JPH04501802A - 生物学的に活性な合成チロトロピンおよびそれを製造するためのクローン化遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生物学的に活性な合成チロトロピンおよびそれを製造するためのクローン化遺伝 子 本発明は概略的には新規遺伝子およびタンパク質の単離および特徴づけに関する 。より詳細には、本発明は、クローン化遺伝子により合成された、単離され実質 的に純粋で、生物学的に活性なヒトチロトロピン（ｒＴＳＨ）の提供に関する。

チロトロピン（Ｔ　Ｓ　Ｈ）は重要な体内機能を制御する脳下垂体ペプチドホル モンである。しかしながら、この重要なホルモンを合成する安定し、信頼性が高 く、そして経済的な手段がこれまでなかった。

発明の要約 それ故に、本発明の目的は、生物学的に活性な合成ヒトチロトロピンを実質的に 純粋な単離された形態で提供することである。

本発明の別の目的は、適当な発現ベクター中で生物学的に活性なヒトチロトロピ ンの発現を指示するクローン化遺伝子を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、甲状腺刺激ホルモン並びにその他のチロトロピン物 質例えば甲状腺刺激免疫グロブリン等を測定するためのアッセイキットを提供す ることである。

本発明のさらに別の目的はヒト甲状腺ガンを診断および治療する方法を提供する ことである。

本発明のその他の目的および利点は本明細書の以下の詳細な記載から明らかにな るであろう。

図面の簡単な説明 本発明の上記目的およびその他の目的ならびに態様および多くの付随した利点は 、添付した図面を参照して以下の詳細な説明を読むとよりよく理解されるであろ う。

図１は、発現ベクターの模式的構築を示す。ｐＳＶ２゜ＧおよびｐＡＶ２は示さ れるように、複製開始点（ｏｒｉ）およびアンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐ　ｒ ）を有するｐＢＲ３２２から誘導されたプラスミドである。ｐＳＶ２．ＧはＨｉ ｎｄｌｌｌクローニング部位上流のＳＶ４０の初期プロモーター、ウサギβ−グ ロビンｃＤＮＡ、およびＳＶ４０のポリアデニル化部位／イントロンを含む。

ｐＡＶ２は全体のアデノウィルス関連ウィルスゲノム（４，７ｋｂ）をその３種 のプロモーターＰ５、ＰＩ３、Ｐ２Ｏ，およびポリアデニル化部位とともに有す る。

）１ｉｎｄｌｌｌクロ一ニング部位はＰ４０プロモーターの下流にある。ヒトＴ ＳＨおよびｈＣＧαはいずれかのプラスミドの旧ｎｄ［Ｉ［部位内に挿入され、 ｐＡＶ２−ｈＴＳＨβ、ｐＡＶ２−ｈＣＧα、ｐＳＶ２．　ＧｈＴＳＨβ、およ びｐｓＶ２．Ｇ−ｈＣＧαが形成された。

図２はトランスフェクションさせた２９３およびＣ０Ｓ細胞のノーザンプロット 分析を示す。全体の細胞のＲＮＡは１％アガロース−ホルムアルデヒドゲル上で 分離され、そしてナイロン膜に移された。対照またはトランスフェクションさせ た細胞培養物からの全体のＲＮＡ　４０マイクログラムが各列に注入された。ヒ トＣＧαおよびｈＴＳＨβを構造的名称およびその他の図面においてαおよびβ と略記した。トランスフェクションされなかった細胞は対照と表示される。ＤＮ Ａを欠（リン酸カルシウム沈殿物でトランスフェクションさせた細胞はｍ。

ｃｋと表示される。列１−４は２９３細胞から誘導された全ＲＮＡであり；列５ −９はＣＯ８細胞から誘導されたＲＮＡである。キロベースで示すＲＮＡ標準お よびヒト脳下垂体からのｈＴＳＨβ　ｍＲＮＡの移動位置はオートラジオグラフ の左側に示されている。オートラジオグラフの下にはｐＡＶ２およびｐＳＶ２． Ｇプラスミドを一本線として、プロモーターを黒丸として、２．Ｏｋｂ　ｈＴＳ Ｈβゲノム断片を２つのエキソン（黒ヌリした部分）を含有する枠として、そし て公知ポリアデニル化シグナル部位配列を白ヌキ矢印として示す図１をより簡略 化したものを示している。各々の構築物ｐＡＶ２−βおよびｐＳＶ２．Ｇ−βの 下には、特定のプロモーターで開始し、そして示されたようにスプライシングす る予１１１ＲＮＡを示しである。黒ヌリ矢印はポリ（Ａ）尾部である。キロベー ス（ｋｂ）での予測された大きさは各ｍＲＮＡ種の右側に示されている。

図３はゲルクロマトグラフィーの結果を示す。ｐＡＶ２−ｈＣＧ／ｐＡＶ２−ｈ ＴｓＨβ／ｐＶＡＲＮＡでトランスフェクションさせた２９３細胞からの細胞培 地のクロマトグラフィーをセファデックスＧ−２００フアインカラムで行った。

さらに、ｈＴＳＨ，ｈＣＧαおよびｈＴＳＨβの標準調製物（明細書に記載され ている）のクロマトグラフィーを同様のカラムで行った。ヒトαおよびＴＳＨα のＲＩＡおよびｈＴｓＨに対するＩＲＭＡは各１．５ｍ１画分で行われた。ウシ チログロブリンの溶離位置（ボイド、Ｖ、）、ＢＳＡ　（６７７００（６７ｋ） ）およびオボアルブミン（４５０００（６７ｋ））並びにｈＴＳＨＳｈＣＧαお よびｈ　Ｔ　Ｓ　Ｈβの標準調製物が表示されている。

図４はヒトＴＳＨＩＲＭＡの結果を示す。ｉＩｋ感度で特異的ｈＴＳＨＩＲＭＡ が２つの脳下垂体ｈＴＳＨ標準で行われた。世界保健機構８０１５５８（Ｗ）（ Ｏ５ＴＤ）およびＮＩＨｌ−６（Ｉ−６５ＴＤ）、並びｉ：ｐへＶ２−ｈＣＧ１ ｐＡＶ２−ｈＴｓＨ，およびｐＶＡＲＮＡでトランスフェクション後の２９３細 胞からの培地（ｐＡＶ２α／β／ｐＶＡＲＮＡ）、　アｙセイ結合のｌｏｇｉｔ （対数）形質転換はアッセイに添加された試料容量の任意の単位に対してプロッ トされた。

図５はラット甲状腺細胞におけるｈＴｓＨの試験管内バイオアッセイの結果を示 す。このアッセイに使用されたヒト脳下垂体ＴＳＨ標準およびトランスフェクシ ョンさせた２９３細胞からの培地は図４の説明に記載されている。この試験管内 バイオアッセイはラット甲状腺細胞（ＦＲＴＬ　５）中へのＴＳＨ刺激された１ ″″Ｉ取込みを測定する。脳下垂体標準およびトランスフェクションさせた培養 物からの培地によりトラップされるヨウ素はＩＲＭＡにおけるＴＳＨ免疫活性に 対して規格化される。

発明の詳細な説明 本発明の上記目的および種々のその他の目的ならびに効果は、適当な発現ベクタ ーにおいて生物学的に活性なヒトチロトロピンの合成を指示する完全ヌクレオチ ド配列のクローニングおよび合成されたホルモンの実質的に純粋な形態での単離 により達成される。

特記しない場合、本明細書で使用されている全ての技術および科学用語は本発明 の属する技術の通常の熟練者（当業者）により通常理解されているものと同様の 意味を存する。本明細書に記載されている同様または等価のあらゆる方法および 材料が本発明の実施または試験において使用され得るけれども、好ましい方法お よび材料が今記載される。以下に記載される全ての刊行物は参照により本明細書 に編入される。特記しない限り、本明細書で使用されている技術は当業者に十分 に公知の標準的な方法論である。

本明細書で使用されている「実質的に純粋」という語は、当業者には公知の標準 的な慣用の精製法により得られうるちのと同程度に純粋であることを意味する。

本明細書で使用されている「生物学的に活性な」という語は、組換えホルモンが 天然に生じるホルモンと物理的もしくは化学的構造または組成が同一でないとし ても、天然のものに依然として機能的に同等であることを意味する。

材料および方法 材料 制限および変性酵素はベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（メリーランド州ガ イザースパーグ）およびファルマシアにュージャージー州ビス力タウエイ）から 得られた。。Ｐおよび１Ｓ化合物はデュポン・二ニー・イングランド・ヌクレア ー（マサチューセッツ州ボストン）およびアマルシャム／サーレ・コーボレーシ ９ン（イリノイ州アーリントン・ハイツ）から購入された。ジーン・スクリーン およびジーン・スクリーン・プラス・メンブレンズ（二ニー・イングランド・ヌ クレアー）が全てのＤＮＡおよびＲＮＡ移送操作に使用された。大腸菌ＨＢ１０ １の形質転換感応株はベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズから得られ、そして 全ての形質転換において使用された。オリゴヌクレオチドはミツドランド・サー ティファイド・リージエント・カンパニー（テキサス州ミツドランド）から購入 された。ＤＮＡのクローニングおよび伝達はＮＩＨガイドラインに従って行われ た。セファデックスＧ−２００フアインおよびコンカナバリンＡ−セファロース はファルマシア・ファイン・ケミカルズから得られた。α−メチルグルコシドお よびα−メチルマンノシドはシグマ（ミズーリ州セントルイス）から購入された 。ヒトＴＳＨ，ｈＣＧαおよびｈＴｓＨβはＮ　Ｉ　ＤＤＫナショナル・ホルモ ン・アンド・ビチュイタリー・プログラム（メリーランド州ベセスダ）により供 給された。タンパク質標準はシグマまたはピアース・ケミカル社（イリノイ州ロ ックフォード）から購入された。

ゲノムスクリーニング ＥＭＢＬ３ヒトゲノム白血球ライブラリィの個々の組換えファージクローン（Ｉ ＸＩＯ’）がマサチューセッツ州ボストンのバーバード・メディカル・スクール 、ダブリュ、クリニ、プリガム・アンド・ウイメンズ・ホスピタルから得られた 放射標識マウスＴＳＨβｃＤＮＡを用いてヒトＴＳＨβの存在に対してスクリー ニングされ、そして２つの別々のクローンが同定された。ウシＴＳＨβｃＤＮＡ の５′非非翻訳列の最初の３４塩基と同じ配列を有する３４塩基のオリゴヌクレ オチドが（ｔ−”Ｐ）ＡＴＰでもってポリヌクレオチドキナーゼを用いて５−８ ｘｌＯ’ｃｐｍ／ピコモルの比活性まで５′末端標議され；マウスＴＳＨβｃＤ ＮＡはランダムプライマーでもって１−５ｘｌＯ’　ｃｐｍ／μｇの比活性まで 〔α−”Ｐ）ｄＣＴＰ標識された。両方が１つのクローンの制限消化物のサザン プロットをプローブするために使用された。

サブクローニングおよび配列決定 ゲノム断片をｐＵｃ１８およびｍｐ１３内にサブクローン化して、サンガーのジ デオキシ鎖停止法（Ｓａｎｇｅｒ等。

１９７７、　Ｐｒｏｃ　ＮａｔＬ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＬＪＳＡ　７４：５４６ ３−５４６７）を用いる制限地図作成および配列決定を容易にする。

発現ベクター ｅ２１ｂｐ　ｈＣＧａｃＤＮＡ（カリフォルニア州バロアルト、カリフォルニア ・バイオテクノロジー社、ジェイ、フィダーから入手）がｐＳＶ２．Ｇ　（ＮＩ Ｈ（メリーランド州ベセスダ）、ビー、ハワードから入手）　（Ｇｏｒｍａｎ等 、　１９８２　ＭｏＬ　ＣｅＬＬ　ＢｉｏＬ　２：１０４４−ＬＯ５１）内のＳ Ｖ４０の初期プロモーター、またはｐ　Ａ　Ｖ　２　（Ｌａｕｇｈｌｉｎ等。

１９８３、　Ｇｅｎｅ　２３：６５−７３）内のアデノ関連ウィルスのＰ４０プ ロモーターの下流の旧ｎｄ１１１部位に挿入され、ｐＳＶ２、Ｇ−ｈＣＧａおよ びｐＡｖ２ｈＣＧαが形成された（図１　）　、　Ｈｉｎｄｌｌｌ　リンカ−は ２７７ｂｐの５′イントロン、両方のコード性エキソン、４５０ｂｐイントロン および約８００ｂｐの３°フランキングＤＮＡを含むｈＴＳＨβ遺伝子の２　、 Ｏｋ　ｂ　Ｐｖｕｌｌ断片に連結された。

それはｈＣＧａと同じ旧ｎｄｒ［１部位内に挿入され、ｐＳＶ２．Ｇ−ｈＴｓＨ βおよびｐＡＶ２ｈＴｓＨβが形成された（図１）。全てのプラスミドが多種類 の制限酵素消化に供されて、適当な配向にある唯一の挿入物の存在が確認された 。

細胞培養 アデノウィルス形質転換ヒト胚腎臓細胞（２９３細胞）およびＳＶ４０形質転換 サル腎臓細胞（ＣＯ３細胞）を変形最小必須培地（ＭＥＭ）およびダルベツコの 変形イーグル培地中でそれぞれ増殖させた。両方の培地は１０％ウシ胎児血清、 ４．４ｍＭＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌスト レプトマイシン、および２５０　ｎ　ｇ／ｍ　１アンフオテリシンＢで補足され た。トランスフェクションの２４時間前に、細胞を同一濃度（５Ｘ１０＠）の１ ００ｍｍ皿に移した。トランスフェクションＩＢ目に、新鮮培地をトランスフエ ラ２３２４時間前に細胞に添加した。

トランスフェクション 全てのトランスフェクションはリン酸カルシウム沈殿法（Ｇｒａｈａｍ等、　１ ９７３．　ＶｉｒｏＬｏｇｙ　５２：４５６−４６７）を用いて行われた。沈殿 は４時間行われ、細胞は洗浄され、そして新鮮培地が添加された。全ＲＮＡはＣ ａｔｈａｌａ等、　１９８３　ＤＨＡ　２：３２９−３３５の方法に従って単離 された。ｐＡＶ２プラスミドを実験１において２９３およびＣＯ８細胞の両方内 に、そして実験２において２９３細胞内だけにトランスフェクションさせた。ｐ ＳＶ２．０プラスミドをＣＯ８細胞内にだけトランスフェクションさせた。α− またはβ−サブユニットのいずれかを細胞内に単独でトランスフェクションさせ た場合、精製プラスミド１５μｇが各プレートに注入された。α−またはβ−サ ブユニットの両方を共トランスフェクションさせた場合、各精製プラスミド９μ ｇが１つのプレートに注入された。いくつかの場合において、細胞はｐＶＡＲＮ Ａと共トランスフェクションサセた。ｐ　Ｖ　Ａ　ＲＮ　Ａ　ｉｔ、ｐＢＲ８２ ２（メリーラント州バルチモア、ジョンホブキンス大学、生物学部のケラトナー から入手）の旧ｎｄｌ１１部位内に挿入されたＶＡ、およびＶＡ、、のための遺 伝子を含むアデノウィルス２型Ｄ　Ｎ　Ａ　ＨｉｎｄｌＩＩ　Ｂ断片からなる。

Ｖａ＋ＲＮＡは真核生物の開始因子２のαサブユニットのリン酸化および不活性 化を阻害することにより翻訳を刺激する（Ａｋｕｓｊａｒｖｉ等、　１９８７． 　ＭｏＬ　ＣｅＬＬ　ＢｉｏＬ　７：５４９−５５１）。

ＲＮＡ分析、ＲＩＡおよびＩ　ＲＭＡ トランスフェクション物からの全ＲＮへのノーザンプロット分析が標準法（Ｍａ ｎｉａｔｉｓ等、　１９８２．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣＬｏｎｉｎｇ　、第１ 版、コールトスプリングツ１−バー研究所。

ニューヨーク州コールドスプリングハーバ−２第２０２頁）および製造会社の説 明書を用いて行われた。共通のヒトα−サブユニットＲＩＡ、ｈＴＳＨ−サブユ ニットＲＩＡ、およびｈＴＳＨＩＲＭＡが各々のトランスフェクションさせた培 養物からの培地で２回行われた（ＭｃＢｒｉｄｅ等、１９８５　ＣＬｉｎ　Ｃｈ ｅｒｒｒ　３１：１８６５−１８６７；　Ｋｏｕｒｊｄｅｓ等。

１９７４、　ＥｎｄｏｃｒｉｎｏＬｏｇｙ　９４：１４１１−１４２１）　ｏア ッセイの感度はそれぞれ０．０３ｎｇ／ｍｌ、０．０３ｎｇ／ｍｌ、および０． ０６ｎｇ／ｍｌより低かった。相当するサブユニットとｈＴｓＨとの間の測定さ れた濃度での交差反応性は共通のαにおいて５％より低く、そしてｈＴＳＨβ　 ＲＩＡにおいて２％より低かった（Ｋｏｕｒｉｄｅｓ等、同上）。さらに、測定 された遊離のサブユニット濃度で、ｈＴＳＨＩＲＭＡは１％より低い交差反応性 を示した（データは示していない）。

ゲルおよびレクチンアフィニティクロマトグラフイー２９３細胞内に合成された ｈＴＳＨの正確なモル重量は５種のタンパク質標準（ウシチログロブリン、ＢＳ Ａ。

オボアルブミン、ウシキモトリプシノーゲンＡ、およびクジラミオグロビン）で の各クロマトグラフィー操作の間に目盛りづけされた１、５Ｘ９０ｃｍセファデ ックスＧ−２００ファインカラム上でのゲルクロマトグラフィーにより決定され た。カラムは０．１２Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍホウ酸、および０．０２％（ 重量／容量）アジ化ナトリウム、ｐＨ７，４を含む緩衝液中４℃で平衡化され、 そして操作された。１０００μＵ　ｈＴＳＨ（ＷＨｏ　８０１５５８）、１１０ ０ｎ　ｈｃＧα（ＣＲ−１１９）および１１００ｎ　ｈＴＳＨβ（ＡＦＰ−３９ ２９β）を含有する新鮮ＭＥＭ培地２マイクロリットルが標準調製物のクロマ） ・グラフィーの間に注入された。カラムは洗浄され、そしてｐＡＶ２−ｈＣＧα ／ｐＡＶ２−ｈＴＳＨβ／ｐＶＡＲＮＡでトランスフェクションさせた２９３細 胞からのＭＥＭ培地培地２炉ｌ入された。１．５ｍｌの画分が６ｍ１／時間の流 速で集められた。

２９３細胞内に合成されたｈＴＳＨのコンカナバリンＡ−セファロースへの結合 はまた、以前記載された方法（Ｇｅｓｕｎｄｈｅｊｔ等、１９８７．　Ｊ　Ｂｉ ｏＬ　Ｃｈｅｒｔｔ　２６２：５１９７−５２０３）を用いて決定された。試料 はレクチンカラムに注入され、そして２ｍｌの両分が１０ｍ１／時間の流速で集 められた。ヒトＴＳＨＩＲＭＡは共通のα−およびｈＴＳＨβ−サブユニットで あり、ＲＩＡはゲルおよびレクチンクロマトグラフィーからの各画分に行われた 。ｈＴＳＨおよびその遊離サブユニットの回収は一般にクロマトグラフィーから ９０％を越えていた。

ＴＳＨバイオアッセイ チロトロピンの生物学的活性はＤａｈｌｂｅｒｇ等、　１９８７．　ＪＣＬｉｎ 　Ｉｎｖｅｓｔ　７９：１３８８−１３９４の方法に従ってラット甲状腺細胞（ ＦＲＴＬ５）内への１″■の取込みを刺激する能力として測定された。このアッ セイはヒト、ラットおよびウシのチロトロピンを測定するが、ゴナドトロピンま たは遊離α−もしくはＴＳＨβ−サブユニットを測定しない。試料測定は２回行 われ、そして２種の脳下垂体のｈＴｓＨＩ準（ＷＨＯ８０１５５８およびＮＩＨ ｌ−６）と比較された。結果はｍｌあたりのマイクロユニットで表現され；ＷＨ Ｏ８０１５５８の１マイクロニー−ｙトはＮＩＨＩ−６精１！ｈＴｓＨの０．ｏ ｅｎｇと同等である（未公開データ）。

統計 種々の対照およびトランスフェクションされた培養物からの細胞培地のイムノア ッセイにおける有意差はスチューデントのｔ試験を用いて決定された。

結果 ヒトＴＳＨβ遺伝子 ｌＸｌ０”組換えファージクローンをスクリーニングすることにより１７ｋｂゲ ノム断片が単離された。制限地図（図１）はマウスＴＳＨβｃＤＮＡプローブ（ ５′−非翻訳配列を含む）および３４ｂｐウシ５′非翻訳配列プローブの両方で ハイブリダイゼーションされたファージＤＮＡのサザンプロットを用いて構築さ れた。２つのコード性エキソンは４５０ｂｐイントロンにより分断され、そして その配列は公開された部分配列と同一である（Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｊ等、　１ ９８５．　ＰＥＢ５　Ｌｅｔｔ　１８８：３９４−４００）　（データは示され ていない）。しかしながら、完全なコード配列は今まで知られていなかった。

トランスフェクション 最も活性なアデノ関連ウィルスプロモーター、Ｐ２ＯおよびＳＶ４０の初期プロ モーターの間でｍＲＮＡおよびタンパク質産生のレベルを比較するために２つの 試験が行われた。

表１はこれらの２つの試験からのＲＩＡおよびＩＲＭＡアッセイ結果を示す。興 味深いことに、２９８細胞は少量の遊離α−サブユニット（対照）を合成し、そ のレベルはＤＮＡを含まないリン酸カルシウム沈殿物（ｍ。

ｃｋ）とのトランスフェクションにおいて約１０倍に高められた（Ｐ＜０．００ ０５）。ｐＡＶ２−ｈＣＧαやｐＶＡＲＮＡでのトランスフェクシヨンはｍｏｃ ｋ）ランスフェクションのレベルよりα−産生を高めず、組合せは遊離α−レベ ルを３ないし５倍高めた（ＣＰ＜０゜０００５）。従って、ヒトα−サブユニッ トの外米起源はこの増加の仲介に明らかに重要だった。タンパク質産生を高める ｐＶＡＲＮＡの同じパターンは、ｐＶＡ２−ｈＴＳＨβがトランスフェクション されたときに見られた。２９３細胞はｈＴＳＨを産生せず、その結果、ｍ。

ｃｋまたはｐＶＡＲＮＡ）ランスフェクションに曝された細胞の培地が測定可能 なｈＴＳＨβを持たなかった。

ｐＡＶ２−ｈＴＳＨβに曝された２９３細胞だけがｈＴＳＨを産生じた。プラス ミドが単独でトランスフェクションされた場合、形成されたｈＴＳＨは外来性α との組合せに起因した。しかし、α−およびβ−プラスミドの両方での共トラン スフェクションはｈＴＳＨレベルを１．５ないし２倍高めた（Ｐ＜０．００５） 。

ＣＯ８細胞は遊離のαもβも合成しなかったが、適当なプラスミドでトランスフ ェクションした場合、ｈＴＳＨβおよびｈＴＳＨを合成できた。タンパク質産生 のレベルは２９３細胞におけるより１０−ないし１００倍低く、そしてｐＶＡＲ ＮＡプラスミドがトランスフェクションされた場合に測定可能だった。ｐＡＶ２ またはｐＳＶ２．Ｇのどちらか使用されたかに関係なく、タンパク質レベルはｐ ＶＡＲＮＡプラスミドなしではほとんど測定不可能だった。

図２はマウスＴＳＨβｃＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションさせた全細胞 のＲＮＡのノーザンプロットを示す。２９３細胞において、ｈＴＳＨβメツセー ジは非トランスフェクション細胞またはｍｏｃｋトランスフェクション細胞から 検出されなかった。しかしながら、２．３ｋｂ、１．６ｋｂおよび６５０塩基の ３つのＲＮＡ種がｐＡＶ２−ｈＴＳＨβおよびｐＶＡＲＮＡのトランスフェクシ ョン後に観察された（列３）。これらの３つのバンドは、もし転写が全ての３つ のアデノ関連ウィルスプロモーターで始まるならば、ｐＡＶ２−ｈＴＳＨβから 予測されたものと同じ大きさである（図２）。６５０塩基のｍＲＮＡは適当にス プライシングされたｈＴＳＨβメツセージをおそらく表現する。列４は同じ３つ ノハンドを示すが、ｐＡＶ−ｈｃＧα、ｐＡＶ−ｈＴＳＨβおよびｐＶＡＲＮＡ が共トランスフェクションされた場合、強度がより弱い。列４に観察されたこの シグナル強度における低下はｐＡＶ−ｈＴｓＨβの量の１５μｇから９μｇへの 減少に起因するのかもしれない。

対照およびｍ　ｏ　ｃ　ｋ　トランスフェクションＣＯ８細胞もまたｈＴＳＨメ ツセージを含まなかった。ｐＳＶ２゜Ｇ−ｈＴＳＨβがトランスフェクションさ れたとき（列７−９）、９００塩基の大バンドおよび３．Ｏｋｂの小バンドが観 察された。あらゆる理論と結び付けることなしに、９００塩基の種が残っている ２７７塩基の５′イントロンを含むｍＲＮＡを表現し得、一方３．Ｏｋｂ種はｈ ＴＳＨβポリアデニル化シグナル部位の読みおよびｐｓＶ２．Ｇのポリアデニル 化シグナル部位の使用を表し得るであろうと予測される（図２参照）。

上記ｈＴＳＨβｍＲＮＡに類似の適当な大きさの特異的ヒトαｍＲＮＡ転写がｐ ＡＶ２−ｈＣＧαでトランスフェクションさせた細胞中に観察された（データは 示していない）。本発明の主な目的はタンパク質発現であるから、２９３細胞に おける内因起源からと外因起源（ｐＡＶ２−ｈＣＧα）からのヒトｍＲＮＡの相 対的寄与は決定されなかった。しかしながら、データは、ｐＡＶ２−ｈＣＧα／ ｐＡＶＲＮＡでのトランスフェクション後に観察された遊離α−サブユニットの 高レベルがほとんど外因起源からのｍＲＮＡによるものであることを示唆する。

ゲルおよびレクチンアフィニティークロマトグラフィーｐＡＶ２−ｈｃＧα／ｐ ＡＶ２−ｈＴＳＨβ／ｐＶＡＲＮＡでトランスフェクションさせた後に２９３細 胞に合成されたｈＴＳＨおよびそのサブユニットの正確な分子量はＧ−２００セ フアデツクスカラムで決定された（図３）。さらに、ｈＴＳＨ，ｈＣＧαおよび ｈＴＳＨβの標準調製物が同一カラム上でクロマトグラフィーされた。内部タン パク質標準は２８０ｎｍでの光学的濃度により決定されるように、操作の間に同 一の溶離パターンを示した。各々の場合において、合成ｈＴＳＨおよびそのサブ ユニットの正確なモル重量は相当する標準より大きかった。特に、合成ｈＴＳＨ は４５０００の正確なモル重量を示し、標準脳下垂体ｈＴＳＨ（正確なＭ、＝４ ００００）より大きかった。このことは、組換えＴＳＨが天然物と全く同一では ないことを示す。トランスフェクション物からのヒトαおよびｈＴＳＨβはｈＴ ＳＨ脳下垂体標準と一緒に溶離され、そして両方がそれらのそれぞれの標準サブ ユニット調製物より大きかった。しかしながら、遊離のヒトα−サブユニットの 場合において、ｐＡＶ２−ｈＣＧαからの外因性αと比較された内因性αのクロ マトグラフィーパターンへの相対的寄与は決定され得ない。

標準ヒト脳下垂体ｈＴＳＨと比較された２９３細胞からの合成ｈＴＳＨのコンカ ナバリンＡセファロースへの結合パターンは表２に示されている。合成ｈＴＳＨ はコンカナバリンＡセファロースへの完全結合により示されるようにグリコジル 化された。レクチンカラムからの標準と合成ｈＴｓＨの異なる溶離パターンは少 なくとも炭化水素構造における相違を示しており、組換えＴＳＨ（ｒＴＳＨ）が 天然に生じるＴＳＨと明らかに異なることを再び示す。

免疫活性および生物学的活性 図４は、細胞培養物中に産生されたｈＴＳＨがｈＴｓＨヘテロダイマー（ＭｃＢ ｒｉｄｅ等、同上）の異なるエピトープに指示された２種の抗体を含むアッセイ において２種の脳下垂体ｈＴＳＨ標準と区別できないことを示す。傾斜は値の範 囲全体にわたり平行だった。図５は、同様の脳下垂体ｈＴＳＨ標準と比較された １−■トラップ試験管内ＴＳＨバイオアッセイにおける同様のｈＴＳＨを示す。

標準脳下垂体ｈＴＳＨまたは２９３細胞からの細胞培養物（ｐＡＶ２−ｈＣＧα ／　ｐ　Ａ　Ｖ　２−　ｈ　Ｔ　Ｓ　Ｈβ／ｐＶＡＲＮＡ）の試験管内バイオア ッセイはｈＴｓＨイムノラジオメトリックアッセイ（Ｉ　ＲＭＡ）における免疫 反応性に対して規格化された。標準および細胞培養物の思量反応およびＥ　Ｄ　 ｓ。は同一だった。さらに、ＣＯ８細ｍ’ｔｙ’ラノ細胞培養物（ｐＡＶ２−ｈ ｃＧα／ｐＳＶ２β／ｐＶＡＲＮＡ）は、低レベルの発現が思量反応曲線の決定 を示したけれども、生物学的に活性だった。

まとめると、ｈＴＳＨβの１７ｋｂゲノム断片が単離され、そしてこの遺伝子の 両方のコード性エキソンは一時的発現アッセイにおいてｈＴＳＨβおよびｈＴＳ Ｈを産生した。これは細胞培養物における遺伝子トランスフェクションにより産 生されたあらゆる種からのＴＳＨの最初の報告である。ｈＴＳＨβの発現ベクタ ーは２つのコード性エキソンだけを含み、そして遺伝子の５′非翻訳エキソンを 含まない（Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄ等、　ＭｏＬ、Ｅｎｄ、　２（１）；３２−３ ９．１９８８）。

遺伝子トランスフェクション後の一時的発現はＳＶ４０の初期プロモーターまた はアデノウィルス関連ウィルスのＰ４０プロモーターの両方を試験するために使 用された。ＣＯ８細胞における初期プロモーターは、ｐＶＡＲＮＡが共トランス フェクションされたか否かに関係なく２９３細胞中のＰ４０プロモーターに比べ より多いｍＲＮＡを産生じた。しかしながら、ｐＶＡＲＮＡはいずれのベクター 系においてｍＲＮＡレベルを明らかに高めた。このことは、翻訳速度を高めるこ との他に、ｐＶＡＲＮＡは転写速度、ＲＮＡ転移、または安定性のいずれかを高 めなければならないことを示唆する。

ｐＳＶ２．Ｇ−ｈＴＳＨβ発現ベクターがｐＡＶ２−ｈＴＳＨβに比べより高い レベルのｈＴＳＨβｍＲＮＡを産生じ、このｍＲＮＡはヒト脳下垂体中に見出さ れたものに比べ約２５０塩基大きかった。４５０ｂｐイントロンは成熟メツセー ジにおいてｈＴＳＨβタンパク質合成を妨げるから、該イントロンは明らかにス プライシングされた。また、適当な大きさのｍＲＮＡはｐＡＶ２−ｈＴＳＨβに より産生され、断片中のポリアデニル化部位が活性でなければならないことを示 した。従って、ＣＯ８細胞中のより大きいｈＴＳＨβｍＲＮＡに対する最も確か な理由は第１のコード性エキソンの上流の２７７ｂｐイントロン断片のスプライ シングの欠如だった。Ｐ４０プロモーターの転写開始部位の下流の１８塩基対は 、２７７ｂｐイントロン断片がアデノ関連ウィルスベクターにおいて切除される かを説明し得るコンセンサススプライシングドナ一部位である。

プラスミドｐＶＡＲＮＡはいずれかのベクター系においてタンパク質産生を高め たが、しかし２９３細胞におけるＰ４０プロモーターはりＶＡＲＮＡと共トラン スフェクションされた場合のＳＶ４０の初期プロモーターに比べ１０ないし１０ ０倍のタンパク質の発現を導いた。

これは、その他のｍＲＮＡの発現に対して以前示されていたように（Ａｋｕｓｊ ａｒｖｉ等、　１９８７．　ＭｏＬ　ＣｅＬＬ　ＢｉｏＬ　７：５４９−５５１ ）、ｐＶＡＲＮＡにより仲介された高められた翻訳速度におそらく起因する。も ちろん、ｐＳＶ２．Ｇ−ｈＴＳＨβからのより大きいｍＲＮＡがＣＯ８細胞から のより低いタンパク質レベルに寄与した可能性は除外され得ない。

細胞培養物中に産生されたｈＴＳＨは、高度に特異的なＩＲＭＡおよび試験管内 バイオアッセイの両方において２つの脳下垂体ｈＴＳＨ標準と機能的に区８σで きなかった。しかしながら、本発明の合成ｈＴｓＨがゲルクロマトグラフィーで は標準脳下垂体ｈＴＳＨより大きかったことは注意されるべきである。それは、 コンカナバリンＡへの完全結合により示されたようにグリコジル化されたけれど も、標準ｈＴＳＨ調製物と比較してレクチンクロマトグラフィーの幾分異なるパ ターンを示した。脳下垂体標準と比較してこれらの合成糖タンパク質のより大き いモル重量は、さらなるシリル化のような変更グリコジル化パターンに起因する ものとは（ｋ考えられる。ｈＴＳＨの場合において、これは、死後ヒト脳下垂体 から精製された標準ｈＴＳＨ中に見出された１１２よりむしろ核酸配列から予測 された１１８アミノ酸を含むβサブユニットを反映するかも知れない。

一時的発現は大多数の発現ベクターの分析における安定な組み込みに比べ便利で ある。ｐＡＶ２およびｐＶＡＲＮＡは今、タンパク質およびグリコジル化部位構 造機能関係を分析するのに十分に高いレベルで２９３細胞中にｈＴｓＨの一時的 発現を可能にする。以前、そのような関係についての唯一の情報がヨウ化、ニト ロ化、アセチル化およびカルボキシメチル化によるタンパク質の化学的変性（Ｐ ｉｅｒｃｅ等、　１９８１．　Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｗ、、　Ａｎ ｎｕａＬ　１ｅｖｉｅｒｎｓ　Ｉｎｃ、、　Ｐａ１ｏ　ＡＬｔｏ、　ＣＡ、　ｐ ｐ４６５−４９５）およびツニカマイシンによるグリコジル化の阻害（Ｗｅｉｎ ｔｒａｕｂ等。

１９８０、　Ｊ　ＢｉｏＬ　Ｃｈｅｗ　２５５：５７１５−５７２３）を含む研 究に由来していた。化学基はそれ自体、それらが産生ずるアミノ酸における変更 に無関係のタンパク質コンホメーションを変えることができ、そしてグリコジル 化の阻害はＴＳＨだけでなく、全ての細胞糖タンパク質に影響を及ぼす。

ｈＣＧαｃＤＮＡおよびヒトＴＳＨβ遺伝子の特定部位の突然変異誘発は、どの 領域がタンパク質コンホメーション、サブユニットコンビネーション、レセプタ ー結合、生物学的活性および代謝クリアランスに対して、化学基または未知の変 化をタンパク質構造に導入することなしに重要であるかを直接示し得る。

実質的に純粋なｒＴｓＨは今、ヒト甲状腺ガンの診断および治療、モしてＴＳＨ のレベルの決定を実際に利用可能にする。

現在、ヒト甲状腺ガンの診断および治療のための利用可能な唯一の方法は、患者 を甲状腺機能不全にし、そしてそれら自身の内因性ヒトＴＳＨを数週間後に高め 、ガン中にＩｌｌ　ｌの取込みを刺激することを包含する。そのような刺激は、 スキャンにより腫瘍の位置決めするための診断試験として使用され、そして引続 き　Ｉｌｌ　ｌの大量投与によりガンを治療するために使用される。診断試験お よび治療の全ては高レベルのヒトＴＳＨに依存する。

しかしながら、内因性甲状腺機能不全を引き起こす方法は、昏睡、虚弱、心臓麻 痺を含む革具を引き起こす副作用を有し、そして数週間に及ぶ治療期間に腫瘍の 急速な増殖を導く可能性がある。これに対し、合成ヒトＴＳＨの望ましい形態が 利用可能であれば、患者はＴＳＨの外因性注射を行われることにより甲状腺機能 正常である間に治療される得るであろう。しかしながら、死体解剖で集められる 利用可能なヒト脳下垂体からの十分な天然物がないから、外因性ＴＳＨを投与す ることは現在可能ではない。さらに、もし利用可能であっても、ヒト脳下垂体は ウィルスの混入が見出され、そして国立脳下垂体局（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｐｉｔ ｕｉｔａｒｙ　Ａｇｅｎｃｙ）はあらゆるヒト診断または治療研究のための天然 物の使用を禁止している。このことは、合成物として現在排他的に市販されてい るヒト成長ホルモンを含む全てのヒト脳下垂体ホルモンに対して真実である。し かしながら、ヒト成長ホルモン（非糖タンパク質）に対して利用可能だった技術 はヒトＴＳＨ（２つのグリコジル化サブユニットの糖タンパク質ホルモン）に全 く利用できない。本明細書に上記されたように、トランスフェクションおよび哺 乳類細胞における各サブユニットの適当なグリコジル化に関する本発明の方法論 だけが、所望の生物学的に活性なｒＴｓＨ物質を産生ずる。さらに、その細胞で 達成され得る変更グリコジル化パターンが、本発明の方法論で記載されたように 、甲状腺ガンの診断および治療に特に適しているより長く作用するヒトチロトロ ピンを産生ずることが見出された。

甲状腺ガンの診断および治療は２ないし４週間にわたり約１００億個の細胞から 集められた大容量の組織培養培地から合成ＴＳＨを精製することを最初に含む。

当業者には公知であるようにタンパク質混入を減らすための化学的に規定された 培地を用いて、培地中に分泌された全てのタンパク質の約５ないし１０％を表現 する合成ヒ）ＴＳＨが得られる。このようにして得られたヒトＴＳＨはイムノア フィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣ排除クロマトグラフィー（２ないし ８回反復）、それに続く透析および限外ろ過による濃縮、凍結乾燥等を包含する 標準技術の組合せにより精製される。精製されたヒトＴＳＨは次に動物で試験さ れ、その効力並びに不所望の毒性のないことが確認される。合成ＴＳ）Ｉは次に 、ＩＩＩ　ｌでの診断および治療の両方のための腫瘍内への最大取込みを達成す る最適投与量を決定するために、患者において異なる投与量を用いて臨床試験が 行われる。診断のための初期の適性試験の間に、約１００μｇの１または２回の 投与が行われ、治療の間に約１００ないし２００μｇの３ないし６回の投与が行 われ得るが、最適投与スケジュールは臨床試験の結果により決定される。これま で利用可能な方法において遭遇される甲状腺機能不全の副作用を生じることな（ 、甲状腺機能正常である間に、これらの操作の全てが行われ得ることは注目され る。

ＩＩＩ　ｌの最適取込みが確立されたら、患者はＩＩＩ　ｌの約５０ないし４０ ０ｍＣＩの投与量で処置され、そして治療の効果は引き続（ｔｉｌｌの治療試験 並びに慣用のＸ線、ＣＡＴスキャン、血清チログロブリンの測定等により評価し た。もちろん、当業者には十分公知の標準方法論により製造される　ＩＩＩ　ｌ 標識ｒＴＳＨは上記の操作で適当に利用され得る。

米国では毎年約１万の甲状腺ガンの新しい例が生じていると見積もられ、そして このガンのより古い例の非常に多くの普及は現在不十分である反復診断および治 療を必要とする。本明細書で教示されるような合成ヒトＴＳＨの有用性は、注射 あたり５０．００ないしｉｏｏ、。

Ｏドルの費用でさえも、依然として、この困難であるがしかし治癒可能なガンに 対する完全な評価および治療の比較的費用のかからない部分であろう。

本発明の生成物のもう一つの利点はラジオイムノアッセイの技術を用いるヒトチ ロトロピンのためのアッセイ成分を提供することである。ある種のイムノアッセ イキットは現在利用可能であるが、しかしその中の試薬は天然物の非常に少ない 供給物から再び誘導される。さらに、天然物はヒトの脳下垂体の起源並びに解剖 の間に起こる劣化の程度に応じて大きく変化する。このことは、種々のキット間 でＴＳＨ試験の結果が不一致であるという市販の利用可能なキット間での相当な 変動を導いていた。

これに対し、本発明は、キット製造物が汎用標準調製物および試薬の実質的に同 一で無尽蔵の供給を有することを可能にする合成ＴＳＨの安定な調製物の実質的 に制限されない供給を初めて提供する。このことは投与の世界的な規模での一致 を可能にし、そしてヒトの甲状腺機能の評価に不可欠なヒトＴＳＨの測定におい てより必要とされる標定を導く。このことは放射性ヨウ素（ｌ　Ｉｌｌ。

１１１８　）、または別の適当な標識性物質例えば化学発光剤または蛍光標識で ｒＴＳＨを標識し、そして当業者には公知のポリクローナルまたはモノクローナ ル技術のいずれかにより純粋物に対する抗体を製造し、そしてその他のホルモン との顕著な妨害性交差反応のない免疫グロブリンの無尽蔵の供給を提供すること により達成される。

抗体は次に種々の標準アッセイ方法論（ＲＩＡ、ＩＲＭＡ、サンドイッチアッセ イ等）に使用されるべき製品に供給される古典的ラジオイムノアッセイキットに 配合される。

ｒＴＳＨのその他の種々の利点がある。試験は、変更されたクリコアル化パター ンを導く種々の細胞系においてホルモンを発現することによりＴＳＨを変更する ことが可能であることを示した。さらに、特定部位の突然変異誘発の技術を用い て、ＤＮＡ中の個々の塩基が変えられ、生成物は変更された生物学的機能例えば 延長または短縮された半減期、並びにＴＳＨレセプターに結合し、そして実際に ７３８機能を阻害する競合拮抗物質を有して得られる。そのような競合拮抗物質 は、疾病例えばＴＳＨ誘導誘導甲状腺機能促進症にＴＳＨレセプターに対して自 己抗体により引き起こされるグラベン症を治療するための新規な方法に有用であ る。これらの異常な刺激物の機能は、我々が細胞レベルで活性であることを既に 確認した競合拮抗物質により阻害されるであろう。さらに、種々の長期間活性な 調剤および短期間活性な調剤を用いて、甲状腺機能を特に刺激するであろう超作 用物質が製造され得、そして甲状腺機能を特別に阻害するであろう超拮抗物質が 製造され得る。このようにして甲状腺機能は甲状腺活性過剰または活性不足の疾 病の多くの異なるタイプにおいて制御され得る。これらの全く新しいアプローチ は、上記の理由で天然物が生体内での使用が禁じられているから、本発明の方法 論による合成ＴＳＨが有用性によってのみ実現可能である。

トランスフェクション法の変形が哺乳類細胞によるＴＳＨ産生の量を非常に高め ることも見出された。例えば、第２および第３エキソン（２コード性エキソン） だけを含むＴＳＨ−β遺伝子構築物を用いる代わりに、新規な構築物がＴＳＨ− βの最初の非翻訳エキソンを添加することにより製造される。この非翻訳ＴＳＨ −βエキソンの包含はＴＳＨ産生を非常に高める。あらゆる特定の理論と関連さ せることなしに、引き起こされたＴＳＨ産生は高められた転写速度および／また はｍＲＮＡ安定性により生じることが考えられる。さらに、β遺伝子に比べ約３ ないし５倍の比率で過剰なα遺伝子は、市販の尺度の産生に近接する高速のＴＳ Ｈ産生（１０−５０ｍｇ／月）をもたらすことが発見された。

抗ｒＴＳＨ抗体を利用する標準濃度曲線が慣用の免疫学的アッセイにより試料中 のＴＳＨの量を決定するために確立される。

要するに、組換えで製造された合成ＴＳＨは、天然物とは本質的に異なるけれど も、天然物と類似する機能的特徴を有し、そして診断ならびに治療操作に有用で ある。

本明細書に記載された実施例および実施態様は説明のためだけのものであり、そ して本明細書の記載から種々の変形または変更は当業者には考えられ得るもので あり、それらは本願の精神および範囲ならびに添付された請求の範囲内に包含さ れるべきものであることが理解される。

表１（つづき） 種々の構築物を２９３またはＣＯ８細胞のいずれかに２つの別々な実験でトラン スフェクションさせた。培地は実験１で２日後、実験２で３Ｂ後に集められた。

細胞培地は示されるようにヒトα−サブユニット、ｈＴＳＨβサブユニット、お よびｈＴＳＨに対して評価された。ｎ。

トランスフェクションさせたプレートの数、Ｉ　ＲＭＡ。

１μＵはＮＩＨｉ８精製ｈＴｓＨＯ，０９ｎｇに免疫学的に同等である。培地、 細胞に添加される前の新鮮培地。対照、トランスフェクションされていない細胞 からの培地。Ｍｏ　ｃｋ、ＤＮＡを欠くリン酸カルシウム沈殿物でトランスフェ クションさせた細胞からの培地。

ａ　ｍｏｃｋ、、２９３１Ｍ胞に対してｐ＜０，０００５ｂ　ｐＡＶ２α／ｐＶ ＡＲＮＡ（２）、２９３細胞に対してｐ＜Ｑ、０００５ ＣｐＡＶ２ａ／β／ｐＶＡＲＮＡ（２Ｌ　２９８細胞に対してｐ＜０．０５ ｄ　ｐＡＶ２β／１）ＶＡＲＮＡＴ２）、２９３細胞に対してｐ＜０．００５ 表２１合成および標準ｈＴＳＨのレクチンクロマトグラカラム　非結合　結合− ＭＧ　結合−ＭＭＩＷＨＯＳＴＤ　０　１２　８８ ２　ｐＡＶ２α／β／ｐＶＡＲＮＡ　０　２８　７２図４の説明に記載したよう に合成対標準ｈＴＳＨ調製物のコンカナバリンＡセファロースへの結合が示され ている。結果は２つの同一カラムから溶離された全す、　Ｔ　Ｓ　Ｈ免疫活性の ％とじて表現される。非結合、結合−ＭＧ、結合−ＭＭ＝それぞれトリス緩衝液 、α−メチルグルコシド（１０ｍＭ）、およびα−メチルマンノシド（５００ｍ Ｍ）　で溶離後の２ｍｌカラム画分中に測定された免疫活性。

ＲＩＡ　（ｎｇ／ｍ１）ｉｓすｌＲＭＡ　（ｐＵ／ｍｌ）補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８）平成３年７月１０日

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．実質的に純粋で、生物学的に活性な組換えヒトチロトロピン（ｒＴＳＨ）。
2. ２．Ｉ１２１、Ｉ１２６を用いてアイソトープで、化学発光剤で、または蛍光剤 で標識された請求項１記載のチロトロピン。
3. ３．チロトロピン産生を引き起こす遺伝子要素を有する構築物を用いる組換え遺 伝子法により製造された請求項１記載のチロトロピン。
4. ４．適当な発現ベクター内に請求項１記載のチロトロピンの発現のための完全ヌ クレオチド配列を含むクローン。
5. ５．ＴＳＨ−βの最初の非翻訳エキソンをさらに含む請求項４記載のクローン。
6. ６．（ａ）過当な発現ベクター内の請求項４記載のクローンによるＴＳＨの発現 を可能にし、そして（ｂ）次に実質的に純粋なＴＳＨを慣用の精製および単離方 法論により回収する、 ことからなるＴＳＨを製造する方法。
7. ７．（ａ）適当な発現ベクター内の請求項５記載のクローンによるＴＳＨの発現 を可能にし、そして（ｂ）次に実質的に純粋なＴＳＨを慣用の精製および単離方 法論により回収する、 ことからなるＴＳＨを製造する方法。
8. ８．（ａ）ＴＳＨαがＴＳＨβの約３ないし５倍過剰である請求項４記載のクロ ーンによるＴＳＨの発現を可能にし、そして （ｂ）次に実質的に純粋なＴＳＨを慣用の精製および単離方法論により回収する 、 ことからなるＴＳＨを製造する方法。
9. ９．（ａ）ＴＳＨαがＴＳＨβの約３ないし５倍過剰である請求項５記載のクロ ーンによるＴＳＨの発現を可能にし、そして （ｂ）次に実質的に純粋なＴＳＨを慣用の精製および単離方法論により回収する 、 ことからなるＴＳＨを製造する方法。
10. １０．請求項４記載のクローンの突然変異体により産生されたＴＳＨ拮抗物質。
11. １１．請求項４記載のクローンの突然変異体により産生されたＴＳＨ作用物質。
12. １２．（ａ）実質的に純粋な非標識ｒＴＳＨの汎用標準（ｂ）実質的に純粋な標 識ｒＴＳＨ （ｃ）精製ｒＴＳＨに対する抗体および（ｄ）試薬（ａ）、（ｂ）および（ｃ） の用法を記載する指示物 を含む分離した容器を包含するシール可能なパッケージからなるキット。
13. １３．非ＴＳＨホルモンとの妨害性交差反応性のない抗ｒＴＳＨ抗体。
14. １４．ＴＳＨの量が決定されるべき試料の一部を請求項１３記載の抗体と反応さ せ、そして予め決定された標準抗体−ｒＴＳＨ反応曲線と抗体反応性のレベルを 比較して前記試料中に存在するＴＳＨの量を決定することからなる試料中のＴＳ Ｈのレベルを決定する方法。
15. １５．請求項１記載のｒＴＳＨを患者に投与して１３１Ｉ取込みを最大にし、そ して次に該患者に１２１Ｉの可視化投与量を投与し、そして次に標準可視化法に よりガンを可視化することからなる甲状腺ガンの範囲を診断する方法。
16. １６．請求項１記載のｒＴＳＨおよび１３１Ｉの組合せまたは１３１Ｉ標識ｒＴ ＳＨの治療的規制を甲状腺ガンに罹患した患者に施すことからなる甲状腺ガンの 処置方法。
17. １７．請求項１０記載の拮抗物質の競合量によりＴＳＨ活性を阻害することから なるＴＳＨ活性を阻害する方法。
18. １８．請求項１１記載の作用物質によりＴＳＨ産生を誘導することからなるＴＳ Ｈ活性を刺激する方法。