de identidad de secuencia respecto a la protema DPPX o las secuencias de acuerdo con SEC. ID. N°: 1, SEC. ID. N°: 2, SEC. ID. N°: 3 o SEC. ID. N°: 4. En otras realizaciones, la invencion se refiere a un fragmento de la protema o polipeptido DPPX con al menos 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 aminoacidos consecutivos de secuencias de acuerdo con SEC. ID. N°: 1, SEC. ID. N°: 2, SEC. ID. N°: 3 o SEC. ID. N°: 4. En realizaciones adicionales de la invencion, la invencion se refiere a un homologo de dichos fragmentos con al menos 70, al menos 75, al menos 80, al menos 90, al menos 92, al menos 94, al menos 96, al menos 98 o al menos 99% de identidad de secuencia de la secuencia de dichos fragmentos.

De acuerdo con una realizacion preferida de la presente invencion, el polipeptido o protema comprende otros aminoacidos, los cuales se unen de forma N-terminal o C-terminal y facilitan la purificacion del polipeptido o protema. Dichos aminoacidos pueden, por ejemplo, constituir ciertas secuencias o etiquetas que son espedficamente reconocidas por otras moleculas, preferentemente protemas, mas preferentemente anticuerpos. Dichas etiquetas se conocen extensivamente en la tecnica y comprenden, por ejemplo, etiquetas-bandera, etiquetas-myc o etiquetas-strep.

De acuerdo con otra realizacion preferida, el polipeptido o protema para el uso de acuerdo con la invencion, alternativamente o adicionalmente a lo anterior, esta unido a una molecula reportera o a una fase solida.

Una molecula reportera, dentro del alcance de la presente invencion, se entiende que es una molecula que permite la deteccion directa o indirecta de la ausencia o presencia del polipeptido o protema al que esta unida, o la ausencia o presencia de un anticuerpo unido a ella. Se conocen en la tecnica muchos tipos de molecula reportera, incluyendo por ejemplo etiquetas radioactivas, colorantes fluorescentes o protemas (p. ej. fluorescema, tetrametilrodamina, protema fluorescente verde (GPF)), haptenos (p.ej. biotina) o enzimas (p. ej. alfa-galactosidasa A, luciferasa, fosfatasa alcalina o peroxidasa de rabano picante, apropiadas para la deteccion usando colorantes convertibles en enzimas). Dichas moleculas reporteras se pueden anadir a la protema diana bien durante la smtesis de protemas (inclusion de aminoacidos marcados radioactivamente, generacion de protemas de fusion) o tras la smtesis de protemas por acoplamiento qmmico.

Una fase solida en relacion con la presente invencion se refiere a cualquier sustrato solido, al cual se puede unir un polipeptido o protema, por ejemplo, por enlace covalente directo o indirecto o por enlace de afinidad via enlaces de hidrogeno y/o interaccion lipofila. Por ejemplo, el polipeptido o protema de la presente invencion se puede unir al material de una placa de microtitulacion, la superficie de perlas magneticas, una membrana (p. ej. una membrana de nitrocelulosa o PVDF) o a la fase solida de una columna o placa de cromatograffa.

La presente invencion proporciona tambien un acido nucleico y un vector que codifica un polipeptido o protema de acuerdo con la invencion. En una realizacion preferida, el vector de acuerdo con la presente invencion se ajusta para la expresion del polipeptido o protema de acuerdo con la invencion.

Ademas, la presente invencion proporciona tambien una celula que comprende un vector de acuerdo con la invencion. Dicha celula puede ser utilizada por metodos conocidos en la tecnica para producir copias del vector o para expresar el polipeptido o protema de acuerdo con la invencion. Ademas, dicha celula tambien puede constituir un medio de diagnostico para la deteccion del enlace de un anticuerpo al polipeptido o protema p. ej. presentando el polipeptido o protema en su superficie.

La presente invencion proporciona tambien un metodo de diagnostico in vitro caracterizado porque una muestra de un sujeto se pone en contacto con un polipeptido o protema de acuerdo con la invencion y se detecta el enlace de un anticuerpo de la muestra al polipeptido o protema. De acuerdo con una realizacion preferida de la presente invencion, el metodo de diagnostico in vitro comprende la deteccion del enlace de un anticuerpo de la muestra del paciente al polipeptido o protema con un ensayo de inmunofluorescencia, micromatriz de protemas, ELISA, ensayo de luminiscencia, blot, ensayo radioinmune, western blot o dot blot.

Dicha muestra puede ser una parte aislada del cuerpo humano, como una parte de tejido o fluido corporal, siempre que la parte contenga anticuerpos. Por ejemplo, la muestra es una muestra lfquida como fluido cerebroespinal (licor), sangre o plasma sangumeo, linfa o fluido intersticial, o una muestra de tejido como tejido de nodulo linfatico, tejido neuronal, tejido muscular o tejido del tracto digestivo.

Ademas, se proporciona un kit de ensayo para la deteccion de anticuerpos en el contexto de la presente invencion, comprendiendo dicho kit de ensayo uno o varios polipeptidos o protemas de acuerdo con la invencion.

Ademas, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende un polipeptido o protema de acuerdo con la invencion. Una composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion puede comprender una o varias sustancias farmaceuticamente activas ademas del polipeptido o protema de acuerdo con la invencion.

Ademas, una composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion puede comprender uno o varios excipientes farmaceuticos. La composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion es particularmente util para la union/absorcion de anticuerpos de diferentes clases (IgA, IgG) de la sangre o plasma de un sujeto y en particular para el tratamiento extracorporeo de un trastorno autoinmune. Por ejemplo, dicha composicion farmaceutica se puede emplear en inmunoferesis. En relacion con esto, la presente invencion proporciona tambien un dispositivo medico recubierto con un polipeptido, una protema o una composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion.

Por ejemplo, dicho dispositivo medico puede ser un dispositivo empleado convencionalmente o en inmunoferesis u comprende superficies que entran en contacto con sangre o plasma del sujeto que se debe tratar.

Ademas, la presente invencion proporciona tambien la base para un metodo para el tratamiento de una enfermedad autoinmune en un sujeto, comprendiendo el metodo las etapas de

a. someter una muestra lfquida de un sujeto a un metodo de diagnostico in vitro de la invencion, y

b. tratar el sujeto con al menos una sustancia farmaceuticamente apropiada y/o intercambio de plasma

Una sustancia farmaceuticamente apropiada puede incluir una sustancia moduladora, en particular que suprime el sistema inmunitario del sujeto o una parte espedfica del mismo. Una sustancia farmaceuticamente apropiada puede ser tambien una sustancia para el tratamiento de los smtomas y condiciones relacionados con o causados por el trastorno autoinmune que debe ser tratado. La sustancia farmaceuticamente aceptable se selecciona del grupo consistente en Rituximab, prednisona, metilprednisolona, ciclofosfamida, lamotrigina, clonazepam, aripiprazol, fentoma, micofenolatemofetil, inmunoglobulina intravenosa, tacrolimus y ciclosporina.

Ademas, la presente invencion proporciona las bases de un metodo para el tratamiento de un trastorno autoinmune en un sujeto, donde preferentemente el sujeto es un humano, comprendiendo el metodo las etapas de

a. extraer sangre o plasma de un sujeto,

b. poner en contacto la sangre o el plasma con la composicion farmaceutica o el dispositivo medico de la invencion para eliminar los anticuerpos asociados con la enfermedad, y

c. readministrar la sangre o el plasma al sujeto.

En un metodo de este tipo, p. ej. la inmunoferesis, los anticuerpos asociados con la enfermedad son eliminados del plasma del sujeto poniendo en contacto la sangre o el plasma con el polipeptido o protema inmovilizados de acuerdo con la invencion. Los metodos correspondientes se han descrito p. ej. para el tratamiento de una cardiomiopatfa dilatada basado en la secuencia del receptor beta-adrenergico.17

Leyenda de las Figuras

Figura 1: Inmunoprecipitacion de DPPX

En cultivos de neuronas disociadas del hipocampo de rata, los anticuerpos de los pacientes mostraron una reactividad intensa con la superficie celular neuronal (A), bar = 10 pm. La inmunoprecipitacion del antfgeno con el suero del caso indizado se muestra en B, donde las protemas precipitadas se corrieron en un gel y posteriormente se tineron con EZblue. Destacar que los anticuerpos de los pacientes precipitaron una protema (banda cercana a 102 kDa en el carril P), la cual se extrajo del gel y se analizo mediante espectrometna de masas, demostrando secuencias de DPPX. El carril N es el precipitado obtenido del suero de control. El inmunoblot de estas protemas con un anticuerpo policlonal de conejo contra DPPX (1:1000, desarrollado por BR) confirmo que la banda correspondfa a DPPX (C).

Figura 2: Expresion de DPPX en el plexo mienterico

Seccion transversal del intestino delgado de rata mostrando la capa muscular longitudinal (LM), la capa muscular circular (CM), la capa submucosa (SM), y el glande (G). El plexo mienterico (Plex) se revela en agrupaciones de neuronas grandes entre las dos capas musculares. (Figura 2A)

En los 3 paneles (A-C) el nucleo de las neuronas (rojo) se marco con anti-Hu (un marcador neuronal altamente espedfico). El panel A muestra en verde la inmunotincion de DPPX utilizando un anticuerpo policlonal de conejo (1:1000, desarrollado por BD); el panel B muestra la reactividad de DPPX del suero de uno de los pacientes con encefalitis, y el panel C muestra la falta de reactividad del suero de un sujeto sano. Destacar que DPPx se expresa predominantemente en el citoplasma-membrana de grandes agrupaciones neuronales del plexo mienterico, y se detecta tambien en un patron longitudinal fino en CM y SM donde se localiza el plexo mienterico. Bar = 20 pm. (Figura 2B)

Figura 3: Analisis de anticuerpos DPPX utilizando un ensayo basado en celulas

Celulas HEK 293 expresando DPPX-L (ver mas abajo en el ejemplo 4) inmunotenidas con suero de pacientes (A, D, G, J) y un anticuerpo monoclonal de raton contra DPPX (B, E, H, K). Las reactividades fusionadas se muestran en los correspondientes paneles (C, F, I, L). Estudios similares comparando el suero de un individuo sano y el anticuerpo monoclonal de DPPX se muestran en M y N, y las reactividades fusionadas en O. Notar que los anticuerpos de los pacientes inmunoreaccionan con las celulas que expresan DPPX. Bar = 10 pm.

Figura 4: Comparacion de la reactividad del suero de pacientes utilizando el cerebro de ratones mutantes DPPX-nulo y de tipo salvaje

La reactividad del suero de los pacientes con el hipocampo de ratones tipo salvaje se muestra en A, C, E y G. La reactividad del anticuerpo DPPX policlonal de conejo con el hipocampo de ratones de tipo salvaje se muestra en I. Los paneles a la derecha muestran los resultados de un experimento similar pero utilizando el hipocampo de ratones DPPX-nulo. Destacar que las reactividades de los sueros de los tres primeros pacientes (casos 1,2 y 3 de la Tabla 1) y el anticuerpo DPPX policlonal de conejo estan abrogados en el hipocampo de ratones DPPX-nulo (paneles B, D, F, J). El paciente 4, no incluido en la tabla (paneles G y H) mostro la reactividad remanente con el hipocampo de ratones DPPX-nulo indicando que este paciente tema dos anticuerpos, uno contra DPPX y otro contra un antfgeno desconocido. Bar = 200 pm.

Figura 5: Inmunotincion de cerebro de rata con el suero de un paciente

Secciones sagitales de cerebro de rata inmunotenido con fluido cerebroespinal (FCS) de un paciente (A) y un individuo sano (B). Notar que el FCS del paciente muestra una intensa reactividad con el neuropilo del cerebro, predominantemente el hipocampo y el cerebelo, mientras que el control de FCS no produce reactividad. Bar = 500 pm.

Figura 6: Analisis de anticuerpos de pacientes utilizando un ensayo basado en celulas expresando un mutante (DPPXed-myc) con el dominio extracelular de DPPX anulado

Celulas HEK 293 expresando el constructo DPPXed-myc mutado inmunotenido con el suero de pacientes (A, D, G, J) y un anticuerpo monoclonal Myc-tag de raton diluido 1:500 (B, E, H, K). Las reactividades fusionadas se muestran en los correspondientes paneles (C, F, I, L). Estudios similares utilizando el suero de individuos sanos y el anticuerpo de anti-Myc-tag se muestran en M y N, y las imagenes fusionadas en O. Destacar que dos pacientes (paneles A y J) teman anticuerpos que no reaccionaron con este constructo indicando que los epftopos objetivo estaban presentes solo en el dominio extracelular (Figura 3); por contra, dos pacientes teman anticuerpos que reaccionaron con este constructo indicando que reconocieron los epftopos intracelulares (D y G) adicionalmente a los epftopos extracelulares presentes en el constructo completo de DPPx (Figura 3) y en los cultivos de neuronas vivas. Bar = 10 pm.

Figura 7: Analisis de anticuerpos de pacientes utilizando un ensayo basado en celulas expresando Kv4.2

Celulas HEK 293 expresando Kv4.2 inmunotenido con el suero de pacientes (A, D, G, J) y un anticuerpo policlonal de conejo (Alomone labs, #APC-023) contra Kv4.2 (B, E, H, K). Las reactividades fusionadas se muestran en los correspondientes paneles (C, F, I, L). Estudios similares comparando el suero de un individuo sano y el anticuerpo policlonal de conejo se muestran en M y N, y las imagenes fusionadas en O. Destacar que los anticuerpos del paciente no reconocen Kv4.2. Bar = 10 pm.

Ejemplos

En la presente se informa de las caractensticas clmicas e inmunologicas de 4 pacientes con smtomas neuropsiquiatricos prominentes (precedidos en 3 de ellos por diarrea intensa) y anticuerpos contra un novedoso antigeno de superficie celular, proteina-6 similar a dipeptidil-peptidasa (DPP6 o DPPX), una subunidad auxiliar de la superficie celular de los canales de potasio de Kv4.2. Adicionalmente a la conocida expresion robusta de DPPX en el hipocampo y cerebelo, los inventores muestran que DPPX se expresa tambien en el plexo mienterico.

La observacion de los 4 pacientes con un principio subagudo de smtomas neuropsiquiatricos y suero o anticuerpos del FCS mostrando un patron similar de inmunotincion del neuropilo de hipocampo y cerebelo de roedor, asf como la inmunomarcacion de la superficie celular de cultivos disociados de neuronas del hipocampo lleva a la inmunoprecipitacion del antigeno objetivo. El suero o el FCS de 149 sujetos incluyendo los pacientes con la inflamacion autoinmune y encefalopatfas no-inflamatorias, e individuos normales sirvieron como controles.

Ejemplo 1: pacientes

Los pacientes se describen en detalle a continuacion (casos 1 a 3) y se resumen en la Tabla 1. El cuarto caso era un hombre de 76 anos que habfa desarrollado una diarrea prominente y perdida de peso junto a una confusion que progresaba rapidamente, declive cognitivo, convulsiones, paso inseguro y evidencia de produccion de IgG-intratecal (IgG mdice 1,49); no esta incluido en la tabla debido a informacion limitada y falta de seguimiento.

Paciente 1:

Un hombre de 61 anos con un historial de obesidad, hipertension, y un principio de diabetes mellitus de inicio adulto fue ingresado durante 4 semanas por dolor abdominal y diarrea seguida de un cambio subagudo en el estado mental, caracterizado por depresion, agresividad, retraccion, alucinaciones visuales, mutismo, mioclono y una exagerada respuesta al sobresalto. La resonancia magnetica del abdomen mostro un Imgado graso pero sin evidencia de tumor y un examen gastrointestinal extensivo fue negativo para leucocitos fecales, Clostridium difficile, parasitos y huevos. Las biopsias endoscopicas de estomago, intestino delgado y colon mostraron unicamente gastritis cronica (suero H, positivo para IgG Pylori sin bacterias en la histologfa). La diarrea persistio durante un mes sin otros smtomas de disfuncion autonoma.

Estudios del FCS, resonancia magnetica y electroencefalograma (EEG) se describen en la Tabla 1. El PCR del FCS para HSV, VZV, Tropheryma Whipplei y enterovirus fue negativo. Los paneles reumatologicos, paraneoplasicos y de anticuerpos de la superficie celular neuronal (los cuales incluyeron tambien el receptor de glicina) fueron negativos. La exploracion completa del cuerpo con TC y PET y ultrasonido testicular no revelaron ningun cancer.

Se intubo brevemente al paciente al deteriorarse su estado mental, y se trato con metilprednisolona intravenosa (1000 mg/dfa x 5 dfas) con una notable mejora neurologica. Se le puso en tratamiento prolongado menguante de esteroides durante 4 meses y se transfirio a una instalacion de atencion medica especializada. Cuatro meses mas tarde se volvio a readmitir debido a un empeoramiento de su estado mental e infeccion del tracto urinario. El tratamiento con antibioticos seguido de Ig iV (2 g/Kg durante 5 dfas) resulto en una breve mejora neurologica. A continuacion, desarrollo sepsis y fue transferido a la UCI requiriendo traqueotoirna y tubo PEG. Repetidas Ig IV no mejoraron su estado mental. Se le trato entonces con Rituximab (1000 mg iv x 2 dosis separadas por 15 dfas) y se titulo la prednisona a 5 mg en dfas alternos. El curso clmico se complico por infecciones del tracto urinario y neumoma, mientras que su estado mental permanecio pobre durante 5 meses. Como mucho podfa vocalizar algunas palabras y seguir ordenes simples. Un descubrimiento sorprendente durante el examen en esta fase de la enfermedad es la exagerada respuesta al sobresalto por ruido o contacto. Adicionalmente exhibio frecuentes episodios de mioclono, disquinesia oral y paratoma; la fuerza muscular era normal.

Se le trato eventualmente con plasmaferesis. Despues de este primer cambio de plasma fue capaz de conversar normalmente con sus examinadores y contestar preguntas, pero no lo suficiente como para participar en un test cognitivo formal. A continuacion, recibio mensualmente pulsos intravenosos de ciclofosfamida con una mejora constante pero incompleta de la cognicion. Fue capaz de volver a casa tras 15 meses desde la aparicion de los smtomas. En el seguimiento tras 21 meses desde la aparicion de los smtomas y despues de recibir 9 dosis mensuales de ciclofosfamida intravenosa, continuaba en casa con la familia pero requena asistencia con muchas actividades cotidianas. En la prueba cognitiva, la orientacion estaba relativamente preservada pero presentaba deficiencias de atencion y concentracion, funcion ejecutiva, abstraccion, funcion espacio-visual y fluidez fonemica. Una prueba de memoria verbal revelo exito en la codificacion (requirio apunte). Consiguio una puntuacion de 9 sobre 30 puntos en la Evaluacion Cognitiva Montreal (MOCA). Perdio 45 kg durante el curso de la enfermedad.

Paciente 2:

En abril de 2008, una mujer de 45 anos de edad presentaba una diarrea progresiva y una perdida de peso de 30 kg. La endoscopia y la biopsia no pudieron encontrar una causa. Durante las siguientes 6 a 8 semanas noto deficiencias cognitivas, realizando un numero creciente de errores en el trabajo. En julio, fue ingresada en el hospital por agitacion y alucinaciones. En el examen se encontro paranoia, ansiedad, insomnio y se quejaba de sudoracion durante el sueno. Estos smtomas junto con la identificacion de anticuerpos antinucleares del suero (ANA > 2560) llevaron inicialmente a un diagnostico de lupus eritematoso.

En septiembre se transfirio a la paciente a una unidad de neurologfa. Nada mas ingresar se encontro que padeda sacudidas mioclonicas ocasionales, temblor en reposo de todas las extremidades, marcado nistagmo bilateral horizontal e hiperreflexia generalizada con los dedos de los pies hacia abajo. La resonancia magnetica del cerebro fue normal y el e Eg mostro episodios intermitentes de actividad generalizada de onda baja theta y delta. Los extensos analisis de sangre para infeccion y desordenes autoinmunes fueron negativos excepto para el anteriormente mencionado ANA (patron homogeneo). Analisis del FCS revelo 15 celulas sangumeas blancas (predominantemente linfocitos), concentracion de protema y glucosa normal y bandas oligoclonales sin pareja. TC de pecho, abdomen y pelvis sugena engrosamiento adnexal que se confirmo con ultrasonido. Un FDG-PET fue normal. Durante las siguientes 3 semanas se volvio cada vez mas agitada con un empeoramiento del mioclono y curso temblor en reposo de todas las extremidades. El Diazepam proporciono un cierto alivio sintomatico pero a lo largo de las siguientes 2 semanas desarrollo episodios de reducido nivel de conciencia y movimiento orofacial. La repeticion de EEG demostro descargas epileptiformes generalizadas de bajo voltaje, y se inicio medicacion anti-epileptica. La repeticion de la resonancia magnetica del cerebro fue normal. Sobre la base de una presumible inflamacion encefalopatica recibio metilprednisolona intravenosa (1 g diario durante 3 dfas) sin efecto. La frecuencia de las convulsiones empeoro y desarrollo frecuentes episodios de estadios epilepticos que fueron refractarios a numerosas medicaciones antiepilepticas, necesitando en ultima instancia sedacion, intubacion y apoyo ventilatorio. Cualquier intento de disminuir la sedacion resultaba en la recurrencia de los ataques epilepticos. En base a la lesion adnexal se llevo a cabo una histerectoirna y una salpingo-ooferectomfa bilateral. La patologfa mostro un utero fibroide. Se la empezo a tratar entonces con inmunoglobulina intravenosa (Ig IV) resultando en una mejora lenta y progresiva que permitio la extubacion y el alta de la UCI.

En enero de 2009, el analisis del suero y del FCS revelo un autoanticuerpo novedoso reaccionando con la superficie celular neuronal. Este descubrimiento y la persistencia de los smtomas neurologicos llevaron a la iniciacion del tratamiento con rituximab que se asocio con una recuperacion mas rapida y fue dada de alta en mayo de 2009. Posteriormente continuo mejorando y se discontinuo la medicacion antiepileptica. Actualmente tiene una cognicion normal y vive de forma independiente. Lleva a cabo controles regulares del conteo de linfocito CD 19 y recibe tratamiento adicional con rituximab cundo el conteo supera el 1%. En una ocasion este tratamiento fue retrasado provocando temblores recurrentes y nistagmo.

Paciente 3:

En junio 2006, esta mujer diestra de 58 anos de edad desarrollo alucinaciones y falta de equilibrio y fue ingresada en el hospital. Los siguientes examenes fueron normales: conteo de celulas sangumeas y qmmica, funcion tiroidea, anticuerpos de ANA y dsADN y estudios para la enfermedad de Lyme, fiebre de las montanas rocosas, virus de Coxsackie, Babesia y virus de la hepatitis C. La velocidad de eritrosedimentacion fue ligeramente superior a 43. La resonancia magnetica del cerebro mostro cambios no espedficos en la materia blanca sin contraste. La radiograffa del pecho fue normal. Los ultrasonidos carotidos no mostraron estenosis significativa. El EEG revelo una ralentizacion suave. El analisis del FCS mostro 11 celulas sangumeas blancas/mm3, todas mononucleares, protema 50 mg/dL y glucosa 74 mg/dL. El PCR del FCS para HSV, cultivos vmcos, titulacion de Lyme y antfgeno de criptococo fueron negativos. Se encontro una banda oligoclonal. Fue visitada por especialistas de neurologfa, enfermedades infecciosas, medicina interna y psiquiatna, y se la trato con risperidona, gabapentina, escitalopram y carvedilol. Con estas medicaciones recupero un 80% de su capacidad habitual y fue dada de alta.

En noviembre de 2006 desarrollo un incremento en la inestabilidad, con frecuentes cafdas, temblores, disartria, alucinaciones recurrentes y sonambulismo, con lo que fue reingresada. La repeticion de la resonancia magnetica del cerebro, angiograffa por resonancia magnetica y angiograffa cerebral fueron normales. La resonancia magnetica abdominal mostro la aparicion de un adenoma adrenal benigno. El EEG mostro una ralentizacion de fondo predominantemente en el hemisferio derecho. La TC de pecho, abdomen y pelvis mostro algun fluido alrededor del hombro, un pancreas homogeneamente activado y la lesion adrenal indicada anteriormente. La biopsia de la arteria temporal fue negativa. El FCS mostro 1 celula sangumea blanca, 0 celulas sangumeas rojas, glucosa a 87 mg/dL, protema a 38 mg/dL y cultivos negativos. Los estudios para HSV, anffgeno criptococal, virus del oeste del Nilo, enzima conversor de la angiotensina (ACE) y citologfa fueron todos negativos. Fue positivo para anti ADN monocadena, pero una vez negativo para anti doble cadena de ADN y una vez positivo a 62 (nl: < 25). Las pruebas negativas o normales incluyeron factor reumatoide, anticuerpo de anticadiolipina, IgG, SPEP, B12, SSA, SSB, Lyme, HSV, plomo, anticuerpo de histonas, LA, ANA, ANCA, anffgeno de superficie de hepatitis B, ceruloplasmina C3, C4, RNP, Smith, RPR, CRP, B12, RF, crioglobulinas, mercurio y arsenico en la orina y un panel completo paraneoplasico. Se la trato con 60 mg diarios de prednisona y mejoro.

En el transcurso de 2 meses se redujo la prednisona a 10 mg y se evaluo en nuestra institucion por primera vez en febrero de 2007. En el historial anterior eran destacables la hipertension, colecistectomfa y reemplazo de cadera. La medicacion inclrna 10 mg diarios de prednisona, pantoprazol, amlopidina, isosorbidemononitrato, carvedilol, clonidina, alendronato, levoflaxicina y albuterol. Durante el examen estaba alerta y respondfa al lenguaje normal, recordo 2/3 palabras y 3/3 con algun apunte. Tema nistagmo congenito pero los nervios craneales por otro lado eran normales. Mostraba debilidad en dorsiflexion y en los tobillos. Sensacion y reflejos eran normales. El andar era lento y mal coordinado. Se repitieron paneles reumatologicos y paraneoplasicos, porfirinas, beta-2-glicoprotemas, crioglobulinas y anticuerpos para TPO, siendo todos negativos.

Se redujo hasta su eliminacion la prednisona al mes siguiente y empeoro con alucinaciones, lentitud en el habla, temblores, mioclono y ataxia, y fue ingresada en el hospital. La resonancia magnetica del cerebro mostro un nuevo infarto no-agudo en el frontal derecho. La tomograffa computarizada de emision monofotonica (SPECT) del cerebro mostro una moderada hipoperfusion global. El EEG mostro una ralentizacion de fondo suave. La repeticion del analisis de FCS fue normal. El ecocardiograma trans-esofagico mostro un pequeno defecto de comunicacion interauricular. La repeticion del angiograma cerebral mostro solamente pequenos cambios aterioescleroticos y bifurcaciones carotidas. La biopsia cerebral revelo un infarto sin evidencia de inflamacion o vasculitis. La repeticion del TC de pecho, abdomen y pelvis mostro los quistes renales y adenoma adrenal previamente mencionados. Fue tratada con esteroides por via intravenosa, seguido de esteroides orales, aspirina, atorvastatina y sertralina. Sus smtomas neurologicos mejoraron y fue dada de alta con 80 mg diarios de prednisona. Posteriormente se redujo lentamente la prednisona y se anadieron lamotrigina, clonazepam y aripiprazol. Aunque los smtomas mejoraron continuo con disartria fluctuante, inestabilidad, temblores y mioclono. El analisis del FCS en diciembre de 2007 mostro 1 celula blanca sangumea, glucosa de 83 mg/dL, protema de 53 mg/dL y bandas oligoclonales positivas. Se anadio micofenolatemofetil 100 mg dos veces al dfa.

En abril de 2008 se redujo aun mas la dosis de prednisona. Entonces desarrollo herpes zoster y sus smtomas empeoraron con estado mental alterado y ataxia, y fue reingresada. Analisis del FCS mostro 53 celulas blancas sangumeas (94% linfocitos y 6% mononuclear), glucosa de 70 mg/dL y protema de 62 mg/dL. PCR para HSV, HHV-6, VZV, CMV, EBV, EEE, SLE, enterovirus y virus del oeste del Nilo fueron todos negativos. Se la trato con aciclovir intravenoso, se aumento la dosis de prednisona y se discontinuo el micofenolato. En ese momento el analisis de FCS revelo un anticuerpo novedoso contra la superficie celular de las neuronas. Se comenzo la Inmunoglobulina intravenosa (Ig IV) 2g/kg y se la dio de alta con prednisona 80 mg diarios con una suave reduccion y ciclos mensuales de Ig IV.

En septiembre de 2008 despues de la reduccion de la prednisona a 50 mg diarios, desarrollo un incremento en las alucinaciones. Se detuvo el Ig IV y se aumento la dosis de esteroides, primero usando esteroides intravenosos y posteriormente esteroides orales. Se comenzo con Rituximab (650 mg semanalmente * 4 dosis). La repeticion de las pruebas de FCS mostro ausencia de reactividad con la superficie celular de las neuronas. Mejoro inicialmente pero volvio a deteriorarse durante la lenta reduccion de esteroides desde 80 mg diarios a 50 mg diarios. En noviembre de 2008 recibio 1 dosis de 1000 mg de ciclofosfamida intravenosa, pero desarrollo neumoma criptococica impidiendo tratamiento adicional. El analisis neuropsicologico mostro deficiencias en la velocidad motora visual, comprension de ordenes complejas y secuencias manuales. Menos deficiente pero por debajo de las expectativas fue su capacidad memonstica, atencion auditiva, analisis visual y razonamiento por ensayo y error. Otros rendimientos en comprension/expresion del lenguaje, juicio, memoria para historias y orientacion fueron consistentes con la estimada funcion premorbida. Debido al agravamiento de la confusion se la trato 5 veces con plasmaferesis y prednisona continua diaria. La repeticion del analisis neuropsicologico en enero de 2009 mostro un nivel de cognicion general estable comparado con noviembre de 2008. El EEG continuo mostro ralentizacion de fondo pero debido a altibajos en el estado mental se anadio fenitoma. Mejoro y fue dada de alta para rehabilitacion con prednisona 50 mg diarios y fenitoma 100 mg dos veces al dfa.

Fue reingresada en febrero de 2009 con una trombosis venosa bilateral profunda y embolia pulmonar y se la trato con anticoagulantes y colocacion de un filtro en la vena cava inferior. Fue dada de alta en marzo de 2009 con 45 mg diarios de prednisona, 100 mg dos veces al dfa de fenitoma junto con medicacion para sus otros problemas medicos. Se redujo gradualmente la prednisona a lo largo de 30 meses y se discontinuo eventualmente. En enero de 2012, tras 4 meses de detener el tratamiento de prednisona, no presentaba smtomas de empeoramiento y estaba alerta, concentrada, totalmente orientada con un 3/3 de memoria y buen conocimiento de hechos actuales. No presentaba temblores, mioclono o alucinaciones. Camina con un paso ligeramente amplio y mal coordinado.

Resultados:

Los 4 pacientes (2 hombres, 2 mujeres; edades en el rango de 45-76 anos) desarrollaron una encefalopatfa de progreso rapido caracterizada por agitacion, delirios, alucinaciones y espasmos mioclonicos, de los cuales 3 pacientes se asocio con diarrea prominente de etiologfa indeterminada. Todos teman ataques confirmados o con sospechas clmicas y pleocitosis en FCS con evidencia de produccion intratecal de IgG o bandas oligoclonales. Informacion detallada de 3 pacientes mostro que tras multiples inmunoterapias todos presentaron una recuperacion sustancial hasta el ultimo seguimiento (18-68 meses desde la aparicion de los smtomas); no habfa mas que una minima informacion de seguimiento del cuarto paciente.

Ejemplo 2: inmunohistoqmmica en cerebro, intestino delgado y cultivos neuronales de ratas

Inmunohistoqmmica de cerebro y plexo mienterico de rata:

Ratas Wistar hembra fueron sacrificadas y se retiro el cerebro e intestino delgado, se seccionaron (cerebro de forma sagital, intestino transversalmente), se sumergieron en paraformaldetudo 4% a 4°C durante 1 hora, se crioprotegio con sucrosa al 40% durante 24 horas y se congelaron subitamente en isopentano enfriado con nitrogeno lfquido.18 Secciones de tejido de 7 pm de grosor fueron incubadas secuencialmente con H²O²al 0,3% durante 20 minutes, suero de cabra al 10% durante 1 hora y suero del paciente o control (1:200), FCS (1:2) o un anticuerpo policlonal de conejo para DPPS (diluido 1:1000, anticuerpo desarrollado por BR) a 4°C durante una noche. Despues de utilizar los anticuerpos biotinilados secundarios apropiados (cabra anti-humano BA-3000, o cabra anti-conejo BA-1000, laboratorios Vector, todos 1:2000), la reactividad fue desarrollada con el metodo avidin-biotin-peroxidasa tal y como se indica.18

Para el analisis de la expresion de DPPX en el intestino delgado de rata se utilizo anti-Hu IgG biotinilado humano (un marcador nuclear neuronal espedfico) con una dilucion de 1:200 junto con los anteriormente indicados anticuerpos policlonales DPPX de conejo (1:1000) o los anticuerpos de DPPX del FCS de pacientes, seguido por avidinarhodamina (1:500) y los anticuerpos fluorescentes secundarios adecuados a 1:1000 (IgGAlexa de cabra anti-conejo Fluor 488, o IgGAlexa de cabra anti-humano Fluor 488; Molecular Probes, Invitrogen). Se fotografiaron los resultados bajo microscopio de fluorescencia utilizando software Zeiss Axiovision (Zeiss, Thornwood, NY).

Inmunocitoquimica en cultivos neuronales:

Cultivos neuronales de hipocampo de rata se prepararon como se indica.19 Neuronas vivas cultivadas en portaobjetos fueron incubadas durante 1 hora a 37°C con suero del paciente o control (dilucion final 1:750) o FCS (1:10). Despues de eliminar el medio y tras lavado intensivo con tampon fosfato salino (PBS), se fijaron las neuronas con paraformaldelmdo al 4%, se permeabilizo con Triton X-100 0,1% y se inmunomarco con IgGAlexa de cabra antihumano Fluor 488 (1:1000).

Resultados:

Los 4 pacientes teman anticuerpos en suero o FCS que reaccionaron con el neuropilo del cerebro de los roedores (Figura 1 suplementaria) y con la superficie celular de cultivos vivos no permeabilizados de neuronas disociadas de hipocampo de rata (Figura 1A).

El analisis inmunohistoqmmico del intestino delgado demostro que DPPX se expreso espedficamente en neuronas del plexo mienterico y que los anticuerpos de los pacientes tambien reaccionaron con el DPPX expresado en estas neuronas (Figura 2).

Ejemplo 3: inmunoprecipitacion, espectrometna de masas e inmunoblot

Inmunoprecipitacion e inmunoblot:

Se cultivaron neuronas de hipocampo de rata en pocillos de 100 mm (densidad 106 neuronas/pocillo) y se incubaron a 37 °C con suero filtrado del paciente (dilucion 1:100) durante 1 hora. Se lavaron las neuronas con PBS, se lisaron con tampon (NaCl 150 mM, EDTA 1mM, tris(hidroximetil)aminometano [Tris]-HCl 100 mM, acido desoxicolico 0,5%, Triton X-100 1% [Sigma Labs, St. Louis, MO], pH 7,5) conteniendo inhibidores de proteasa (P8340; Sigma Labs) y centrifugado a 16,1 x 103 g durante 20 minutos a 4 °C. Se retuvo el sobrenadante y se incubo con protema A/G en perlas de agarosa (20423; Pierce, Rockford, IL) durante una noche a 4 °C, se centrifugo, y el pellet conteniendo las perlas con los anticuerpos de los pacientes ligados al antfgeno de superficie celular se lavo con PBS, se alicuoto y se conservo a -80 °C. Se resuspendio una alteuota de este pellet en tampon de Laemmli, se hirvio durante 10 minutos, se separo en un gel de poliacrilamida para electroforesis al 4 a 15% en dodecil sulfato sodico, y se visualizo las protemas con gel de tincion EZBlue (G1041; Sigma Labs). Las bandas visibles de protema precipitada por el suero de los pacientes fueron extrafdas del gel y analizadas utilizando espectrometna de masas en la instalacion central de proteomica del Instituto de genomica en el Abramson Cancer Center (Universidad de Pennsylvania). Despues de la caracterizacion del antfgeno, se separaron alteuotas congeladas de los pellets indicados mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sodico como se describio anteriormente, se transfirio a una membrana immobilon-P (Millipore IPVH00010) y se tino con el anticuerpo indicado contra DPPX (desarrollado por BR, 1:0000). La reactividad se desarrollo utilizando los anticuerpos secundarios apropiados biotinilados (1:2000) y el metodo de avidina-biotina peroxidasa y el metodo de diaminobencidina.

Espectrometna de masas:

Se cortaron las bandas de protema de los geles y se enviaron a la instalacion de proteomica de la Universidad de Pennsylvania. Se digirieron las bandas de protema con tripsina y se analizaron con un espectrometro de masas (Thermo Electron Corporation, San Jose, c A) de cromatograffa nano lfquida (nano LC)/nanospray/trampa de iones lineal (TIL) tal y como se indica.20 Brevemente, se inyectaron 3 pL de muestra digerida con tripsina en el autocargador de Eksigent (Dublin, CA). Las muestras digeridas se separaron en una columna C18 de 10 cm, utilizando nano LC de Eksigent con un flujo de 200 pL/min, gradiente de 45 minutos. Se utilizo nanospray en lmea para la separacion de los peptidos en LTQ y el software Xcalibur (Thermo Scientific, Waltham, MA) para la adquisicion de datos en bruto. Los ficheros de los datos en bruto se exploraron utilizando Mascot (Matrix Science, Boston, MA) contra las bases de datos NCBI y Swissprot (Swiss Institute of Bioinformatics, Basilea, Suiza). El corte para la identificacion de confianza de la protema fue >70.

Resultados:

La inmunoprecipitacion del antigeno objetivo con el suero de uno de los pacientes, seguido de separacion electroforetica de protemas y tincion en gel EZBlue mostro una banda distintiva de aproximadamente 100 kDa que no estaba presente en el inmunoprecipitado utilizando el suero de control (Figura 1B). La excision de la banda del gel y el analisis mediante espectrometna de masas demostro que contema secuencias derivadas de DPPX (puntuaciones 6441, 5945 y 383; puntuacion de corte para identificacion de confianza de la protema >70). Este descubrimiento se confirmo mediante inmunoblotting del precipitado con un anticuerpo espedfico para DPPX (Figura 1C).

Ejemplo 4: inmunocitoqmmica en celulas HEK293

Se transfectaron celulas HEK293 con plasmidos conteniendo DPPX-S de rata (dominio citoplasmico corto de 32 aminoacidos), DPPX-L (dominio citoplasmico largo de 88 aminoacidos), DPPXed-myc (constructo DPPX con dominio extracelular eliminado, y ligado a myc-tag), rata Kv4.2, DPPX humano (DPP6; Origene, secuencia NM_001039350.1; SEC ID N°: 1), humano DPP10), o plasmido sin inserto (control).11 En otros experimentos se co-transfectaron las celulas con DPPX y Kv4.2 en relaciones equimolares. La reactividad de los anticuerpos de pacientes se evaluo como se ha indicado anteriormente.21 Para este proposito se cultivaron las celulas durante 24 horas tras la transfeccion antes de la evaluacion. Las celulas transfectadas se fijaron con paraformaldelddo 4%, se permeabilizaron con Triton X-100 0,1% y se incubaron con suero de pacientes (1:200) o FCS (1:2) y dependiendo del antfgeno de interes uno de los siguientes anticuerpos, DPPX (policlonal de conejo desarrollado por BR diluido 1:1000; policlonal de conejo abcam 41811 diluido 1:200 o monoclonal de raton Sta Cruz #365147 diluido 1:500), Kv4.2 (policlonal de conejo, Alomone Labs, #APC-023 diluido 1:500), o anticuerpo myc-tag (monoclonal de raton myc-tag 9B11, Cell Signaling, diluido 1:2000) durante 2 horas, y el correspondiente anticuerpo secundario fluorescente (cabra anti-humano IgGAlexa Fluor 488; cabra anti-conejo IgG Alexa Fluor 555, o cabra anti-raton IgGAlexa Fluor 555, todos a 1:1000). Los resultados se fotografiaron bajo un microscopio de fluorescencia utilizando el software Zeiss Axiovision (Zeiss, Thornwood, NY).

Resultados:

Las celulas transfectadas con DPPX-S o DPPX-L de rata mostraron reactividad similar con suero o FCS de pacientes, consistente con el reconocimiento de un epttopo extracelular (la Figura 3 muestra la reactividad con DPPX-L; se obtuvo reactividad similar con DPPX-S, no mostrado). Los anticuerpos de los pacientes no reaccionaron con las celulas expresando Kv4.2 (Figura 2 suplementaria) y la reactividad con DPPX no se modifico cuando se coexpreso con Kv4.2 (datos no mostrados). Analisis posteriores utilizando un plasmido de DPPX de rata en el cual se elimino el dominio extracelular (DPPXed-myc)11 mostraron abrogacion de la reactividad con el suero y FCS de los pacientes 1 y 4, y reactividad debil con el suero y FCS de los pacientes 2 y 3, indicando que los ultimos dos pacientes teman anticuerpos contra la superficie celular y epftopos intracelulares (paneles D y G de la Figura 3 suplementaria). Adicionalmente, las celulas HEK293 transfectadas con DPPX humano tambien mostraron reactividad con el suero o FCS de los 4 pacientes con anticuerpos DPPX (muestra que reaccionan con secuencias de DPPX de rata) mientras que no mostraron reactividad con el suero y FCS de 10 individuos sanos. Aunque DPPX y DPP10 tienen un 51% de identidad de la secuencia de aminoacidos,12 los anticuerpos de los pacientes no reaccionaron con DPP10 (datos no mostrados). Globalmente estos descubrimientos demuestran que los anticuerpos de los pacientes son espedficos de DPPX pero no del canal Kv4.2, y que algunos pacientes tienen anticuerpos contra ambos, los dominios intracelular y extracelular de DPPX.

A continuacion, los inventores determinaron la reactividad del suero o FCS de los 149 controles con un ensayo basado en celulas coexpresando DPPX y Kv4.2. No se encontro que ninguno de estos sujetos tuviera anticuerpos que reaccionasen contra estas 2 protemas, sugiriendo que los anticuerpos contra DPPX son espedficos del subgrupo de pacientes con encefalitis autoinmune. Contrariamente, un paciente sin encefalitis con un timoma y miastenia seronegativa gravis (incluido en los controles) tema anticuerpos para DPP10, pero no para DPPX (Martmez-Hernandez, datos no mostrados).

Ejemplo 5: inmunohistoqmmica con ratones de tipo salvaje y DPPX-nulo

Se generaron y genotipificaron ratones de tipo salvaje y DPPX-nulo tal y como se ha indicado previamente.22 Los cerebros se extrajeron, seccionaron sagitalmente, procesaron y examinaron mediante el metodo estandar de inmunohistoqmmica avidina-biotina-peroxidasa utilizando suero (1:200) o FCS (1:5) de los pacientes tal y como se ha indicado para el cerebro de rata.

Resultados:

Para acabar de confirmar la especificidad de los anticuerpos de los pacientes para DPPX, se comparo la inmunohistoqmmica del cerebro de ratones de tipo salvaje con el de ratones DPpX-nulo. Estos experimentos demostraron abrogacion de la reactividad del suero o FCS de 3 pacientes (aquellos mostrados en la Tabla 1) con el cerebro de ratones DPPX-nulo indicando que los anticuerpos de los pacientes se dirigieron unicamente contra DPPX, y que el paciente 1 tema anticuerpos adicionales contra otra protema de identidad desconocida (Figura 4H).

Referencias

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21. Dalmau J, Gleichman AJ, Hughes EG, Rossi JE, Peng X, Lai M, et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case

Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso de un polipeptido o protema que comprende uno o varios epftopos de protema-6 similar a dipeptidil-peptidasa en un metodo in vitro de diagnostico de un trastorno autoinmune del sistema nervioso en un sujeto.

2. El uso de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado porque el polipeptido o protema comprende

a. la secuencia de acuerdo con la SEC. ID N°: 1 o una secuencia de aminoacido con al menos 70%, al menos 75, al menos 80, al menos 90, al menos 92, al menos 94, al menos 96, al menos 98 o al menos 99% de identidad de secuencia respecto a SEC. ID. N°: 1, y/o

b. la secuencia de acuerdo con la SEC. ID N°: 2 o una secuencia de aminoacido con al menos 70%, al menos 75, al menos 80, al menos 90, al menos 92, al menos 94, al menos 96, al menos 98 o al menos 99% de identidad de secuencia respecto a SEC. ID. N°: 2, y/o

c. la secuencia de acuerdo con la SEC. ID N°: 3 o una secuencia de aminoacido con al menos 70%, al menos 75, al menos 80, al menos 90, al menos 92, al menos 94, al menos 96, al menos 98 o al menos 99% de identidad de secuencia respecto a SEC. ID. N°: 3, y/o

d. La secuencia de acuerdo con la SEC. ID N°: 4 o una secuencia de aminoacido con al menos 70%, al menos 75, al menos 80, al menos 90, al menos 92, al menos 94, al menos 96, al menos 98 o al menos 99% de identidad de secuencia respecto a SEC. ID. N°: 4.

3. El uso de acuerdo con la reivindicacion 1, donde

(a) el polipeptido o protema tiene al menos 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 aminoacidos consecutivos de secuencias de aminoacido de acuerdo con SEC. ID. N°: 1, SEC. ID. N°: 2, SEC. ID. N°: 3 o SEC. ID. N°: 4; o (b) el polipeptido o la protema es un homologo con al menos 70, al menos 75, al menos 80, al menos 90, al menos 92, al menos 94, al menos 96, al menos 98 o al menos 99% de identidad de secuencia respecto al polipeptido o protema de (a).

4. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el polipeptido o protema comprende otros aminoacidos, los cuales se unen de forma N-terminal o C-terminal y facilitan la purificacion del polipeptido o protema.

5. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el polipeptido o protema esta unido a una molecula reportera o una fase solida.

6. Uso de un acido nucleico que codifica un polipeptido o protema que comprende uno o varios epftopos de protema-6 similar a dipeptidil-peptidasa en un metodo in vitro de diagnostico de una enfermedad autoinmune del sistema nervioso en un sujeto.

7. Uso de un vector que comprende un acido nucleico que codifica un polipeptido o protema que comprende uno o varios epftopos de protema-6 similar a dipeptidil-peptidasa en un metodo in vitro de diagnostico de una enfermedad autoinmune del sistema nervioso en un sujeto, en el que el vector se ajusta para la expresion de dicho polipeptido o protema.

8. Uso de una celula que comprende un vector que comprende un acido nucleico que codifica un polipeptido o protema que comprende uno o varios epftopos de protema-6 similar a dipeptidil-peptidasa en un metodo in vitro de diagnostico de una enfermedad autoinmune del sistema nervioso en un sujeto.

9. Un metodo de diagnostico in vitro para el diagnostico de una enfermedad autoinmune del sistema nervioso central que comprende la etapa de deteccion de un anticuerpo que se une espedficamente a protema-6 similar a dipeptidilpeptidasa humana en una muestra de un sujeto.

10. El metodo de diagnostico in vitro de acuerdo con la reivindicacion 9, caracterizado porque la muestra de un sujeto se pone en contacto con un polipeptido o protema que comprende uno o varios epftopos de protema-6 similar a dipeptidil-peptidasa humana y se detecta la union de un anticuerpo de la muestra al polipeptido o protema.

11. El metodo de diagnostico in vitro de acuerpo con las reivindicaciones 9 o 10, caracterizado porque la union de un anticuerpo de la muestra al polipeptido o protema se detecta con un ensayo de inmunofluorescencia, micromatriz de protemas, ELISA, ensayo de luminiscencia, blot, ensayo radioinmune, western blot o dot blot.

12. Uso de un kit de ensayo que comprende un polipeptido o protema que comprende uno o varios epftopos de protema-6 similar a dipeptidil-peptidasa en un metodo in vitro de diagnostico de una enfermedad autoinmune del sistema nervioso en un sujeto.

13. Uso de una composicion farmaceutica que comprende un polipeptido o protema que comprende uno o varios epftopos de protema-6 similar a dipeptidil-peptidasa en un metodo in vitro de diagnostico de una enfermedad autoinmune del sistema nervioso en un sujeto.