CN104640877B

CN104640877B - 用于检测自身免疫性疾病的诊断方法和相关主题

Info

Publication number: CN104640877B
Application number: CN201380047212.9A
Authority: CN
Inventors: J·达尔茂
Original assignee: Institucio Catalana de Recerca i Estudis Avancats ICREA; Institut dInvestigacions Biomediques August Pi i Sunyer IDIBAPS
Current assignee: Institucio Catalana de Recerca i Estudis Avancats ICREA; Institut dInvestigacions Biomediques August Pi i Sunyer IDIBAPS
Priority date: 2012-09-11
Filing date: 2013-09-11
Publication date: 2021-06-18
Anticipated expiration: 2033-09-11
Also published as: PL2895507T3; US20150247847A1; CA2884282A1; EP2895507A1; CA2884282C; ES2712474T3; US9719993B2; WO2014041035A1; CN104640877A; EP2895507B1; SI2895507T1

Abstract

本发明涉及用于受试者中自身免疫性疾病的诊断或治疗方法的多肽或蛋白质，特征在于所述多肽或蛋白质包含衍生自蛋白DPPX的一个或更多表位。此外，本发明涉及编码这样的多肽的核酸或载体、包含这样的载体的细胞、涉及这样的多肽的体外诊断方法和检测试剂盒、包含这样的多肽的药物组合物、涂敷有这样的多肽或药物组合物的医疗设备(device)和用于治疗受试者中自身免疫性疾病的方法。

Description

用于检测自身免疫性疾病的诊断方法和相关主题

发明领域

本发明涉及新鉴定的自身免疫性疾病的诊断和治疗，提供包含衍生自新的细胞表面自身抗原的至少一个表位的多肽或蛋白以及用于检测和治疗所述自身免疫性疾病的相关手段(means)和方法。

发明背景

记忆、行为、认知和思维过程可以被自身抗体改变的这一发现已经改变了之前被认为是特发性的(idiopathic)神经精神疾病的诊断和治疗方法(approach)。从2007年以来，已经鉴定了七种这样的抗体 (抗NMDAR、AMPAR、GABA(B)、LGI1、Caspr2、GlyR和mGluR5)，均靶向细胞表面蛋白质，所述蛋白质参与突触传递、可塑性或神经兴奋性并与尽管严重但通常对免疫治疗作出应答的综合征有关。¹患者可昏迷数月，具有怪异的行为、异常的动作或顽固性癫痫并在免疫治疗和扩展的护理支持下仍然恢复。²考虑到直到最近这些疾病是未知的，一些疾病相对高的频率已经是令人惊讶的。例如，在专注于脑炎的诊断和流行病学的中心(加利福尼亚脑炎项目)里，抗NMDAR脑炎的频率超过了任何个体病毒性脑炎的频率。³由于这些原因，在未知病因的脑炎(经常发生的情况)的背景下发展成快速进展性神经精神症状的患者中，类似的免疫机制被越来越多地予以考虑。目前大约70％的不明病因的脑炎在针对感染性病因的广泛评估之后仍未得到诊断。⁴在这样的情形下，针对神经元细胞表面抗原的自身抗体的鉴定将管理转向了免疫治疗的使用，并且可以在其它方式被认为是徒劳的情况下扩展重症监护支持。

鉴于上述情况，本发明的潜在问题在于提供分别用于之前未鉴定的自身免疫性脑炎或不明病因的脑炎的诊断和治疗的手段。

发明概述

该问题由本申请权利要求的方案得到解决，特别是通过提供包含衍生自DPPX(用于检测和治疗自身免疫性疾病(特别是脑炎)的新的自身抗原)的至少一个表位的多肽或蛋白质，编码这样的多肽的核酸或载体，包含这样的载体的细胞，涉及这样的多肽的体外诊断方法和检测试剂盒，包含这样的多肽的药物组合物，涂敷有这样的多肽或药物组合物的医疗设备以及用于治疗受试者中自身免疫性疾病(特别是脑炎)的方法。

本发明的一个优点在于这样的事实，病因不明脑炎的诊断能够分别鉴定所述疾病为自身免疫性脑炎，区分其它(非自身免疫性)形式的脑炎或其他疾病或相关的症状，并从而给患者的具体治疗提供例如免疫抑制剂。

附图概述

图1显示DPPX的免疫沉淀；

图2显示肠肌丛中DPPX的表达；

图3显示采用基于细胞的测定分析DPPX抗体；

图4显示采用DPPX无效突变体和野生型小鼠的大脑对比患者的血清反应性；

图5显示用患者的血清免疫染色的大鼠大脑；

图6显示采用表达缺失了DPPX细胞外结构域的突变体 (DPPXed-myc)的基于细胞的测定分析患者的抗体；以及

图7显示采用表达Kv4.2的基于细胞的测定分析患者的抗体。

发明详述

根据本发明，“多肽”应理解为两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个或更多个氨基酸的聚合物，其可以包括标准氨基酸以及非标准氨基酸。本文互换使用术语多肽、肽和蛋白质。

对于本发明，术语“自身免疫性疾病”涉及与抗DPPX抗体的出现有关的疾病。如本文所报道的，具有这样的自身免疫性疾病的患者患有例如包括癫痫、认知功能障碍、幻觉、精神病症状、情绪激动、神志不清、静止性震颤和肌阵挛的症状。这些症状的大部分与神经疾病有关。因此，根据本发明一个优选的实施方案，自身免疫性疾病是神经系统的自身免疫性疾病。此外，本文所列的症状至少部分与中枢神经系统的缺陷有关。因此，根据本发明的另一个实施方案，所述自身免疫性疾病是自身免疫性脑炎。更进一步地，一组特定的症状(如震颤)也可以是由外周神经系统的缺陷(例如由影响运动神经元的自身免疫性疾病)引起的。因此，根据本发明一个进一步的实施方案，所述自身免疫性疾病是外周神经系统的自身免疫性疾病。另外，在患有本文所述的疾病的患者中观察到严重的腹泻、便秘和体重减轻，表明其它组织(如消化道的组织)也可以受这样的自身免疫性疾病的影响。因此，根据本发明的一个实施方案，所述自身免疫性疾病是自主神经系统的自身免疫性疾病。本文互换使用术语病症(disorder)和疾病 (disease)。

在本发明的范围内，“表位”应理解为能够被抗体特异性识别(即结合)的多肽的一部分。所述表位可以是构象表位(由多肽的氨基酸序列的不连续部分组成)或线性表位(由多肽的氨基酸序列的连续部分组成)。

在本发明的范围内，对于表位，术语“衍生的”涉及由多肽或蛋白质的一级氨基酸序列的不连续或连续部分形成的表位。本领域已知的是，表位中的一个或更多个氨基酸可以被取代，例如通过基本上不改变抗体结合强度或特异性的保守氨基酸置换(例如谷氨酸至天冬氨酸 E→D，谷氨酰胺至天冬酰胺Q→N，苯丙氨酸至酪氨酸F→Y，亮氨酸至异亮氨酸L→I)。因此，术语“衍生的”还涉及这样的表位：当与具有原始氨基酸序列的表位相比，尽管在氨基酸序列上具有差异，所述表位表现出不变的或基本上不变的抗体结合强度或特异性。

根据本发明，“核酸”涉及DNA或RNA聚合物，还包括其化学衍生物或合成类似物(如肽核酸或吗啉代核酸)。本领域已知的是，由于遗传密码的简并性，核酸编码的某些变化不会导致其所编码的肽序列的变化。因此，术语“核酸”还涵盖编码相同肽序列、与原始核酸序列在序列上存在不同的核酸序列。

根据本发明的“载体”应理解为包括插入物(例如编码所需蛋白质的基因或核酸序列)和其它特征(如载体复制、所述插入物的表达、承载载体的宿主细胞的阳性选择或标记蛋白的表达所需的序列)的环状或线性核酸序列。这样的载体和序列是本领域广泛已知的。

本发明范围内的“细胞”是能够被载体转化的任何原核或真核宿主细胞。例如，细胞可以是细菌细胞(如大肠杆菌细胞)或真核细胞(如永生化的人培养细胞)。永生化的人培养细胞的一个例子是HEK293 细胞。

术语“DPPX”涉及二肽基肽酶样蛋白-6(DPP6或DPPX)，KV4.2 钾通道的细胞表面辅助亚基。DPPX的同义词包括二肽基氨肽酶相关蛋白、二肽基肽酶6、二肽基肽酶IV样蛋白和二肽基肽酶VI。

DPPX是高度保守的，使得即使是来自与人类关系较远的物种的 DPPX也适合于引发与人抗DPPX抗体的特异性结合。这也适用于 DPPX蛋白的所有人同种型。此外，已知例如线性MHC I类表位长度为大约8至11个氨基酸。因此，在DPPX同系物中，在各自物种和人类之间保守的、长度在8至11个氨基酸的区域原则上已足以引发与人抗DPPX抗体的特异性结合。在这方面，构成构象表位的保守序列可能甚至更短。因此，对于本发明，“DPPX”涉及源自真核生物、优选哺乳动物、更优选智人(homo sapiens)或大鼠(rattus norvegicus) 的DPPX蛋白的任何已知同种型。

此外，与人抗DPPX抗体的特异性结合也可被DPPX的同系物(如 DPPX天然存在的同系物)引发。还包括DPPX非天然存在的同系物，例如，如通过单个或多个氨基酸或甚至蛋白质基序或结构域的缺失或交换衍生自DPPX天然存在的同系物的同系物。因此，对于本发明， “DPPX”还涉及DPPX天然和非天然存在的同系物。

我们在本文中报道4位患有新型自身免疫性疾病的患者，特征在于与抗DPPX(KV4.2钾通道的细胞表面辅助亚基)抗体有关的认知功能障碍、情绪激动、幻觉、神志不清、静止性震颤和肌阵挛的亚急性发展。在三位患者中，严重腹泻和体重减轻先于神经学症状出现或与其重叠，其程度达到两位患者进行了广泛的内窥镜活检而没有得到明确诊断的地步。脑脊液(CSF)细胞增多、增加的IgG指数或寡克隆带和针对密集或持久的免疫治疗的神经学应答的存在给该病的自身免疫性病因提供支持。采用患者的抗体，三组实验确立了DPPX作为主要自身抗原：从分离的大鼠海马神经元的培养物中免疫沉淀DPPX；基于细胞的测定中DPPX的免疫染色和野生型和DPPX无效小鼠的对比大脑免疫染色，显示出患者抗体与DPPX无效小鼠大脑的反应性的消除，并在一位患者中显示出针对未知抗原的额外的抗体。

DPPX具有通过重构通道门控“上调(tuning up)”Kv4.2通道的关键作用。⁵这种类型的钾通道属于哺乳动物Shal K+通道家族⁶(其具有与Shaker K+(Kv1)家族相比不同的性质)，之前被认为是抗体相关边缘性脑炎、神经性肌强直或莫旺氏(Morvan’s)综合征(主要自身抗原是LGI1和Caspr2)的靶标。^7,8Kv4.2通道在膜电位的亚阈值范围内工作。⁵这种细胞体-树突亚阈值A型K+电流(I_SA)是决定细胞体-树突信号整合的电压门控离子流的集合(ensemble)的关键组成部分。⁹在许多神经元中，始于轴丘(axon hillock)的动作电位不但沿轴下传而且回传入树突。在树突树中，这些动作电位充当报告神经元输出状态的信号。树突中的瞬时亚阈值I_SA电流减弱动作电位的这种回传。在静息条件下，I_SA关闭该动作电位，因为它试图传入树突树的远端区域。然而，在某个时间窗口内兴奋性突触输入与体细胞动作电位配对时，在远端树突中随之而来的亚阈值去极化灭活I_SA，并且回传动作电位的衰减实质上被降低了。⁶据信，这种相互作用提供了一致性检测机制，其在树突Ca++信号传导、信号整合和突触可塑性中起着重要作用。^5,6,9

Kv4通道的功能依赖于两个辅助亚基，即细胞内Kv通道相互作用蛋白(KChIPs)，¹⁰和细胞外DPPX(主要表达于海马锥体神经元和小脑)或DPP10(具有不同的大脑表达谱并且还存在于胰腺)。^11，12DPPX由短的细胞质N末端、单个跨膜结构域和大的细胞外C末端组成。依赖于细胞质结构域的长度，已经鉴定了两个成熟形式，DPPX-S 和DPPX-L。^13，14与抗细胞外表位抗体的存在一致的是，我们的4位患者的血清和CSF同等识别DPPX-S和DPPX-L，但是两位患者具有抗细胞外C末端被缺失的突变体构建体中存在的细胞内表位的额外的抗体。

三位患者广泛的评估和延长的随访表明该病是严重的，导致在免疫治疗被降低的同时常常发生的漫长的住院或多次复发。患者1#能够在症状出现15个月之后返回家中，并且在泼尼松逐渐减量的同时发生临床复发。患者2#在医院呆了10个月并且当CD19计数增加至1％时目前继续接受利妥昔单抗治疗。有一次延误治疗导致症状复发。患者3#在5年中发生7次复发，大部分与试图降低类固醇的剂量有关。

该病的主要症状(包括情绪激动、肌阵挛、震颤和癫痫，尽管不是具体综合征的特征)与神经元过度兴奋相容，并与在DPPX敲除的电生理研究中指出的增加的兴奋性一致。¹⁵有趣的是，患有颞叶癫痫的患者中鉴定的Kv4.2的截短突变导致表达该突变体通道的细胞的异常兴奋性。¹⁶总之，这些发现表明，DPPX-Kv4.2复合体的遗传或免疫性改变导致神经元过度兴奋。在临床实践中，上述神经学症状与严重腹泻和非器官特异性抗体(例如ANA)的组合可导致广泛的鉴别诊断，包括如在我们的患者中发生的惠普尔氏(Whipple’s)病或系统性红斑狼疮等很多病。

此时腹泻的意义尚不清楚，但该症状是值得注意的，因为它是严重的、持续数周的并且仅发生于脑炎的初始时期。另外，回顾我们与被怀疑是自身免疫性的脑炎的经验表明，在腹泻和DPPX抗体相关脑炎之间存在联系。实际上，在2009年至2012年之间所检查的不明病因的1429例脑炎病例中，仅有11例在症状出现时具有严重腹泻。这些11位患者中的三位对应于这里所报道的病例，其它8位并不具有 DPPX抗体；没有腹泻的1418例病例中没有一例具有如DPPX抗体阳性样品所显示的血清或CSF大脑反应性(参见图5A)。腹泻和DPPX 相关脑炎的相关性的合理解释是，在一些患者中，免疫应答可能是由 DPPX和仍然未知的感染因子(infectious agent)之间的分子模拟 (mimicry)产生的。这种模式会类似于促发患有Guillain-Barré综合征和空肠弯曲菌感染的患者的GM1自身抗体的机制。另外，由肠肌丛神经元的DPPX的强劲表达支持以下可能性：与大脑中DPPX被消除时发生的CNS过度兴奋类似，患者的抗体可能改变神经丛的功能，导致胃肠机能亢进。¹⁵

在这种背景下，本发明提供了用于受试者中自身免疫性疾病的诊断或治疗方法的多肽或蛋白质，该多肽或蛋白质特征在于它包含衍生自蛋白DPPX的一个或更多个表位。

在本发明的一些实施方案中，根据本发明的多肽或蛋白质包括或具有根据SEQID NO:2的氨基酸序列，相应于来自大鼠(rattus norvegicus)的DPPX-S和DPPX-L共同的细胞外结构域。备选地或者此外，根据本发明的多肽或蛋白质可以包括或具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列，相应于来自大鼠(rattus norvegicus)的DPPX-L的细胞内和跨膜结构域。在本发明的其它实施方案中，备选地或者除上述之外，根据本发明的多肽或蛋白质包括或具有根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列，相应于来自大鼠(rattus norvegicus)的DPPX-S的细胞内和跨膜结构域。

根据本发明的其它实施方案，根据本发明使用的多肽或蛋白质包括或具有与DPPX蛋白或根据SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列具有至少70、至少75、至少80、至少 90、至少92、至少94、至少96、至少98或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在其它实施方案中，本发明涉及具有根据SEQ ID NO:1、 SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4的序列的至少20、25、 30、40、50、60、70、80、90或100个连续氨基酸的DPPX蛋白或多肽的片段。在本发明进一步的实施方案中，本发明涉及与这样的片段的序列具有至少70、至少75、至少80、至少90、至少92、至少94、至少96、至少98或至少99％序列同一性的这样的片段的同系物。

根据本发明一个优选的实施方案，所述多肽或蛋白质包含进一步的氨基酸，所述氨基酸是N端或C端连接的并促进所述多肽或蛋白质的纯化。

例如，这样的氨基酸可以构成特定的序列或标签，其是专门由其它分子、优选蛋白质、更优选抗体识别的。这样的标签是本领域广泛已知的，包含例如flag-标签、myc-标签或strep-标签。

根据其它的优选实施方案，备选地或者除上述之外，根据本发明使用的多肽或蛋白质被连接至报告分子或固相。

在本发明的范围内，报告分子应理解为允许直接或间接检测其所连接的多肽或蛋白质的不存在或存在或者其所结合的抗体的不存在或存在的分子。许多种报告分子是本领域已知的，包括例如放射性标记物、荧光染料或蛋白质(例如荧光素(fluorescine)、四甲基罗丹明 (tetramethylrodamine)、绿色荧光蛋白(GFP))、半抗原(haptenes) (例如生物素)或酶(例如α-半乳糖苷酶A、萤光素酶、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶，适用于采用酶可转换的染料的检测)。这样的报告分子可以通过化学偶联在蛋白合成过程中(包含放射性标记氨基酸，融合蛋白的产生)或者在蛋白合成之后被加至靶蛋白。

与本发明相关的固相涉及任何固相基质，其中多肽或蛋白质可以被连接至所述基质，例如通过直接或间接共价结合或通过经由氢键和/ 或亲脂性相互作用的亲和结合。例如，本发明的多肽或蛋白质可以被连接至微量滴定板的材料、磁珠的表面、膜(例如硝酸纤维素或PVDF 膜)或连接至色谱柱或片(sheet)的固相。

本发明还提供编码根据本发明的多肽或蛋白质的核酸和载体。在一个优选的实施方案中，根据本发明的载体被调整用于根据本发明的多肽或蛋白质的表达。

另外，本发明还提供包含根据本发明的载体的细胞。这样的细胞可采用本领域已知的方法进行利用以产生载体的拷贝或以表达根据本发明的多肽或蛋白质。此外，这样的细胞还可以构成用于检测抗体和多肽或蛋白质的结合的诊断手段(means)(例如通过将所述多肽或蛋白质提呈于其表面)。

本发明还提供了体外诊断方法，特征在于使来自受试者的样品与根据本发明的多肽或蛋白质接触并检测来自该样品的抗体与该多肽或蛋白质的结合。根据本发明一个优选的实施方案，所述体外诊断方法包括用免疫荧光检测、蛋白质微阵列、ELISA、发光检测 (luminiscence-test)、印迹法、放射免疫检测、蛋白质印迹法或斑点印迹法检测来自患者样品的抗体与该多肽或蛋白质的结合。

这样的样品可以是人体的任何分离的部分，如组织或体液的部分，只要该部分含有抗体。例如，所述样品是液体样品，如脑脊液(液 (liquor))、血液或血浆、淋巴液或组织间液(insterstitial fluid) 或组织样品如淋巴结组织、神经组织、肌肉组织或来自消化道的组织。

此外，在本发明的上下文中提供了用于抗体检测的检测试剂盒，所述检测试剂盒包含根据本发明的一种或更多种多肽或蛋白质。

此外，本发明提供了包含根据本发明的多肽或蛋白质的药物组合物。除本发明的多肽或蛋白质之外，根据本发明的药物组合物还可以包含一种或更多种药物活性物质。此外，根据本发明的药物组合物可以包含一种或更多种药物赋形剂。根据本发明的药物组合物对于来自受试者血液或血浆的不同类(IgA、IgG)的抗体的结合/吸收、特别是对于自身免疫性疾病的体外治疗特别有效。例如，所述药物组合物可以被用于免疫血浆取出法(immunopheresis)。在这方面，本发明还提供了涂敷有根据本发明的多肽、蛋白质或药物组合物的医疗设备。例如，所述医疗设备可以是被用于常规或免疫血浆取出法并包含与要治疗的受试者的血液或血浆进行接触的表面的设备。

此外，本发明还提供了用于治疗受试者中自身免疫性疾病的方法，该方法包含以下步骤：

a.对来自受试者的液体样品进行本发明的体外诊断方法，以及

b.用至少一种合适的药物物质和/或血浆交换治疗该受试者。

根据本发明，合适的药物物质可以包括调节(特别是抑制)受试者的免疫系统或其特定部分的物质。合适的药物物质还可以是用于治疗与要被治疗的自身免疫性疾病相关或由其引起的症状和状况 (condition)的物质。根据本发明一个优选的实施方案，所述合适的药物物质选自由以下组成的组：利妥昔单抗、泼尼松、甲泼尼龙、环磷酰胺、拉莫三嗪、氯硝西泮、阿立哌唑(apiriprazole)、苯妥英、霉酚酸莫酯、静脉注射免疫球蛋白、他克莫司和环孢素。

此外，本发明提供了用于治疗受试者中自身免疫性疾病的方法，其中(优选地)所述受试者是人类，该方法包含以下步骤：

a.从受试者取血液或血浆，

b.将所述血液或血浆与本发明的药物组合物或医疗设备接触以去除疾病相关抗体，以及

c.将所述血液或血浆重新施用给该受试者。

在这样的方法例如免疫血浆取出法中，通过将所述血液或血浆与根据本发明的固定的多肽或蛋白质接触而从受试者的血浆去除疾病相关抗体。相应的方法已被描述例如用于基于β-肾上腺素能受体的序列的扩张型心肌病的治疗。¹⁷

附图说明

图1：DPPX的免疫沉淀

在分离的大鼠海马神经元的培养物中，患者的抗体显示出与神经元细胞表面强烈的反应性(A)，小棒(bar)＝10μm。抗原与指示病例(index case)的血清的免疫沉淀示于B中，其中所沉淀的蛋白质进行凝胶电泳并随后用EZblue染色。需要注意的是，患者的抗体沉淀蛋白质(在泳道P中接近102kDa的带)，其被从凝胶切出并通过质谱法进行分析，证实了DPPX的序列。泳道N是从对照血清获得的沉淀。这些蛋白与抗DPPX兔多克隆抗体(1:1000，由BR开发)的免疫印迹证实该带对应于DPPX(C)。

图2：肠肌丛中DPPX的表达

大鼠小肠的横切片显示纵肌层(LM)、环肌层(CM)、粘膜下层(SM)和腺体(glans)(G)。肠肌丛(Plex)被显示为两个肌层之间大神经元的簇。(图2A)

在3个小图(A-C)中，神经元的核(红色)是用抗Hu(高度特异性神经元标记物)标记的。小图A以绿色显示采用兔多克隆抗体 (1:1000，由BD开发)的DPPX免疫染色；小图B显示来自患有脑炎的患者之一的血清的DPPX反应性，小图C显示来自健康受试者的血清缺乏反应性。需要注意的是，DPPX主要表达于肠肌丛的大簇神经元的细胞质膜，并且还在粘膜下神经丛所位于的CM和SM中以细纵模式(fine longitudinal pattern)被检测到。小棒＝20μm。(图2B)

图3：采用基于细胞的测定分析DPPX抗体

表达DPPX-L的HEK293细胞(参见实施例4，见下文)用患者的血清(A、D、G、J)和抗DPPX的小鼠单克隆抗体(B、E、H、 K)进行免疫染色。合成(merged)的反应性示于相应的小图(C、F、 I、L)中。比较健康个体的血清和DPPX单克隆抗体的类似研究示于 M和N中，并且合成的反应性示于O中。需要注意的是，患者的抗体与表达DPPX的细胞发生免疫反应。小棒＝10μm。

图4：采用DPPX无效突变体和野生型小鼠的大脑对比患者的血清反应性

患者血清与野生型小鼠海马的反应性示于A、C、E和G中。兔多克隆DPPX抗体与野生型小鼠海马的反应性示于I中。右侧小图显示了类似实验的结果，但采用的是DPPX无效小鼠的海马。需要注意的是，前三位患者的血清(表1的病例1、2和3)和兔多克隆DPPX 抗体的反应性在DPPX无效小鼠的海马中被消除了(小图B、D、F、 J)。没有被包括在表中的患者4(小图G和H)显示与DPPX无效小鼠的海马有剩余的反应性，表明该患者具有两种抗体，一种抗 DPPX，另一种抗未知抗原。小棒＝200μm。

图5：用患者的血清对大鼠大脑免疫染色

大鼠脑的矢状(sagittal)切片用患者(A)和健康个体(B)的 CSF免疫染色。需要注意的是，患者的CSF显示出与大脑的神经纤维 (主要是海马和小脑)强烈的反应性，而对照CSF不产生反应性。小棒＝500μm。

图6：采用表达缺失了DPPX细胞外结构域的突变体 (DPPXed-myc)的基于细胞的测定分析患者的抗体

表达突变的DPPXed-myc构建体的HEK293细胞用患者的血清 (A、D、G、J)和1:500稀释的小鼠单克隆Myc标签抗体(B、E、 H、K)进行免疫染色。合成的反应性示于相应的小图(C、F、I、L) 中。采用健康个体的血清和抗Myc标签的抗体的类似研究示于M和 N中，并且合成的图示于O中。需要注意的是，两位患者(图A和J) 具有不与该构建体反应的抗体，表明靶表位仅存在于细胞外结构域中 (图3)；相反，两位患者具有与该构建体反应的抗体，表明除在DPPX 完全构建体(图3)中和活神经元培养物中存在的细胞外表位之外，它们还识别细胞内表位(D和G)。小棒＝10μm。

图7：采用表达Kv4.2的基于细胞的测定分析患者的抗体

表达Kv4.2的HEK293细胞用患者的血清(A、D、G、J)和抗 Kv4.2的兔多克隆抗体(Alomone labs，#APC-023)(B、E、H、K) 进行免疫染色。合成的反应性示于相应的小图(C、F、I、L)中。比较健康个体的血清和兔多克隆抗体的类似研究示于M和N中，并且合成的图示于O中。需要注意的是，患者的抗体不识别Kv4.2。小棒＝10μm。

实施例

本文报道的是具有突出神经精神症状(之前，在3位中之前有强烈的腹泻)的4位患者的临床和免疫性特征和抗新型细胞表面抗原— —二肽基肽酶样蛋白-6(DPP6或DPPX)(KV4.2钾通道的细胞表面辅助亚基)的抗体。除了已知在海马和小脑中DPPX的强劲表达之外，发明人显示了DPPX也表达于肠肌丛中。

患有神经精神症状的亚急性发作的4位患者和与啮齿类海马和小脑的神经纤维的免疫染色以及分离的培养海马神经元的细胞表面的免疫标记显示具有类似模式的血清或CSF抗体的观察结果导致免疫沉淀靶抗原。包括患有自身免疫性炎症性和非炎症性脑病的患者以及正常个体的149位受试者的血清或CSF用作对照。

实施例1：患者

下文详细描述患者(病例1至3)，并总结于表1中。第四个病例是76岁的男子，其发展了突出的腹泻和体重减轻，伴随快速进展的神志不清、认知下降、癫痫、步态不稳和鞘内IgG产生迹象(IgG指数1.49)；由于信息有限和缺乏随访，他没有被列入表中。

患者1：

61岁的男性，有肥胖、高血压和成年发作的糖尿病史，由于腹痛和腹泻四周接着精神状态的亚急性变化(特征在于抑郁、攻击性、撤退(withdrawal)、幻视、缄默症、肌阵挛和夸张的惊吓反应)而住院。腹部MRI显示脂肪肝，但没有肿瘤迹象，广泛的GI后处理(extensive GI workup)显示粪便白细胞、艰难梭菌、寄生虫和卵为阴性。胃、小肠和结肠内窥镜活检仅显示慢性胃炎(血清幽门螺旋杆菌IgG阳性，无组织学上的细菌)。腹泻持续超过一个月，没有植物神经功能紊乱的其它症状。

CSF、MRI和EEG研究描述于表1中。针对HSV、VZV、 Tropherymawhippelii和肠病毒的CSF PCR为阴性。风湿病、副肿瘤和神经元细胞表面抗体组(panel)(其也包括甘氨酸受体)为阴性。全身CT和PET扫描和睾丸超声检查未发现癌症。

由于恶化的精神状态，患者被短暂插管(intubated)，并用静脉注射甲泼尼龙(1000mg/天×5天)治疗，具有明显神经学改善。然后他被安排为延长的口服类固醇逐渐减量方案超过4个月，并出院至专业护理机构。四个月之后，他由于恶化的精神状态和尿路感染再次入院。用抗生素接着IVIg(在5天中2克/kg)治疗导致短暂的神经功能改善。随后，他发展成败血症并被转移至ICU，需要气管切开术和 PEG管。重复的IVIg并未改善他的精神状态。然后，用利妥昔单抗对他进行治疗(1000mg静脉注射×2剂量，相隔15天)，并且每隔一天泼尼松被逐渐给药(titrated)至5mg。临床进程(clinical course) 是尿路感染和肺炎并发，并且5个多月他的精神状态一直很差。他最好的时候能够张嘴说几个词并遵循简单的命令。在该疾病阶段检查的一个惊人发现是对于声音和触摸有夸张的惊吓反应。此外，他表现出频繁的发作性肌阵挛、口腔运动障碍和伸展过度(paratonia)；肌肉力量正常。

最终用血浆交换对他进行治疗。在首次交换之后，他能够与他的检查人员容易地交谈并回答问题，但还不足以参加正式的认知测试。随后，他每月接受环磷酰胺的静脉内脉冲治疗，在认知方面得到稳定的但不完整的改善。他能够在症状出现后15个月回家。在症状出现后 21个月的随访时和已接受9个每月剂量的静脉内环磷酰胺之后，他还与家人呆在家中，但日常生活的许多活动需要协助。认知测试时，定向有相对保留但在注意力和集中注意、执行功能、抽象、视觉空间功能和音位流畅性方面还有些障碍。口头记忆测试显示成功编码(需要提示)。关于蒙特利尔认知评估(MOCA)，他在30点中得分为9 点。在疾病过程中他体重已经减轻45kg。

患者2：

2008年4月，45岁的女性，表现为进展性腹泻和体重减轻30kg。内窥镜和活检未能查明病因。在随后的6至8周，她注意到她变得认知障碍、工作时越来越多的错误。7月，她由于情绪激动和幻觉住进了医院。检查时，她被发现具有偏执、焦虑、失眠并抱怨盗汗。这些症状加上血清抗核抗体的鉴定(ANA>2560)最初导致诊断为红斑狼疮。

9月，患者被转移到神经科(Neurology unit)。抵达时，她被发现具有偶尔的肌阵挛抽搐、四肢的静止性震颤、显著的双侧水平眼球震颤和具有下行脚趾的全身反射亢进。大脑MRI正常，并且EEG显示全身慢波θ和Δ活动的间歇性发作。除了之前注意到的ANA，针对感染和自身免疫性疾病的广泛血液检测结果为阴性(均匀模式)。CSF 分析显示15个白细胞(主要是淋巴细胞)、正常的蛋白质和葡萄糖浓度和无法匹配的寡克隆带。胸部、腹部和骨盆的CT显示附件增厚超声，得到证实。FDG-PET扫描正常。接下来超过3周，她变得越来越情绪激动，具有恶化的肌阵挛和四肢的静息性粗颤(course resting tremor)。地西泮提供了一些症状的缓解，但在接下来2周内她发展成意识和颜面部运动水平下降的发作。重复的EEG证实低压全身癫痫样放电，并且开始抗癫痫药物治疗。重复的大脑MRI显示大脑正常。基于假定的炎症性脑病，她接受静脉内甲泼尼龙(每天1g，3天)，没有效果。癫痫频率恶化，并且她发展成各种抗癫痫药物治疗难治的癫痫持续状态的频繁发作，最终需要镇静、插管和机械通气支持。任何试图撤除镇静均导致癫痫持续状态的复发。基于附件病变，她接受了子宫及双侧输卵管卵巢切除术。病理学证实了子宫肌瘤。然后，她开始静脉内施用免疫球蛋白(IVIg)，带来缓慢和持续性的改善，允许拔管和离开ICU。

2009年1月，血清和CSF分析显示新的与神经元细胞表面反应的自身抗体。该发现和神经学症状的持续导致开始用利妥昔单抗治疗，其与更快的恢复有关，并且她于2009年5月出院回家。随后，她继续改善并停止抗癫痫药物治疗。目前，她有正常的认知并独立生活。她进行她的CD19淋巴细胞计数的定期监测，并且当计数提高到1％时接受利妥昔单抗的进一步治疗。有一次治疗被延迟了，导致震颤和眼球震颤的复发。

患者3：

2006年6月，该58岁惯用右手的女性发展成幻觉和不稳定，并住进了医院。以下测试均正常：血细胞计数和化学分析、甲状腺功能检测、ANA和ds DNA抗体以及莱姆病、落基山斑疹热、柯萨奇病毒、巴贝斯虫和丙型肝炎病毒的研究。ESR略微升高至43。在无对比度增强情况下大脑MRI显示非特异性白质变化。胸部X射线正常。颈动脉超声未见显著狭窄。EEG显示轻度放缓。CSF分析显示11 WBC/mm3，均为单个核细胞，50mg/dl的蛋白质和74mg/dl的葡萄糖。CSF HSV PCR、病毒培养、莱姆滴度、隐球菌抗原均为阴性。有一个寡克隆带。来自神经病学、感染性疾病、内科和精神病学的顾问对她进行看病，并用利培酮、加巴喷丁、艾司西酞普兰和卡维地洛进行治疗。有了这些药物治疗，她回到了她自己平常的大约80％并出院回家。

到2006年11月，她发展成增加的不稳定，患有频繁跌倒、震颤、发音困难、复发的幻觉和梦游，并重新入院。重复的大脑MRI、MR 血管造影和脑血管造影均正常。腹部MRI显示呈良性的肾上腺腺瘤。 EEG显示主要在右半球放缓的背景。胸部、腹部和骨盆的CT扫描显示肩部周围有一些流体、均匀增大的胰腺和所示的肾上腺病变。颞动脉活检为阴性。CSF显示1个白细胞、0个红细胞、87mg/dl的葡萄糖、38mg/dl的蛋白质和培养物阴性。针对HSV、隐球菌抗原、西尼罗河病毒、血管紧张素转换酶(ACE)和细胞学的研究均为阴性。抗单链DNA为阳性，但抗双链DNA为一次阴性和一次阳性(62)(nl: <25)。阴性或正常的监测包括类风湿因子、抗心磷脂抗体、IgG、SPEP、 B12、SSA、SSB、莱姆、HSV、铅、组蛋白抗体、LA、ANA、ANCA、乙肝表面抗原、血浆铜蓝蛋白C3、C4、RNP、史密斯、RPR、CRP、 B12、RF、冷球蛋白、尿汞和砷、血砷和全面的类肿瘤组。她被用每天60mg泼尼松进行治疗并得到改善。

接下来的2个月，泼尼松逐渐减量至每天10mg，并且2007年2 月她第一次在我们的机构进行评估。已往病史是显著的高血压、胆囊切除术和髋关节置换术。药物治疗包括每天10mg泼尼松、泮托拉唑、氨氯地平、单硝酸异山梨醇、卡维地洛、可乐定、阿仑唑奈(alendronate)、左氧氟沙星和沙丁胺醇。检查时，她保持神智清醒 (alert)并专注，语言正常，能记住2/3的词，在提示下能记住3/3 的词。她具有先天性眼球震颤，但颅神经其他方面正常。她表现出脚踝背屈无力。感觉和反射正常。步态协作较差(poor tandem)而缓慢。重复的风湿病和类肿瘤组、卟啉、β-2-糖蛋白、冷球蛋白和TPO抗体均为阴性。

接下来的一个月，泼尼松逐渐减少，她病情恶化，具有幻觉、言语减少、震颤、肌阵挛和共济失调，并住进了医院。大脑MRI显示非急性但新的右额叶梗塞。大脑SPECT显示中度全身性血流灌注不足。 EEG显示轻度背景放缓。重复的CSF分析正常。经食管超声心动图显示小的房间隔缺损。重复的脑血管造影仅在颈动脉分叉处显示轻度动脉粥样硬化的变化。大脑活检显示梗塞，没有炎症或血管炎的迹象。重复的胸部、腹部和骨盆CT显示之前注意到的肾上腺腺瘤和肾囊肿。她被用静脉内类固醇治疗，接着口服类固醇、阿司匹林、阿托伐他汀和舍曲林。她的神经学症状得到改善，并且出院，要求每天80mg泼尼松。随后，泼尼松缓慢减量并增加拉莫三嗪、氯硝西泮和阿立哌唑。尽管症状得到改善，但她的发音困难、不稳定、震颤和肌阵挛时好时坏。2007年12月的CSF分析显示1个WBC、83mg/dl的葡萄糖、53mg/dl的蛋白质和阳性寡克隆带。增加霉酚酸莫酯100毫克，每天两次。

到2008年4月，进一步减少泼尼松的剂量。然后，她发展成带状疱疹，她的症状恶化，精神状态改变和共济失调，她再次入院。CSF 分析显示53个WBC(94％的淋巴细胞和6％的单个核细胞)、70mg/dl 的葡萄糖和62mg/dl的蛋白质。针对HSV、HHV-6、VZV、CMV、 EBV、EEE、SLE、肠病毒和西尼罗河病毒的PCR均为阴性。她被用静脉内阿昔洛韦治疗，增加泼尼松的剂量而中止霉酚酸酯。到那时， CSF分析显示针对神经元细胞表面的新的自身抗体。开始静脉内施用免疫球蛋白(IVIg)2g/kg，她出院同时以缓慢减量的方式每天80mg 泼尼松并且每月一次IVIg的周期。

2008年9月，在泼尼松被减至每天50mg之后，她发展成增加的幻觉。停止IVIg，并增加类固醇的剂量，首先采用静脉内施用类固醇，随后口服类固醇。开始利妥昔单抗(每周650mg×4的剂量)。重复的CSF检测显示与神经元的细胞表面不存在反应性。她得到改善，但在类固醇从每天80mg至每天50mg缓慢减量的过程中再度恶化。在 2008年11月，她接受1个剂量的1000mg静脉内施用环磷酰胺，但发展成隐球菌性肺炎，排除进一步治疗。神经心理测试显示视觉运动速度、多步骤命令的理解和手动排序的受损。受损较少但低于预期的是一些记忆功能、听觉注意力、视觉分析和试错法(trial-and-error) 的推理。针对故事和定向的语言理解/表达、判断、记忆的其它功能与病前估计的功能一致。由于恶化的神志不清，她被用5个疗程(course) 的血浆交换和持续的每天泼尼松进行治疗。2009年1月的重复神经心理测试显示与2008年11月相比总体稳定的认知。连续EEG显示背景放缓，但由于精神状态时好时坏，还是加了苯妥英。她得到改善并出院康复，同时每天一次50mg泼尼松和每天两次100mg苯妥英。

2009年2月她由于双侧下肢深静脉血栓和肺栓塞而再次入院，用抗凝和下腔静脉滤器置入治疗。2009年3月她出院同时每天45mg泼尼松和每天两次100mg苯妥英以及针对她的其它医疗状况的药物治疗。接下来的30个月泼尼松被逐渐减量并最终中止。截至停止泼尼松的4个月之后的2012年1月，她没有症状恶化，并且保持神智清醒、专注、完全定向、记忆3/3并且非常了解时事。她没有震颤、肌阵挛或幻觉。她稍宽底式走路并且具有协作较差的步态。

结果：

所有4位患者(2位男性，2位女性；年龄范围45－76岁)均发展成快速进展脑病，特征在于情绪激动、妄想、幻觉和肌阵挛性抽搐，其中3位患者与不明病因的突出腹泻相关。所有患者均已确认或临床怀疑癫痫和CSF细胞增多，证据为IgG或寡克隆带的鞘内产生。来自 3位患者的详细信息显示在多重免疫治疗之后，所有患者在后续随访时(从症状发作起18－68个月)均具有实质性恢复；对于第四位患者可获得的随访信息极少。

实施例2：关于大鼠大脑、小肠和神经元培养物的免疫组化

大鼠大脑和肠肌丛的免疫组化：

处死雌性Wistar大鼠，取出大脑和小肠，切片(大脑矢状，肠横向)，浸入4℃4％低聚甲醛1小时，用40％蔗糖冷冻保护24小时，并在异戊烷中快速冷冻、冷冻在液氮中。¹⁸然后，七微米厚的组织切片依次用0.3％H₂O₂孵育20分钟、10％山羊血清孵育1小时以及患者或对照血清(1:200)、CSF(1:2)或抗DPPX多克隆兔抗体(1:1000 稀释，由BR开发的抗体)于4℃孵育过夜。如所报道的，用合适的生物素标记的二抗(山羊抗人BA-3000或山羊抗兔BA-1000，Vector laboratories，均为1:2,000)之后，用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶方法检查反应性。¹⁸

针对大鼠小肠中DPPX的表达分析，与上述多克隆兔DPPX抗体 (1:1000)或带有DPPX抗体的患者CSF一起，采用以1:200稀释的生物素标记人抗Hu IgG(特异性神经元细胞核标记物)，接着抗生物素蛋白-罗丹明(1:500)和1:1000的合适的荧光标记二抗(山羊抗兔 IgGAlexa Fluor 488或山羊抗人IgGAlexa Fluor 488；Molecular Probes，Invitrogen)。采用Zeiss Axiovision软件(Zeiss，Thornwood， NY)在荧光显微镜下对结果进行拍照。

关于神经元培养物的免疫组化：

如所报道的制备大鼠海马神经元培养物。¹⁹生长于盖玻片上的活神经元与患者或对照血清(最终稀释度1:750)或CSF(1:10)于37℃ 孵育1小时。除去培养基并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)充分洗涤后，神经元被用4％低聚甲醛固定、用0.1％Triton X-100透化并用山羊抗人IgGAlexa Fluor 488(1:1000)免疫标记。

结果：

所有4位患者在血清或CSF中均具有与啮齿动物的大脑神经纤维 (附图1)和分离的大鼠海马神经元的活的未透化培养物的细胞表面 (图1A)发生反应的抗体。

小肠的免疫组化分析证实DPPX由肠肌丛的神经元特异性表达，并且患者的抗体也与这些神经元中表达的DPPX反应(图2)。

实施例3：免疫沉淀、质谱法和免疫印迹法

免疫沉淀和免疫印迹法：

大鼠海马神经元的培养物生长于100mm孔中(密度10⁶个神经元 /孔)，并与过滤的患者血清(1:100稀释)于37℃孵育1小时。然后，用PBS洗涤神经元，用含有蛋白酶抑制剂(P8340；Sigma Labs)的缓冲液(NaCl 150mM、EDTA 1mM、三(羟甲基)氨基甲烷[Tris]-HCl100mM、脱氧胆酸0.5％、1％Triton X-100[Sigma Labs，St.Louis， MO]，pH 7.5)裂解神经元，于16.1x 10³g 4℃离心20分钟。保留上清，并用蛋白A/G琼脂糖珠(20423；Pierce，Rockford，IL)4℃孵育过夜，离心，然后用PBS洗涤含有带有结合至靶细胞表面抗原的患者抗体的珠的沉淀，等份分装并保存于-80℃。该沉淀的一等份重悬于 Laemmli缓冲液中，煮10分钟，在4至15％的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离，并用EZBlue凝胶染色(G1041；Sigma Labs) 使蛋白质可视化。由患者血清沉淀的可见蛋白带从凝胶切出并通过位于Abramson Cancer Center(University of Pennsylvania)基因组研究所蛋白质组学核心设备经质谱进行分析。对抗原表征之后，冷冻等份的所示沉淀在如早先所述的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离，转移到immobilon-P膜(MilliporeIPVH00010)并用所示抗 DPPX抗体(由BR开发，1:0000)进行印迹。采用合适的生物素标记的二抗(1:2000)和抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶和二氨基联苯胺方法显示反应性。

质谱法：

从凝胶切下蛋白质条带并送去University of Pennsylvania的蛋白质组学设备进行质谱法。如所报道的，蛋白质条带被胰酶消化并用纳米液相色谱(纳米LC)/纳米喷雾/线性离子阱(LTQ)质谱仪(Thermo Electron Corporation，San Jose，CA)进行分析。²⁰简单地说，3μl 经胰酶消化的样品用来自Eksigent的自动进样器(Dublin，CA)进行注射。消化的样品采用来自Eksigent的纳米LC以200μl/分钟的流速、45分钟的梯度在10cm C18柱上进行分离。在线纳米喷雾用于将所分离的肽喷雾入LTQ，利用Xcalibur软件(ThermoScientific， Waltham，MA)获得原始数据。采用Mascot(Matrix Science，Boston， MA)针对NCBI和Swissprot数据库(Swiss Institute of Bioinformatics，Basel，Switzerland)搜索原始数据文件。可信度蛋白质鉴定的截断值为>70。

结果：

靶抗原与患者之一的血清的免疫沉淀，接着电泳蛋白质分离和 EZBlue凝胶染色显示出在采用对照血清的免疫沉淀中不存在的大约100kDa的独特条带(图1B)。从凝胶切出该条带，由质谱法分析，证实了它含有衍生自DPPX的序列(得分6441、5945和383；可信度蛋白质鉴定的截断值得分>70)。这一发现被用特异性针对DPPX的抗体对沉淀的免疫印迹所确认(图1C)。

实施例4：关于HEK293细胞的免疫组化

用含有大鼠DPPX-S(32个氨基酸的短的细胞质结构域)、DPPX-L (88个氨基酸的长的细胞质结构域)、DPPXed-myc(缺失了细胞外结构域并连接至myc标签的DPPX构建体)、大鼠Kv4.2、人DPPX (DPP6；Origene序列NM_001039350.1；SEQ ID NO:1)、人DPP10 的质粒或没有插入物的质粒(对照)转染HEK293细胞。¹¹在其它实验中，DPPX和Kv4.2以等摩尔比共转染细胞。然后，如之前所报道的，评估患者抗体的反应性。²¹为了这个目的，在转染后进行评估之前将细胞生长24小时。转染的细胞被固定于4％低聚甲醛，用0.1％ Triton X-100透化，然后用患者的血清(1:200)或CSF(1:2)和以下抗体之一(依赖于目的抗原)孵育2小时：DPPX(由BR开发的兔多克隆抗体1:1000稀释；兔多克隆抗体abcam 418111:200稀释或小鼠单克隆Sta Cruz#3651471:500稀释)、Kv4.2(兔多克隆，Alomone labs，#APC-0231:500稀释)或myc标签抗体(小鼠单克隆myc标签 9B11，Cell Signaling，1:2000稀释)，以及相应的荧光标记二抗(山羊抗人IgG Alexa Fluor 488；山羊抗兔IgGAlexa Fluor 555或山羊抗小鼠IgGAlexa Fluor 555，均以1:1000使用)。采用Zeiss Axiovision 软件(Zeiss，Thornwood，NY)在荧光显微镜下对结果进行拍照。

结果：

转染了大鼠DPPX-S或DPPX-L的HEK293细胞显示与患者的血清或CSF类似的反应性，与细胞外表位的识别一致(图3显示与 DPPX-L的反应性；与DPPX-S获得类似的反应性，未显示)。患者的抗体不与表达Kv4.2的细胞反应(附图2)，并且DPPX的反应性在其与Kv4.2共表达时并未被改变(数据未显示)。采用其中细胞外结构域被缺失的大鼠DPPX质粒(DPPXed-myc)¹¹进一步的分析显示与患者1和4的血清和CSF的反应性被消除，以及与患者2和3的血清和CSF的反应性弱，表明后两位患者具有抗细胞表面和细胞内表位的抗体(附图3的小图D和G)。此外，转染了人DPPX的HEK293 细胞还显示与具有DPPX抗体的4位患者的血清或CSF的反应性(显示与DPPX的大鼠序列发生反应)，而它们与来自10位健康个体的血清和CSF并不显示反应性。尽管DPPX和DPP10具有51％的氨基酸序列同一性，¹²患者的抗体并不与DPP10反应(数据未显示)。总的来说，这些发现证实，患者的抗体特异性靶向DPPX而不是Kv4.2 通道，以及一些患者具有抗DPPX的细胞外和细胞内结构域的抗体。

发明人接下来在共表达DPPX和Kv4.2的基于细胞的测定中确定 149位对照的血清或CSF的反应性。这些受试者中没有一个被发现具有与这2种蛋白质反应的抗体，表明抗DPPX的抗体对于患有自身免疫性脑炎的患者亚群(subgroup)是特异性的。相反，患有胸腺瘤和血清阴性重症肌无力而没有脑炎的患者(包含于对照中)具有针对 DPP10的抗体，但没有针对DPPX的抗体(Martinez-Hernandez，数据未显示)。

实施例5：与野生型和DPPX无效小鼠的免疫组化

如之前所报道的产生野生型和DPPX无效小鼠并进行基因分型。 ²²取出大脑，矢状切片，进行处理，并采用患者的血清(1:200)或 CSF(1:5)通过如针对大鼠大脑所示的标准抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶免疫组化进行检查。

结果：

为了进一步证实患者的抗体对DPPX的特异性，比较了野生型小鼠大脑与DPPX无效小鼠大脑的免疫组化。这些实验证实3位患者的血清或CSF与DPPX无效小鼠的大脑的反应性被消除，表明患者的抗体仅针对DPPX，并且1位患者具有针对未知身份的蛋白质的额外的抗体(图4H)。

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Claims

1.用于检测针对二肽基肽酶样蛋白-6的自身抗体的试剂在制备用于诊断受试者中自身免疫疾病的制剂中的用途，其中所述制剂用于与来自受试者的样品相接触，所述自身免疫疾病是自身免疫性脑炎，其特征在于所述试剂是具有二肽基肽酶样蛋白-6多肽的一个或多个表位的多肽，所述制剂用于使来自受试者的所述样品与所述具有二肽基肽酶样蛋白-6多肽的一个或多个表位的多肽相接触，以及检测来自该样品的抗体与该多肽的结合，所述具有二肽基肽酶样蛋白-6多肽的一个或多个表位的多肽选自SEQ ID NO:1-4。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述具有二肽基肽酶样蛋白-6多肽的一个或多个表位的多肽为二肽基肽酶样蛋白-6多肽。

3.根据权利要求1所述的用途，特征在于所述具有二肽基肽酶样蛋白-6多肽的一个或多个表位的多肽包含根据SEQ ID NO:2的二肽基肽酶样蛋白-6的胞外结构域和根据SEQ IDNO:3或4的二肽基肽酶样蛋白-6的胞内和跨膜结构域。

4.根据权利要求1所述的用途，特征在于所述多肽包含进一步的氨基酸，所述氨基酸是N端或C端连接的并促进所述多肽或蛋白质的纯化。

5.根据权利要求1所述的用途，特征在于所述试剂被连接至报告分子或固相。

6.根据权利要求1的用途，特征在于用免疫荧光检测、蛋白质微阵列、ELISA、发光检测、印迹法、或放射免疫检测来检测来自该样品的抗体与该多肽的结合。

7.根据权利要求1的用途，特征在于用蛋白质印迹法检测来自该样品的抗体与该多肽的结合。

8.根据权利要求1的用途，特征在于用斑点印迹法检测来自该样品的抗体与该多肽的结合。