ES2324322T3 - Uso de igf-1 solo o combinado con la hormona de crecimiento para estimular el crecimiento. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de ensayo inmunofuncional mediado por ligando (LIFA) para la detección de la presencia y la concentración de proteínas de unión a hormonas polipeptídicas, que comprende capturar la proteína de unión con un primer anticuerpo unido a una fase sólida, saturar la proteína de unión a la hormona unida con el ligando de hormona polipeptídica, y detectar el ligando de hormona polipeptídica, y detectar el ligando de la hormona polipeptídica unido con un segundo anticuerpo marcado detectablemente específico del ligando de la hormona polipeptídica. En ausencia de hormona polipeptídica saturante añadida, el LIFA mide la cantidad de proteína de unión a hormona unida al ligando endógeno de la hormona polipeptídica. Un ensayo de proteína de unión a hormona del crecimiento ilustra el procedimiento de la presente invención. Los resultados del ensayo LIFA indican que el aumento de la proteína de unión aumenta sustancialmente la actividad de la hormona del crecimiento. Se describen procedimientos de uso y formulaciones de proteína de unión a hormona del crecimiento, hormona del crecimiento, factor I de crecimiento de tipo insulina y proteína de unión al factor del crecimiento de tipo insulina.

Description

Uso de IGF-1 solo o combinado con la hormona de crecimiento para estimular el crecimiento.

Campo de la invención

Se describe un procedimiento novedoso de ensayo inmunofuncional mediado por ligando (LIFA) para detectar la presencia y cuantificar la cantidad de una proteína de unión de hormona polipeptídica en un fluido biológico, y/o determinar la cantidad de hormona polipeptídica ligando específicamente unida a la proteína de unión de hormona. Este procedimiento inmunométrico modificado para una proteína de unión de hormona usa: 1) un primer anticuerpo, unido a una fase sólida, para capturar la proteína de unión de hormona; 2) una cantidad de saturación de hormona ligando; y, 3) un segundo anticuerpo marcado específico contra la hormona ligando. El procedimiento LIFA se ejemplifica mediante un ensayo de proteína de unión de hormona del crecimiento.

Descripción de la técnica previa

Una proteína de unión de hormona (HBP) es una proteína portadora, que se encuentra en fluidos biológicos, que tiene especificidad de unión por una hormona polipeptídica ligando. Son ejemplos de tales HBP la proteína de unión de la hormona del crecimiento (GHBP), la proteína de unión del factor de crecimiento epidérmico (EGF), las proteínas unidoras (seis de ellas) de los factores 1 y 2 de crecimiento parecidos a la insulina (IGF-1, IGF-2), la proteína de unión del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), la proteína de unión del factor de crecimiento del nervio (NGF), la proteína de unión de la insulina, la proteína de unión del factor de liberación de la corticotropina (CRF), la proteína de unión del factor beta de crecimiento transformante (TGF-\beta), y la proteína de unión de la activina (folistatina).

Una de las proteínas de unión a hormonas polipeptídicas mejor caracterizadas es la GHBP. La GHBP descrita en la invención es el dominio extracelular del receptor GH que circula en sangre y funciona como una GHBP en varias especies.

Se sabe poco sobre el destino de la GHBP o su regulación en varias afecciones fisiológicas y patológicas.

Los procedimientos para la producción de hibridomas productores de anticuerpos monoclonales son descritos por Kipps y Herzenberg en Clinical Endocrinology and Metabolism Vol. 62, no. 1 página 108.1-108.9 (1986). Tal como se describe en la presente invención desarrollamos un ensayo para la GHBP mediante la elección de una nueva estrategia. Este ensayo era capaz sorprendentemente de detectar de manera precisa proteínas de unión a hormonas individuales de una manera que no se ha demostrado previamente.

El LIFA, que es el procedimiento de ensayo preferido, es fácil de utilizar y tiene la ventaja de que sólo detecta proteínas de unión funcionales. Cuando el procedimiento de ensayo se aplica a GHBP, se miden tanto la GHBP total como la GHBP complejada de manera endógena, y el ensayo no requiere la eliminación de GH endógeno de la GHBP o procedimientos para separar la GH libre del complejo GHBP. En contraste con los procedimientos anteriores, la GH endógena no interfiere en el ensayo; en cambio, la GH unida, endógena o añadida de forma exógena, se utiliza para detectar la GHBP total y complejada. De hecho, no se puede utilizar la GH como el primer miembro unido a la fase sólida, ya que GH no puede formar complejos con la proteína de unión que ya está complejada con GH endógena. Por lo tanto, un requerimiento del presente procedimiento de ensayo es para un anticuerpo de recubrimiento de la fase sólida que reconoce la proteína de unión tanto en forma libre como en forma complejada. El procedimiento de ensayo descrito en la presente invención también se puede utilizar para medir la capacidad de unión total y la saturación de otras proteínas de unión a hormonas polipeptídicas con respecto a los ligandos que se unen.

Descripción resumida de la invención

Se describe un procedimiento LIFA (no reivindicado en la presente invención) para detectar la presencia y la concentración de una proteína de unión a hormona polipeptídica y/o el grado de saturación de la proteína de unión a hormona con su hormona ligando específica. La unión funcional entre la proteína de unión a hormona y la hormona ligando es necesaria en el ensayo. Tal como se ilustra en la figura 1, etapas 1-3, se utiliza un anticuerpo monoclonal o policlonal que se une a uno o más epítopos de proteína de unión a hormona, que están expuestos tanto en la proteína libre como en la proteína de unión asociada a hormona ligando, para capturar la proteína de unión a hormona en una matriz sólida. En la etapa 3, la proteína de unión a hormona capturada se incuba con la hormona ligando para saturar los sitios de proteína de unión a hormona específicos para la hormona ligando. En una opción, la proteína de unión a hormona no se satura con la hormona ligando antes de la incubación de la etapa 4 con anticuerpo marcado específico de hormona. Esto permite la determinación del nivel de hormona ligando endógena asociada con la proteína de unión a hormona antes de la incubación con la hormona ligando añadida exógena. La proteína de unión a hormona y la hormona ligando se pueden incubar juntas simultáneamente y con el anticuerpo de captura de la fase sólida y se pueden incubar secuencialmente con el anticuerpo de captura. En la etapa 4, un anticuerpo monoclonal o policlonal marcado de manera detectable, que se une a uno o más epítopos en la hormona ligando en un sitio que es diferente al que se une la proteína de unión a hormona, se une de manera estable al complejo hormona ligando-proteína de unión a hormona. Cuando la proteína de unión a hormona se satura con a hormona añadida (etapa 3), la cantidad total de hormona detectada es una medida de la cantidad de proteína de unión presente. Cuando la proteína de unión a hormona no está saturada con hormona añadida, la cantidad de hormona detectada es una medición de la hormona ligando endógena asociada con la proteína de unión a hormona. Una comparación de los dos valores permite la determinación de tanto la cantidad de proteína de unión a hormona presente como la saturación relativa con hormona ligando
endógena.

Se muestra el uso terapéutico de GHBP solo y en combinación con GH para estimular tejidos sensibles a la hormona de crecimiento. Se muestra que el uso de una composición terapéutica de GHBP-GH da lugar a una mayor estimulación de tejidos sensibles a GH con el uso de menos GH. Además, la composición de GHBP-GH es duradera después de la administración, permutando de este modo una administración menos frecuente que con GH sola.

La presente invención proporciona el uso de un factor de crecimiento-1 de tipo insulina en la fabricación de una formulación terapéuticamente eficaz para estimular el crecimiento de un humano que tiene una estatura corta idiopática, donde (i) la formulación no comprende la hormona de crecimiento; o (ii) la formulación comprende adicionalmente la hormona de crecimiento humano y no es para el tratamiento de un paciente que muestra una ralentización en la velocidad de crecimiento después de por lo menos doce meses de administración de la hormona de crecimiento.

EPA 91911898.4 4 (publicada originalmente como WO 91/18621) está comprendida en el estado de la técnica tal como se define según el Artículo 54(3) EPC y describe el uso de una combinación de IGF-1 y GH para potenciar el crecimiento de un mamífero. Se indica el tratamiento de pacientes que muestran una ralentización en la velocidad de crecimiento después de por lo menos 12 meses de administración de GH, incluyendo pacientes en los que la etiología de la estatura corta es idiotípica y esta es la base para el "Disclaimer" en la parte (ii) de la reivindicación 1 y en la correspondiente definición de la invención tal como se afirma anteriormente.

EPA90908176.2 (publicada originalmente como WO90/15142) está comprendida en el estado de la técnica tal como se define según el Artículo 54(3) EPC y describe proteínas de fusión que comprenden un primer polipéptido que presenta actividad de la hormona de crecimiento, preferiblemente que presenta actividad de la hormona de crecimiento porcina, y un segundo polipéptido que puede ser el factor de crecimiento de la insulina (IGF)-I, para su uso en el tratamiento, entre otras, de deficiencias en la hormona del crecimiento.

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Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Esquema del procedimiento de ensayo para detectar la proteína de unión a la hormona de crecimiento humana.

Figura 2. Selección de MAb de recubrimiento. % de GH-I^{125} unido por MAb 5, 43 y 263 se representaron frente a las tres configuraciones de incubación diferentes. Se evaluaron los MAbs inmovilizados en tres experimentos diferentes. En el primer experimento, utilizando etapas secuenciales de incubación, se incubó en primer lugar GHBP con MAb recubierto en el pocillo, seguido de la adición de GH radiomarcada (GH-I^{125}). En el segundo experimento, la reacción de GHBP y GH-I^{125} se llevó a cabo simultáneamente en pocillos recubiertos de MAb. En el tercer experimento, la GHBP se preincubó con hGH-I^{125} a 4ºC y, a continuación, se añadió al pocillo recubierto de MAb.

Figura 3. Comparación de dos curvas estándar generadas con y sin preincubación con GH. Se incubaron un grupo de patrones con GH (concentración final 200 ng/ml) durante toda la noche a 4ºC, los patrones de control se incubaron con tampón de ensayo. A continuación, las muestras así generadas se ensayaron en el LIFA.

Figura 4. Curvas estándar de hGHBP utilizando hGH de 22 kD como ligando, hGHBP utilizando 20 kD como ligando y hGHBP utilizando una combinación de hGH de 22 kD y 20 kD.

Figura 5. Representación de la concentración de hGHBP téorica basada en la dilución de tres muestras de suero diferentes frente a la concentración de hGHBP en las muestras de suero diluidas en tampón de ensayo y medidas mediante LIFA.

Figura 6. Niveles de hGHBP total y unida a hGH en muestras de suero aleatorias de 16 adultos sanos (muestras # 1-16) y dos pacientes con enanismo tipo Laron (muestra # 17 y 18).

Figura 7. Correlación cruzada de GH y GHBP (A) Perfiles concentración en plasma en veinticuatro horas de GH (panel superior), complejo GH/GHBP (panel central) y de GHBP total (panel inferior) en muestras de un chico de 15 años (perfil No. 15, Tabla 4); (B) Análisis de correlación cruzada estadística de los datos de (A).

Figura 8. Niveles de proteína de unión a GH en pacientes del Nacional Cooperative Growth Study (NCGS) indicando la concentración logarítmica de GHBP frente a la edad del paciente. Las líneas cruzadas representan los valores promedio, las líneas verticales son más o menos 1 SDs; las líneas verticales de puntos son más o menos dos desviaciones estándar (SDs). Los puntos negros separados representan cada uno un paciente. (A) Deficiencia de la hormona de crecimiento (GHD) idiopática para machos; (B) GHD idiopática para hembras, (C) estatura corta idiopática (ISS) para machos; (D) ISS para hembras; (E) Síndrome de Turner.

Ensayo de la proteína de unión a hormona polipeptídica

El ensayo para la presencia de la proteína de unión a hormona polipeptídica utiliza: (1) un primer anticuerpo monoclonal de captura específico para la proteína de unión; (2) hormona polipeptídica ligando y (3) un segundo anticuerpo monoclonal específico para la hormona polipeptídica ligando. El LIFA que se ha desarrollado es un método sencillo y sensible que permite la cuantificación de la concentración total de proteína de unión a hormona funcional en una solución. El intervalo de detección de proteína de unión en los ensayos puede variar de aproximadamente 4 a 20.000 pmol/L, más preferiblemente de aproximadamente 10 a 4.000 pmol/L y los más preferible de aproximadamente 20 a 2000 pmol/L. El ensayo también se puede modificar para medir la concentración del complejo de hormona ligando-proteína de unión circulante. Se utiliza un anticuerpo monoclonal dirigido contra la proteína de unión, que reconoce tanto la proteína libre como la proteína de unión unida a hormona para capturar la proteína de unión en una fase sólida, tal como una placa de microtitulación. Las muestras se incuban con la hormona ligando para saturar todos los sitios de unión y se utiliza un anticuerpo anti-hormona para detectar la cantidad de hormona (endógena y exógena) que se ha unido a la proteína de unión. El mismo procedimiento, pero sin incubación con hormona ligando, permite la cuantificación de los niveles del complejo hormona-proteína de unión circulante.

Este LIFA se puede utilizar para cualquier proteína de unión a hormona polipeptídica. Ofrece la capacidad de detectar de manera precisa la concentración de proteína de unión funcional presente en cualquier fluido biológico y de medir el nivel endógeno de saturación de la proteína de unión funcional con su hormona polipéptidica ligando. Por primera vez, este método de ensayo permite la medición de HBP funcional y la calibración de un ensayo de HBP a una unidad de masa verificable en oposición con unidades de suero, etc. Aunque esto se puede realizar utilizando HBP producida de forma natural y hormona ligando (si está disponible), normalmente se lleva a cabo realizando el ensayo con hormonas polipeptídicas recombinantes y creando una curva estándar basada en HBP recombinante. Sorprendentemente, el método LIFA presente se puede utilizar para detectar tanto la HBP total como la cantidad de HBP complejada con hormona polipeptídica endógena. Por lo tanto, por primera vez, existe un método preciso de determinación de la cantidad de HBP funcional que no está influida por la hormona polipeptídica ambiente.

En una modificación del presente método de ensayo de HBP inmunofuncional, la hormona ligando añadida contiene un segundo marcador detectable que no impide la unión del anticuerpo de detección. Este segundo marcador en la hormona ligando y el primer marcador en el anticuerpo de detección no son los mismos. Mediante la medición por separado de la cantidad de hormona ligando añadida unida y la cantidad de anticuerpo unido, se puede determinar el porcentaje de saturación de la HBP con hormona ligando. El uso de dos marcadores distintos, uno en la hormona ligando y uno en el anticuerpo de detección, permite una determinación simultánea de la cantidad de hormona ligando exógena unida y la HBP total.

El ensayo también se puede utilizar para cuantificar la cantidad de hormona ligando en una muestra desconocida. La HBP recombinante o la HBP sin hormona ligando endógena, se une a la fase sólida como en el método de ensayo. En primer lugar, la muestra desconocida que contiene la hormona ligando se pone en contacto con la HBP unida a anticuerpo. En segundo lugar, se añade el anticuerpo marcado específico de la hormona ligando y se determina la cantidad unida. Esta aplicación del LIFA permite el uso de HBP en menores cantidades que se utilizarían mediante el acoplamiento directo de la HBP a la fase sólida. El uso del anticuerpo para unirse a HBP asegura que la orientación sea de manera que los sitios de unión de HBP para la hormona ligando no están bloqueados.

Ensayo de la proteína de unión de la hormona del crecimiento humana

El ensayo de la presencia de hGHBP usa: 1) un primer anticuerpo monoclonal de captura específico contra la proteína de unión; 2) hormona del crecimiento; y 3) un segundo anticuerpo monoclonal específico contra la hormona del crecimiento (Figura 1). El LIFA que hemos desarrollado es un procedimiento fácil y sensible que permite la cuantificación de la concentración total de proteína de unión de la hormona del crecimiento funcional en fluidos biológicos. El ensayo también puede modificarse para medir la concentración del complejo ligando-proteína de unión circulante. Se usa un anticuerpo monoclonal dirigido contra la hormona del crecimiento-proteína de unión, el cual reconoce ambas, la proteína de unión libre y unida a GH, para capturar la proteína de unión en una placa de microtitulación (Figura 1, paso 1). Las muestras se incuban con hormona del crecimiento humana para saturar todos los sitios de unión (Figura 1, paso 3), y se usa un anticuerpo anti-hGH para detectar la cantidad de hGH (Figura 1, paso 4) (endógena y exógena) que se ha unido a la proteína de unión. El mismo procedimiento, pero sin la incubación con hGH añadida, permite la cuantificación de los niveles circulantes en suero del complejo hGH-proteína.

Un ensayo preferido en ésta es un ELISA de "sándwich" basado en anticuerpo monoclonal (MAb) para la cuantificación de la GHBP en fluidos biológicos tales como el suero humano o plasma. El ensayo, que solamente detecta GHBP funcional, puede usarse para medir ambas, la GHBP total y complejada, y, por tanto, puede calcularse el grado de saturación de la GHBP con su ligando. En un ensayo desarrollado para la hGHBP, el MAb 263 (de recubrimiento) se une libremente a la GHBP así como a la GHBP unida a la hGH, y se usa para capturar la GHBP sobre placas de microtitulación. El MAb conjugado, MCB, que está dirigido contra la hGH, se usa para detectar la hGH que está unida a la GHBP inmovilizada. La cantidad total de GHBP se mide saturando los sitios de unión con hGH, seguida por la detección de la totalidad (GH endógena y exógena) unida a la GHBP. La concentración del complejo GH endógena-GHBP se obtiene incubando las muestras con el anticuerpo conjugado sin saturación previa de la GHBP con GH. El ensayo es sensible y parece cubrir el rango fisiológico, puesto que todas las muestras aleatorias procedentes de 16 adultos normales tuvieron niveles de GHBP claramente detectables. Los experimentos de recuperación de pico muestran que el ensayo es útil para medir niveles de GHBP en ambos, suero y plasma, con recuperaciones que oscilan desde el 80,1 hasta el 113,6%.

Un requisito del presente método de ensayo es un anticuerpo de recubrimiento que reconoce el antígeno en forma libre y forma complejada, que para hGHBP es el MAb 263. Utilizando las técnicas descritas en la presente invención para generar dichos anticuerpos, se cree que el principio tras el LIFA de GHBP se podría utilizar para medir la capacidad de unión total y la saturación de otras proteínas de unión a hormona polipeptídica. La diferencia en el % de unión observado cuando el MAb 263 se analizó en tres formatos de ensayo diferentes (figura 2) es debido a la cinética de ensayo en lugar de las características de unión a MAb. En el experimento de preincubación durante toda la noche, la GHBP presentó la incubación más larga con GH-I^{125} y, por tanto, el mayor % de unión. Aun cuando el tiempo de reacción (4 h) fuera el mismo en el ensayo simultáneo y el ensayo secuencial, la complejación de GH-I^{125} a GHBP sería más rápida para un sistema homogéneo (simultáneo) frente a un sistema heterogéneo (secuencial), y por tanto el % de unión sería superior.

La GH usada para saturar la GHBP podría ser un análogo de la GH en el que hay un sitio de unión específico para el GHBP, y uno más epítopos expuestos para unir el anticuerpo específico contra la GH.

Aplicaciones del ensayo de la GHBP

Los resultados del ensayo de la GHBP y el grado de saturación de la GHBP con la GH podrían usarse para el diagnóstico y tratamiento de deficiencias del crecimiento. Se anticipa que este ensayo proporciona un índice integrado de la exposición de un organismo a la GH. Proporciona una determinación más precisa de la GH total y libre, la cual identificará mejor pacientes que son relativamente deficitarios en GH, y que se beneficiarán de una terapia de remplazo de la GH. En general, el ensayo sería valioso en cualquier situación en la que se administra GH terapéuticamente para tratar una condición clínica, o en la que la GH está presente en cantidades excesivas e implicada en causar o reflejar una patofisiología clínica. Los resultados proporcionan un procedimiento mejorado para verificar el cumplimiento de la terapia de remplazo de la GH y la valoración de la dosis, y para individualizar la terapia con GH en pacientes individuales o en aquéllos con manifestaciones clínicas particulares de deficiencia o exceso de GH.

La utilización de estos resultados del ensayo facilita el diagnóstico de la resistencia a la acción de GH debida a menores cantidades o menor actividad de unión de la GHBP o del receptor de GH, tal como en síndromes hereditarios o adquiridos. Los síndromes hereditarios, incluyendo el enanismo de Laron y otros síndromes de corta estatura, tales como la estatura corta idiopática, se revelan cuando se observa que existen anormalidades de la GHBP. El ensayo también ayuda a la identificación y el tratamiento de síndromes adquiridos, incluyendo estados de enfermedades en los que existe una expresión de GHBP disminuida o excesiva, tal como en una enfermedad hepática. Otros ejemplos del uso del ensayo incluyen la detección de enfermedades de la función ovárica, enfermedades de las articulaciones o los huesos, o enfermedades del hipotálamo o la pituitaria que provocan una producción en exceso de GH o GHBP. El uso clínico de GHBP o los complejos GHBP/GH como agente terapéutico está asistido por el ensayo, ya que la medición de GHBP o GHBP+GH después de su administración ayuda en la práctica clínica al permitir la determinación de la presencia de cantidades terapéuticamente eficaces o terapéuticamente ineficaces en los fluidos corporales.

Todas las partes del sistema promotor del crecimiento se interrelacionan y se espera que la administración del factor liberador de la hormona del crecimiento, el factor inhibidor de la hormona del crecimiento (somatostatina), IGF-1 o proteínas de unión a IGF-1, puedan perturbar las concentraciones de GHBP. La medición de GHBP ayuda en la práctica clínica al evaluar la adeqüidad de los pacientes para el tratamiento con estas proteínas y la eficacia de dichos tratamientos. La presente invención se refiere al uso de IGF-1 tal como se reivindica.

Aplicaciones clínicas del ensayo de la GHBP

El progreso de nuestra comprensión de la GHBP requiere un ensayo rápido, conveniente y preciso de la GHBP. El artículo inicial que describía la GHBP se publicó en 1964 (Hadden et al., Nature 202: 1342 (1964)). La proteína de unión de la GH del suero se caracterizó mejor en el ratón en 1977 (Peeters, S. y Friesen, H. G., Endocrinology 101: 1164 (1977)), y en 1986 dos grupos caracterizaron aún más la existencia de una proteína de unión del suero humana para la GH (Baumann, G. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 62: 134-141 (1986); Herington, A. C. et al., J. Clin. Invest. 77: 1817-1823 (1986)). Cuando se purificó y caracterizó la GHBP en el conejo, se observó que sus 37 residuos amino-terminales eran idénticos a aquellos de la parte extracelular del receptor de la GH del hígado de conejo (Spencer et al., J. Biol. Chem. 263: 7862-7867 (1988)). Se ha sugerido que la GHBP se deriva del receptor de la membrana mediante rotura proteolítica (Trivedi y Daughaday, Endocrinology 123: 2201 (1988)), o que se produce a partir de un mARN diferente derivado del mismo gen que el receptor de GH de longitud completa (Smith et al., Mol. Endo., p. 984 (1989); Baumbach et al., Genes and Dev. 3: 1199 (1989)). Los estudios de la ontogenia de la actividad GHBP en humanos (Daughaday et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 65: 1072-74 (1987)) y los cambios en las concentraciones de GHBP y receptores hepáticos de la GH en ratones embarazados (Smith y Talamantes, Endocrinology 123: 1489-94 (1988)) sugieren que los niveles en suero de GHBP podrían ser un indicador periférico de la actividad del receptor de la GH.

Esta idea de que los niveles de GHBP reflejan la actividad del receptor de la GH está apoyada por el hallazgo de que los pacientes con el enanismo del tipo Laron, un síndrome causado por la carencia de receptores funcionales de la GH, también carecen de actividad de unión de la GH en suero (Daughaday y Trivedi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4636-40 (1987); Baumann et al., J. Clin. Endocrinol. Metabol. 65: 814-816 (1987); Laron et al., Acta Endocrinologica (Copenhague) 121: 603-608 (1989)). Hay indicaciones de que, en algunos pacientes con enanismo del tipo Laron, la anomalía está causada por la supresión parcial del gen del receptor de la GH (Godowski et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8083-8087 (1989); Anselem et al., New England J. Med. 321: 989-95 (1989)), lo que resultaría en fallos del crecimiento debidos a la incapacidad de unir la GH. Nuestro ensayo sería particularmente útil para este tipo de anomalía, puesto que éste, al contrario que ciertos inmunoensayos, no detectaría la proteína inactiva. La capacidad de unión de la GH del suero está reducida en los heterozigóticos para el enanismo de Laron, y se ha sugerido que la medición de los niveles de hGHBP en suero podría ser útil para el asesoramiento genético (Laron et al., ver más arriba).

Se conoce muy poco sobre el papel fisiológico de la GHBP, no obstante, estudios recientes han mostrado que la proteína de unión puede modificar los efectos de la hormona del crecimiento. Se ha demostrado que la GHBP altera la distribución y vida media de la GH (Baumann et al., Metabolism 38: 330-333 (1989)), y también hay evidencia que sugiere que la GHBP afecta la interacción de la GH con su receptor sobre las células diana (Lim et al., Endocrinology 1276: 1287 (1990)). Se ha mostrado recientemente que la hGHBP recombinante producida en E. coli mejora el crecimiento promoviendo los efectos de la hGH cuando se administra a ratas deficientes en GH, indicando que la GHBP podría jugar un papel importante en la regulación del crecimiento corporal en humanos (ver Ejemplo 5).

El LIFA de la presente invención se utiliza para monitorizar la concentración de GHBP en los fluidos biológicos de un paciente para detectar concentraciones aberrantes. En los Ejemplos 5, 6 y 7, se utilizan numerosas aplicaciones del ensayo para monitorizar y evaluar la actividad de la GHBP humana sola y complejada con hGH. Estas aplicaciones farmacológicas incluyen la purificación, dosificación, frecuencia de administración y duración en circulación. El LIFA también se utiliza para monitorizar la actividad de hGHBP de diferentes fuentes, tales como E. coli, células 293 o tejidos de tejido natural.

El LIFA tiene utilidad en la evaluación farmacológica de la acción de la hGHBP en primates. La hGHBP con, y sin, hGH complejada puede monitorizarse en primates para mejorar la dosificación y frecuencia de administración.

En primates

La capacidad de la GHBP para permitir que uno administre inyecciones infrecuentes de GH, usando dosis de GH similares a aquéllas usadas actualmente, y a la vez mantener respuestas de crecimiento, es de importancia clínica. Los experimentos en monos, usando el LIFA, demuestran que la eliminación del complejo GHBP + GH (en una de las formas descritas más arriba, o en una forma modificada) se retrasa en monos. La eliminación de la GH inyectada unida a la GHBP se lentifica hasta un grado similar al que hemos observado en ratas. Esto demuestra en primates las actividades mejoradas de promoción del crecimiento que resultan de administrar hGH complejada con la hGHBP.

En los primates, incluyendo los humanos, el complejo con GHBP es capaz de ser suministrado a intervalos infrecuentes, superiores a cada 2 días, más preferiblemente superiores a cada 7 días, sin una merma de eficacia en comparación con las inyecciones de GH sola cada 1 ó 2 días, o diariamente durante una semana o más. Además, la GHBP complejada con GH o sola se administrará en dosis semanales inferiores en comparación con la GH sola. Los efectos secundarios indeseables del tratamiento con GH, por ejemplo, las propiedades diabetogénicas y de retención de fluidos de la GH, se reducirán con el uso de la GHBP. Hay otros efectos beneficiosos del uso del complejo GH-GHBP, incluyendo una respuesta al IGF-1 aumentada, y la capacidad de la GHBP para dirigir la GH preferiblemente hacia los huesos. Esto permite que el complejo GH-GHBP sea usado para el tratamiento de enfermedades óseas, incluyendo la prevención y tratamiento de la osteoporosis. En cada situación, el LIFA se usa para monitorizar el progreso de la reacción. Las dosis, formulaciones, y procedimientos de uso y fabricación de la hGHBP se describen en la patente estadounidense nº 5.057.417.

El LIFA se usará para definir grupos de pacientes que tienen cantidades aberrantes del complejo GHBP. Por ejemplo, se encontrará que un subconjunto de niños con crecimiento pobre, los cuales son relativamente resistentes a la actividad promotora del crecimiento de la GH, son deficitarios en la GHBP. Tales niños incluyen pacientes con el síndrome de Turner, enfermedades renales, así como una clase de pacientes con proteína de unión deficiente, los cuales fueron previamente descritos como poseedores de una estatura baja idiopática. Se realizarán en humanos estudios farmacocinéticos, en los que se suministra GHBP o complejo GH-GHBP subcutáneamente y se ensayan los niveles en sangre del complejo GH-GHBP usando el LIFA, para establecer regímenes de dosificación temporal apropiados. Se determinarán las dosis de complejo GH-GHBP suficientes para estimular el incremento en las concentraciones de IGF-1 en sangre, estas dosis indicarán las dosis de complejo GH-GHBP necesarias para inducir el crecimiento corporal. De forma subsiguiente, se iniciarán estudios a largo plazo de niños resistentes a la GH para demostrar la capacidad del complejo GHBP-GH para estimular el crecimiento corporal completo, incluyendo el crecimiento óseo. Se usará el LIFA para monitorizar los niveles de GHBP en sangre.

Una aplicación primaria del ensayo es la utilización de LIFA para GHBP con el fin de monitorizar los niveles de GHBP endógenos antes y durante el tratamiento por la deficiencia de GH o GHBP. El ensayo sirve para dirigir el tratamiento que un paciente experimenta. Si no existe GHBP detectable en la sangre, puede estar presente un síndrome de tipo Laron y se puede indicar el tratamiento con IGF-1. Si existe un nivel bajo de GHBP en la sangre, se puede indicar GH o GHBP con o sin IGF-1. Cualquiera que sea la pauta de tratamiento (tratamiento con GH o GH + IGF-1 o el complejo GH-GHBP) aplicado, el LIFA será el más valioso para determinar la respuesta de GHBP al tratamiento. Las concentraciones de GHBP en sangre reflejarán rápidamente la eficacia del tratamiento con GH mucho más que la medición de puntos finales habituales. Una falta de respuesta de los niveles de GHBP en sangre se utilizará como un diagnóstico rápido para considerar estrategias alternativas del tratamiento.

Otro uso de la LIFA es detectar la actividad biológica de la GH endógena en sangre. Esta ensayo usa la adición de una cantidad constante de GHBP seguida por la adición de una muestra sin saturación con la GH. Se anticipa que se detectarán pacientes que poseen concentraciones inmunoreactivas elevadas de GH pero concentraciones inmunofuncionales bajas. Puede usarse un formato de ensayo similar para medir la cantidad de GH bioactiva en cualquier muestra, especialmente para ensayar la actividad biológica de lotes de GH recombinante.

El ensayo de la GHBP puede invertirse para ensayar la GH. El anticuerpo cautivo une la GH, la GHBP se compleja, y el anticuerpo indicador es específico para la GHBP unida. Esto permite el ensayo de la GH sola o complejada con GHBP nativa.

El ensayo se puede utilizar para medir cualquier proteína de unión a hormona polipeptídica conocida encontrada en fluidos biológicos. De manera similar, se puede utilizar con nuevas proteínas de unión a hormonas que se vayan descubriendo. Entre las proteínas de unión diana preferidas del método de ensayo de la presente invención están las siguientes: cualquier proteína de unión a hormona de crecimiento, proteína de unión al factor de crecimiento epidérmico, proteínas de unión al factor de crecimiento de tipo insulina, proteína de unión a insulina, proteína de unión al factor de liberación de corticotropina, proteína de unión al factor de crecimiento nervioso, proteína de unión al factor de crecimiento transformante beta y proteína de unión a activina. La detección de cada una de estas proteínas de unión utilizando el método de ensayo de la presente invención requiere el uso de su respectiva hormona polipeptídica ligando para saturar los sitios de unión a hormona en la proteína de unión. Las hormonas polipeptídicas se pueden purificar a partir fuentes naturales, se pueden producir mediante síntesis de proteínas en fase sólida o se pueden producir mediante medios recombinantes. Entre las hormonas polipeptídicas ligando preferidas utilizadas están: la hormona del crecimiento, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento 1 de tipo insulina, factor de crecimiento 2 de tipo insulina, factor de crecimiento nervioso, insulina, factor de liberación de corticotropina, factor de crecimiento transformante beta y activina. Las proteínas de unión y hormonas polipeptídicas preferidas pueden ser de cualquier animal que tenga dichas proteínas en sus fluidos biológicos. Los fluidos biológicos pueden ser cualquier líquido acuoso, tal como los siguientes: suero, plasma, fluido linfático, fluido sinovial, fluido folicular, fluido seminal, fluido amniótico, leche, sangre completa, orina, fluido espinal, saliva, esputo, lágrimas, perspiración, moco, medio de cultivo tisular, extractos tisulares y extractos celulares.

El pH del medio estará habitualmente en el intervalo de aproximadamente 4-11, más habitualmente en el intervalo de aproximadamente 5-10 y preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 6,4-9,5. El pH se escoge de manera que se mantenga un nivel significativo de unión específica por la HBP y la hormona polipeptídica, la unión de los anticuerpos y los requisitos del marcador detectable. En algunos casos, deberá realizarse un compromiso entre estos tres aspectos. Se pueden utilizar varios tampones para conseguir el pH deseado y mantener el pH durante la determinación con el ensayo. Entre los tampones de ejemplo se incluyen borato, fosfato, carbonato, Tris, barbital y similar. El tampón particular utilizado no es crítico para esta invención, pero en los ensayos individuales un tampón puede ser preferible sobre otro.

Normalmente se utilizan temperaturas moderadas para llevar a cabo el método de ensayo y normalmente se mantienen las temperaturas constantes durante el periodo del ensayo. Las temperaturas para la determinación variarán generalmente desde aproximadamente 4ºC hasta 50ºC, más habitualmente desde aproximadamente 15ºC hasta 40ºC.

La concentración de HBP que se puede analizar variará generalmente desde aproximadamente 10^{-4} hasta 10^{-5}, más habitualmente desde aproximadamente 10^{-6} hasta 10^{-13}. Aunque las concentraciones de varios reactivos se determinarán generalmente mediante el intervalo de concentraciones de interés de la HBP, la concentración de cada uno de los reactivos se determinará normalmente de manera empírica para optimizar la sensibilidad del ensayo sobre el intervalo de interés.

El LIFA se puede utilizar para monitorizar la administración clínica de hGHBP, complejado con o sin hGH. Un uso del método de ensayo es en un método de inducción del crecimiento y anabolismo mamífero, que comprende: (a) determinar la cantidad óptima de una proteína de unión a la hormona de crecimiento requerida para inducir una respuesta inducida por la hormona de crecimiento; (b) medir mediante LIFA la cantidad de proteína de unión a la hormona de crecimiento presente en los fluidos biológicos de una persona sospechosa de ser deficiente en dicha respuesta inducida; y (c) comparar (a) con (b), y si (a) es superior a (b), administrar la proteína de unión a la hormona de crecimiento en una cantidad suficiente para incrementar el nivel de proteína de unión a la hormona de crecimiento hasta dicha cantidad óptima. Otra aplicación clínica del método LIFA es monitorizar una respuesta inducida por la hormona de crecimiento, tal como ganancia de peso, crecimiento óseo, crecimiento y función muscular, crecimiento y función de los órganos, crecimiento de la piel, y el nivel de IGF-1. Los órganos en los que se estimulan el crecimiento y la función pueden ser el timo, rincón, hígado, bazo, cerebro, corazón, pulmones o gónadas. Otra aplicación del método LIFA es disminuir la frecuencia de inyección de una cantidad inductora del crecimiento de un complejo proteína de unión a la hormona de crecimiento-hormona de crecimiento que comprende: (a) determinar el nivel mínimo necesario en suero del complejo proteína de unión a la hormona de crecimiento-hormona de crecimiento requerido para mantener un crecimiento óptimo; (b) medir mediante LIFA el nivel de la proteína de unión a la hormona de crecimiento presente en un paciente sospechoso de ser deficiente en el complejo proteína de unión a la hormona de crecimiento-hormona de crecimiento; y, si el nivel de complejo en (b) es inferior al nivel en (a), entonces (c) administrar una cantidad del complejo proteína de unión a la hormona de crecimiento-hormona de crecimiento suficiente para mantener el nivel del complejo durante un periodo superior a 2 días. El periodo puede ser de dos a catorce días, más preferiblemente de dos a ocho días, y más preferiblemente de tres a siete días. La cantidad óptima de proteína de unión a la hormona de crecimiento se define como aquella igual o superior al 90% del nivel promedio hallado en individuos sanos.

Anticuerpos

Aunque se pueden utilizar anticuerpos policlonales, el anticuerpo preferido es un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un sitio antigénico único. El anticuerpo utilizado en el ensayo debe ser específico para epítopos que no interfieren o bloquean la unión de la hormona polipeptídica con la proteína de unión a hormona. Por lo tanto, el anticuerpo de captura o recubrimiento debe unirse a epítopos en la proteína de unión que dejan el sitio de unión a la hormona disponible para la unión a la hormona. De manera similar, el anticuerpo de detección debe ser específico para aquellos epítopos de hormona polipeptídica que permanecen expuestos después de la unión de la hormona polipeptídica a la proteína de unión a hormona. Los anticuerpos se pueden producir mediante métodos disponibles habitualmente para los expertos en la materia. Los métodos para la producción de anticuerpos monoclonales se describen en numerosos textos de inmunología, tales como Microbiology, 3ª Edición, de Davis et al., Harper & Row, Nueva York, 1980.

Los anticuerpos monoclonales se pueden producir mediante el método descrito en primer lugar por Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol., 6: 511 (1976). Aunque el ensayo se demuestra utilizando anticuerpos monoclonales de ratón; también funcionarán en el método de ensayo anticuerpos monoclonales de cualquier especie animal. De hecho, en el método de ensayo, también funcionarán los anticuerpos quiméricos. Los anticuerpos quiméricos se describen en la Patente de Estados Unidos No. 4.816.567, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851 (1984); Neuberger et al., Nature 312: 604 (1994); Takeda et al., Nature 314: 452 (1985). Los anticuerpos quiméricos se producen mediante el corte y empalme de genes de una molécula anticuerpo de ratón de especificidad antigénica apropiada junto con genes de otro animal que codifica un segundo anticuerpo. De manera similar, los anticuerpos monoclonales, o la región de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal, tal como fragmentos Fab o (Fab)_{2}, se pueden producir mediante métodos recombinantes. En el método de ensayo se pueden utilizar tanto anticuerpos quiméricos como anticuerpos recombinantes o fragmentos de anticuerpo.

Los anticuerpos monoclonales pueden pertenecer a cualquier clase o subclase de anticuerpos, incluyendo IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. También se pueden utilizar fragmentos de anticuerpos de unión activos, tales como Fab, Fv, (Fab)_{2} o similar. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar mediante cualquier medio conveniente que proporciona la inmortalización de los genes de linfocito-B que expresan las subunidades de los anticuerpos, tales como la fusión entre linfocitos sensibles y un compañero de fusión mieloide; transformación, por ejemplo, con el virus Epstein-Bar (EBV); u otras técnicas de inmortalización. Alternativamente, los genes se pueden aislar a partir de un huésped linfocítico que expresa los anticuerpos y se transfieren a un huésped más conveniente para la expresión según técnicas de ingeniería genética conocidas.

Los anticuerpos se pueden obtener a partir de cualquier fuente de vertebrado conveniente, tal como murino, primate, lagomorfo, bovino, ovino, equino, canino, felino o porcino. Los anticuerpos se preparan a menudo mediante la fusión de células de bazo de un huésped sensible al antígeno con célula de mieloma según técnicas conocidas o mediante la transformación de las células de bazo con un vector transformante apropiado para inmortalizar las células. Las células se pueden cultivar en un medio selectivo, se pueden clonar y cribar para seleccionar anticuerpos monoclonales que se unen a los antígenos designadas.

Los métodos utilizados para producir los anticuerpos para el anticuerpo de captura y para el anticuerpo de detección se puede realizar convenientemente mediante la administración del inmunógeno respectivo, proteína de unión u hormona polipeptídica, y la obtención del anticuerpo. El anticuerpo preferido es un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo producido se criba a continuación para determinar el anticuerpo preferido que no impide la reacción de unión entre la hormona polipeptídica y la proteína de unión. El anticuerpo monoclonal preferido para detectar la hGH cuando se une a hGHBP se produjo mediante un hibridoma de ratón (Cunningham et al., Science (1989) 243: 1330-1336). El anticuerpo monoclonal anti-hGHBP utilizado como el anticuerpo de captura o recubrimiento está disponible comercialmente (Agen Inc., 90 East Halsey Road, Parsippanyu NJ 07054) o se puede producir utilizando el hGHBP como inmunógeno y cribando el anticuerpo tal como se ha descrito anteriormente.

Debido a la facilidad relativa con la que ahora se pueden preparar anticuerpos contra antígenos, los ensayos preferidos utilizan anticuerpos monoclonales o policlonales unidos a la fase sólida para capturar la HBP. Las técnicas para unir HBP específica a sustratos de fase sólida, tales como filtro, plástico, etc. son bien conocidos y no necesitan describirse en detalle aquí. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 4.376.110 y las referencias citadas en la misma. Entre los soportes de fase sólida habituales más preferidos están: pequeñas láminas, gránulos de plástico, placas de ensayo o tubos de ensayo fabricados de polietileno, poliestireno, polipropileno u otro material adecuado. También son útiles materiales particulados, tales como papel, agarosa, dextrano reticulado y otros polisacáridos.

Interferencia por anticuerpos heterofílicos

Cuando se compararon los resultados de los ensayos con GHBP utilizando MCB conjugado a HRPO y anticuerpo policlonal de ratón conjugado a HRPO, una muestra de suero humano mostró niveles de GHBP mucho más elevados cuando se detectó con el conjugado a MCB. Para analizar si la discrepancia podría ser debida a anticuerpos heterofílicos, se incluyó IgG (mIgG) de ratón purificado a 0,5 mg/ml en el tampón de muestra. Los resultados mostraron que mIgG redujo la señal en la muestra 6 desde 384 pmol/L hasta 215 pmol/L cuando se ensayó con el conjugado a MAb, mientras que las concentraciones de GHBP no cambiaron en dos muestras de control (323 frente a 338, 92 frente a 11 pmol/L cuando se analizaron con y sin mIgG, respectivamente). Estos resultados indican que los dos anticuerpos conjugados diferentes eran sustancialmente los mismos si la unión no específica era bloqueada por la mIgG. Los ensayos inmunométricos de tipo Sándwich se someten a interferencia positiva por los anticuerpos heterofílicos en la muestra. Esto está provocado por anticuerpos humanos anti-ratón en la muestra de suero humano. Dichos anticuerpos heterofílicos se entrecruzan con los anticuerpos de recubrimiento y de ratón conjugados. La interferencia por los anticuerpos heterofílicos se puede disminuir o eliminar si se añaden inmunoglobulinas de un animal no inmunizado (aquí para HBP o hormona ligando) al ensayo para bloquear los anticuerpos heterofílicos en la muestra. De hecho, la discrepancia en la concentración de GHBP se eliminó cuando la IgG del ratón se incluyó en el tampón de ensayo. Esto indicó que la señal no específica que se detectó cuando se utilizó el MAb conjugado era debida a la presencia de anticuerpos IgG anti-ratón en el suero de este sujeto. Dado que no se sabe qué muestras mostrarán este tipo de interferencia es mejor siempre incluir IgG de ratón en la primera etapa del ensayo.

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Depósito de hibridoma

La línea celular de hibridoma que produce este anticuerpo anti-hGH es HGH-B que se depositó con la American Type Culture Collection (ATCC) 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, SUA el 9 de noviembre de 1990 y tiene el número de registro ATTC HB-10596. Este depósito se realizó según lo estipulado en el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en Materia de Patentes y el Reglamento bajo el mismo (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de los cultivos viables durante 30 años a partir de la fecha del depósito. Las células estarán disponibles mediante la ATCC según los términos del Tratado de Budapest, y están sujetos a un acuerdo entre Genentech, Inc. y ATCC, que asegura la disponibilidad permanente y sin restricción de la progenie de los cultivos al público tras la publicación de la respectiva patente estadounidense o tras ponerse abierta a la inspección pública de cualquier solicitud de patente estadounidense o extranjera, la que sea primera, y asegura la disponibilidad de la progenie para alguien determinado por la U.S. Commissioner of Patents and Trademarks para tener el derecho a la misma de acuerdo con 35 USC \NAK 122 y las normas de la Commissioner según las mismas (incluyendo 37 CFER \NAK 1.14 con referencia concreta a 886 OG 638).

El cesionario de la presente solicitud ha acordado que si los cultivos en el depósito muriera o se perdiera o se destruyera cuando se cultiva en las condiciones adecuadas, los materiales serán inmediatamente remplazados en una notificación por una muestra viable del mismo cultivo. La disponibilidad de la cepa depositada no se interpreta como una licencia para realizar la invención contraviniendo los derechos concedidos bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patente.

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Marcadores detectables

Los marcadores o etiquetas detectables en los anticuerpos que se pueden unir covalentemente incluyen un indicador adecuado, tal como una enzima, isótopo radioactivo, fluorescente, u otra etiqueta medible tal como se describe en la Patente de Estados Unidos 4.275.149, columnas 19 a 28 y la Patente de Estados Unidos 4.318.980, columnas 10-14. De particular interés son las enzimas que implican la producción de peróxido de hidrógeno y el uso del peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de colorante a un colorante. Entre las combinaciones particulares se incluyen sacárido oxidasas, por ejemplo, glucosa y galactosa oxidasa, u oxidasas heterocíclicas, tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que utiliza el peróxido de hidrógeno para oxidar un percursor de colorante, es decir, una peroxidada tal como la peroxidada de rábano picante, lactoperoxidasa, o microperoxidasa. Entre las enzimas preferidas están las siguientes: peroxidada de rábano picante, glucoamilasa, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa, y beta-D-galactoxidasa.

Se pueden encontrar combinaciones adicionales de enzimas en la materia descritas en las referencias citadas. Cuando se utiliza una única enzima como marcador, se pueden utilizar otras enzimas, tales como hidrolasas, transferasas y oxidorreductasas, preferiblemente hidrolasas, tales como fosfatasa alcalina y beta-galactosidasa. Alternativamente, se pueden utilizar luciferasas, tales como luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (Patente de Estados Unidos 4.787.456).

Tras el uso de anticuerpo específico para la hormona ligando, se determina la cantidad de anticuerpo unido midiendo la actividad del indicador unido. En el caso de las enzimas, la cantidad de color revelado y medido será una medida directa de la cantidad de hormona o proteína de unión a hormona presente. La conjugación de dichas etiquetas, incluyendo las enzimas, a un anticuerpo tal como se describe en la presente invención es un procedimiento de manipulación estándar para un experto en técnicas de inmunoensayo. Véase, por ejemplo, O'Sullivan et al., (1981) Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, en Methods in Enzymology (ed. J.J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, Nueva York, 73, pág. 147-168.

Kits

Por conveniencia, el método de ensayo se puede disponer como un kit, es decir, una combinación envasada con otros reactivos para la combinación con una muestra o muestras en el ensayo para una proteína de unión a hormona polipeptídica y/o para determinar la saturación relativa con hormona polipeptídica ligando. Los componentes del kit se proporcionarán en proporciones predeterminadas. El kit contendrá la fase sólida portadora específica para el anticuerpo de captura, el anticuerpo de captura separado o unido a la fase sólida portadora, la hormona ligando (preferiblemente recombinante) y el anticuerpo de detección que contiene un marcador detectable. Cuando el marcador detectable es una enzima, el kit incluirá sustratos y cofactores requeridos por la enzima, un precursor de colorante, que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectable. Además, se pueden incluir otros aditivos, tales como estabilizantes, tampones y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden variar ampliamente para proporcionar concentraciones en solución de los reactivos que sustancialmente optimizan la sensibilidad del ensayo. Particularmente, los reactivos se pueden proporcionar como polvos secos, habitualmente liofilizados, incluyendo excipientes, que en disolución proporcionarán una solución de reactivos que tienen la concentración apropiada para combinar con la muestra a ensayar.

Definiciones y abreviaturas

Anticuerpo de captura (recubrimiento): Anticuerpo específico para el epítopo de la proteína de unión a hormona, de manera que la unión del anticuerpo no impide la unión de la hormona polipeptídica ligando a la proteína de unión a hormona. El anticuerpo se une a una fase sólida y se utiliza para unirse selectivamente a la proteína de unión y facilitar la extracción de la proteína de unión de la solución.

Anticuerpo de detección: Anticuerpo que está marcado con un marcador detectable específico para un epítopo en la hormona polipeptídica y que es el marcador detectable.

HBP: proteína de unión a hormona; proteína portadora hallada en fluidos biológicos que presenta afinidad por una hormona polipeptídica ligando y actúa como portador para la hormona polipeptídica ligando unida.

hGH: Hormona de crecimiento humano, incluyendo formas naturales múltiples, tales como 22 kd, 20 kd, variantes de la placenta (GHY_) y variantes producidas mediante métodos recombinantes (Cunningham et al., Science (1989) 243: 1330-1336).

GHBP: proteína de unión a la hormona de crecimiento.

hGHBP: proteína de unión a la hormona de crecimiento humana.

GH: hormona de crecimiento.

MAb: anticuerpo monoclonal.

MCB: Monoclonal B producido por el hibridoma HGH-B de ratón.

HRPO: peroxidada de rábano picante.

BSA: albúmina de suero bovino.

LIFA: ensayo inmunofuncional mediado por ligando.

Purificación de la GHBP

La purificación de la GHBP se monitoriza usando un ELISA convencional (Fuh, G. et al., J. Biol. Chem. 265: 3111-3115 (1990)). El LIFA proporciona un ensayo mejor para detectar la presencia y ensayar la cantidad de proteína de unión funcional durante tal purificación. El LIFA garantiza que se purifica la proteína de unión funcionalmente activa en vez de la proteína inmunológicamente activa. Durante el almacenamiento de la hGHBP, se usa el LIFA para seguir la cantidad de GHBP funcional que permanece en una forma activa con el tiempo. Esta propiedad del ensayo ayuda enormemente a satisfacer los requisitos reguladores concernientes a la estabilidad de la GHBP durante el almacenamiento prolongado.

Materiales y procedimientos Selección de MAb de recubrimiento

Cuatro anticuerpos monoclonales contra el receptor de la hormona del crecimiento en el hígado de conejo, MAb 1, 2, 5 y 7, fueron proporcionados por el Dr. M. Waters (Universidad de Queensland, Queensland, Australia), y dos MAb adicionales (43 y 263) se purificaron a partir de fluido ascítico de ratón comprado a Agen, Australia. Se recubrieron pocillos de supresión Immulon II (Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, Va.) incubándolos durante la noche a 4ºC con anticuerpo, 100 \mul por pocillo a 5 \mug/ml en tampón carbonato 50 mmol/litro, pH 9,6 (tampón de recubrimiento). Después de retirar la solución de recubrimiento, se bloquearon los sitios de unión inespecíficos sobre la placas recubiertas con 150 \mul de solución salina isotónica tamponada con fosfato, pH 7,2 (PBS), que contenía 5 g de albúmina de suero bovina (BSA) por litro (tampón de bloqueo), durante 1 hora a temperatura ambiente, seguida por tres lavados con tampón de lavado (0,5 ml de Tween-20 y 0,1 g de Thimerosal por litro de PBS). Los MAb inmovilizados se evaluaron en tres experimentos diferentes. En el primer experimento, usando pasos de incubación secuenciales, se incubó primero la GHBP con el MAb recubierto sobre el pocillo, seguida por la adición de GH radiomarcada (GH-I^{125}). En el segundo experimento, la reacción de la GHBP y de la GH-I^{125} se realizó simultáneamente en pocillos recubiertos con MAb. En el tercer experimento, se preincubó la GHBP con la GH-I^{125} durante la noche a 4ºC y a continuación se añadió al pocillo recubierto con MAb. En los tres experimentos, la unión inespecífica del trazador se determinó sustituyendo la solución de GHBP en la mezcla de reacción con tampón de incubación (PBS que contenía, por litro,
5 g de BSA, 0,5 ml de Tween® 20, y 0,1 ml de Thimerosol).

Ensayo secuencial

En el experimento de incubación secuencial, se dejaron reaccionar 100 \mul de GHBP (2,5 ng/100 \mul) con el MAb inmovilizado durante 2 horas, se lavó con tampón de lavado, y se incubó durante 4 horas a temperatura ambiente con GH-I^{125} (20.000 c.p.m./100 \mul). Se lavaron los pocillos 6 veces con tampón de lavado, se absorbieron cuidadosamente sobre papel absorbente, y se contaron en un contador gamma LKB serie 1277 (Pharmacia LKB Nuclear Inc., Gaithersburg, Md.) durante 1 minuto (Figura 6).

Ensayo simultáneo

En el experimento de incubación simultánea, se incubaron 50 \mul de GHBP, a 2,5 ng/50 \mul en tampón de incubación, y 50 \mul de GH-I^{125}, a 20.000 c.p.m./50 \mul en tampón de incubación, en cada pocillo durante 4 horas a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron, absorbieron y contaron tal como se ha descrito más arriba.

Ensayo con pre-incubación

En el experimento de pre-incubación, se incubaron 150 \mul de GHBP, a 2,5 ng/50 \mul en tampón de incubación, y 150 \mul de GH-I^{125}, a 20.000 c.p.m./50 \mul en tampón de incubación, en un tubo de ensayo, durante la noche a 4ºC. A continuación, se añadió la mezcla de reacción (100 \mul por pocillo) a los pocillos recubiertos con MAb, y se incubaron durante 4 horas a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron, absorbieron, y contaron tal como se ha descrito previamente.

Anticuerpos anti-hGH conjugados con enzimas

El MAb de detección anti-hGH se seleccionó para la conjugación porque no causaba un desplazamiento detectable de la GHBP, y no contiene determinantes que se solapen con la GHBP (Cunningham et al., Science 243: 1330-1336 (1989)). Los anticuerpos se purificaron a partir de fluido ascítico de ratón usando proteína A-Sepharose® (Repligen Corp., Cambridge, MA) siguiendo procedimientos establecidos (Ey et al., Immunochem. 15: 429 (1978); Goding, J. W., J. Immunol. Meth. 20:241 (1978)), y se almacenó estéril en fosfato sódico 0,01 M, cloruro sódico 0,15 M, pH 7,2 (PBS) a 4ºC. Los MAb purificados se conjugaron con peroxidasa de rábano silvestre (Nakane y Kawaoi, J. Histochem. Cytochem. 22: 1084 (1974)) y se almacenaron a -20ºC en glicerol al 50%.

Patrones para el ensayo LIFA

La proteína de unión de la hormona del crecimiento humana recombinante (GHBP) se purificó a partir de una línea celular de mamíferos siguiendo el procedimiento descrito por Spencer et al. (J. Biol. Chem. 263: 7862-7867 (1988)). La composición de aminoácido de la GHBP purificada, según se determinó mediante análisis cuantitativo de aminoácidos, fue idéntica a la esperada teóricamente para el producto del gen clonado. La GHBP purificada era homogénea en base al análisis de electroforesis en gel-SDS. La concentración de GHBP en la preparación purificada se estableció mediante análisis de Scatchard (Scatchard, G., Annals of the New York Academy of Sciences 51: 660-672 (1949)), y las diluciones de esta muestra en PBS, que contenían por litro, 5 g de BSA, EDTA 5,0 mM, 0,5 ml de Tween-20, y 0,1 g de Thimerosal (tampón de ensayo), se usaron a continuación como estándares en el LIFA. También se usó la GHBP producida en E. coli, pero, sorprendentemente, se halló que daba curvas de dilución no paralelas en el ensayo. Por tanto, la GHBP preferida es la GHBP natural o la GHBP producida por células que producen GHBP en una configuración nativa, esto es, glicosilada.

GH humana recombinante

La hormona del crecimiento humana recombinante (GH) la proporcionó Genentech Inc., South San Francisco, California, EE.UU.

Muestras de suero y plasma

Las muestras de suero y plasma (EDTA, citrato y heparina como anticoagulantes) se obtuvieron a partir de voluntarios adultos sanos (9 hombres y 7 mujeres, de 26 a 43 años de edad). Las muestras se centrifugaron y almacenaron a -70ºC hasta que se ensayaron.

Tratamiento terapéutico a continuación de la evaluación de la GHBP

Para los diversos objetivos de la presente invención, las COMPOSICIONES se pueden administrar a un ser humano mediante cualquier técnica adecuada, incluyendo parenteralmente, y se puede administrar local o sistémicamente.

Las composiciones se administran directamente al mamífero mediante cualquier técnica apropiada, incluyendo parenteral, intranasal u oralmente. La ruta específica de administración dependerá, por ejemplo, del historial médico del paciente, incluyendo cualquier efecto lateral o anabólico percibido o anticipado usando hGH o IGF-1 sólo, y el defecto del crecimiento a corregir. Los ejemplos de administración parenteral incluyen la administración subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarterial, e intraperitoneal. Más preferiblemente, la administración es mediante infusión continua (usando, por ejemplo, minibombas tales como bombas osmóticas), o mediante inyección usando, por ejemplo, medios intravenosos o subcutáneos. Preferiblemente, la administración de la COMPOSICIÓN es subcutánea. La administración también podría hacerse como un único bolo, o mediante una formulación de depósito con liberación lenta. Más preferiblemente, el IGF-1 o IGF-1 más proteína de unión se administran continuamente mediante infusión, más preferiblemente subcutáneamente, la GHBP + GH o GH sola se administra diariamente de forma subcutánea mediante inyección. Más preferiblemente, la GHBP + GH se administra intermitentemente cada 2 o más días, semanal, bisemanal, o mensualmente.

La IGF-1 se administra de manera adecuada junto con su proteína de unión, por ejemplo, BP53, que se describe en WO 89/09268 publicada el 5 de octubre de 1989 y por Marlin y Baxter, J. Biol. Chem. 261: 8754-8760 (1986), las descripciones de las cuales se incorporan en la presente invención por referencia. Esta proteína es un componente ácido-base de aproximadamente 53 kd en un gel SDS-PAGE no reductor de un complejo de glicoproteínas de 125-150 kd hallado en plasma humano que transporta la mayoría de las IGFs endógenas y también está regulada por GH. La IGF-1 también se acopla de manera adecuada a un receptor o anticuerpo o fragmento de anticuerpo para la administración. De manera similar, la GH se puede liberar acoplada a otro agente, tal como un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o una de sus proteínas de unión.

Las composiciones a usar en la terapia se formularán y dosificarán de forma consistente con las buenas prácticas médicas, tomando en consideración la condición clínica del paciente individual (especialmente los efectos secundarios del tratamiento con hGH o IGF-1 solos, o el retraso en el crecimiento después de tratamiento continuo con GH), el sitio de administración de las composiciones, el procedimiento de administración, el plan de administración, y otros factores conocidos por los practicantes. Por tanto, las "cantidades efectivas" de cada componente para los propósitos en ésta están determinadas por tales consideraciones, y deben ser cantidades que mejoren el crecimiento anabólico del paciente tratado.

A modo de propuesta general, la cantidad farmacéuticamente efectiva de cada una de las composiciones administradas parenteralmente por dosis estará en el rango de aproximadamente 1 \mug/kg/día a 50 mg/kg/día de peso corporal del paciente, aunque, tal como se ha destacado más arriba, esto estará sometido en gran parte a la discreción terapéutica. Más preferiblemente, esta dosis es de al menos 2 \mug/kg/día, y más preferiblemente de al menos 5 \mug/kg/día para cada hormona. Si se administran continuamente, el IGF-1, IGF-1 + proteína de unión, GHBP + GH, y GH, se administran cada uno típicamente a una velocidad de dosificación de desde aproximadamente 1 \mug/kg/hora hasta aproximadamente 100 \mug/kg/día, bien mediante 1-4 inyecciones por día o mediante infusiones subcutáneas continuas, por ejemplo, usando una minibomba. También podría emplearse una solución en bolsa intravenosa. El factor clave para seleccionar una dosis apropiada es el resultado anabólico obtenido, tal como se mide mediante incrementos en la ganancia de peso corporal, masa corporal magra, o crecimiento de la estatura aproximándose al rango normal, o mediante otros criterios para medir la actividad anabólica según se define en ésta, según sean considerados apropiados por el practicante.

Las composiciones también se administran convenientemente mediante sistemas de suministro continuado. Los ejemplos apropiados de composiciones de suministro continuado incluyen las matrices de polímero semipermeables en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Las matrices de suministro continuado incluyen los poliláctidos (patente estadounidense 3.773.919, EP-58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-L-etil-glutamato (U. Sidman et al., Bioplymers, 22: 547-556 (1983)), poli(2-hidroxietilmetacrilato) (R. Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981), y R. Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)), etilenvinilacetato (R. Langer et al., Id.), o poli-ácido D-(-)-3-hidroxibutírico (EP-133.988). Las composiciones de suministro continuado también incluyen composiciones atrapadas en liposomas. Los liposomas que contienen composiciones se preparan mediante procedimientos conocidos por sí mismos: DE-3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034 (1980); EP-52.322; EP-36.676; EP-88.046; EP-143.949; EP-142.641; solicitud de patente japonesa 83-118.008; patentes estadounidenses nº 4.485.045 y 4.544.545; y EP-102.324. De forma ordinaria, los liposomas son del tipo unilamelar pequeño (aproximadamente 200-800 Angstroms), en los cuales el contenido lipídico es superior a aproximadamente 30 mol. por ciento de colesterol, ajustándose la proporción seleccionada para la terapia óptima con composiciones.

Para su administración parenteral, en una realización, el IGF-1 y la GH se formularon generalmente mezclando cada uno con el grado de pureza deseado, en forma de inyectable de dosis unitaria (solución, suspensión, o emulsión), con un portador farmacéuticamente aceptable, es decir, uno que no sea tóxico para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, y que sea compatible con los otros ingredientes de la formulación. Por ejemplo, la formulación pre-
feriblemente no incluye agentes oxidantes y otros componentes que se sabe que son perjudiciales para los polipéptidos.

Generalmente, las formulaciones se preparan poniendo en contacto las composiciones, cada una de ellas, de forma uniforme e íntima con los portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos, o ambos. A continuación, si es necesario, el producto se moldea en la formulación deseada. Preferiblemente, el portador es un portador parenteral, más preferiblemente, una solución que es isotónica con la sangre del receptor. Los ejemplos de tales vehículos portadores incluyen el agua, solución salina, solución de Ringer, y solución de dextrosa. Los vehículos no acuosos, tales como aceites fijados y etiloleato, también son útiles en ésta, así como los liposomas.

El portador incluye, de forma conveniente, pequeñas cantidades de aditivos tales como sustancias que mejoran la isotonicidad y la estabilidad química. Tales materiales no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones, tales como el fosfato, citrato, succinato, ácido acético, y otros ácidos orgánicos o sus sales; antioxidantes, tales como el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente diez residuos), por ejemplo, poliarginina o tripéptidos; proteínas, tales como la albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como la polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como la glicina, ácido glutámico, ácido aspártico, o arginina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos, incluyendo la celulosa o sus derivados, glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como el EDTA; azúcares alcohol, tales como el manitol o sorbitol; contraiones, tales como el sodio; y/o tensioactivos no iónicos, tales como los polisorbatos, poloxámeros, o PEG.

Las composiciones se formulan típicamente cada una de forma individual en tales vehículos, en una concentración de aproximadamente desde 0,1 mg/ml hasta 100 mg/ml, preferiblemente 1-10 mg/ml, a un pH de aproximadamente 4,5 a 8. El IFG-1 de longitud completa es generalmente estable a un pH de no más de aproximadamente 6; des(1-3)-IFG-1 es estable a aproximadamente 3,2 a 5; hGH y GHBP son estables a un pH superior, de, por ejemplo, 6,0-7,8. Se entenderá que el uso de algunos de los anteriores excipientes, portadores, o estabilizantes, resultará en la formación de sales de IGF-1 o GH.

Además, las composiciones, preferiblemente el IGF-1 de longitud completa, se formulan juntas de forma apropiada en un vehículo portador apropiado para formar una composición farmacéutica que no contiene células. En una realización, el tampón usado para la formulación dependerá de si la composición se va a emplear inmediatamente después de la mezcla, o de si se va a almacenar para un uso posterior. Si se emplean inmediatamente después de la mezcla, las composiciones se pueden formular en manitol, glicina, y fosfato, pH 7,4. Si esta mezcla va a almacenarse, se formula en un tampón a un pH de aproximadamente 6, tal como citrato, con un tensioactivo que incremente la solubilidad de la GH en este pH, tal como un 0,1% de polisorbato 20 o poloxámero 188. La preparación final podría ser un líquido estable o un sólido liofilizado.

Las composiciones a ser usadas en la administración terapéutica deben ser estériles. La esterilidad se consigue fácilmente mediante filtración, a través de membranas de filtración estériles (por ejemplo, membranas de 0,2 micrómetros). Las composiciones terapéuticas (composiciones de IGF-1, IGF-1 + proteína de unión, GHBP + GH, y GH) generalmente se colocan en un contenedor que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa, o un vial que tiene un tapón que puede perforarse mediante una aguja de inyección hipodérmica.

Las composiciones se almacenarán ordinariamente en contenedores unitarios o multidosis, por ejemplo, ampollas selladas o viales, como una solución acuosa o como una formulación liofilizada a reconstituir. Como ejemplo de formulación liofilizada, se rellenan viales de 10 ml con 5 ml de una solución acuosa esterilizada mediante filtración de GH al 1% (peso/volumen), y la mezcla resultante se liofiliza. La solución de infusión se prepara reconstituyendo la GH liofilizada usando agua bacteriostática para inyecciones.

La GHBP más GH se almacenará ordinariamente en contenedores unitarios o multidosis, por ejemplo, ampollas selladas o viales, como una solución acuosa o como una formulación liofilizada a reconstituir. Como ejemplo de formulación liofilizada, se rellenan viales de 10 ml con 5 ml de una solución acuosa esterilizada mediante filtración de IGF-1 al 1% (peso/volumen), y la mezcla resultante se liofiliza. La solución de infusión se prepara reconstituyendo la GH liofilizada usando agua bacteriostática para inyecciones. La formulación GHBP + GH podría contener además manitol, glicina, un tampón, y un tensioactivo no iónico. La formulación de la presente invención podría opcionalmente incluir uno de varios tipos de tensioactivos no iónicos, tales como los polisorbatos (por ejemplo, polisorbato 20, 80, etc.) y los poloxámeros (por ejemplo, poloxámero 188). Cuando se usa polisorbato 80, la proporción molar de GHBP + GH:polisorbato 80 es de 1:0,07-30, ventajosamente de 1:0,1-10, y más ventajosamente de 1:3. En una base peso a volumen, el polisorbato 80 se añade en cantidades de aproximadamente 0,001 hasta aproximadamente 2% (p/v), con objeto de mejorar aún más la estabilidad de la hGH. El polisorbato 80, en concentraciones superiores al 0,01% (p/v) reduce la cantidad de agregación que se forma a partir de la liofilización. Además de una vida de almacenamiento mejorada, la formulación de la presente invención que contiene tensioactivo inhibe la formación de agregados proteicos cuando se agita la formulación reconstituida.

Cuando se administra GHBP + GH, ésta debe contener una o más de sus proteínas unidoras. Una proteína de este tipo que está bien caracterizada es la proteína de unión con gran afinidad de la hormona del crecimiento (GHBP) que constituye el dominio extracelular del receptor de la GH, y que circula en la sangre y funciona como GHBP en varias especies (Ymer y Herington, Mol. Cell. Endocrino., 41: 153 (1985); Smith y Talamantes, Endocrinology, 123: 1489-1494 (1988); Emtner y Roos, Acta Endocrinologica (Copenh.), 122: 296-302 (1990)), incluyendo los humanos (Baumann et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 62: 134.141 (1986); EP-366.710, publicada el 9 de mayo de 1990; Herington et al., J. Clin. Invest., 77: 1817-1823 (1986); Leung et al., Nature, 330: 537-543 (1987)). También se ha descrito una segunda BP con menor afinidad por la GH, que parece no estar relacionada estructuralmente con el receptor de la GH (Baumann y Shaw, J. Clin. Endocrinol. Metab., 70: 680-686 (1990)).

Las formulaciones novedosas de zinc, GHBP y GH resultan en una composición estable apropiada para almacenamiento prolongado, y para administración terapéutica. Las formulaciones terapéuticas que contienen el ion Zn^{2+} son estables, permitiendo la administración terapéutica de la formulación. El aspecto de la formulación de la presente invención está por tanto dirigido a tales formulaciones, y a todas las formulaciones asociadas, y como un medio para estabilizar efectivamente la GHBP + GH. La formulación contiene zinc, y GHBP y GH sustancialmente puras, libres de proteínas contaminantes o agentes infecciosos que se hayan en los humanos. Las formulaciones de la presente invención podrían contener adicionalmente una tampón farmacéuticamente aceptable, aminoácidos, un agente para dar volumen, y/o tensioactivo no iónico. Estos incluyen, por ejemplo, tampones, agentes quelantes, antioxidantes, conservantes, cosolventes, y similares; los ejemplos específicos de éstos incluyen, las sales de trimetilamina ("tampón Tris"), y el edeato disódico.

Composiciones de hGH

Tal como se usan en ésta, los términos "hormona del crecimiento humana" o "hGH" denotan la hormona del crecimiento humana producida, por ejemplo, mediante extracción y purificación a partir de una fuente natural, y mediante sistemas de cultivo de células recombinantes. La secuencia nativa de la hGH y sus características están establecidas, por ejemplo, en "Hormone Drugs", Gueriguigan et al., U.S.P. Convention, Rockville, MD (1982). De igual forma, los términos cubren equivalentes activos de la hormona del crecimiento humana; por ejemplo, que difieran en uno o más aminoácidos en toda la secuencia. Más aún, los términos tal como se usan en esta solicitud se pretende que abarquen las variantes de la hGH por sustitución, supresión, e inserción de aminoácidos, o modificaciones post-traducción. Los ejemplos de tales variantes se describen en la PCT Pub. WO-90/04.788 publicada el 3 de mayo de 1990. La hGH usada en las formulaciones de la presente invención se produce generalmente por medios recombinantes tal como se ha discutido previamente. La formulación de la GHBP recombinante + GH es sustancialmente pura, libre de otras proteínas humanas, libre de agentes infecciosos como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), y es soluble. GHBP + GH "sustancialmente pura" significa GHBP y GH que están libres de proteínas con las que están ordinariamente asociadas en los fluidos corporales, tales como la sangre, plasma y suero. Ordinariamente, sustancialmente pura quiere decir GHBP y GH que son más del 95% puras en peso total de proteína, y preferiblemente más del 98% puras en peso.

Aminoácidos de la formulación

En una realización alternativa de la formulación, se añade a la formulación de GHBP y GH:zinc un aminoácido farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, glicina. Cuando la glicina está presente, la proporción molar de GHBP + GH:glicina es de 1:5-600. Además de la glicina, otros aminoácidos, tales como la alanina, glutamina, asparagina, arginina o lisina, o derivados de tales aminoácidos, podrían usarse en la presente formulación. Tales aminoácidos son particularmente ventajosos, cuando se liofiliza la formulación, para crear una masa suficiente para formar una formulación de pasta seca, estable.

Tensioactivo no iónico

En otra realización se añade un tensioactivo no iónico a la formulación de GHBP + GH. La formulación que es materia de la invención podría incluir opcionalmente uno de varios tipos de tensioactivos no iónicos, tales como los polisorbatos (por ejemplo, polisorbato 20, 80, etc.), y los poloxámeros (por ejemplo, poloxámero 188). De forma ventajosa se usa el polisorbato 80, y la proporción molar de hGH:polisorbato 80 podría ser de 1:0,03-60. En una base de peso por volumen, el polisorbato 80 se añade en cantidades desde aproximadamente 0,001 hasta aproximadamente 2% (p/v), con objeto de mejorar aún más la estabilidad de la GHBP y GH. El polisorbato 80, en concentraciones superiores al 0,01% (p/v) podría reducir la cantidad de agregados inactivos que se forman a partir de la liofilización y reconstitución. El uso de tensioactivos no iónicos mejora la estabilidad de la formulación cuando se expone a tensiones de corte y superficiales sin causar desnaturalización de la proteína. Más aún, tales formulaciones de GHBP y GH que contienen tensioactivo podrían emplearse en aparatos de aerosol tales como los usados en dosificación pulmonar, y en pistolas de inyección sin aguja. Tales formulaciones de suministro podrían mejorarse mediante la adición de tensioactivos no iónicos en el rango de 0,1-5% (p/v).

Tal como se usa en ésta, la expresión mamífero se refiere a cualquier mamífero, pero especialmente a primates, bovinos, ovinos, caninos, felinos, equinos y roedores. Específicamente incluye los humanos, las vacas, los caballos, las ratas, los ratones, los conejos, los monos, los gatos, los perros y los cerdos. El termino ave se refiere a cualquier pájaro, particularmente pollo, pavo, pato y ganso.

Los siguientes ejemplos incluyen el uso del ensayo descrito anteriormente y otra experimentación que no se encuentra dentro de los términos de la presente invención que se reivindican, que está dirigida al uso del factor de crecimiento 1 de tipo insulina en la fabricación de una formulación terapéuticamente eficaz para la estimulación del crecimiento de un ser humano que presenta una estatura corta idiopática, donde (i) la formulación no comprende la hormona de crecimiento; o (ii) la formulación comprende adicionalmente la hormona de crecimiento humano y no es para el tratamiento de un paciente que muestra una ralentización en la velocidad de crecimiento después de por lo menos doce meses de administración de la hormona de crecimiento.

Ejemplo 1 Selección del anticuerpo para en ensayo con GHBP

Se necesitan dos anticuerpos distintos para el método LIFA. El primer anticuerpo es un anticuerpo de captura que recubre la fase sólida y se utiliza para extraer selectivamente la HBP de la muestra biológica en análisis. Este anticuerpo debe ser específico para epítopos que no impiden la unión de la hormona ligando. El segundo anticuerpo de detección es específico para un epítopo en la hormona ligando. El segundo anticuerpo de selección debe unirse a la hormona ligando en un sitio que no impide su capacidad para complejarse con la HBP. En el caso de GHBP, se cribaron anticuerpos monoclonales conocidos disponibles comercialmente por las propiedades de unión deseadas. El anticuerpo monoclonal de detección específico para hGH se creó recientemente en un sistema de hibridomas de ratón.

Selección de MAb de recubrimiento

Para analizar la presencia de GHBP, se necesita un anticuerpo de captura que se une a GHBP para recubrir la fase sólida, en este caso un pocillo de placa de microtitulación, para unirse a la GHBP. Se evaluaron cinco MAbs anti-GHBP de ratón (1, 5, 7, 43 y 263) en su concentración de recubrimiento óptima para unirse a GHBP en presencia de GH-I^{125} circulante (formato de incubación simultánea). A continuación, se examinaron en base a su capacidad para unirse al complejo GHBP-GH-I^{125} (experimento de preincubación). Dado que ambos MAb 1 y 7 muestran una unión muy débil en el formato de ensayo secuencial y simultáneo, sólo se ensayaron los MAb 5, 43 y 263 en el experimento con preincubación. La figura 2 muestra el porcentaje de unión para cada MAb en tres configuraciones de ensayo diferentes. Los datos muestran que MAb 263, que proporcionó la unión más elevada en las tres condiciones, es el MAb más adecuado como recubrimiento, ya que es capaz de unirse a GHBP libre, así como a GHBP en el complejo con GH. De manera más destacada, el experimento de incubación secuencial mostró que el MAb263 no interfería con el presente sitio de unión a hGHBP-hGH.

La figura 3 muestra una comparación de dos curvas estándar generadas con y sin preincubación con hGH. Un grupo de patrones se incubaron con hGH (concentración final 200 ng/ml) durante toda la noche a 4ºC, los patrones de control se incubaron con tampón de ensayo. Las muestras generadas de este modo se analizaron a continuación en el LIFA según el protocolo estándar, es decir, todas las muestras se expusieron a hGH en las placas de microtitulación. Tal como se observa en la figura 3, se obtienen resultados similares tanto si la GHBP se preincuba o no con hGH. La unión de la GHBP al anticuerpo de recubrimiento y la saturación de la GHBP con su ligando se puede llevar a cabo simultáneamente mediante la coincubación de las muestras y la hGH en los pocillos de microtitulación. La LIFA simplificada proporcionó una curva estándar similar a la obtenida con dos etapas separadas pero necesitó sólo la mitad del tiempo de incubación (2 horas frente a 4 horas, figura 1, tercer recuadro abajo).

El MCB, véase a continuación (Selección del MAb de detección), que se utilizó para la conjugación a HRPO, se une a la GH de 22 kDa con una afinidad elevada, pero presenta baja afinidad por la de 20 kDa y consecuentemente se analizó la posible interferencia por la GH de 20 kDa en el ensayo. La figura 4 muestra que la adición de 200 ng/ml de la hGH de 20 kDa a la solución de hGH 200 ng/ml da lugar a una curva estándar similar a la obtenida mediante incubación con 200 ng/ml de hGH. Esto muestra que la GH de 20 kDa no interfiere en el presente ensayo con GHBP en ningún grado sustancial.

Selección del MAb de detección

Para analizar la presencia de hGH, se necesita un anticuerpo de detección con una afinidad elevada para un epítopo en la hGH que no impedirá la unión de la hGH con la GHBP. El anticuerpo monoclonal se produjo en un sistema de ratón utilizando hGH recombinante y se cribó según la especificidad requerida. El mejor anticuerpo monoclonal de ratón se produjo por un hibridoma designado HGH-B. Este hibridoma se depositó con la ATCC tal como se ha descrito previamente.

Ejemplo 2 Procedimiento de ensayo LIFA para la GHBP

El procedimiento de ensayo LIFA desarrollado para medir la GHBP es tal como sigue. Se recubrieron placas de microtitulación de noventa y seis pocillos (Corning Glass Works, Corning, Nueva York) con MAb 263 mediante incubación durante la noche a 4ºC con 100 \mul/pocillo de anticuerpo a 20 \mug/ml en una solución de 50 mmoles/litro de tampón carbonato sódico, pH 9,6 (tampón de recubrimiento) (ver Figura 1, paso 1). Después de retirar la solución de recubrimiento, se bloquearon las placas recubiertas con 150 \mul por pocillo de 5 g/litro de BSA en PBS, durante 1 hora a temperatura ambiente (Figura 1, paso 2), y se lavaron seis veces con 0,5 g/litro de Tween-20 en PBS (tampón de lavado).

Los estándares, diluidos en tampón de ensayo, o las muestras (50 \muM de suero o plasma, y 50 \muM de tampón de ensayo) se dispensaron dentro de los pocillos recubiertos (100 \mul/pocillo) (Figura 1, paso 3). Se sellaron las placas y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas con agitación suave. Las placas se lavaron seis veces con tampón de lavado. A continuación se añadió (100 \mul/pocillo) hGH recombinante, 200 hg/ml, o tampón de ensayo, y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Las placas se lavaron seis veces con tampón de lavado antes de la adición de peroxidasa de rábano silvestre (HRPO) marcada con MAb MCB (100 \mul/pocillo) (Figura 1, paso 4). Después de otra incubación durante 2 horas a temperatura ambiente, se lavaron las placas seis veces con tampón de lavado. Se añadió a las placas (199 \mul por pocillo) una solución de sustrato recién preparada (0,4 g de o-fenilenediamina dihidrocloruro en un litro de PBS, más 0,4 ml de peróxido de hidrógeno al 30%), y la incubación se llevó a cabo en la oscuridad durante 15 minutos (Figura 1, paso 5). La reacción se detuvo mediante la adición de 100 \mul de ácido sulfúrico 2,25 mol/litro, y la absorbancia a 490 nm se determinó en un lector de placas Vmax (Molecular Devices, Menlo Park, CA). Se generó una curva estándar mediante la representación de la absorbancia frente al logaritmo de la concentración de GHBP, usando un programa de ajuste no lineal de curvas de regresión con 4 parámetros. Las concentraciones de la muestra se obtuvieron mediante interpolación de su absorbancia en la curva estándar.

Ejemplo 3 Propiedades del ensayo con GHBP

Se evaluó el ensayo con GHBP y se determinó el intervalo, sensibilidad, especificidad y precisión del ensayo. La especificidad de este ensayo se analizó sustituyendo la GHBP por otros cuatro receptores solubles (rCD4, rHER2 ECD, receptor de EGF y receptor de rPRL) y una proteína no relacionada producida en células CHO (proteína de envoltura del VIH, gp120). Las cuatro proteínas se obtuvieron de Genentech Inc. Los resultados (Tabla 1) mostraron que el ensayo presenta menos de un 0,01% de reactividad cruzada con estas proteínas. Además, se analizó la reactividad cruzada con lactógeno de placenta humana (HPL) y prolactina humana (PRL). Sustituyendo HPL y PRL por hGh en la misma concentración (200 ng/ml) dio lugar a valores indistinguibles de los blancos cuando se analizaron juntos con la GHBP o el receptor de PRL.

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TABLA 1

1

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Precisión del ensayo

Las muestras de suero con concentraciones bajas, medias o altas de GHBP se analizaron en 24 réplicas para la valoración de la precisión intra-ensayos (Tabla IIA). La precisión inter-ensayos se determinó midiendo las muestras de concentraciones bajas, medias o altas de GHBP en diez experimentos separados (Tabla 2B). Los coeficientes de la variación intra-ensayos en los tres niveles varió del 6,3 al 8,9%, mientras que los coeficientes de variación inter-ensayos varió del 9,7 al 12,9%.

TABLA 2

3

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Linealidad del ensayo

La linealidad del ensayo se determinó realizando diluciones en serie de muestras de suero en tampón de ensayo y midiendo la concentración de GHBP. Los resultados se examinaron mediante la correlación de la concentración observada determinada en la LIFA con la concentración calculada obtenida multiplicando el factor de dilución con la concentración de la muestra no diluida determinada en la LIFA. El análisis de la regresión lineal de las muestras dio lugar a coeficientes de correlación de 0,99 o superior (figura 5), indicando que el ensayo es lineal.

Ejemplo 4 Determinación de GHBP en fluidos biológicos Recuperación adicional

Se añadieron las GHBP purificadas a tres concentraciones diferentes en el tampón de ensayo en volúmenes iguales a cuatro muestras de suero y cuatro muestras de plasma. Las muestras generadas se analizaron en el LIFA. La concentración teórica se calculó para cada muestra mixta y se utilizó para calcular el porcentaje de recuperación. Los datos en la Tablas 3A y la Tabla 3B muestran una recuperación promedio de 106,7 y 99,5 para el suero y el plasma, respectivamente, con un intervalo de 89,1 a 115,9%, demostrando la precisión del ensayó.

Saturación de la GH-BP con GH

La figura 3 muestra una comparación de dos curvas estándar generadas con y sin preincubación con GH. Se incubaron un grupo de patrones con GH (concentración final de 200 ng/ml) durante toda la noche a 4ºC, los patrones de control se incubaron con tampón de ensayo. Las muestras generadas de este modo se analizaron a continuación en el LIFA según el protocolo estándar, es decir, todas las muestras se expusieron a GH en las placas de microtitulación. Tal como se observa en la figura 2, se obtienen resultados similares tanto si la GHBP se preincuba o no con
GH.

Aplicación del procedimiento LIFA

Los niveles de GHBP unida a GH, en muestras aleatorias de 16 adultos sanos y dos pacientes con el enanismo del tipo Laron, se muestran en la Figura 6. Los niveles de GH-BP fueron detectables en todas las muestras procedentes de los sujetos normales (Figura 6, pacientes 1-16). Por contra, las concentraciones de GHBP fueron indetectables (inferiores 30 pmol/l) en ambos pacientes con el enanismo del tipo Laron (Figura 6, paciente #17 y #18).

TABLA 3A

5

TABLA 3B

7

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Ejemplo 5 Monitorización de la GHBP en la promoción del crecimiento

El LIFA podría usarse para monitorizar la concentración de GHBP en los fluidos biológicos de un paciente, y administrar GHBP adicional, si los niveles son inadecuados para la velocidad de crecimiento deseada. Un ejemplo de niveles de GHBP bajos es el enanismo de Laron; mientras que niveles elevados de GHBP podrían estar presentes en pacientes con un exceso de secreción de GH. Si el nivel de GHBP es insuficiente para la velocidad de crecimiento deseada, podría administrarse GHBP adicional, sola o complejada con hGH. El nivel óptimo de GHBP podría determinarse mediante los procedimientos discutidos más arriba, en combinación con la medición del nivel de GHBP en una serie de individuos sanos normales. La GHBP podría evaluarse en cualquier sistema de mamífero, preferiblemente en roedores y primates.

En roedores

Se usan dos modelos en roedores de deficiencia de GH: 1) ratas en las que la glándula productora de la GH, la pituitaria, se retira quirúrgicamente (ratas hipofi-sectomizadas), y 2) animales genéticamente deficientes en hormona del crecimiento (ratas enanas, Charlton, H. W. et al., J. Endo. 119: 51-58 (1988)). Estas ratas se tratan con GH humana (hGH) sola o hGH acoplada con GHBP humana, la cual se produce de forma recombinante en E. coli o, alternativamente, en células 293 de mamífero. Se miden varios índices de crecimiento para verificar el efecto de la proteína de unión en el crecimiento corporal inducido por la GH. Se requiere la monitorización de los niveles de GHBP y GH para determinar el destino metabólico de la GHBO administrada y complejada con la GH.

Ratas hipofisectomizadas

La hGHBP recombinante y la hGH se administran, bien solas o en combinación, a ratas hipofisectomizadas, un modelo reconocido para medir la bioactividad de la GH (Thorngren, K.-G. y Hansson, L. I., Acta Endo. 75: 653-668 (1977)). La HG humana (0,03, 0,1 y 0,3 mg/kg, 7 inyecciones diarias) induce una ganancia de peso relacionada con la dosis, mientras que las inyecciones de hGHBP derivada de E. coli en estas misma 3 dosis no produce efecto por sí misma. No obstante, la co-administración de 0,3 mg/kg de hGHBP con 0,1 mg/kg de hGH no tan sólo provoca una ganancia de peso superior que 0,1 mg/kg de hGH sola (p < 0,01), sino que también induce una ganancia de peso mayor que tres veces más hGH (22 pm 3,6 frente a 17,1 pm 2,1 g, respectivamente; promedio pm s.d., p < 0,01). El crecimiento longitudinal óseo es paralelo a la ganancia de peso corporal. Por tanto, la co-administración de 0,3 mg/kg de hGHBP y 0,1 mg/kg de hGH causa un crecimiento óseo superior que 0,3 mg/kg de hGH (102 pm 14 frente a 84 pm 17 micrómetros/día; p < 0,05), y 0,1 mg/kg hGHBP más hGH causa un crecimiento óseo superior al de hGH sola (99 pm 6 frente a 72 pm 7 micrómetros/día; p < 0,01).

El hígado, bazo y riñón son todos significativamente mayores después de la co-administración de hGHBP (0,3 mg/kg) con hGH (0,1 mg/kg) que con 0,1 mg/kg de hGH sola: hígado (5,5 pm 0,4 frente a 4,6 pm 0,6 g; p < 0,01), bazo (292 pm 46 frente a 240 pm 34 mg; p < 0,05); y riñón (836 pm 60 frente a 716 pm 57 g; p < 0,05). Los pesos de hígado, bazo y riñón en ratas tratadas con excipiente son 4,5 pm 0,2 g, 193 pm 32 mg, y 687 pm 58 mg, respectivamente. Estas respuestas a la hGH son, al menos, duplicadas por la hGHBP. Las concentraciones en suero de IGF-1 y hGH 24 horas después de la última inyección son marcadamente elevadas por la co-administración de los dos dosis más elevadas de hGHBP y hGH, mientras que la hGHBP causa que tanto como 20 veces más hGH esté presente después de 24 horas.

Un ELISA (Fuh, G. et al., J. Biol. Chem. 265: 3111-3115 (1990)) para la hGHBP, adaptado para su uso en suero, muestra la razón de la persistencia de la GH en sangre 24 horas después de que se administrara a las ratas la séptima inyección subcutánea del bolo. La hGHBP tan sólo es detectable en los animales co-administrados con hGHBP y hGH. Cuando la GHBP se administra sola, desaparece de la sangre más rápidamente que cuando la GHBP se administra complejada con la GH. Estos hallazgos a partir de la medición de la GHBP en sangre sugieren que es la persistencia del complejo GH + GHBP en la sangre de las ratas la que causa muchas o todas las anteriores actividades mejoradas de la GH. El procedimiento LIFA se usa, por tanto, para seguir la GHBP durante su preparación, almacenamiento, uso, y, en fluidos biológicos, a partir de la administración de la GHBP.

Sistema de ratas enanas

También comparamos la hGH y hGHBP en una rata enana que tenía un contenido de GH de pituitaria un 5-10% del normal, que crecía lentamente, y respondía al tratamiento con GH (Charlton, H. W. et al., J. Endo. 119: 51-58 (1988)). La co-administración de 0,27 mg/kg de hGHBP con 0,27 mg/kg de hGH incrementa la ganancia de peso en comparación con 0,27 mg/kg de hGH sola (11,1 pm 4,2 frente a 7,5 pm 1,7 g; p < 0,05). La co-administración de la totalidad de las tres dosis de hGHBP con 0,27 mg/kg de hGH incrementa significativamente el crecimiento óseo en comparación con 0,27 mg/kg de hGH sola (baja 33,5 pm 5,8; media 38,6 pm 8,6; elevada 35,5 pm 5,0; frente a 26,0 pm 4,1 micrómetros/día; p < 0,05). Las concentraciones de IGF-1 están elevadas por la co-administración incluso en comparación con 0,81 mg/kg de hGH sola (hGHBP elevada 136 pm 45 frente a 90 pm 16 ng por ml; p < 0,05), así como las concentraciones de hGH (hGHBP elevada 609 pm 240 frente a 73 pm 22 pg por ml; p < 0,0001).

GHBP procedente de células 293 de mamífero

En marcado contraste, la hGHBP producida en células 293 humanas inhibe completamente la respuestas a la GH en ratas hipofisectomizadas. Las ganancias de peso después de 10 inyecciones subcutáneas diarias de hGH sola son de 11,3 pm 2,5, 16,4 pm 2,1 y 21,1 pm 2,1 g a 0,03, 0,1 y 0,3 mg/kg/día respectivamente. Cuando la hGH a 0,03 y 0,1 mg/kg/día se co-administra con un exceso molar de 2 veces de hGHBP derivada de 293, esta ganancia de peso se suprime (3,0 pm 2,1 y 3,0 pm 1,6 g, respectivamente) en comparación con los grupos hGH y excipiente (2,3 pm 1,6 g). Esta diferencia entre las respuestas al crecimiento inducidas usando estas 2 formas de la hGHBP podría deberse a una diferencia en la eliminación de la hGH de la circulación, la cual está reducida aproximadamente 10 veces para la GHBP derivada de E. coli (Moore, J. A., et al., Proc. US Endocr. Soc. 71, Resumen #1652 (1989)) o purificada a partir de fuentes naturales (Baumann, G. y Shaw, M. A., J. Clin. Endrocrinol. Metab., 70: 680-686 (1990); Baumann, G., Shaw, M. A., y Buchanan, T. A., Metabolism. 38: 330-333 (1989)).

La eliminación (ml/min/kg) de la hGH en ratas macho normales, a partir de un bolo intravenoso de hGH sola, es de 18,6 pm 3,4, para la hGH co-administrada con GHBP de suero de conejo es de 2,1 pm 0,2, para la GHBP procedente de E. coli es de 1,9 pm 0,4, o procedente de células 293 es de 41,3 pm 16,7. Por tanto, la eliminación de la hGH, para la hGHBP derivada de 293, está aumentada dos veces, sugiriendo una correlación entre la potencia in vivo y la eliminación de la hGH. La eliminación disminuida de la hGH complejada con la hGHBP derivada de E. coli podría deberse a que el complejo es de tamaño suficiente (Mr > 40 kDa) para escaparse de la filtración por el riñón. Las proteínas producidas en las células 293 pueden tener patrones de carbohidratos heterogéneos, posiblemente debido a una glucosilación incompleta, lo que causa que sean rápidamente eliminados por el hígado, lo que podría explicar la rápida eliminación de la hGHBP derivada de 293.

En este caso, la GHBP derivada de 293 actúa, por tanto, como un inhibidor de la acción de la GH, en comparación con las actividades promotoras de la proteína derivada de E. coli. Esta diferencia en la actividad parece deberse a las diferentes eliminaciones de las dos moléculas de la sangre. El ensayo ayuda a discriminar de forma similar proteínas unidoras inhibidoras y estimulantes en base a su eliminación de la sangre.

Persistencia de la GHBP

Esta serie de experimentos muestra el valor del conocimiento ganado a partir de un ensayo de la GHBP, y se deduce naturalmente a partir los experimentos anteriores con ratas. En base a la prolongada vida media en sangre del complejo de la GH derivada de E. coli más la GHBP, la GHBP permite que la GH persista en la sangre el tiempo suficiente para permitir inyecciones menos frecuentes de GH, cuando la GH está acoplada a la GHBP.

En 2 estudios separados, hemos inyectado hGH por sí misma, o en combinación y co-inyectada con hGHBP, en ratas enanas deficientes en GH. En el primer estudio se administran hGH o hGH más hGHBP diariamente o cada 2 ó 4 días durante 8 días. El segundo estudio se diseñó de forma que la hGH o la hGH más hGHBP se administran diariamente o cada 3 ó 6 días durante 18 días. En ambos estudios, la hGHBP causa respuestas de crecimiento mayores que la hGH sola, no importa cual sea el intervalo de inyección. Estos estudios muestran que, cuando la hGH se inyecta con la hGHBP, la frecuencia de la inyección puede reducirse enormemente, hasta una o dos veces por semana, sin reducir el tamaño de la respuesta de crecimiento.

Unas ratas enanas hembras (estudio A, 12-15 semanas de edad, 110-130 g; estudio B, 50-70 días de edad, 95-110 g) se reparten aleatoriamente en dos grupos de 8 (estudio A) o 7 (estudio B), y se inyectan intraperitonealmente con tetraciclina como marcador intravital del crecimiento óseo. Todas las inyecciones de GH o GHBP se administran subcutáneamente en un volumen de 100 microlitros en solución. En cada estudio, se suministra a todas las ratas una inyección diaria de cada excipiente o compuesto de ensayo, y se pesan diariamente.

La hGH usada el la rhGH (Genentech, Lote N9267AX, G042A) disuelta en agua estéril. La GHBP usada se produce en E. coli y se purifica. En este caso, la GHBP tiene una secuencia alterada respecto la GHBP usada más arriba, produciéndose la molécula mediante la supresión del exón formado por 3 dominios codificantes, obteniéndose una secuencia peptídica 1-5,27-238.

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En el primer experimento, la hGH y la hGHBP se preparan para ser inyectadas en un volumen de 0,1 ml según:

a)

hGH 0,25 mg/ml, o

b)

hGH 1 mg/ml,

c)

hGH 1 mg/ml + hGHBP 2 mg/ml.

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Los 8 regímenes de inyección son:

1)

inyecciones diarias de a), b) y c),

2)

inyecciones cada dos días de b) y c)

3)

inyecciones cada 4 días de b) y c)

4)

inyecciones de excipiente cada día.

Por tanto, es este diseño, los animales inyectados subcutáneamente cada 2º día reciben tan sólo la mitad de la dosis de GH que los animales a los que se administra inyecciones diarias, y las ratas inyectadas cada cuatro días reciben tan sólo un cuarto de la dosis acumulativa de GH.

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En el segundo experimento la hGH se prepara según:

a)

0,33 mg/ml,

b)

1 mg/ml, o

c)

2 mg/ml.

\newpage

Las soluciones de hGH + hGHBP son 0,33, 1 ó 2 mg/ml de hGH combinada con 2 veces más hGHBP (0,66, 2 ó
4 mg/ml respectivamente). Los 9 regímenes, todos inyectados en 0,1 ml subcutáneamente, son:

1)

control con excipiente

2)

inyecciones de hGH diaria de 33 microgramos/día

3)

inyecciones de hGH diaria de 100 microgramos/día

4)

inyecciones de hGH diaria de 33 microgramos/día + 66 \mug de GHBP

5)

inyecciones de hGH diaria de 100 microgramos/día + 200 \mug de GHBP

6)

inyecciones de hGH de 100 microgramos/inyección cada 3 días

7)

inyecciones de hGH de 200 microgramos/inyección cada 6 días

8)

inyecciones de hGH de 100 microgramos/inyección cada 3 días + 200 \mug de GHBP/inyección

9)

inyecciones de hGH de 200 microgramos/inyección cada 6 días + 200 \mug de GHBP/inyección.

Por tanto, en este diseño, los animales inyectados subcutáneamente cada tercer o sexto día reciben la misma dosis acumulativa de GH (0,33 mg/kg/día) que aquéllos inyectados subcutáneamente con la dosis inferior de GH.

Las respuesta a la hGH incrementa en todas las frecuencias de inyección mediante la combinación de hGHBP con la hGH. Es sorprendente que, en el estudio A, a pesar de que disminuye la frecuencia de inyección de diaria a cada dos días, y por tanto se reduce la dosis acumulativa de hGH por la mitad, la respuesta de ganancia de peso de las inyecciones de GHBP + GH es la misma. Para las inyecciones de hGH, la respuesta de ganancia de peso está marcadamente reducida cuando las inyecciones se administran cada 2 ó 4 días. La ganancia de peso es respuesta a ocho inyecciones diarias de 0,25 mg/kg de hGH es idéntica a la de tan sólo 2 inyecciones de la misma dosis acumulativa de hGH administradas cada 4 días.

En el segundo experimento, se administran diariamente dos dosis de hGH con o sin un exceso de 2 veces de hGHBP. La respuesta a la hGH está enormemente aumentada por la combinación de hGHBP con la hGH (ver más abajo). (En un estudio subsiguiente, en a rata enana la respuesta de ganancia de peso máximo a la hGH se incrementó cuando la hGH se complejó y se inyectó diariamente de forma subcutánea con hGHBP). Como en los experimentos anteriores, la GHBP mejoró la respuesta del IGF-1 a la GH. Esto parece deberse a que el complejo GHBP-GH causa un crecimiento desproporcionado y preferente del hígado, una actividad ausente cuando la GH se administra sola. Suministrando la misma dosis total de hGH en intervalos de 3 ó 6 días causa una respuesta de crecimiento pobre (en comparación con la hGH administrada diariamente, Grupo 2). La respuesta de ganancia de peso al tratamiento combinado con GH + GHBP es mucho mayor. El efecto de la hGH diaria sola es directamente comparable al de la hGH + GHBP administrada cada 3 ó 6 días. Las inyecciones infrecuentes de la combinación hGHBP + GH son tan efectivas como las inyecciones diarias de hGH. Estos datos muestran claramente que la co-administración de hGH + GHBP permite que el intervalo entre inyecciones se extienda hasta 6 días (semanalmente) sin una pérdida de actividad en el crecimiento óseo longitudinal (medido mediante la técnica de marcaje con tetraciclina) en comparación con inyecciones de la misma dosis de GH inyectadas diariamente. La co-administración de GH + GHBP también permite administrar una dosis menor de GH menos frecuentemente para una respuesta de crecimiento equivalente (inyecciones cada 2 ó 3 días a 1/2 ó 1/3 de la dosis en la rata).

9

En primates

En monos Rhesus juveniles normales, la GHBP se monitorizó después de la administración de GHBP + GH o después de GH sola. La respuesta somatogénica y anabólica se determinó midiendo las concentraciones de IGF-1. Los monos recibieron bien hGH diariamente o hGHBP + hGH semanalmente, y hubo un grupo control inyectado con excipiente. Los resultados, principalmente a partir de las concentraciones de IGF-1 en sangre, mostraron que la GHBP mejora la actividad biológica de la GH en los primates. La dosis de hGH (administrada con dos veces la proporción molar de hGHBP) fue de 0,35 mg/kg inyectada semanalmente, la dosis de hGH inyectadas diariamente fueron de 0,05 mg/kg ó 0,35 mg/kg. Los análisis de suero indican que la respuesta de IGF-1 máxima a la hGH + hGHBP es superior a la hGH sola a cualquier dosis. Tal como se midió, la vida en el suero de la hGH cuando se administra en combinación con la hGHBP se incrementó 2,2 veces respecto la de la hGH administrada sola. La administración de 0,35 mg/kg de hGH diariamente estimuló el IGF-1 en suero menos que una única administración semanal de hGH (0,35 mg/kg) complejada con hGHBP en una proporción molar de 2:1. La administración semanal de hGH + hGHBP (proporción molar de 1:2, administrada subcutáneamente como un bolo), resultó en una respuesta fisiológica superior a la administración diaria de la misma dosis de hGH, o un dosis total siete veces superior. Por tanto, pueden administrarse cantidades menores de hGH e inyecciones menos frecuentes si la hGH está complejada con la hGHBP. En resumen, en la rata y en el mono, la GHBP mejora la actividad de la GH, de forma que en humanos se espera una mejora similar.

El mecanismo de los efectos anteriores de la GHBP en el crecimiento corporal podría explicarse por una absorción retrasada del complejo GH-GHBP a partir de inyecciones subcutáneas, y, a continuación, una eliminación retrasada del complejo GH-GHBP de la sangre. Se han demostrado ambos efectos. La magnitud de este efecto es bastante sorprendente, puesto que la absorción de la GHBP fue similar a la de la GH sola. Estos mecanismos farmacocinéticos explican una gran parte de la actividad incrementada, y la capacidad de administrar inyecciones menos frecuentes del complejo GHBP + GH. Estos descubrimientos son sorprendentes puesto que no hay técnica previa que muestre el incremento de la vida media de la GH en la sangre inevitablemente conduciría a una actividad incrementada. Si una molécula se retiene en la sangre, su acceso a los tejidos se verá limitado, además, continuará la degradación de la molécula en la sangre. Si la GH está unida a la GHBP, se esperaría que el acceso de la GH a un receptor celular de la GH estuviera modificado. Está claro que, para que la molécula sea activa en los tejidos, ésta debe pasar desde la sangre hacia los tejidos, de forma que hay límites al grado de eliminación retrasada que es deseable.

Ejemplo 6 Análisis de los perfiles en plasma, durante 24 horas, de GHBP, GH/complejo-GH-GHBP y GH en niños sanos

Hemos usado el LIFA para medir los niveles de GHBP en los perfiles de plasma de niños sanos. La GH se midió mediante IRMA. Se examinaron quince perfiles de plasma durante 24 horas procedentes de 12 niños sanos (3 niñas y 9 niños) de diferentes edades (6-17 años), estaturas (-3,7 hasta +3,5 SDS) y estados púberes (1 a 4). La sangre se extrajo continuamente durante 24 horas, y se colectó en fracciones de 20 minutos. Las series temporales de GH, GHBP, y complejo GH/GHBP se analizaron mediante correlación cruzada y análisis de Fourier. La GH se secretó de forma pulsátil en todos los individuos. La concentración del complejo GH/GHBP varió durante el período de muestreo, y los cambios se correlacionaban significativamente con los pulsos de GH, con coeficientes de correlación que alcanzaban su máximo con el tiempo de retraso cero. Por contra, los cambios en la concentración local de GHBP fueron menores (CV \sim 10%) y no se correlacionaban con los pulsos de GH. El análisis de Fourier mostró patrones espectrales de potencia similares para la GH y el complejo GH/GHBP, sugiriendo un ritmo diurno (períodos de 12-24 horas), así como componentes de frecuencias superiores (períodos de aproximadamente 4 horas). A pesar de las fluctuaciones sutiles en la concentración total de GHBP, la transformación de Fourier mostró un marcado ritmo diurno, mientras que los componentes de frecuencias más elevadas eran menos abundantes. Concluimos que las variaciones en la GHBP total durante un período de muestreo de 24 horas son pequeñas, y que los niveles pueden estimarse a partir de una única muestra aleatoria de sangre.

Materiales y procedimientos Sujetos

Doce niños, 3 niñas y 9 niños, de diferentes edades (6-15 años de edad), estaturas (-3,7 hasta +3,5 SDS) y estados púberes (estados 1-4), se investigaron en el Hospital Infantil, Göteborg, Suecia. Dos de los sujetos se estudiaron en más de una ocasión (Tabla 4). La estatura en el momento del estudio se expresó como puntuaciones SD comparadas con los niños suecos normales (Karlberg, P., Taranger, J., Engström, I., Lichtenstein, H., Svennberg-Redegren, I. "The somatic development of children in a Swedish urban community". Acta Pediatrica Scand. 1976; Supl. 258:1). Todos los niños estaban sanos y bien alimentados, y tenían una función tiroidea, hepática y renal normal. Se excluyó la enfermedad celíaca. Los niños con la deficiencia clásica de GH no se incluyeron en el estudio. El volumen testicular se midió mediante orquidómetro, y los estados púberes se clasificaron de acuerdo con Tanner (Tanner, J. M., Whitehouse RH. "Clinical longitudinal standards for height velocity, weight velocity and stages of puberty." (Arch. Dis. Child. 51: 170-179 (1976)).

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Protocolo del estudio

Los niños permanecieron en el hospital durante al menos 2 días. Se les administró una dieta normal, con desayuno a la 08.00 horas, almuerzo a las 12.00 horas, cena a las 17.00 horas, y se les permitió una actividad u sueño normal. La primera tarde se les inyectó una aguja heparinizada (Carmeda, Estocolmo, Suecia). La mañana siguiente, a las 08.00 h-09.00 h, se inició la extracción de sangre a través de un catéter trombogénico (Carmeda) insertado a través de la aguja y conectado a una bomba de extracción constante (Swemed AB, Göteborg, Suecia). La velocidad de extracción fue de 0,5-2 ml/h, y el volumen del tubo fue de 0,1-0,2 ml. Los tubos de almacenamiento heparinizados se cambiaron cada 20 minutos durante 24 horas, obteniéndose, por tanto, 72 muestras. Las muestras de sangre de mantuvieron a temperatura ambiente y se centrifugaron en 24 horas. Después de la centrifugación, el plasma se congeló hasta que se ensayó.

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Mediciones de la GH

La concentración de GH en plasma se determinó por duplicado usando un IRMA basado en anticuerpo policlonal (Pharmacia, Suecia) y la hGH 66217, Primera Preparación de Referencia Internacional de la OMS, como estándar. La variación dentro de los ensayos fue del 3,2 al 3,5% en los niveles de GH entre 2-100 mU/l. La variación entre ensayos fue del 5,0% y 2,7% en las concentraciones de GH de 10 mU/ml y 40 mU/ml respectivamente. Cuando convino, se usó un factor de conversión de 2,7 U/mg y un peso molecular de 22.000 para expresar las concentraciones de GH en pmoles/l.

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Mediciones de la GHBP

La GHBP total se midió mediante LIFA tal como se ha discutido previamente en detalle. En resumen, se recubrieron placas de microtitulación de noventa y seis pocillos (Corning Glass Works, Corning, Nueva York) con un anticuerpo monoclonal dirigido contra la GHBP (MAb 263, Agen, Australia) mediante incubación durante la noche a 4ºC con 100 \mul/pocillo de anticuerpo a 10 \mug/ml en tampón de recubrimiento. Los pocillos recubiertos se bloquearon y lavaron. Los estándares (hGHBP recombinante, Genentech Inc.) o muestras (50 \mul por pocillo) se dispensaron en los pocillos recubiertos que contenían 50 \mul/pocillo de 200 ng/ml de rhGH. Las placas se sellaron, se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas con agitación suave, a continuación se lavaron antes de la adición de un anticuerpo monoclonal anti-hGH (MAb MCB, Genentech Inc.), se conjugaron con peroxidasa de rábano silvestre (100 \mul/pocillo). Después de una incubación ulterior durante 2 horas a temperatura ambiente, se lavaron las placas seis veces con tampón de lavado. Se añadió solución de sustrato recién preparada (0,4 g de o-fenilenediamina dihidrocloruro en un litro de PBS, más 0,4 ml de peróxido de hidrógeno al 30%) a las placas (100 \mul por pocillo), y la incubación se llevó a cabo en la oscuridad durante 15 minutos a temperatura ambiente. La reacción se paró mediante la adición de 100 \mul de 2,25 mol/l de ácido sulfúrico, y se determinó la absorbancia a 490 nm. El mismo procedimiento, sin la adición de rhGH a las muestras, se usó para medir la concentración en plasma del complejo GH/GHBP. El rango de detección en el LIFA fue de 15,6 hasta 1000 pmoles/l. Los coeficientes de variación intra- y entre ensayos fueron 7,3% y 11,3% respectivamente.

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Análisis estadístico

La ritmo de los perfiles de 24 horas se analizó mediante transformada de Fourier. Las series temporales originales de concentraciones de GH, GHBP y complejo GH/GHBP se suavizaron mediante el promedio en movimiento (moving average) de 3 puntos (pesos w_{-1} = w_{+1} = 1/4, w_{0} = 1/2) con objeto de reducir la influencia de los componentes de alta frecuencia. Las series suavizadas se analizaron como expansiones de Fourier (Chatfield, C., "The analysis of time series." Chapman and Hall, Londres, 1989). Los resultados se expresaron como un espectro de potencia, en donde la amplitud se representa como una función de la frecuencia. Para analizar los datos en busca de correlaciones entre GH, GHBP, y complejo GH/GHBP, se usó la correlación cruzada seguida por un modelo de autorregresión de Box-Jenkins (Haugh, L., Box, G. E. P. "Identification of dynamic regression (distributed lag) models connecting two time series." Journal of the American Statistics Association. 1977; 72: 121-130).

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Resultados Perfiles de plasma de la GH, complejo GH/GHBP, y GHBP total

En la Figura 7 se muestran los perfiles de veinticuatro horas en plasma de GH, complejo GH/GHBP y GHBP total procedente de un sujeto representativo (perfil #15). Las concentraciones en plasma de ambos, la GH (panel superior) y complejo GH/GHBP (panel medio) variaron a lo largo de un amplio rango durante el período de muestreo, y los cambios parecían estar sincronizados en el tiempo. Por contra, la concentración total de GHBP (panel inferior) fue mucho menos variable, y no parecía estar influenciada por los cambios en la concentración de GH y complejo GH/GHBP.

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Concentraciones en plasma de la GH, GHBP y complejo GH/GHBP

Las concentraciones en plasma de GH, GHBP y complejo GH/GHBP se muestran en la Tabla 5. Los valores indicados son la media y los coeficientes de variación (CV) para cada perfil de 24 horas individual, así como el promedio del grupo. La concentración media de GHBP, complejo GH/GHBP y GH variaron entre los diferentes individuos (rango 109-247 pmoles/l, 13-109 pmoles/l, y 32-215 pmoles/l, para GHBP, complejo GH/GHBP y GH, respectivamente). La naturaleza altamente pulsátil de los perfiles en plasma de la GH y del complejo GH/GHBP se reflejan en un mayor CV (156,0% y 47,2% respectivamente). El porcentaje de GH que estaba unida a la GHBP en los picos elevados de GH (250 pmoles/l) fue del 14,6%. La concentración de GHBP total fue mucho menos variable durante el período de muestreo, tal como ilustra el bajo coeficiente de variación (9,6%) (Tabla 5). Los perfiles de 24 horas completos de la concentración de GHBP total de los sujetos ilustran que los niveles varían mucho entre los individuos, y que la concentración de cada sujeto es relativamente constante a lo largo del día.

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Discusión

El objetivo al monitorizar la GHBP fue investigar las posibles variaciones diurnas en la concentración en plasma de la GHBP en niños sanos, y determinar si las fluctuaciones en las concentraciones de la GHBP estaban correlacionadas con la liberación episódica de GH. Los sujetos incluidos en nuestro estudio diferían en edad, sexo, estado púber, estatura y niveles de GH. Desde un punto de vista práctico, creemos que el descubrimiento más útil a partir de estos datos es que la concentración de GHBP total presenta muestra tan sólo variaciones menores durante un período de muestreo de 24 horas, implicando que una única muestra de sangre debería proporcionar una buena estimación del nivel de GHBP total. No obstante, el análisis riguroso de los datos reveló que las pequeñas fluctuaciones (CV \sim 10%) en la concentración en plasma de GHBP total se deben a un ritmo circadiano significativo. No se observó correlación cruzada significativa entre los pulsos de GH u los cambios en la concentración de GHBP total. Por contra, la concentración en plasma del complejo GH/GHBP mostró fluctuaciones rápidas, la cuales estaban muy correlacionadas con los cambios en la concentración de GH. El análisis de Fourier mostró que los patrones de plasma tanto de la GH como del complejo GH/GHBP seguían un ritmo diurno, pero que también poseían componentes de frecuencias elevadas (períodos de alrededor de 4 horas).

El LIFA descrito, que se usó para las mediciones de GHBP, tiene los ventajas de que tan sólo se detecta la GHBP funcional, y que la GHBP endógena, que fluctúa rápidamente a lo ancho de un amplio rango, no afecta la medición de las concentraciones de GHBP total. El ensayo también puede medir la concentración de complejo GH/GHBP. Se ha informado recientemente que, cuando la proporción de GHBP respecto a GH excede 1:1, pueden formarse trímeros consistentes en una molécula de GH y dos moléculas de GHBP. El trímero no puede ser unido por el anticuerpo de captura, de forma que el complejo GH/GHBP que se mide en el LIFA es el heterodímero formado por una molécula de GH y una molécula de GHBP. Cuando la concentración de GH aumenta (por ejemplo, cuando se añade rhGH a la muestra en el LIFA, o durante los picos endógenos de GH), el trímero [GH-(GHBP)_{2}] se disocia y se forman dímeros [GH-GHBP], los cuales pueden ser unidos por el MAb 263. Esto implica que la totalidad de la GHBP, incluyendo las moléculas de GHBP en trímeros formados de forma endógena, son detectables en el ensayo de la concentración de GHBP total.

Hemos hallado que aproximadamente un 15% de la GH en los picos elevados (> 250 pmoles/l) parece estar unida en el complejo GH/GHBP, pero la fracción total unida de la GH podría ser superior, puesto que parte de la GH podría haber formado trímeros con la GHBP.

La variación en la concentración en plasma de GHBP en muestras seriadas ha sido estudiada previamente en dos estudios (Snow, K. J., Shaw, M. A., Winer, L. M., Baumann, G. "Diurnal pattern of plasma growth hormone-binding protein in man." J. Clin. Endocrinol. Metab. 70: 417-420 (1990); Hochberg, Z., Amit, T., Zadik, Z., "Twenty-four-hour profile of plasma growth hormone-binding protein." J. Clin. Endocrinol. Metab., 72: 236-239 (1991)). El estudio de Snow et al., que se llevó a cabo en adultos con niveles bajos de GH, coincide con nuestros resultados en que no hay una variación importante en los niveles de GHBP total durante el período de muestreo. No obstante, puesto que los pulsos de GH estaban ausentes o eran muy pequeños en el estudio de Snow et al., no pudo excluirse la posibilidad de que pudiera haber una variación inducida por GH en los niveles de GHBP en pacientes con secreción pulsátil de GH. En otro estudio, por Hochberg et al., los niveles de GH y GHBP se midieron en muestras obtenidas de niños normales con secreción pulsátil de GH, y se concluyó que, dentro de los 30 minutos la mayoría de los pulsos de GH estaban acompañados por pulsos de GHBP. Esto está en contradicción con los presentes resultados, en los que sólo se detectaron cambios menores en la concentración de GHBP total, y éstos no estaban correlacionados con los pulsos de GH. La razón de esta discrepancia entre los dos estudios no está clara, pero podría deberse a las diferencias entre los ensayos de GHBP. El LIFA mide directamente la GHBP total (es decir, la suma de la GHBP libre y de la GHBP unida a GH), mientras que el ensayo usado por Hochberg et al., se basa en la unión de la hGH radiomarcada a la GHBP, y, a continuación, los valores se corrigen para la interferencia por GH endógena. Puesto que nuestros datos respecto el complejo GH/GHBP indican que el complejo se forma y elimina rápidamente, es posible que los pulsos aparentes de GHBP, que Hochberg et al. observaron 30 minutos después del pulso de GH, pudieran reflejar la desaturación de la GHBP, permitiendo, de este modo, que se uniera más GH marcada.

Los niveles de GHBP total variaron a lo ancho de un amplio rango en sujetos diferentes (109-247 pmoles/l), y es probable que estos valores se correlacionen con la edad, sexo, estado púber, velocidad de crecimiento, etc. Hemos concluido que los niveles de GHBP son relativamente constantes a lo largo del día, y que una muestra de sangre única o mezclada debería ser suficiente para estimar la concentración de GHBP total. Este hallazgo facilita las comparaciones con poblaciones más extensas, e ilustra el valor de la medición de la GHBP como una herramienta diagnós-
tica.

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Ejemplo 7 Determinaciones de la GHBP en niños de estatura baja y normal

La proteína de unión a la hormona del crecimiento se analizó usando el ensayo LIFA de la GHBP humana. Los resultados se describen en las Tablas 6, 7, 8 y 9 siguientes. Estas tablas contienen estadísticas de resumen sobre los niveles de GHBP en niños normales (Tabla 6), así como en niños con estatura baja debida a tres etiologías diferentes: deficiencia idiopática de la hormona del crecimiento (GHD) (Tabla 7), (ISS) (Tabla 8), y síndrome de Turner (Tabla 9). Los datos normales se obtuvieron a partir de muestras en el control de Genentech y a partir de colaboraciones con investigadores externos. Las muestras procedentes de niños con baja estatura se obtuvieron como parte de un proyecto en activo de vigilancia posterior a la comercialización de la hormona humana del crecimiento Protropin®, el Estudio Cooperativo Nacional del Crecimiento de Genentech (Genentech National Cooperative Growth Study, NCGS). Actualmente, los niños ISS ya no son idiopáticos, puesto que la deficiencia de la GHBP posiblemente refleja una deficiencia subyacente del receptor de la hormona del crecimiento.

Las estadísticas de resumen se presentan por sexo y edad, y representan nuestra mejor estimación de un rango normal de la GHBP. Estas estadísticas consisten en la media, y más o menos 2 desviaciones estándar (SD), y se determinaron a partir de los datos registrados (en base 10) de los valores de GHBP, a continuación convertidos de nuevo en las unidades originales. Los tamaños de las muestras usadas en las estimaciones se incluyen con las estadísticas de resumen. Hay de destacar que solamente hubo datos suficientes para realizar estos cálculos para niños varones y hembras con edades de 3, 4 y 6 hasta 15. Los datos procedentes de niños de otras edades y procedentes de adultos eran demasiado escasos para permitir una buena estimación de la media.

Las estadísticas de resumen que se listan para cada una de las etiologías de baja estatura son: el tamaño de la muestra, el promedio, y más o menos una S.D. Estos valores se calcularon en la misma forma que se ha descrito para los normales. Las estadísticas se imprimen por edad y sexo para todos los datos disponibles, con independencia del tamaño de la muestra. Las unidades de la GHBP están en pmoles/litro.

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La Figura 8 ilustra gráficamente la diferencia entre la GHBP normal y varias etiologías. Se representan los niveles de proteína de unión de la GH procedentes de pacientes del Estudio Cooperativo Nacional del Crecimiento (logaritmo de la concentración de la GHBP frente a la edad del paciente). Las líneas cruzadas representan los valores promedio; las líneas verticales son más o menos 1 SD; las líneas de puntos verticales son más o menos 2 SD. Los puntos negros separados representan cada uno un paciente, (A) GHD idiopático para varones; (B) GHD idiopático para hembras; (C) baja estatura idiopática para varones; (D) baja estatura idiopática para hembras; (E) síndrome de Turner.

La utilidad clínica del ensayo LIFA para distinguir entre normales y varias etiologías puede observarse en la Figura 8(A-E). Esto es particularmente pronunciado en la Figura 8 C y D, en donde los pacientes con baja estatura idiopática están predominantemente por debajo de la media tanto en varones y hembras. Esto proporciona un ensayo de diagnóstico clínicamente valioso para evaluar el nivel de GHBP, e, indirectamente, una determinación presuntiva del receptor de la hormona del crecimiento.

La baja estatura idiopática ya no es idiopática en el sentido que ahora puede verse como un estado de relativa resistencia a la GH. En base a la ausencia relativa de GHBP, es probable que esta resistencia se deba a una deficiencia en receptores de la GH que son capaces de responder a la GH. La terapia actual de la ISS implica inyecciones diarias de hGH. Una estrategia a la deficiencia de receptores de la GH es administrar dosis más elevadas de GH para estimular aquellos receptores que están presentes. Se espera que una dosis de desde 1,1 hasta 10 veces la que se usa actualmente incremente la respuesta a la GH. Alternativamente, ahora que la base subyacente a la ISS ha sido revelada, se sugieren nuevas opciones de tratamiento diferentes de las usadas actualmente. En la deficiencia de GH y en el síndrome de Turner, en situaciones de GHBP normal y de respuesta normal del receptor de la GH, la GHBP + GH es el tratamiento lógico. En pacientes ISS, la GHBP + GH también podría usarse para maximizar la respuesta por parte de aquellos receptores presentes. No obstante, en la ISS, también está indicado el tratamiento terapéutico con IGF-1. El IGF-1 se administra sólo o con proteína de unión del IGF, y podría co-administrarse con GH, y/o con GHBP. Puesto que los pacientes con ISS tienen una GHBP reducida, la combinación GHBP + GH eleva la respuesta por parte de aquellos receptores de la GH que están presentes. La administración de cantidades terapéuticas de IGF-1 o IGF-1 más IGF BP eleva la cantidad efectiva de IGF-1 en suero, solventando en parte la respuesta deficiente a la GH, y estimulando las respuestas dependientes del IGF-1.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

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Claims (3)

1. Uso de un factor de crecimiento 1 de tipo insulina en la fabricación de una formulación terapéuticamente eficaz para estimular el crecimiento de un ser humano que presenta una estatura corta idiopática, con la condición de que, si la formulación comprende adicionalmente la hormona de crecimiento humana, no es para el tratamiento de un paciente que muestra una ralentización en la velocidad de crecimiento después de por lo menos doce meses de administración de la hormona de crecimiento.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha formulación comprende adicionalmente la proteína de unión al factor de crecimiento 1 de tipo insulina.

3. Uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicha formulación que comprende la hormona de crecimiento humana comprende adicionalmente la proteína de unión a la hormona de crecimiento humana.