JPH11346765A - ホルモン結合タンパク質検定用抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ホルモン結合タンパク質の検定に使用するた
めの抗体の提供。 【解決手段】 ＡＴＣＣ番号ＨＢ-１０５９６を有する
ラインＨＧＨ-Ｂからなるマウスハイブリドーマによっ
て生産されるヒト成長ホルモンに特異的な抗体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】生物学的液体中のポリペプチ
ドホルモン結合タンパク質の存在を検出しその量を定量
するためおよび／またはホルモン結合タンパク質に特異
的に結合したリガンドポリペプチドホルモンの量を測定
するための新規リガンド媒介免疫機能的検定(ＬＩＦＡ)
法について記述する。このホルモン結合タンパク質用の
改良された免疫測定検定法では、１）ホルモン結合タン
パク質を捕らえるための第１固相結合抗体、２）飽和量
のリガンドホルモン、および３）リガンドホルモンに特
異的な標識された第２抗体を使用する。本ＬＩＦＡ法は
成長ホルモン結合タンパク質検定法によって例示され
る。

【０００２】

【従来の技術】ホルモン結合タンパク質(ＨＢＰ)は生物
学的液体中に認められる担体タンパク質であり、リガン
ドポリペプチドホルモンに対する結合特異性を有する。
上記ＨＢＰの例は成長ホルモン結合タンパク質(ＧＨＢ
Ｐ)、上皮成長因子(ＥＧＦ)結合タンパク質、インスリ
ン様成長因子１及び２(ＩＧＦ-１、ＩＧＦ-２)結合タン
パク質(それらの６)、血小板由来成長因子(ＰＤＧＦ)結
合タンパク質、神経成長因子(ＮＧＦ)結合タンパク質、
インスリン結合タンパク質、コリチコトロピン放出因子
(ＣＲＦ)結合タンパク質、形質転換成長因子ベータ(Ｔ
ＧＦ-β)結合タンパク質およびアクチビン結合タンパク
質(フォリスタチン)である。

【０００３】最もよく特徴づけられているポリペプチド
ホルモン結合タンパク質の１つはＧＨＢＰである。本発
明で議論するＧＨＢＰはＧＨ受容体の細胞外ドメインで
あり、これは人間(Baumann,G.ら,J.Clin.Endocrinol.Me
tab.62:134-141[1986]；Herington,A.C.ら,J.Clin.Inve
st.77:1817-1823[1986])を含む数種において、血液中を
循環して、ＧＨＢＰとして機能する(Ymer,S.I.及びHeri
ngton,A.C.,Mol.CellEndocrinol.41:153[1985]；Smith,
W.C.及びTalamantes,F.,Endocrinology 123:1489-94[19
88]；Emtner,M.及びRoos,P.,Acta Endocrinologica[Cop
enhagen] 122:296-302[1990])。さまざまな生理学的お
よび病的状態におけるＧＨＢＰの命運またはその調節に
ついてはほとんどわかっていない。

【０００４】ホルモン結合タンパク質は、リガンドが標
識されており、抗体が結合タンパク質自体に特異的であ
ることを特徴とする抗体に基づく沈降法によって検定さ
れてきた。Barnardら,J.Endocrinol.123(2):327-32[198
9]はヒト成長ホルモン結合タンパク質(ｈＧＨＢＰ)に特
異的なモノクローナル抗体を使用し、Ymerら,Endocrino
logy,125(2):993-9[1989]はウサギＧＨＢＰについて、
またSmithら,Endocrinology 123(3):1489-94[1988]はマ
ウスについて使用した。血中のＧＨＢＰレベルを評価す
るために現在利用できる方法は、放射性標識ＧＨと共に
試料をインキュベートし、次いで結合したＧＨと遊離の
ＧＨを分離することに基づいている(Baumann,G.ら,Acta
Endocrinologica (Copenhagen) 119:529-34[1988]；Am
it,T.ら,J.Clin.Endo.Metab.71:474-479[1990])。これ
らの検定法によって得られる結果は内因性ＧＨの干渉ゆ
えにその解釈が難しい(Baumann,G.ら,J.Clin.endocrino
l.Metab.62:134-141[1986])。ＧＨＢＰを検出するため
に標識した成長ホルモンを使用した他の研究者らは、Em
terら,Acta Endocrinol. 122(3):296-302(1990)；Silbe
rgeldら,Clin.Endocrinol.31(3):295-303(1989)；Daugh
adayら,J.Clin.Endocrinol Metab.,65(5):1072-4(198
7)；Heringtonら,J.Clin.Invest.77(6):1817-23(198
6)；およびLaronら,Acta Endocrinol.121(4):603-8(198
9)である。ＧＨＢＰに関するこれら検定法には重大な問
題がある。これらは困難であり、錯化したＧＨＢＰ-Ｇ
Ｈをサイズ-排除クロマトグラフィーか抗体沈降によっ
て分離することを必要とし、研究室ごとに得られる結果
が異なり得る。さらに、これらは不定の(即ち、共通の
タンパク質標品に較正されない)結果を与え、内因性成
長ホルモンによる影響を受ける。したがって、内因性ポ
リペプチドホルモンに結合したものも含めてすべてのポ
リペプチドホルモン結合タンパク質を検出することがで
きる改善された検定法が必要とされている。

【０００５】モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの
作成法はKipps及びHerzenberugらにより、「Clinical E
ndocrinology and Metabolism」第62巻第1号108.1-108.
9頁(1986)に開示されている。

【０００６】ＩＧＦ結合タンパク質に関するモノクロー
ナル抗体に基づく免疫放射線測定検定法はPekonenら,J.
Immunoassay 10:325-37(1989)に記述されている。高親
和性モノクローナル抗体を用いる免疫測定あるいはサン
ドイッチ免疫検定法はDavidら,米国特許第４４８６５３
０号に教示されている。このようなサンドイッチ検定法
では２つの抗体の間に挟まれた２またはそれ以上のエピ
トープを伴う抗原を用いる。非ポリペプチドホルモンリ
ガンドを結合する循環中のタンパク質(例えばチロキシ
ン結合タンパク質)は、チロキシンによって占められて
いない結合タンパク質部位の数を決定するために蛍光標
識トレーサー(米国特許第４４７６２２８号)を用いて測
定されている。遮断剤とチロキシン結合グロブリンを用
いる生物学的液体のヨードチロニン免疫検定法がGordon
ら,米国特許第４６２２２９３号に記述されている。

【０００７】特異的結合対(ＳＢＰ)については抗原-抗
体反応、リガンド-受容体、ホルモン-受容体およびレク
チン-オリゴ糖を参照して議論されている(米国特許第４
９５６３０２号)。Zukら(米国特許第４５９４３２７号)
はこのようなＳＢＰの構成要素を検出するための全血の
検定法であって、ＳＢＰの一構成要素を血液に接触させ
る前に固相に結合させなければならない方法について記
述している。その他のＳＢＰの第２の構成要素は標識さ
れた第２のＳＢＰ構成要素を用いて競争反応で検出され
る。同様に、Wengら(米国特許第４７３７４５６号)はＳ
ＢＰ構成要素の検定法における妨害物質を減じる方法で
あって、ＳＢＰの個々の構成要素を標識する方法を記述
している。受容体は標識されたリガンドと非標識のリガ
ンドの両方を捕捉するための競争的検定法に用いられて
いるが、本願発明のように受容体の存在の分析とその定
量を行うためには用いられていない。２つの抗体を用い
る抗原の決定法は米国特許第４３４３８９６号に開示さ
れている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】従来のポリペプチドホ
ルモン結合タンパク質検定法における問題点 ＨＢＰを検出する際の課題はＧＨＢＰを検出する際に直
面する問題点によって最もよく例示され得る。生物学的
液体中のＧＨＢＰの存在を決定するための従来の方法は
望まれる程には正確でなく、しばしば放射性物質の使用
を必要とした。本発明は、(ａ)放射性標識ＧＨを必要と
せず、(ｂ)内因性ＧＨをＧＨＢＰから除去する必要がな
く、(ｃ)いかなる形態でもＧＨ-ＧＨＢＰ錯体からＧＨ
のサイズ分離を行う必要がなく、さらに、(ｄ)恣意的な
単位で報告される相対値ではなくＧＨＢＰの正確な質量
もしくは絶対的な量を測定する点で、従来の検定法の問
題点を回避するものである。本発明は循環中のＧＨＢＰ
の結合容量を測定し、ＧＨに関するＧＨＢＰの飽和度を
測定することができるという利点をも有する。さらに、
本発明は不正確性をもたらす背景検定雑信号を本質的に
軽減することにより、ＧＨＢＰに特異的である。本発明
の検定法は、ＧＨＢＰを捕捉するために第１の抗体を使
用し、結合したＧＨの存在を測定するために検出可能に
標識された第２の抗体を使用することにより、標準的な
免疫測定検定法における問題点を回避するものである。
ＧＨＢＰ上のもう１つのエピトープに特異的な第２の抗
体を使用することはＧＨＢＰが機能的であるか否かを決
定せず、加えて、両抗体に結合した他の血清タンパク質
ゆえに背景(バックグラウンド)を増大させるであろう。

【０００９】内分泌系の機能を研究するためには、その
系のすべての部分、即ちホルモン、その結合タンパク質
およびホルモン-結合タンパク質錯体を定量する信頼で
きる方法を利用できることが不可欠である。これらの測
定が過去に達成されたことはなかった。その理由は、異
なる成分による検定の妨害と、ホルモンおよびＢＰの両
方が遊離および錯化した形態で存在することができると
いう事実にある。ＩＧＦ-１の場合のように同じホルモ
ンについて数種の異なる結合タンパク質が存在する場合
にはさらに複雑である。しかし、本発明は、特定の結合
タンパク質に対するモノクローナル抗体を使用すること
が如何にその特定の結合タンパク質の飽和度と量を決定
することができるかを教示するものである。より低い親
和性を有する第２の結合タンパク質が記述されている(B
aumann,G.及びShaw,M.A.,J.Clin.Endocrinol.Metab.70:
680-686[1990])ＧＨの場合、この結合タンパク質はＧＨ
受容体とは構造的に無関係であると見られ、我々の検定
法では検出されないに違いない。しかし、この他の結合
タンパク質が単離され、適当な抗体を生じさせれば、こ
の他のＧＨ結合タンパク質も本発明者らの検定法で検出
することができよう。

【００１０】現在のところ、ペプチドホルモンに関する
担体タンパク質の標準的な定量法は、血清を放射性標識
したリガンドと共にインキュベートし、次いでクロマト
グラフィーか沈殿によって結合したホルモンと遊離のホ
ルモンを分離することからなる。これらの手法は手間が
かかり、試料中の内因性ホルモンによる妨害ゆえにその
結果はしばしば解釈が困難である。これらの検定法はあ
る大きさの血清タンパク質の結合容量の見積もりを与え
るが、類似する大きさの異なる結合タンパク質の活性を
識別することはなく、遊離のＢＰと錯化したＢＰの相対
的比率を決定することはできない。もう１つの不都合
は、結果が血清貯蔵液との関連で表され、このことが異
なる研究で得られた結果との比較を困難にするという点
である。本発明において、我々は、新しい方法を選択す
ることによりＧＨＢＰの検定法を開発した。この検定法
は驚くべきことに、過去に例示されたことのない方法
で、個々のホルモン結合タンパク質を正確に検出するこ
とができる。

【００１１】本発明で使用される好ましい方法であるＬ
ＩＦＡは、使用が簡単であり、機能的な結合タンパク質
のみを検出するという利点を有する。本検定法をＧＨＢ
Ｐに適用した場合、内因的に錯化したＧＨＢＰと全ＧＨ
ＢＰの両方が測定され、また本検定法は、内因性ＧＨの
ＧＨＢＰからの除去やＧＨＢＰ錯体から遊離のＧＨを分
離する操作を必要としない。従来の方法とは対照的に、
内因性ＧＨは本検定法を妨害せず、内因性もしくは外部
から加えた結合ＧＨを用いて錯化したＧＨＢＰと全ＧＨ
ＢＰを検出する。実際に、ＧＨは既に内因性ＧＨと錯化
している結合タンパク質とは錯化できないので、第１構
成要素として固相に結合されたＧＨを使用することはで
きない。したがって、本検定法の１つの必要条件は、遊
離型および錯化型の両方の結合タンパク質を認識する固
相被覆抗体である。本発明が教示する本検定法を用い
て、他のポリペプチドホルモン-結合タンパク質の全結
合容量と飽和度をそれらが結合するリガンドに関して測
定することもできる。

【００１２】したがって、本発明は、生物学的液体中の
生物学的に活性なＨＢＰを定量するための、新規で高感
度かつ特異的な酵素結合免疫吸着剤検定法(ＥＬＩＳＡ)
の開発について記述する。本検定法を用いてリガンド-
ホルモン結合タンパク質錯体の濃度を測定することもで
きる。本発明の方法は、分析の容易さ、感度、正確さお
よび信頼性に関連するいくつかの利点を提供するが、こ
れらは本法の詳細を議論することによりさらに明確にな
るであろう。

【００１３】

【課題を解決するための手段】ポリペプチドホルモン結
合タンパク質の存在と濃度および／または該ホルモン結
合タンパク質のその特異的リガンドホルモンとの飽和度
を検出するためのＬＩＦＡ法について記述する。本検定
法では、ホルモン結合タンパク質とリガンドホルモンと
の間の機能的な結合が要求される。図１の操作１〜３に
例示するように、１またはそれ以上のホルモン結合タン
パク質エピトープを結合し、リガンドホルモンに結合し
た結合タンパク質および遊離の結合タンパク質にさらさ
れるモノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用し
て固体基盤上にホルモン結合タンパク質を捕捉する。操
作３では、捕捉したホルモン結合タンパク質をリガンド
ホルモンと共にインキュベートすることにより、そのリ
ガンドホルモンに特異的なホルモン結合タンパク質部位
を飽和させる。１つの選択枝して、操作４：ホルモン特
異的標識抗体とのインキュベーションの前に、ホルモン
結合タンパク質をリガンドホルモンで飽和させない。こ
れによって、外因性リガンドホルモンを添加してインキ
ュベートする前にホルモン結合タンパク質と結合してい
る内因性リガンドホルモンのレベルを決定することがで
きる。ホルモン結合タンパク質とリガンドホルモンを一
緒にして、固相捕捉抗体と共に同時にインキュベートす
るか、もしくはこれらを逐次的に捕捉抗体とインキュベ
ートすることができる。操作４では、ホルモン結合タン
パク質が結合するところとは異なる部位にあるリガンド
ホルモン上の１またはそれ以上のエピトープに結合する
検出可能に標識したモノクローナルまたはポリクローナ
ル抗体が、リガンドホルモン-ホルモン結合タンパク質
錯体に安定に結合する。ホルモン結合タンパク質を追加
のホルモンで飽和させる場合(操作３)、検出されるホル
モンの全量が存在する結合タンパク質の量の測定値とな
る。ホルモン結合タンパク質を追加のホルモンで飽和さ
せない場合、検出されるホルモンの量は、ホルモン結合
タンパク質に結合している内因性リガンドホルモンの測
定値となる。この２つの値を比較することにより、存在
するホルモン結合タンパク質の量と内因性リガンドホル
モンによる相対的飽和度の決定が可能になる。

【００１４】成長ホルモン応答性組織を刺激するために
ＧＨＢＰを単独で、あるいはＧＨと組み合わせて治療的
に使用することを示す。ＧＨＢＰ-ＧＨ治療的組成物の
使用はより少ないＧＨの使用でより大きいＧＨ応答性組
織の刺激をもたらすことを示す。さらに、ＧＨＢＰ-Ｇ
Ｈ組成物は投与後、より長く続くので、ＧＨ単独よりも
少ない頻度での投与を可能にする。

【００１５】

【発明の実施の形態】ポリペプチドホルモン結合タンパ
ク質検定法 ポリペプチドホルモン結合タンパク質の存在の検定に
は、(１)該結合タンパク質に特異的な第１の捕捉モノク
ローナル抗体、(２)リガンドポリペプチドホルモンおよ
び(３)該リガンドポリペプチドホルモンに特異的な第２
のモノクローナル抗体を使用する。我々が開発したＬＩ
ＦＡは溶液中の機能的ホルモン結合タンパク質の全濃度
を定量することができる簡便で高感度な方法である。本
検定法の結合タンパク質検出範囲は約４乃至２００００
ｐｍｏｌ／Ｌの範囲で変化し得、より好ましくは約１０
乃至４０００ｐｍｏｌ／Ｌであり、最も好ましくは約２
０乃至２０００ｐｍｏｌ／Ｌである。本検定を改良し
て、循環中のリガンドホルモン-結合タンパク質錯体の
濃度を測定することもできる。遊離の結合タンパク質と
ホルモンが結合した結合タンパク質の両方を認識する結
合タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いて固相
(例えば微量滴定プレート)上に結合タンパク質を捕捉す
る。すべての結合部位を飽和させるためにリガンドホル
モンと共に試料をインキュベートし、抗ホルモン抗体を
用いて結合タンパク質に結合しているホルモン(内因性
および外因性)の量を検出する。リガンドホルモンとの
インキュベーションを行わないこと以外は同じ手法を行
うことによって、循環中のホルモン-結合タンパク質錯
体のレベルを定量することができる。

【００１６】このＬＩＦＡはいずれのポリペプチドホル
モン結合タンパク質にも使用できる。あらゆる生物学的
液体中に存在する機能的な結合タンパク質を正確に検出
することができ、機能的結合タンパク質のそのリガンド
ポリペプチドホルモンによる内因性飽和レベルを測定す
ることができる。この検定法は機能的ＨＢＰの測定と、
血清単位などとは異なり確認し得る質量単位にＨＢＰ検
定を内挿することを初めて可能にするものである。天然
に生産されるＨＢＰとリガンドホルモン(利用可能であ
れば)を用いてこれを行うこともできるが、一般的には
組換えポリペプチドホルモンを用いて検定を行い、組換
えＨＢＰに基づいて標準曲線を作成することにより達成
される。驚くべきことに、本ＬＩＦＡ法を用いて全ＨＢ
Ｐと内因性ポリペプチドホルモンと錯化したＨＢＰの量
の両方を検出することができる。したがって、周囲のポ
リペプチドホルモンによる影響を受けない機能的なＨＢ
Ｐの量を決定する正確な方法が初めて提供されるのであ
る。

【００１７】本免疫機能的ＨＢＰ検定法の１つの変法と
して、添加するリガンドホルモンが検出抗体の結合を妨
害しない第２の検出可能標識を含有する。リガンドホル
モン上のこの第２の標識と検出抗体上の第１標識は同じ
ではない。結合した添加リガンドホルモンの量と結合し
た抗体の量を別個に測定することにより、リガンドホル
モンによるＨＢＰの飽和百分率を決定することができ
る。２つの異なる標識(１つはリガンドホルモン上にあ
り、１つは検出抗体上にある)の使用により、結合した
外因性リガンドホルモンの量と全ＨＢＰを同時に決定す
ることができる。

【００１８】本発明の検定法を用いて未知の試料中のリ
ガンドホルモンの量を定量することもできる。組換えＨ
ＢＰまたは内因性リガンドホルモンを除去したＨＢＰを
本検定法と同様に固相に結合させる。第１に、リガンド
ホルモンを含有する未知の試料を抗体結合ＨＢＰと接触
させる。第２に、リガンドホルモン特異的に標識された
抗体を加え、結合量を決定する。ＬＩＦＡのこの応用
は、ＨＢＰを固相に直接結合させて用いる場合よりも少
ない量のＨＢＰを使用して行える。ＨＢＰを結合するた
めに抗体を使用することにより、リガンドホルモンに関
するＨＢＰの結合部位が遮断されていないような配向が
保証される。

【００１９】ヒト成長ホルモン結合タンパク質検定法 ｈＧＨＢＰの存在を検定するには、１）該結合タンパク
質に特異的な第１捕捉モノクローナル抗体、２）成長ホ
ルモン、および３）成長ホルモンに特異的な第２モノク
ローナル抗体を使用する(図１)。我々が開発したＬＩＦ
Ａは簡便で高感度な方法であり、生物学的液体中の機能
的成長ホルモン結合タンパク質の全濃度の定量を可能に
する。本検定法を改良して循環中のリガンド-結合タン
パク質錯体の濃度を測定することもできる。遊離の結合
タンパク質とＧＨが結合した結合タンパク質の両方を認
識する成長ホルモン結合タンパク質に対するモノクロー
ナル抗体を用いて微量滴定プレート上の結合タンパク質
を捕捉する(図１，工程１)。試料をヒト成長ホルモンと
共にインキュベートしてすべての結合部位を飽和させ
(図１，工程３)、抗-ｈＧＨ抗体を用いて結合タンパク
質に結合しているｈＧＨ(外因性および内因性)の量を検
出する(図１，工程４)。添加したｈＧＨと共にインキュ
ベートしない点を除いて同じ手法をとることにより、循
環中のｈＧＨ-結合タンパク質錯体の血清レベルを定量
することができる。

【００２０】本明細書における好ましい検定法は、ヒト
血清や血漿などの生物学的液体中のＧＨＢＰを定量する
ための、モノクローナル抗体(ＭＡｂ)に基づくサンドイ
ッチＥＬＩＳＡである。機能的なＧＨＢＰのみを検出す
る本検定法を用いて全ＧＨＢＰと錯化したＧＨＢＰの両
方を測定することができ、それゆえに、そのリガンドに
よるＧＨＢＰの飽和度を計算することができる。ｈＧＨ
ＢＰのために開発した検定法では、２６３(コート)ＭＡ
ｂが遊離のＧＨＢＰ並びにｈＧＨに結合したＧＨＢＰを
結合し、これを用いて微量滴定プレート上にＧＨＢＰを
捕捉することができる。ｈＧＨに対する結合ＭＡｂ Ｍ
ＣＢを用いて固定化ＧＨＢＰに結合しているｈＧＨを検
出する。全ＧＨＢＰ量は、結合部位をｈＧＨで飽和さ
せ、次いでＧＨＢＰに結合している(内因性および外因
性)全ＧＨ結合を検出することにより測定される。内因
性ＧＨ-ＧＨＢＰ錯体の濃度は、試料を結合抗体と共
に、ＧＨでＧＨＢＰを予め飽和させることなくインキュ
ベートすることによって得られる。本検定法は高感度で
あり、１６人の正常な成人から得た無作為試料のすべて
が明確に検出できるＧＨＢＰレベルを有したので生理学
的範囲を覆うようである。スパイク回収実験は、本検定
法が血清および血漿中のＧＨＢＰレベルを測定するのに
有用であることを８９.１〜１１３.６％の範囲の回収率
で示している。

【００２１】本検定法の１つの必要条件は遊離型と錯体
型の両方の抗原を認識するコート抗体であり、これはｈ
ＧＨＢＰについてはＭＡｂ２６３である。本明細書に記
載するこのような抗体の作成技術を用いることにより、
我々のＧＨＢＰ ＬＩＦＡの背後にある原理を用いて他
のポリペプチドホルモン結合タンパク質の全結合容量と
飽和度を測定することができるであろうと確信する。Ｍ
Ａｂ２６３を３つの異なる検定形式で試験した時(図２)
に観察された結合百分率の相違はＭＡｂの結合特性では
なくむしろ検定の速度論によるものである。終夜予備イ
ンキュベーション実験では、ＧＨＢＰがＧＨ-Ｉ¹²⁵との
最大インキュベーションを有し、それゆえに最も高い結
合百分率を有した。同時的および逐次的検定法における
反応時間(４時間)が同じであっても、ＧＨＢＰに対する
ＧＨ-Ｉ¹²⁵の錯化は不均一系(逐次)に対して均一系(同
時)の方が速く、従って結合率がより高くなろう。

【００２２】ＧＨＢＰを飽和させるために用いるＧＨ
は、ＧＨＢＰに対する特異的結合部位と１またはそれ以
上のＧＨ特異的抗体を結合するための暴露されたエピト
ープがあるＧＨ類縁体であってもよい。

【００２３】ＧＨＢＰ検定法の応用 ＧＨＢＰとＧＨによるＧＨＢＰの飽和度の検定結果を成
長欠損症の診断と治療に用いることができる。この検定
法はＧＨに対する生物の暴露の統一した指標を提供する
と考えられる。これは全ＧＨおよび遊離のＧＨのより正
確な決定を提供し、これにより相対的にＧＨが欠乏して
いる患者がよりよく同定され、ＧＨ置換療法の利益が得
られるであろう。一般に、臨床的状態を治療するために
ＧＨが治療的に投与されたり、あるいはＧＨが過剰に存
在して臨床的病態生理を引き起こすか反映することに関
わっている状況下では、本検定法が価値を有するであろ
う。その結果は、ＧＨ置換療法でのコンプライアンスを
評価する方法、投与量を滴定する方法、個々の患者もし
くはＧＨ欠乏または過剰の特定の臨床的顕示を伴う人々
についてＧＨ療法を個別化する方法の改善を提供する。

【００２４】これらの検定結果を使用することにより、
遺伝的または後天的症候群などＧＨＢＰまたはＧＨ受容
体の量あるいは結合活性の減少に起因するＧＨ作用に対
する耐性の診断が容易になる。ラロン(Laron)矮小症や
特発性低身長などの他の低身長の症候群を含む遺伝的症
候群は、ＧＨＢＰの異常性が存在することが示された時
に明らかになる。本発明は、肝臓疾患などＧＨＢＰ発現
の減少や過剰発現が存在する病的状態を含む後天的症候
群の同定と治療にも助けとなる。本検定発明の他の使用
例には、卵巣機能の疾患、関節または骨の疾患、あるい
は過剰なＧＨまたはＧＨＢＰ生産をもたらす視床下部ま
たは下垂体の疾患の検出が含まれる。治療剤としてのＧ
ＨＢＰ／ＧＨ錯体またはＧＨＢＰの臨床的使用は本発明
によって援助される。なぜなら、それらの投与後のＧＨ
ＢＰまたはＧＨＢＰ＋ＧＨの測定は、体液中の治療的に
有効な、あるいは治療的に無効な量の存在の決定を可能
にすることによって、医療を助けるからである。

【００２５】成長促進系のすべての部分が相互に関係し
ており、成長ホルモン放出因子、成長ホルモン阻害因子
(ソマトスタチン)、ＩＧＦ-１、またはＩＧＦ-１結合タ
ンパク質を投与することはＧＨＢＰ濃度を混乱させるで
あろうと予期される。ＧＨＢＰの測定は、これらのタン
パク質による治療とそのような治療の効率について患者
の適性を評価する上で医療を援助する。

【００２６】ＧＨＢＰ検定の臨床的応用 ＧＨＢＰの我々の理解の進展には迅速、便利でかつ正確
なＧＨＢＰの検定法が必要である。ＧＨＢＰについて記
述した最初の報文は１９６４年に刊行された(Haddenら,
Nature 202:1342[1964])。１９７７年には血清ＧＨ-結
合タンパク質がマウスでよりよく特徴づけられ(Peeter
s,S.及びFriesen,H.G.,Endocrinology 101:1164[197
7])、１９８６年には２つのグループがＧＨに関するヒ
ト血清結合タンパク質の存在をさらに特徴づけた(Bauma
nn,G.ら,J.Clin.Endocrinol.Metab.62:134-141[1986]；
Herington,A.C.ら,J.Clin.Invest.77:1817-1823[198
6])。ＧＨＢＰがウサギで精製され、特徴づけられた時
に、そのアミノ末端３７残基がウサギ肝臓ＧＨ受容体の
細胞外部分のそれと同一であることが示された(Spencer
ら,J.Biol.Chem.263:7862-7867[1988])。ＧＨＢＰがこ
の膜受容体からタンパク質加水分解的切断によって誘導
されるか(Trivedi及びDaughaday,Endocrinology 123:22
01[1988])、もしくは全長ＧＨ受容体と同じ遺伝子から
誘導される独立したｍＲＮＡから生産されること(Smith
ら,Mol.Endo.P984[1989]；Baumbachら,Genes and Dev.
3:1199[1989])が示唆されている。人間におけるＧＨＢ
Ｐ活性の個体発生の研究(Daughadayら,J.Clin.Endocrin
ol.Metab.65:1072-74[1987])と妊娠マウスにおけるＧＨ
ＢＰと肝臓ＧＨ受容体の濃度の変化(Smith及びTalamant
es,Endocrinology 123:1489-94[1988])は、血清ＧＨＢ
ＰレベルがＧＨ受容体活性の周辺指標で有り得ることを
示唆している。

【００２７】ＧＨＢＰレベルがＧＨ受容体活性を反映す
るというこの考えは、機能的なＧＨ受容体の欠失によっ
て引き起こされる症候群であるラロン型矮小症患者が、
血清中のＧＨ結合活性をも欠くという発見によって支持
される(Daughaday及びTrivedi,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
84:4636-40[1987]；Baumannら,J.Clin.Endocrinol.Met
abol 65:814-816[1989]；Laronら,Acta Endocrinologic
a (Copenhagen) 121:603-608[1989])。ラロン型矮小症
の幾人かの患者のなかで、ＧＨ受容体遺伝子の部分的欠
失によって異常が引き起こされているという指摘があり
(Godowskiら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8083-8087[19
89]；Anselemら,New England J.Med.321:989-95[198
9])、これがＧＨを結合できないゆえの成長不全症をも
たらし得よう。この型の異常性に関して、我々の検定法
は特に有用である。というのは、いくつかの免疫検定法
とは対照的に、我々の検定法は不活性なタンパク質を検
出しないからである。ラロン矮小異種接合体では血清Ｇ
Ｈ結合容量が減少しており、血清中のｈＧＨＢＰレベル
の測定は遺伝学的なカウンセリングの助けとなり得よう
(Laronら,前出)。

【００２８】ＧＨＢＰの生理学的役割については殆どわ
かっていないが、最近の研究は、この結合タンパク質が
成長ホルモンの効果を変化させ得ることを示している。
ＧＨＢＰがＧＨの分布と半減期を変化させることが立証
されており(Baumannら,Metabolism 38:330-333[198
9])、またＧＨの標的細胞上のその受容体との相互作用
にＧＨＢＰが影響を与えることを示唆する証拠もある(L
imら,Endocrinology 1276:1287[1990])。大腸菌中で生
産された組換えｈＧＨＢＰが、ＧＨ欠損ラットに与えた
場合に、ｈＧＨの成長促進効果を増進することが最近に
なって示されており、このことはＧＨＢＰがヒトの身体
成長の調節において重要な役割を果たし得ることを示し
ている(実施例５を参照のこと)。

【００２９】本発明のＬＩＦＡを用いて患者の生物学的
液体中のＧＨＢＰ濃度を監視することにより、常軌を逸
した濃度を検出する。実施例５、６および７では本検定
法の数多くの応用を用いてヒトＧＨＢＰのみ、およびｈ
ＧＨと錯化したヒトＧＨＢＰの活性を監視し、評価す
る。これらの薬学的応用には、精製、投与量、投与の頻
度および循環系中での持続時間が含まれる。また、大腸
菌、２９３細胞または天然の組織供給源など異なる供給
源から得られるｈＧＨＢＰの活性を監視するためにもＬ
ＩＦＡを用いる。

【００３０】ＬＩＦＡは霊長類中でのｈＧＨＢＰ作用の
薬学的評価に応用される。ｈＧＨＢＰはｈＧＨと錯化し
ていても、錯化していなくても、投与量と投与の頻度を
改善するために霊長類中で監視することができる。

【００３１】霊長類において 現在使用されている投与量と類似するＧＨ投与量を用い
て頻繁でないＧＨ注射を行い、それでも成長応答を維持
することができるというＧＨＢＰの能力は、臨床的に有
意義である。ＬＩＦＡを用いたサルにおける実験では、
(上述の形態の１つ、または修飾型の)ＧＨＢＰ＋ＧＰ錯
体のクリアランス(清掃率)が霊長類において遅延するこ
とが立証されている。ＧＨＢＰに結合している注射され
たＧＨのクリアランスは我々がラットにおいて観察した
程度と同程度に遅くなる。このことは、霊長類において
ｈＧＨＢＰに錯化したｈＧＨを投与することの改善され
た成長促進活性を立証している。

【００３２】霊長類では、ヒトを含めて、ＧＨＢＰ錯体
を頻繁でない間隔(２日以上に１回、より好ましくは７
日以上に１回)で、１〜２日おきまたは毎日１週間また
はそれ以上の間ＧＨ単独を注射する場合と比較して効能
を失うことなく、与えることができる。さらに、ＧＨと
錯化したＧＨＢＰまたは単独を、ＧＨのみと比較してよ
り低い全週用量で与えるであろう。例えばＧＨの糖尿病
誘発および液体維持特性などＧＨ処置の望ましくない副
作用はＧＨＢＰの使用により軽減されるであろう。ＧＨ
-ＧＨＢＰ錯体を用いる有益な効果は、増大したＩＧＦ-
１応答およびＧＨを優先的に骨に誘導するというＧＨＢ
Ｐの能力を含めて他にもある。このことは、ＧＨ-ＧＨ
ＢＰ錯体を骨粗鬆症の予防および治療を含む骨障害の治
療に使用することを可能にする。各状況においてＬＩＦ
Ａを用いて反応の進行を監視する。投与量、製剤並びに
ｈＧＨＢＰの使用および製造法は米国特許第５０５７４
１７号に記述されている。

【００３３】常軌を逸した量のＧＨＢＰ錯体を有する患
者群を定義するためにＬＩＦＡを用いるであろう。例え
ば、ＧＨの成長促進活性に対して比較的耐性のある成長
の遅い小児の副集合はＧＨＢＰが欠乏していることがわ
かるであろう。そのような小児にはターナー症候群の患
者、腎臓疾患、並びに、過去に特発性低身長を有すると
記述された結合タンパク質欠乏患者の一群が含まれる。
好適な経時的投与法を確立するために、ＧＨＢＰまたは
ＧＨＢＰ-ＧＨ錯体を皮下的に送達し、ＧＨＢＰ-ＧＨ錯
体の血液レベルをＬＩＦＡを用いて検定する薬物動態学
的研究がヒトで行われるであろう。血中のＩＧＦ-１濃
度の上昇を刺激するに足るＧＨ-ＧＨＢＰ錯体の投与量
が決定され、これらの投与量が身体成長を誘発するのに
必要なＧＨＢＰ-ＧＨ錯体の投与量を示すであろう。次
いで、骨成長を含む全身成長を刺激するというＧＨＢＰ
-ＧＨ錯体の能力を立証するために、ＧＨ耐性小児に関
する長期間の研究が開始されるであろう。ＧＨＢＰの血
液レベルを監視するためにＬＩＦＡが用いられるであろ
う。

【００３４】本発明の主要な応用は、ＧＨまたはＧＨＢ
Ｐ欠乏症の治療の前および間にＧＨＢＰの内因性レベル
を監視するためにＧＨＢＰ ＬＩＦＡを用いることであ
る。本発明の検定法は患者が受ける治療を支持するよう
機能する。血液中に検出し得るＧＨＢＰがない場合に
は、ラロン型症候群が存在し得、ＩＧＦ-１治療が必要
とされる。血中のＧＨＢＰが低レベルである場合には、
ＩＧＦ-１と共に、あるいはＩＧＦ-１なしで、追加のＧ
ＨまたはＧＨＢＰが必要とされ得る。どのような治療法
(ＧＨまたはＧＨ＋ＩＧＦ-１、またはＧＨ-ＧＨＢＰ錯
体治療)を設定するにせよ、治療に対するＧＨＢＰ応答
を決定するためにはＬＩＦＡが最も貴重であろう。血液
ＧＨＢＰ濃度はＧＨ治療の効能を従来の終点測定よりは
るかに迅速に反映するであろう。血液ＧＨＢＰレベルの
応答の欠如は代替的な治療法を考慮するための迅速な診
断手段として使用されるであろう。

【００３５】ＬＩＦＡのもう１つの使用法は、内因性血
液ＧＨの生物学的活性を検出することである。この検定
法では一定量のＧＨＢＰの添加とそれに続くＧＨで飽和
しない試料の添加を使用する。高い免疫反応性を有する
が、ＧＨの免疫機能的濃度が低い患者が検出されるであ
ろうと予期される。あらゆる試料中の生物活性ＧＨの量
を測定するため、特に組換えＧＨのバッチをそれらの生
物学的活性について試験するために、同様の検定形式を
用いることができる。

【００３６】ＧＨＢＰ検定法を逆転させてＧＨを検定す
ることができる。捕捉抗体がＧＨを結合し、ＧＨＢＰが
錯化され、指標抗体は結合したＧＨＢＰに特異的であ
る。これは、ＧＨのみまたは天然のＧＨＢＰと錯化した
ＧＨの検定を可能にする。

【００３７】本発明の実施様式 本発明は生物学的液体中のあらゆる既知のポリペプチド
ホルモン結合タンパク質を測定するために使用すること
ができる。同様に、新しいホルモン結合タンパク質が発
見された時にはそれらを用いて使用することもできる。
本発明検定法の好ましい結合タンパク質標的のなかに
は、次のものがある：あらゆる成長ホルモン結合タンパ
ク質、表皮成長因子結合タンパク質、インスリン様成長
因子結合タンパク質、インスリン結合タンパク質、コル
チコトロピン放出因子結合タンパク質、神経成長因子結
合タンパク質、形質転換成長因子ベータ結合タンパク質
およびアクチビン結合タンパク質。本発明の検定法を用
いるこれら各結合タンパク質の検出にはそれぞれのリガ
ンドポリペプチドホルモンを用いて結合タンパク質上の
ホルモン結合部位を飽和させる必要がある。ポリペプチ
ドホルモンは天然の供給源から精製されたものであって
もよいし、固相タンパク質合成によって製造されたもの
であってもよいし、組換え法で製造されたものであって
もよい。使用される好ましいリガンドポリペプチドホル
モンのなかには成長ホルモン、表皮成長因子、インスリ
ン様成長因子-１、インスリン様成長因子-２、神経成長
因子、インスリン、コルチコトロピン放出ホルモン、形
質転換成長因子ベータおよびアクチビンがある。好まし
い結合タンパク質とポリペプチドホルモンはそのような
タンパク質を自身の生物学的液体中に有するあらゆる動
物から得ることができる。生物学的液体は、血清、血
漿、リンパ液、骨液、濾胞液、精液、羊水液、乳、全
血、尿、骨髄液、唾液、涙、発汗、粘膜、組織培養培
地、組織抽出物および細胞抽出物などあらゆる水性液体
であり得る。

【００３８】媒質のｐＨは通常約４〜１１の範囲であ
り、より通常には約５〜１０の範囲であり、好ましくは
約６.４〜９.５の範囲である。ｐＨはポリペプチドホル
モンおよびＨＢＰによる特異的結合の有意なレベル、抗
体の結合および検出可能なラベルの必要条件が維持され
るように選択される。ある場合には、これら３つの考慮
の間で妥協が行われるであろう。所望のｐＨを達成し、
検定測定の間そのｐＨを維持するためには様々な緩衝液
を使用することができる。緩衝液の例にはホウ酸塩、リ
ン酸塩、炭酸塩、トリス、バルビタールなどが含まれ
る。使用する特定の緩衝液は本発明にとって重要ではな
いが、個々の検定ではある緩衝液が別の緩衝液より好ま
しいこともある。

【００３９】本検定法を実行するには穏やかな温度が通
常使用され、通常は検定時間中一定温度に保たれる。測
定のための温度は一般に約４°〜５０℃の範囲であり、
より通常には１５°〜４０℃の範囲である。

【００４０】検定され得るＨＢＰの濃度は一般に約１０
^-4〜１０^-15、より通常には約１０^{- 6}〜１０^-13Ｍの範囲
で変化するであろう。様々な試薬の濃度は一般にＨＢＰ
の目的の濃度範囲によって決定されるが、各試薬の最終
濃度は通常、目的の範囲にわたって検定の感度が最適化
されるよう経験的に決定されるであろう。

【００４１】ｈＧＨと錯化した、あるいは錯化していな
いｈＧＨＢＰの臨床的投与を監視するためにＬＩＦＡを
使用することができる。本検定法の好ましい使用は、哺
乳類の成長と同化作用を促進する方法であって、(ａ)成
長ホルモンによって誘発される応答を促進するのに必要
な成長ホルモン結合タンパク質の量を決定し、(ｂ)該誘
発される応答が欠乏していると疑われる人の生物学的液
体中に存在する成長ホルモン結合タンパク質の量をＬＩ
ＦＡで測定し、(ｃ)(ａ)と(ｂ)を比較して、もし(ａ)が
(ｂ)より大きければ成長ホルモン結合タンパク質のレベ
ルを該至適量まで増大させるに足る量の成長ホルモン結
合タンパク質を投与することからなる方法における使用
である。ＬＩＦＡ法のもう１つの好ましい臨床的応用
は、体重増加、骨成長、筋肉の成長および機能、器官の
成長および機能、皮膚成長、およびＩＧＦ-１のレベル
など、成長ホルモンによって誘発される応答を監視する
ことである。成長と機能が刺激される器官は胸腺、腎
臓、肝臓、脾臓、脳、心臓、肺または性腺であり得る。
本ＬＩＦＡ法のさらにもう１つの応用は、成長促進量の
成長ホルモン結合タンパク質-成長ホルモン錯体の注射
の頻度を減らす方法であって、(ａ)至適成長を維持する
のに必要な成長ホルモン-成長ホルモン結合タンパク質
錯体の最小必要限度の血清レベルを決定し、(ｂ)成長ホ
ルモン結合タンパク質-成長ホルモン錯体が欠乏してい
ると疑われる患者中に存在する成長ホルモン結合タンパ
ク質のレベルをＬＩＦＡによって測定し、もし(ｂ)での
錯体レベルが(ａ)でのレベルより低い場合には、(ｃ)２
日より長い期間錯体のレベルを維持するに足る量の成長
ホルモン結合タンパク質-成長ホルモン錯体を投与する
ことからなる方法への応用である。上記期間は２〜１４
日、より好ましくは２〜８日、最も好ましくは３〜７日
であり得る。成長ホルモン結合タンパク質の至適量は健
康な個体に認められる平均レベルの９０％以上と定義さ
れる。

【００４２】抗体 ポリクローナル抗体を使用することもできるが、好まし
い抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗
体は高度に特異的であり、単一の抗原性部位に対して指
向する。本発明で使用される抗体はポリペプチドホルモ
ンのホルモン結合タンパク質との結合を妨害または遮断
しないエピトープに対して特異的でなければならない。
したがって、捕捉またはコート抗体は、ホルモン結合部
位がホルモン結合のために利用できるようにしておく結
合タンパク質上のエピトープに結合しなければならな
い。同様に検出抗体は、ホルモン結合タンパク質に対す
るポリペプチドホルモンの結合後にまだ暴露されて残っ
ているポリペプチドホルモンエピトープに対して特異的
でなければならない。これらの抗体は当業者が一般に利
用できる方法によって調製することができる。ポリクロ
ーナル抗体の生産法は、DavisらによるMicrobiology(第
3版，Harper & Row，New York，1980)など数多くの免疫
学の教科書に記述されている。

【００４３】モノクローナル抗体はKohler及びMilstei
n,Eur.J.Immnol.,6:511(1976)によって最初に記述され
た方法によって生産することができる。本発明はマウス
モノクローナル抗体を用いて立証されるが、本発明はそ
のように限定されるものではなく、どのような動物種か
ら得られるモノクローナルも本発明の検定法で機能する
であろう。実際、本検定法ではキメラ抗体も機能するで
あろう。キメラ抗体は米国特許第４８１６５６７号；Mo
rrisonら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851(1984)；Neu
bergerら,Nature 312:60481984)；Takedaら,Nature 31
4:452(1985)に記述されている。キメラ抗体は、適当な
抗原特異性を有するマウス抗体分子から得られる遺伝子
を第２の抗体をコード化する別の動物から得られる遺伝
子と接合することによって作成される。同様に、モノク
ローナル抗体もしくはモノクローナル抗体の抗原結合領
域(Ｆａｂや(Ｆａｂ)₂断片など)を組換え法によって生
産することができる。キメラ抗体と組換え抗体または抗
体断片は共に本発明の検定法で使用することができる。

【００４４】モノクローナル抗体はＩｇＡ、ＩｇＤ、Ｉ
ｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含む抗体のあらゆるクラス
またはサブクラスに属することができる。Ｆａｂ、Ｆ
ｖ、(Ｆａｂ)₂などのように抗体の活性に結合する断片
を使用することもできる。モノクローナル抗体は、その
抗体サブユニットを発現させているＢ-リンパ球遺伝子
の不死化を提供する従来な手段、例えば感作リンパ球と
骨髄融合相手の融合、形質転換(例えばエプシュタイン-
バールウイルス(ＥＢＶ)による形質転換)または他の不
死化技術などによって調製することができる。別法とし
て、抗体を発現させているリンパ球宿主から遺伝子を単
離し、公知の遺伝子工学技術に従って、より便利な宿主
に移すこともできる。

【００４５】これらの抗体は便利な脊椎動物供給源、例
えばネズミ、霊長類、ウサギ目、ウシ、ヒツジ、ウマ、
イヌ、ネコまたはブタなどから得ることができる。抗体
は、抗原に感作した宿主から得られる脾臓細胞を公知の
技術に従って融合させるか、もしくはその細胞を不死化
させるために適当な形質転換ベクターでその脾臓細胞を
形質転換することによって調製されることが多い。これ
らの細胞を選択培地中で培養し、クローン化し、スクリ
ーニングすることによって指定した抗原を結合するモノ
クローナル抗体を選択すことができる。

【００４６】捕捉抗体と検出抗体に関する抗体を生産す
るために用いる方法はそれぞれの免疫原(結合タンパク
質もしくはポリペプチドホルモン)を投与し、抗体を引
き出すことによって都合よく製造され得る。好ましい抗
体はモノクローナル抗体である。次いで、生産された抗
体をスクリーニングすることにより、ポリペプチドホル
モンと結合タンパク質との間の結合反応を妨害しない好
ましい抗体を決定する。ｈＧＨＢＰに結合した時にｈＧ
Ｈを検出するための好ましいモノクローナル抗体はマウ
スハイブリドーマによって生産された(Cunninghamら,Sc
ience(1989) 243:1330-1336)。捕捉またはコート抗体と
して使用した抗ｈＧＨＢＰモノクローナル抗体は市販さ
れているか(Agen Inc.,ニュージャージー州07054パルシ
パニュ、イースト・ハルセイ・ロード90番)、もしくはｈＧ
ＨＢＰを免疫原として用い、上述のように抗体をスクリ
ーニングすることによって作成することができる。

【００４７】現在では抗原に対する抗体を調製すること
が比較的簡単であるので、本発明の好ましい態様ではＨ
ＢＰを捕捉するための固相に結合したモノクローナルま
たはポリクローナル抗体を使用する。特定のＨＢＰを様
々な固相基質(例えばフィルターやプラスチックなど)に
結合させる技術はよく知られており、ここに詳しく記述
する必要はない。例えば米国特許第４３７６１１０号と
そこに引用されている文献を参照のこと。より好ましい
一般的固相支持体のなかには、ポリエチレン、ポリスチ
レン、ポリプロピレンもしくは他の好適な材料で作られ
た試験管、プラスチックビーズ、または小シートがあ
る。紙、アガロース、架橋デキストランおよび他の多糖
などの粒子状材料も有用である。

【００４８】異好性抗体による妨害 ＨＲＰＯ複合ＭＣＢとＨＲＰＯ複合マウスポリクローナ
ル抗体を用いるＧＨＢＰ検定で得られる結果を比較した
ところ、１つのヒト血清試料がＭＣＢ複合体で検出した
時にはるかに高いＧＨＢＰレベルを示した。この不一致
が異好性抗原によるものであるかどうかを試験するため
に、精製したマウスＩｇＧ(ｍＩｇＧ)０.５ｍｇ／ｍｌ
を試料緩衝液中に加えた。その結果は、ＭＡｂ複合体で
検定した時にはｍＩｇＧが試料番号６中の信号を３８４
ｐｍｏｌ／Ｌから２１５ｐｍｏｌ／Ｌに減少させるが、
２つの対照試料中でＧＨＢＰ濃度は変化しない(ｍＩｇ
Ｇの存在下および非存在下でそれぞれ３２３対３３８、
９２対１１１)ことを示した。これらの結果は、非特異
的結合をｍＩｇＧで遮断すれば、２つの異なる複合抗体
が実質上同じであることを示している。

【００４９】サンドイッチ型免疫測定法は試料中の異好
性抗体による陽性妨害を受ける。これは、ヒト血清試料
中のヒト抗マウス抗体によって引き起こされる。このよ
うな異好性抗体はコートおよび複合マウス抗体を架橋す
る。非免疫化動物から得られる免疫グロブリン(ここで
はＨＢＰまたはリガンドホルモンに対する)を検定系に
加えて試料中の異好性抗体を遮断すれば、異好性抗体に
よる妨害を軽減または除去することができる。実際に、
ＧＨＢＰ濃度の不一致はマウスＩｇＧを検定緩衝液に加
えた時に除去された。このことは、複合ＭＡｂを使用し
た時に検出された非特異的な信号がこの対象から得た血
清中の抗マウスＩｇＧ抗体の存在によるものであること
を示した。どの試料がこの種類の妨害を示すかはわから
ないので、検定の第１段階で常にマウスＩｇＧを含ませ
ることが最適である。

【００５０】ハイブリドーマの寄託 抗ｈＧＨ抗体を生産するハイブリドーマ細胞系は、１９
９０年１１月９日にアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション(ＡＴＣＣ)(米国メリーランド州ロックビ
ル、パークローン・ドライブ１２３０１番)に寄託さ
れ、ＡＴＴＣ登録番号ＨＢ-１０５９６を有するＨＧＨ-
Ｂである。この寄託は特許手続上の微生物の寄託の国際
的承認に関するブタペスト条約およびそれに基づく規則
(ブタペスト条約)の規定に基づいて行われた。これは寄
託の日から３０年間、生存できる培養の維持を保証する
ものである。この細胞は、当該米国特許の発行時または
米国または他国の特許出願の公開時にいずれが最初にな
っても公衆に対してその培養の子孫の永続する無制限の
利用可能性を保証し、３５ＵＳＣ１２２とそれに準ずる
長官規則(８８６ＯＧ６３８に対する特別な参照を伴う
３７ＣＦＲ１.１２を含む)に従って与えられるべき特許
商標庁長官によって決定された者に対するその子孫の利
用可能性を保証する、ジェネンテク,インコーポレイテ
ッドとＡＴＣＣの合意を受けて、ブタペスト条約の約定
の下にＡＴＣＣによって利用可能にされるであろう。

【００５１】本願の出願人は、適当な条件下で培養され
た時に寄託された培養が死滅するか、失われるか、ある
いは破壊された場合、その通知時に直ちに、同じ培養の
生存できる標本と交換することを合意している。寄託さ
れた株の利用可能性を、あらゆる政府の機関の下にその
特許法に従って認可された権利に違反する本発明の実施
に対する許諾であるとみなすべきではない。

【００５２】検出可能なマーカー 共有結合させ得る抗体上の検出可能なマーカーまたはラ
ベルには、酵素、放射性同位体、蛍光物質または米国特
許第４２７５１４９号の１９欄から２８欄にかけて、お
よび米国特許第４３１８９８０号の１０欄から１４欄ま
でに記述されているような他の測定可能な標識など好適
な指標が含まれる。特に興味深いのは、過酸化水素の産
生と色素前駆体の色素への酸化にその過酸化水素を使用
することが関与する酵素である。特定の組み合わせに
は、色素前駆体の酸化に過酸化水素を使用する酵素(即
ち西洋ワサビペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダー
ゼ、またはミクロペルオキシダーゼなどのペルオキシダ
ーゼ)と組み合わされた糖酸化酵素(例えばグルコースお
よびガラクトースオキシダーゼ)または複素環酸化酵素
(例えばウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ)が含
まれる。好ましい酵素のなかには次のものがある：西洋
ワサビペルオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルカリ
性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、およびベ
ータ-Ｄ-ガラクトシダーゼ。

【００５３】別の酵素の組み合わせは引用した文献に開
示された主題に認められるであろう。一つの酵素をラベ
ルとして使用する場合には、他の酵素、例えば加水分解
酵素、転移酵素、酸化還元酵素、好ましくはアルカリ性
ホスファターゼやベータ-ガラクトシダーゼなどの加水
分解酵素を使用し得る。別法として、ホタルルシフェラ
ーゼや細菌性ルシフェラーゼなどのルシフェラーゼも使
用できる(米国特許第４７３７４５６号)。

【００５４】リガンドホルモンに特異的な抗体の使用
後、結合した指標の活性を測定することにより結合した
抗体の量を決定する。酵素の場合、発色し測定される色
の量は存在するホルモンまたはホルモン結合タンパク質
の量の直接的な測定となるであろう。酵素を含むこのよ
うな標識の本明細書に記載の抗体への複合体化は免疫検
定技術の当業者にとっては標準的な操作法である。例え
ばMethods in Enzymology(J.J.Langone及びH.Van Vunak
is編,アカデミック・プレス,ニューヨーク,73巻,147〜16
6頁のO'Sulivanら(1981)「酵素免疫検定で使用する酵素
-抗体複合体の調製法(Methods for Preparation of Enz
yme-Antibody conjugates for use in Enzyme Immunoas
ay)」を参照のこと。

【００５５】キット 利便性の問題として、本発明の検定法をキット(即ち、
ポリペプチドホルモン結合タンパク質を検定するため、
および／または、リガンドポリペプチドホルモンによる
相対的飽和を決定するための試料(単数または複数)と組
み合わせるために他の試薬と共に梱包された組み合わ
せ)として提供することができる。キットの成分は予め
決定された比率で提供されるであろう。このキットは捕
捉抗体のための特定の担体固相、担体固相と分離した、
あるいは担体固相に結合した捕捉抗体、リガンドホルモ
ン(好ましくは組換え体)、および検出可能なラベルを含
有する検出抗体を含むであろう。検出可能な抗体が酵素
である場合には、その酵素が必要とする基質および補因
子、発蛍光団の検出可能な発色団を提供する色素前駆体
がキットに含まれるであろう。さらに安定化剤、緩衝液
などの他の添加剤が含まれていてもよい。様々な試薬の
相対的な量は広く変化して、検定の感度を実質上最適化
する試薬の溶液中の濃度を与える。特に、賦形剤を含め
て乾燥粉末として、通常は凍結乾燥物として試薬を提供
することができ、これは溶解時に試験すべき試料と混合
するのに適当な濃度を有する試薬溶液を与えるであろ
う。

【００５６】定義と略号 捕捉(コート)抗体：抗体の結合がホルモン結合タンパク
質に対するリガンドポリペプチドホルモンの結合を妨害
しないような、ホルモン結合タンパク質のエピトープに
特異的な抗体。抗体を固相に結合し、これを用いて結合
タンパク質に選択的に結合し、溶液からの結合タンパク
質の除去を容易にする。 検出抗体：ポリペプチドホルモン上のエピトープに特異
的な、検出可能なマーカーでラベルされた抗体であっ
て、それ自体が検出可能なマーカーである抗体。 ＨＢＰ：ホルモン結合タンパク質：リガンドポリペプチ
ドホルモンに対して親和性を有し、結合したリガンドポ
リペプチドホルモンの担体として作用する生物学的液体
中に認められる担体タンパク質。 ｈＧＨ：ヒト成長ホルモンであって、２２ｋｄ、２０ｋ
ｄ、胎盤変異種(ＧＨＶ)、および組換え法によって生産
される変異種(Cunninghamら,Science81989)243:1330-13
36)を含む。 ＧＨＢＰ：成長ホルモン結合タンパク質。 ｈＧＨＢＰ：ヒト成長ホルモン結合タンパク質。 ＨＰＢ：ホルモン結合タンパク質。 ＧＨ：成長ホルモン ＭＡｂ：モノクローナル抗体。 ＭＣＢ：マウスハイブリドーマＨＧＨ-Ｂによって生産
されるモノクローナル抗体Ｂ。 ＨＲＰＯ：西洋ワサビペルオキシダーゼ。 ＢＳＡ：牛血清アルブミン。 ＬＩＦＡ：リガンド媒介免疫機能的検定法。

【００５７】ＧＨＢＰの精製 使用するＧＨＢＰの精製は従来のＥＬＩＳＡを用いて監
視する(Fuh,G.ら,J.Biol.Chem.265,3111-3115[1990])。
本発明のＬＩＦＡは、このような精製中の機能的な結合
タンパク質の存在と量を検定するより良い検定法を提供
する。ＬＩＦＡは免疫学的に活性な結合タンパク質では
なく機能的に活性な結合タンパク質が精製されることを
確実にする。ｈＧＨＢＰの貯蔵中に、ＬＩＦＡを用い
て、時間と共に活性型で残っている機能的なＧＨＢＰの
量を追跡する。本検定法のこの特性は長期間にわたる貯
蔵の間ＧＨＢＰの安定性に関する制御必要条件を満たす
のに大きな助けとなる。

【００５８】材料と方法コートＭＡｂの選択 ウサギ肝臓成長ホルモン受容体に対する４つのモノクロ
ーナル抗体ＭＡｂ１、２、５および７はM.Waters博士
(クイーンズランド大学,オーストラリア・クイーンズラ
ンド)から提供を受け、別の２つのＭＡｂ(４３および２
６３)はオーストラリアのAgenから購入したマウス腹水
から精製した。イムロンIIリムーバウェル(Immulon II
removawell)(Dynatech Laboratories,Inc.,バージニア
州アレキサンドリア)を、５０ｍｍｏｌ／リットル炭酸
塩緩衝液ｐＨ９.６(コーティング緩衝液)中５μｇ／ｍ
Ｌで１ウェルあたり１００μＬの抗体と共に４℃で終夜
インキュベートすることにより、これらをコートした。
コーティング溶液を除去した後、被覆プレート上の非特
異的結合部位を牛血清アルブミン(ＢＳＡ)５ｇ／リット
ルを含むリン酸緩衝等張食塩水ｐＨ７.２(ＰＢＳ)(遮断
緩衝液)１５０μＬのを用いて室温で１時間遮断した
後、洗浄緩衝液(ＰＢＳ１リットルあたり０.５ｍＬのツ
ウィーン２０と０.１ｇのチメロサール)で３回洗浄し
た。固定化したＭＡｂを３つの異なる実験で評価した。
第１の実験では逐次的なインキュベーション段階を用い
て、まずＧＨＢＰをウェル上にコートしたＭＡｂと共に
インキュベートし、その後に放射性標識ＧＨ(ＧＨ-Ｉ
¹²⁵)を添加した。第２の実験ではＧＨＢＰとＧＨ-Ｉ¹²⁵
の反応をＭＡｂ被覆ウェル中で同時に行った。第３の実
験ではＧＨＢＰをｈＧＨ-Ｉ¹²⁵と４℃で終夜予備インキ
ュベートし、次いで、ＭＡｂ被覆ウェルに加えた。３つ
の実験すべてにおいて、反応混合物中のＧＨＢＰ溶液を
インキュベーション緩衝液(１リットルあたりに５ｇの
ＢＳＡ、０.５ｍＬのツウィーン２０および０.１ｍＬの
チメロソールを含むＰＢＳ)と置換することにより、ト
レーサーの非特異的結合を決定した。

【００５９】逐次的検定 逐次的なインキュベーション実験では、１００μＬのＧ
ＨＢＰ(２.５ｎｇ／１００μＬ)を固定化ＭＡｂと２時
間反応させ、洗浄緩衝液で洗浄し、ＧＨ-Ｉ¹²⁵(２００
００ｃｐｍ／１００μＬ)と共に室温で４時間インキュ
ベートした。ウェルを洗浄緩衝液で６回洗浄し、吸着紙
に完全に吸い取り、ＬＫＢシリーズ１２７７ガンマ計数
器(Pharmacia LKB Nuclear Inc.,メリーランド州ガイサ
ースブルク)で１分間計数した(図６)。

【００６０】同時検定 同時インキュベーション実験では、インキュベーション
緩衝液中の２.５ｎｇ／５０μＬのＧＨＢＰ５０μＬと
インキュベーション緩衝液中の２００００ｃｐｍ／５０
μＬのＧＨ-Ｉ¹²⁵５０μＬを各ウェル中室温で４時間イ
ンキュベートした。ウェルを洗浄し、吸い取り、上述の
ように計数した。

【００６１】予備インキュベーション検定 予備インキュベーション実験では、インキュベーション
緩衝液中の２.５ｎｇ／５０μＬのＧＨＢＰ１５０μＬ
とインキュベーション緩衝液中の２００００ｃｐｍ／５
０μＬのＧＨ-Ｉ¹²⁵を試験管内で４℃で終夜インキュベ
ートした。次にこの反応混合物をＭＡｂ被覆ウェルに加
え(１ウェルあたり１００μＬ)、室温で４時間インキュ
ベートした。ウェルを洗浄し、吸い取り、上述のように計
数した。

【００６２】酵素複合抗ｈＧＨ抗体 抗ｈＧＨ検出ＭＡｂを複合化のために選択した。なぜな
らそれはＧＨＢＰの検出可能な置換を与えず、ＧＨＢＰ
と重複しない決定基を含有するからである(Cunningham
ら,Science 243:1330-1336[1989])。確立された手法(Ey
ら,Immunochem.15:429[1978])；Goding,J.W.,J.Immuno
l.Meth.20:241[1978])に従ってプロテインＡ-セファロ
ース(Repligen Corp.マサチューセッツ州ケンブリッジ)
を用いて抗体を腹水から精製し、０.０１Ｍリン酸ナト
リウム、０.１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７.２(ＰＢＳ)
中４℃で滅菌的に保存した。精製したＭＡｂを西洋ワサ
ビペルオキシダーゼに複合体化し(NakaneおよびKawaoi,
J.Histochem.Cytochem.22:1084[1974])、５０％グリセ
ロール中−２０℃で保存した。

【００６３】ＬＩＦＡ検定標品 Spencerらが概略を記した方法(J.Biol.Chem.263:7832-7
867[1988])に従って、組換えヒト成長ホルモン結合タン
パク質(ＧＨＢＰ)を哺乳類細胞系から精製した。定量的
アミノ酸分析によって決定した精製ＧＨＢＰのアミノ酸
組成はクローン化した遺伝子産物について理論的に予期
されるものと一致した。ＳＤＳゲル電気泳動の分析によ
れば精製したＧＨＢＰは均一であった。精製調製物中の
ＧＨＢＰ濃度をスカチャード分析(Scatchard,G.,Annals
of the New York Academy of Science 51:660-672[194
9])によって確立した後、１リットルあたり５ｇのＢＳ
Ａ、５.０ｍＭ ＥＤＴＡ，０.５ｍｌのツウィーン２０
および０.１ｇのチメロサールを含むＰＢＳ(検定緩衝
液)中のこの試料の希釈液をＬＩＦＡの標品として使用
した。大腸菌中で生産したＧＨＢＰをも使用したが、意
外なことに検定系で非平行希釈曲線を与えることがわか
った。したがって、好ましいＧＨＢＰは天然のＧＨＢＰ
か、もしくは天然の立体配置にある(即ちグリコシル化
された)ＧＨＢＰを生産する細胞によって生産されたＧ
ＨＢＰである。

【００６４】組換えヒトＧＨ 組換えヒト成長ホルモン(ＧＨ)はGenentech,Inc.(米国
カリフォルニア州サウス・サン・フランシスコ)から供給
された。

【００６５】血清および血漿試料 血清および血漿(ＥＤＴＡ、クエン酸塩および抗凝固剤
としてのヘパリン)試料を健康な成人ボランティア(９人
の男性と７人の女性で２６〜４３歳)から得た。これら
の試料を遠心分離し、検定するまで−７０℃で保存し
た。

【００６６】ＧＨＢＰ評価後の治療的処置 本発明の様々な目的について、「組成物」(ＧＨＢＰ＋
ＧＨ、ＧＨ、ＩＧＦ-Ｉ、ＩＧＦ-１＋結合タンパク質)
を哺乳動物または鳥類に非経口投与を含む適当な技術で
投与し、局部的または全身的に投与することができる。

【００６７】「組成物」は非経口的、鼻孔内または経口
的投与を含む適当な技術で哺乳動物に直接投与される。
特定の投与経路は例えば患者の医学的経緯(ｈＧＨまた
はＩＧＦ-Ｉのみを用いて感知されるかもしくは予期さ
れる副作用または同化作用の減少を含む)および修正さ
れるべき成長不全に依存するであろう。非経口投与の例
には皮下、筋肉内、静脈内、動脈内および腹膜内投与が
含まれる。最も好ましくは、(例えば浸透圧ポンプなど
のミニポンプを用いる)連続的注入か、例えば静脈内ま
たは皮下手段を用いる注射によって投与する。好ましく
は、「組成物」投与は皮下である。１回のボーラスとし
てか、あるいは徐放性デポー剤によって投与してもよ
い。最も好ましくは、ＩＧＦ-ＩまたはＩＧＦ-１＋結合
タンパク質を注入によって連続的に、最も好ましくは皮
下的に投与し、ＧＨＢＰ＋ＧＨまたはＧＨのみを毎日注
射によって皮下的に投与する。最も好ましくはＧＨＢＰ
＋ＧＨを２日またはそれ以上、毎週、２週間毎、または
毎月断続的に投与する。

【００６８】ＩＧＦ-Ｉはその結合タンパク質、例えば
１９８９年１０月５日に公開されたＷＯ８９／０９２６
８およびMartinおよびBaxter,J.Biol.Chem.,261:8754-8
760(1986)(これらは参考文献として本明細書の一部を構
成する)に記述されているＢＰ５３と共に好適に投与さ
れる。このタンパク質は、内因性ＩＧＦの大部分を保持
し、ＧＨによって調節されているヒト血漿中に認められ
る１２５〜１５０Ｋｄの糖タンパク質複合体のうち非還
元ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルで約５３Ｋｄの酸安定性成分で
ある。ＩＧＦ-Ｉは投与のために受容体または抗体また
は抗体断片とも好適に組み合わされる。同様に、ＧＨは
抗体、抗体断片、またはその結合タンパク質の１つなど
他の薬剤と組み合わされて送達され得る。

【００６９】治療に使用すべき「組成物」は、個々の患
者の臨床的状態(特にｈＧＨまたはＩＧＦ-Ｉのみでの処
置の副作用または連続的なＧＨ処置後の成長遅延)、
「組成物」の送達部位、投与方法、投与の日程、および
医師の知る他の因子を考慮して、よい医学に合致する様
式で製剤化され、投与されるであろう。このように、こ
こにおける目的にとっての各成分の「有効量」はこのよ
うな考慮によって決定され、治療される患者の同化成長
を増進する量でなければならない。

【００７０】一般的な提案として、一投与あたりに投与
される「組成物」の各成分の全医薬的有効量は、患者の
体重につき約１μｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日の
範囲であろうが、上述のように、これは治療的判断にゆ
だねられるところが大であろう。より好ましくはこの投
与量は各ホルモンについて少なくとも２μｇ／ｋｇ／日
であり、最も好ましくは少なくとも５μｇ／ｋｇ／日で
ある。連続的に与えられる場合、ＩＧＦ-Ｉ、ＩＧＦ-１
＋結合タンパク質、ＧＨＢＰ＋ＧＨおよびＧＨはそれぞ
れ典型的には約１μｇ／ｋｇ／時間〜約１００μｇ／ｋ
ｇ／時間の投与速度で、１日に１〜４回の注射によっ
て、あるいは例えばミニポンプを用いる連続的な皮下注
入によって投与される。静脈内バッグ溶液も使用でき
る。適当な投与量を選択する際に重要な因子は、体重増
加、無脂肪体重または正常域に近づきつつある規定の成
長によって測定されるか、あるいは医師が適当と見なす
本明細書に定義される同化活性を測定するための他の規
準によって測定される、得られた同化作用の結果であ
る。

【００７１】「組成物」は徐放系によっても好適に投与
される。好適な徐放性組成物の例には、例えば薄膜また
はマイクロカプセルなどの成型物の形態の半透過性ポリ
マー基盤が含まれる。徐放性基盤にはポリラクチド(米
国特許第３７７３９１９号、ＥＰ５８４８４)、Ｌ-グル
タミン酸とガンマ-エチル-Ｌ-グルタメートの共重合体
(U.Sidmanら,Biopolymers,22,547-556(1983))、ポリ(２
-ヒドロキシエチルメタクリレート)(R.Langerら,J.Biom
ed.Meter.Res.,15:167-277(1981)およびR.Langer,Chem.
Tech.,12:98-105(1982))、エチレンビニルアセテート
(R.Langerら,同上)またはポリ-Ｄ-(−)-３-ヒドロキシ
ラク酸(ＥＰ１３３９８８)が含まれる。徐放性組成物に
はリポソームに封入した「組成物」も含まれる。「組成
物」を含有するリポソームはそれ自体は公知の方法によ
って調製される(ＤＥ３２１８１２１；Epsteinら,Proc.
natl.Acad.Sci.U.S.A.,82]3688-3692(1985)；Hwangら,P
roc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77:4030-4034(1980)；ＥＰ
５２３２２；ＥＰ３６６７６；ＥＰ８８０４６；ＥＰ１
４３９４９；ＥＰ１４２６４１；日本国特許出願８３-
１１８００８；米国特許第４４８５０４５号および４５
４４５４５号；並びにＥＰ１０２３２４)。通常、リポ
ソームは小さい(約２００〜８００オングストローム)単
層型であり、その脂質含量は約３０ｍｏｌ％コレステロ
ール以上であり、その比率は最適な「組成物」療法のた
めに調節される。

【００７２】非経口投与について、一態様では、ＩＧＦ
-ＩおよびＧＨを一般的に、医薬的に許容される担体(即
ち、使用する投与量および濃度では受容者にとって非毒
性であり、かつ、その製剤の他の成分と適合し得るも
の)と共にそれぞれ所望の純度で単位投与注射可能剤形
(溶液、懸濁液、乳液)に混合して製剤化する。例えば製
剤は、酸化物質やポリペプチドにとって有害であること
が知られている他の化合物を含まないことが好ましい。

【００７３】一般に、「組成物」を均一かつ完全に液体
担体もしくは細かく砕いた固体担体もしくはその両方と
接触させることによって、製剤を調製する。次いで、必
要であれば、その生産物を所望の製剤に成型する。担体
が非経口担体であることが好ましく、受容者の血液と等
張性の溶液であることがより好ましい。このような担体
賦形剤の例には水、食塩水、リンゲル溶液、およびデキ
ストロース溶液が含まれる。固定油やオレイン酸エチル
などの非水性賦形剤もリポソームと同様に有用である。

【００７４】担体は等張性や化学的安定性を増進する物
質などを少量含有することが好適である。このような物
質は使用する投与量と濃度において受容者にとって非毒
性であり、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸お
よび他の有機酸またはそれらの塩などの緩衝剤、アスコ
ルビン酸などの抗酸化剤、低分子量(約１０残基未満)の
ポリペプチド(例えばポリアルギニンやトリペプチド)、
血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど
のタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリ
マー、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、また
はアルギニンなどのアミノ酸、セルロースやその誘導
体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含
む単糖、二糖および他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレ
ート剤、マンニトールやソルビトールなどの糖アルコー
ル、ナトリウムなどの対イオンおよび／またはポリソル
ベート、ポロキサマーまたはＰＥＧなどの非イオン性界
面活性剤が含まれる。

【００７５】「組成物」はそれぞれ典型的には約０.１
ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ(好ましくは１〜１０ｍ
ｇ／ｍｌ)の濃度で、約４.５〜８のｐＨで上記賦形剤中
に個々に製剤化される。全長ＩＧＦ-Ｉは一般に約６を
越えないｐＨで安定であり、des(１-３)-ＩＧＦ-Ｉは約
３.２〜５で安定であり、ｈＧＨとＧＨＢＰはより高い
ｐＨ、例えば６.０〜７.８で安定である。上述の賦形
剤、担体または安定化剤のうちのいくつかの使用によっ
て、ＩＧＦ-ＩまたはＧＨの塩が形成されることは理解
されるであろう。

【００７６】さらに、「組成物」(好ましくは全長ＩＧ
Ｆ-Ｉ)は好適な担体賦形剤と共に好適に製剤化されて細
胞を含有しない医薬組成物を形成する。一態様では、製
剤化に使用する緩衝剤はその組成物が混合直後に使用さ
れるか、それとも後で使用するために保存されるかに依
存するであろう。混合直後に使用するのであれば、「組
成物」をマンニトール、グリシンおよびリン酸塩ｐＨ
７.４中に製剤化することができる。この混合物を保存
すべき場合には、ｐＨが約６の緩衝剤(例えばクエン酸
塩)中に、このｐＨでのＧＨの溶解度を増大させる界面
活性剤(例えば０.１％ポリソルベート２０またはポロキ
サマー１８８など)と共に製剤化する。最終調製物は安
定な液体であるか、凍結乾燥固体であり得る。

【００７７】治療的投与に用いられる「組成物」は滅菌
状態でなければならない。滅菌性は滅菌濾過膜(例えば
０.２ミクロン膜)を通して濾過することにより容易に達
成される。治療的「組成物」(ＩＧＦ-Ｉ、ＩＧＦ-１＋
結合タンパク質、ＧＨＢＰ＋ＧＨおよびＧＨ組成物)は
一般に滅菌注入口の付いた容器、例えば静脈内バッグや
皮下用注射針で突き刺すことができる蓋を持つバイアル
などに入れられる。

【００７８】「組成物」は通常は単位または複数投与量
容器、例えば密封したアンプルまたはバイアル中に、水
性溶液として、もしくは再構成用の凍結乾燥製剤として
保存されるであろう。凍結乾燥製剤の例として、１０ｍ
ｌバイアルに滅菌濾過した１％(ｗ／ｖ)水性ＧＨ溶液５
ｍｌを充填し、得られた混合物を凍結乾燥する。注入溶
液は凍結乾燥ＧＨを静菌注射用水を用いて再構成するこ
とによって調製される。 ＧＨＢＰ＋ＧＰは通常は単位
または複数投与量容器、例えば密封したアンプルまたは
バイアル中に、水性溶液として、もしくは再構成用の凍
結乾燥製剤として保存されるであろう。凍結乾燥製剤の
例として、１０ｍｌバイアルに滅菌濾過した１％(ｗ／
ｖ)水性ＧＨ溶液５ｍｌを充填し、得られた混合物を凍
結乾燥する。注入溶液は凍結乾燥ＧＨを静菌注射用水を
用いて再構成することによって調製される。ＧＨＢＰ＋
ＧＨ製剤はさらにマンニトール、グリシン、緩衝剤およ
び非イオン性界面活性剤をも含み得る。本発明の製剤は
随意に、ポリソルベート(例：ポリソルベート２０、８
０など)およびポリキサマー(例：ポリキサマー１８８)
など数種類の非イオン性界面活性剤のうちの一つを含有
してもよい。ポリソルベート８０を使用する場合には、
ＧＨＢＰ＋ＧＨ：ポリソルベート８０のモル比が１：
０.０７〜３０であり、有利には１：０.１〜１０であ
り、最も有利には１：３である。体積対重量比では、ｈ
ＧＨの安定性をさらに増大させるために、ポリソルベー
ト８０を約０.００１〜約２％(ｗ／ｖ)の量で加える。
０.０１％(ｗ／ｖ)以上の濃度でポリソルベート８０は
凍結乾燥時の凝集形成の量を減じる。シェル寿命の改善
に加えて、本発明の製剤を含有する界面活性剤は再構成
した製剤を振盪した時にタンパク質凝集体の形成を抑制
する。

【００７９】ＧＨＢＰ＋ＧＨを投与する場合、その結合
タンパク質を１またはそれ以上含有しなければならな
い。充分に特徴づけられたこのような結合タンパク質
は、ＧＨ受容体の細胞外ドメインを構成する高親和性成
長ホルモン結合タンパク質(ＧＨＢＰ)であり、これは血
液中を循環し、ヒト(Baumannら,J.Clin.Endocrinol.Met
ab.,62:134-141(1986)；ＥＰ３６６７１０(１９９０年
５月９日公開)；Heringtonら,J.Clin.Invest.,77:1817-
1823(1986)；Leungら,Nature,330:537-543(1987))を含
むいくつかの種でＧＨＢＰとして機能する［Ymer及びHe
rington,Mol.Cell.Endocrino.,41:153(1985)；Smith及
びTalamantes,Endocrinology,123:1489-1494(1988)；Em
tner及びRoos,Acta Endocrinologica(Copenh.),122:296
-302(1990)]。ＧＨに対してより低い親和性を有する第
２のＢＰも記述されており、これはＧＨ受容体とは構造
的に無関係であると思われる(Baumann及びShaw,J.Clin.
Endocrinol.Metab.,70:680-686(1990))。

【００８０】亜鉛、ＧＨＢＰおよびＧＨの新規製剤は長
期間にわたる貯蔵と治療的投与に適した安定な組成物を
もたらす。Ｚｎ²⁺イオンを含有する治療用製剤は安定で
あり、その製剤の治療的投与を可能にする。したがっ
て、本発明の製剤的側面はＧＨＢＰ＋ＧＨを効果的に安
定化する手段として、このような製剤およびすべての関
連する製剤に関する。本製剤は、亜鉛と実質上純粋なＧ
ＨＢＰおよびヒトに認められる汚染タンパク質または感
染性物質を含まないＧＨを含有する。本発明の製剤はさ
らに医薬的に許容される緩衝剤、アミノ酸、充填剤およ
び／または非イオン性界面活性剤を含有してもよい。こ
れらには、例えば緩衝剤、キレート剤、抗酸化剤、保存
料、補助溶媒などが含まれ、これらのうちの特定の例に
は、トリメチルアマイン塩(トリス緩衝剤)およびＥＤＴ
Ａ二ナトリウムが含まれ得る。

【００８１】ｈＧＨ組成物 本明細書で使用する場合、用語「ヒト成長ホルモン」ま
たは「ｈＧＨ」は、例えば天然の供給源から抽出・精製
することによって生産されるヒト成長ホルモンおよび組
換え細胞培養系によって生産されるヒト成長ホルモンを
意味する。ｈＧＨの天然の配列とその特徴は、例えば
「Hormone Drugs」(Gueriguiganら,U.S.P.Convention,
メリーランド州ロックビル(1982))に説明されている。
これらの用語はさらに生物学的に活性なヒト成長ホルモ
ン等価物(例えば全体の配列中の１またはそれ以上が異
なっているもの)をも包含する。さらに、本願で使用さ
れるこれらの用語はｈＧＨの置換、欠失および挿入アミ
ノ酸変異種または翻訳後修飾をも包含するものとする。
このような変異種の例はＰＣＴ公開ＷＯ９０／０４７８
８(１９９０年５月３日公開)に記述されている。本発明
の製剤で使用されるｈＧＨは一般的には既に議論されて
いるように組換え法によって生産される。組換えＧＨＢ
Ｐ＋ＧＨの製剤は実質上純粋であり、他のヒトタンパク
質を含有せず、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)などの感
染性物質を含有せず、可溶性である。「実質上純粋」な
ＧＨＢＰ＋ＧＨとは、血液、血漿および血清などの体液
が通常伴っているタンパク質を含有しないＧＨＢＰとＧ
Ｈを意味する。通常は、全タンパク質の重量の約９５％
以上純粋(好ましくは９８％以上純粋)なＧＨＢＰとＧＨ
を意味する。

【００８２】製剤アミノ酸 もう１つの製剤態様では、医薬的に許容されるアミノ
酸、例えばグリシンをＧＨＢＰおよびＧＨ：亜鉛イオン
製剤に加える。グリシンが存在する場合、ＧＨＢＰ＋Ｇ
Ｈ：グリシンのモル比は１：５〜６００である。グリシ
ンに加えて、アラニン、グルタミン、アスパラギン、ア
ルギニンまたはリジンあるいはそれらアミノ酸の誘導体
を本製剤中に使用することができる。このようなアミノ
酸は製剤を凍結乾燥して安定で乾燥した固まった製剤を
形成するに足る塊を作成するのに特に有利である。

【００８３】非イオン性界面活性剤 もう１つの態様として、非イオン性界面活性剤をＧＨＢ
Ｐ＋ＧＨ製剤に加える。本発明の製剤はポリソルベート
(例：ポリソルベート２０、８０など)やポロキサマー
(例：ポロキサマー１８８)など数種類の非イオン性界面
活性剤の１つを随意に含有してもよい。ポリソルベート
８０は有利に使用され、ｈＧＨ：ポリソルベート８０の
モル比は１：０.０３〜６０であり得る。体積対重量で
は、ＧＨＢＰおよびＧＨの安定性をさらに増大させるた
めに、ポリソルベートを約０.００１〜約２％(ｗ／ｖ)
の量で添加する。０.０１％(ｗ／ｖ)以上の濃度のポリ
ソルベートは凍結乾燥および再構成時に生成する不活性
な凝集体の量を減じ得る。非イオン性界面活性剤は剪断
圧や表面圧にさらされた時に、タンパク質の変性を引き
起こすことなく、製剤の安定性を改善する。さらにＧＨ
ＢＰおよびＧＨ製剤を含有するこのような界面活性剤は
肺投与や無針ジェット注入銃を用いるようなエアゾル装
置でも使用できる。このような送達製剤は０.１〜５％
(ｗ／ｖ)の範囲の非イオン性界面活性剤の添加によって
改善され得る。

【００８４】本明細書で使用する場合、哺乳動物という
表現はあらゆる哺乳動物を意味するが、とりわけ霊長
類、ウシ属、羊、イヌ科、ネコ科、ウマ科および齧歯目
を意味する。具体的には、ヒト、ウシ、ウマ、ラット、
マウス、ウサギ、サル、ネコ、イヌ、およびブタが含ま
れる。用語鳥類はあらゆる鳥、具体的にはニワトリ、七
面鳥、アヒルおよびガチョウを意味する。

【００８５】上記の説明は当業者をして本発明を実施さ
せるに足ると考えられる。寄託された態様は本発明のあ
る側面を例示するものであるに過ぎず、機能的に等価な
構築物はすべて本発明の範囲に包含されるので、本発明
は寄託された構築物によって範囲を制限されるべきでは
ない。本明細書における物質の寄託は本明細書の記述が
本発明のなんらかの実施を(その最適な方法を含めて)可
能にするに足らないことを認めるものではなく、またそ
れらが表現する特定の例示に請求の範囲が制限されると
見なすべきでもない。実際に、本明細書に示し記述する
本発明の様々な変法が、上記の説明から当業者には明ら
かになるであろうし、これらも請求の範囲に包含され
る。以下の実施例は本発明を実施する現在知られている
最善の方法を例示するものであるが、本発明がこれらの
実施例に限定されるとみなすべきではない。

【００８６】

【実施例】実施例１：ＧＨＢＰ検定抗体の選択 ＬＩＦＡ法には２つの異なる抗体が必要である。第１の
抗体は固相を覆う捕捉抗体であり、これはＨＢＰを検定
する生物学的試料から選択的に取り出すために使用され
る。この抗体はリガンドホルモンの結合を妨害しないエ
ピトープに対して特異的でなければならない。第２の検
出抗体はリガンドホルモン上のエピトープに特異的な抗
体である。この第２の検出抗体はＨＢＰと錯化するとい
うリガンドの能力を妨害しない部位でリガンドホルモン
に結合しなければならない。ＧＨＢＰの場合、公知の市
販のモノクローナル抗体を所望の結合特性に関してスク
リーニングした。ｈＧＨに特異的な検出モノクローナル
抗体はマウスハイブリドーマ系で新たに作成した。

【００８７】コートＭＡｂ選択 ＧＨＢＰの存在を検定するために、ＧＨＢＰを結合する
べくＧＨＢＰを結合する捕捉抗体で固相(この場合には
微量滴定プレート)を覆う(コートする)必要がある。５
種類のマウス抗ＧＨＢＰ ＭＡｂ(１、５、７、４３およ
び２６３)をそれぞれの最適コート濃度で評価すること
により、まずＧＨＢＰ-ＧＨに対するＧＨＢＰの結合部
位を決定した。即ち、逐次的検定および循環中のＧＨ-
Ｉ¹²⁵の存在下におけるＧＨＢＰへの結合容量(同時イン
キュベーション形式)。次に、それらのＧＨＢＰ-ＧＨ-
Ｉ¹²⁵錯体への結合容量に基づいてこれらを調べた(予備
インキュベーション実験)。ＭＡｂ１と７は共に逐次的
および同時検定形式で極めて弱い結合を示し、ＭＡｂ
５、４３および２６３のみを予備インキュベーション実
験で調べた。図２は３つの異なる検定配置下での各ＭＡ
ｂに関する結合百分率を示す。このデータは３種類すべ
ての条件下で最高の結合を与えたＭＡｂ２６３がコート
として最も好適なＭＡｂであることを示している。とい
うのは、これは遊離のＧＨＢＰと共にＧＨと錯化したＧ
ＨＢＰにも結合することができるからである。より重要
なことに、逐次的インキュベーション実験は、ＭＡｂ２
６３が本ｈＧＨＢＰ-ｈＧＨ結合部位を妨害しないこと
を示した。

【００８８】図３はｈＧＨと予備インキュベートして作
成した標準曲線と予備インキュベートせずに作成した標
準曲線の比較を表す。一組の標準をｈＧＨ(最終濃度２
００ｎｇ／ｍｌ)と共に４℃で終夜インキュベートし、
対照標準は検定緩衝液と共にインキュベートした。次
に、このようにして作成した試料を標準的な手法に従っ
てＬＩＦＡで検定した。即ち、すべての試料を微量滴定
プレート上でｈＧＨにさらした。図３に認められるよう
に、ＧＨＢＰをｈＧＨと共に予備インキュベートするか
どうかにかかわらず類似する結果が得られる。コート抗
体へのＧＨＢＰの結合とそのリガンドによるＧＨＢＰの
飽和は試料とｈＧＨを微量滴定ウェル中で同時にインキ
ュベートすることによって同時に行うことができる。簡
潔化されたＬＩＦＡは２つの別個の段階で得られるもの
と類似の標準曲線を与えるが、必要なインキュベーショ
ン時間は半分であった(２時間対４時間、図１第３ボッ
クス下)。

【００８９】ＨＲＰＯ複合体に用いたＭＣＢ(下記検出
ＭＡｂ選択を参照のこと)は高い親和性で２２ｋＤａ-Ｇ
Ｈを結合するが、２０ｋＤａには極めて低い親和性を有
し、結果として検定における２０ｋＤａ-ＧＨによる考
え得る妨害が試験された。図４は２００ｎｇ／ｍｌのｈ
ＧＨ溶液に２００ｎｇ／ｍｌの２０ｋＤａ-ｈＧＨを添
加すると２００ｎｇ／ｍｌのｈＧＨと共にインキュベー
ションして得られるものと類似の標準曲線がもたらされ
ることを示している。このことは２０ｋＤａ-ＧＨが本
ＧＨＢＰ検定法を実質的な程度には妨害しないことを示
している。

【００９０】検出ＭＡｂ選択 ｈＧＨの存在を検定するためには、ＧＨＢＰに対するｈ
ＧＨの結合を妨害しないｈＧＨ上のエピトープに高い親
和性を有する検出抗体が必要である。組換えｈＧＨを用
いてマウス系でモノクローナル抗体を作成し、必要な特
異性についてスクリーニングした。最適なマウスモノク
ローナル抗体はＨＧＨ-Ｂと命名されたハイブリドーマ
によって生産された。このハイブリドーマは上述のよう
にＡＴＣＣに寄託された。

【００９１】実施例２：ＧＨＢＰのためのＬＩＦＡ検定
操作 ＧＨＢＰを測定するために開発したＬＩＦＡ検定操作は
以下の通りである。５０ｍｍｏｌ／リットルの炭酸ナト
リウム緩衝液ｐＨ９.６(コート緩衝液)中２０μｇ／ｍ
ｌの抗体を１００μｌ／ウェルとして４℃で終夜インキ
ュベートすることにより、９６穴微量滴定プレート(Cor
ning Glass Works,ニューヨーク州コーニング)をＭＡｂ
２６３でコートした(図１、工程１)。コーティング溶液
を除去した後、コートされたプレートを１ウェルあたり
１５０μｌのＰＢＳ中５ｇ／リットルのＢＳＡを用いて
室温で１時間遮断し(図１、工程２)、ＰＢＳ中０.５ｇ
／リットルのツウィーン２０(洗浄緩衝液)で６回洗浄し
た。

【００９２】検定緩衝液で希釈した標品または試料(５
０μＭ血清または血漿および５０μＭ検定緩衝液)をコ
ートしたウェルに分配(１００μｌ／ウェル)した(図
１、工程３)。プレートを密閉し、穏やかに撹拌しなが
ら室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄緩
衝液で６回洗浄した。次に、２００ｎｇ／ｍｌの組換え
ｈＧＨまたは検定緩衝液を加え(１００μｌ／ウェル)、
室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝
液で６回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(Ｈ
ＲＰＯ)標識ＭＡｂ ＭＣＢ(１００μｌ／ウェル)を加え
た(図１、工程４)。室温でさらに２時間インキュベート
した後、プレートを洗浄緩衝液で６回洗浄した。新たに
調製した基質溶液(ＰＢＳ１リットル中に０.４ｇのｏ-
フェニレンジアミン・二塩酸塩＋３０％過酸化水素)０.
４ｍｌをプレートに加え(１００μｌ／ウェル)、遮光下
室温で１５分間インキュベートした(図１、工程５)。
２.２５ｍｏｌ／Ｌ硫酸１００μｌを添加することによ
り反応を停止させ、Ｖｍａｘプレート・リーダー(Molec
ular Devices,カリフォルニア州メンロ・パーク)で４９
０ｎｍの吸光度を測定した。４変数非線形回帰曲線最適
化プログラムを用いて、ＧＨＢＰ濃度の対数に対して吸
光度をプロットすることにより、標準曲線を作成した。

【００９３】実施例３：ＧＨＢＰ検定法の特性 ＧＨＢＰ検定法を評価し、検定法の範囲、感度、特異性
および正確さを決定した。ＧＨＢＰを４つの他の可溶性
受容体(ｒＣＤ４、ｒＨＥＲ２、ＥＣＤ，ＥＧＦ受容体
およびｒＰＲＬ受容体)とＣＨＯ細胞によって生産され
る無関係なタンパク質(ＨＩＶ包膜タンパク質ｇｐ１２
０)に代えてこの検定法の特異性を試験した。４つのタ
ンパク質はすべてGenetech Inc.から入手した。その結
果(表１)は本検定法がこれらのタンパク質と０.０１％
未満の交差反応性を有することを示した。さらに、ヒト
胎盤ラクトゲン(ＨＰＬ)とヒトプロラクチン(ＰＲＬ)と
の交差反応性を試験した。ｈＧＨをＨＰＬおよびＰＲＬ
に同じ濃度(２００ｎｇ／ｍｌ)で代えると、ＧＨＢＰま
たはＰＲＬ受容体と共に試験した時にブランクと識別で
きない値がもたらされた。

【００９４】

【表１】 交差反応性 試験したタンパク質 濃度 交差反応性^a 試験値 測定値 ％ (μg／ml) (ng／ml)^b ｒＨＥＲ２ ＥＣＤ １０.０ ＜０.６ ＜０.０１ ｒＣＤ４ １０.０ ＜０.６ ＜０.０１ ｒｇｐ１２０ １０.０ ＜０.６ ＜０.０１ ＥＧＦ受容体 １０.０ ＜０.６ ＜０.０１ ｒＰＲＬ受容体 １０.０ ＜０.６ ＜０.０１ ^a交差反応性率は(測定された濃度)／(試験した量)×１００として計算した。 ^b２６ｋＤをｒｈＧＨＢＰの分子量として用いることにより濃度を計算した。

【００９５】検定精度 低度、中度、または高度のＧＨＢＰ濃度を伴う血清試料
を検定内精度の評価のために２４反復中で分析した(表
２Ａ)。低度、中度または高度のＧＨＢＰ濃度の試料を
１０回の別個の実験で測定することにより、検定間精度
を決定した(表２Ｂ)。３つのレベルすべてにおける検定
内偏差の係数は６.３〜８.９％の範囲にあり、検定間偏
差の係数は９.７〜１２.９％の範囲にあった。

【００９６】

【表２】 ＬＩＦＡの精度 Ａ．検定内精度 試料１ 試料２ 試料３ 反復 ２４ ２４ ２４ 平均(ｐｍｏｌ／Ｌ) １３８ ２６８ ６１４ Ｓ.Ｄ.(ｐｍｏｌ／Ｌ) ９.２ １６.９ ５４.６ Ｃ.Ｖ.(％) ６.６ ６.３ ８.９ Ｂ．検定間精度 試料１ 試料２ 試料３ 反復 １０ １０ １０ 平均(ｐｍｏｌ／Ｌ) １３６ ２９３ ６７４ Ｓ.Ｄ.(ｐｍｏｌ／Ｌ) １７.６ ３３.１ ６５.０ Ｃ.Ｖ.(％) １２.９ １１.３ ９.６

【００９７】検定の直線性 検定緩衝液中の血清試料の一連の希釈物を作り、ＧＨＢ
Ｐ濃度を測定することによって、検定の直線性を決定し
た。ＬＩＦＡで決定した観測濃度を、希釈率とＬＩＦＡ
で決定した非希釈試料の濃度をかけることによって得た
計算値と相関させることにより結果を調べた。試料の線
形回帰分析は０.９９またはそれ以上の相関係数をもた
らし(図５)、この検定が線形であることを示した。

【００９８】実施例４:生物学的液体中のＧＨＢＰの決
定スパイク回収 検定緩衝液中３つの異なる濃度の精製ＧＨＢＰを等体積
で４つの血清試料および４つの血漿試料に加えた。生成
した試料をＬＩＦＡで検定した。理論的濃度を各混合試
料について計算し、これを用いて回収百分率を計算し
た。表３および表４のデータは血清と血漿について、８
９.１〜１１５.９％の範囲で、それぞれ１０６.７およ
び９９.５の平均回収率をしめしており、本検定法の正
確さを立証している。

【００９９】ＧＨによるＧＨ-ＢＰの飽和 図３はＧＨとの予備インキュベーショントを行うか、行
わないで作成した２つの標準曲線の比較を示す。一組の
標品をＧＨ(最終濃度２００ｎｇ／ｍｌ)と共に４℃で終
夜インキュベートし、対照標品を検定緩衝液と共にイン
キュベートした。次いで、このように生成した試料を標
準的な手法に従ってＬＩＦＡで検定した。即ち、すべて
の試料を微量滴定中でＧＨにさらした。図２に認められ
るように、ＧＨと共に予備インキュベートするか、しな
いかにかかわらず、類似の結果が得られる。

【０１００】ＬＩＦＡ法の応用 １６人の健康な成人とラロン型矮小症の患者２人から得
た無作為血清試料中の全ＧＨＢＰとＧＨ結合ＧＨＢＰの
レベルを図６に示す。ＧＨ-ＢＰのレベルはすべての正
常な対象から得た試料中で検出可能であった(図６、患
者１〜１６)。対照的にラロン型矮小症の患者で共にＧ
ＨＢＰ濃度が検出できなかった(＜３０ｐｍｏｌ／Ｌ)
(図６：患者番号１７および１８)

【０１０１】

【表３】 血清における精度^a スパイクした試料^b 血清試料^b 予想値^c 測定値 回収率 （pmol／L） （pmol／L) (pmol／L) (pmol／L) ％ ２０４ １７７ １９２ ２１２ １１０.４ ２３８ ２１９ ２５４ １１５.９ ４６５ ２２５ ３６２ １０５.９ １１３８ ６７１ ７３５ １０９.５ ６５８ １７７ ４１９ ４１２ ９７.６ ２３８ ４４６ ５００ １１１.１ ４６５ ５６２ ５７７ １０１.８ １１３８ ８９８ ９６２ １０７.１ １４２７ １７７ ８０２ ７６２ ９５.０ ２３８ ８３２ ９３１ １１２.０ ４６５ ９４６ ９６５ １０２.１ １１３８ １２８２ １４３８ １１１.９ 平均値 １０６.７ 範囲 ９５.０〜１１５.９ ^a等体積の３種の精製ｒＧＨＢＰ(第１欄)をそれぞれ血清試料(第２欄)に加え 、ＬＩＦＡで検定した。 ^bＧＨＢＰ濃度は予めＬＩＦＡで決定しておいた。 ^c(スパイクした量＋血清)／２

【０１０２】

【表４】 血漿における精度^a スパイクした試料^b 血漿試料^b 予想値^c 測定値 回収率 （pmol／L） （pmol／L) (pmol／ L) (pmol／L) ％ １４２ １００ １２１ １１２ ９２.６ １５０ １４６ １５４ １０５.５ ３００ ２２１ ２３１ １０４.５ ５６９ ３５５ ３３５ ９４.４ ４３５ １００ ２６７ ２５４ ９５.１ １５０ ２９２ ３２３ １１０.６ ３００ ３６７ ３２７ ８９.１ ５６９ ５０２ ５００ ９９.６ ８３５ １００ ４６７ ４５８ ９８.１ １５０ ４９２ ５３８ １０９.３ ３００ ５６７ ５３１ ９３.６ ５６９ ７０２ ７１５ １０１.９ 平均値 ９９.５ 範囲 ８９.１〜１１０.６ ^a等体積の３種の精製ｒＧＨＢＰ(第１欄)をそれぞれ血漿試料(第２欄)に加え 、ＬＩＦＡで検定した。 ^bＧＨＢＰ濃度は予めＬＩＦＡで決定しておいた。 ^c(スパイクした量＋血清)／２

【０１０３】実施例５：成長促進におけるＧＨＢＰの監
視 患者の生物学的液体中の濃度を監視するために本発明の
ＬＩＦＡを用いることができ、そのレベルが望ましい成
長速度にとって不充分である場合には追加のＧＨＢＰを
投与する。低ＧＨＢＰレベルの例はラロン矮小症にある
が、これに対して過剰のＧＨ分泌を伴う患者では高いＧ
ＨＢＰレベルが存在し得る。ＧＨＢＰレベルが望ましい
成長速度にとって不充分である場合には、追加のＧＨＢ
Ｐを単独で、もしくはｈＧＨと錯化させて投与すること
ができる。ＧＨＢＰの最適レベルは上述の方法によっ
て、一連の正常で健康な個体中のＧＨＢＰの測定と組み
合わせて決定することができる。ＧＨＢＰはあらゆる哺
乳動物系、好ましくは齧歯目および霊長類で評価するこ
とができる。

【０１０４】齧歯目において ２つのＧＨ欠損齧歯目モデルを用いた：１）ＧＨを生産
する腺、下垂体を外科的に除去したラット(下垂体切除
ラット)および２）遺伝的に成長ホルモンが欠乏してい
る動物(矮小ラット、Chariton,H.W.ら,J.Endo.119:51-58
[1988])。ヒトＧＨ(ｈＧＨ)単独もしくは大腸菌もしく
は哺乳類２９３細胞で組換え生産されるヒトＧＨＢＰに
結合したｈＧＨでこれらのラットを処置した。ＧＨが誘
発する身体成長に対する結合タンパク質の効果を評価す
るために数種の成長の指標を測定した。投与したＧＨＢ
Ｐおよび錯化したＧＨの代謝結果を決定するためにはＧ
ＨＢＰとＧＨのレベルを監視する必要がある。

【０１０５】下垂体切除ラット 組換えｈＧＨＢＰおよびｈＧＨを単独で、もしくは組み
合わせて、ＧＨ生物活性を測定するための認可されたモ
デルである下垂体切除ラットに与える(Thorngen,K-G.お
よびHansson L.I. Acta.Endo.75]653-668[1977])。ヒト
ＧＨ(０.０３、０.１および０.３ｍｇ／ｋｇ、７日間毎
日注射)は投与量に関連する体重増加を誘発するが、大
腸菌由来のｈＧＨＢＰの注射は同じ３つの投与量でそれ
自体では効果を生み出さない。しかし、０.３ｍｇ／ｋ
ｇのｈＧＨＢＰを０.１ｍｇ／ｋｇのｈＧＨと同時に投
与すると０.１ｍｇ／ｋｇのｈＧＨ単独の場合より体重
増加が大きくなる(ｐ＜０.０１)ばかりでなく、３倍量
のｈＧＨよりも高い体重増加を誘発した(それぞれ２２.
０±３.６対１７.１±２.１ｇ：平均値±ｓ.ｄ，ｐ＜
０.０１)。縦の骨成長は体重増加と平行する。したがっ
て、０.３ｍｇ／ｋｇのｈＧＨＢＰと０.１ｍｇ／ｋｇの
ｈＧＨを同時投与することにより０.３ｍｇ／ｋｇより
大きい骨成長が得られ(１０２±１４対８４±１７ミク
ロン／日；ｐ＜０.０５)、０.１ｍｇ／ｋｇのＧＨＢＰ
＋ｈＧＨはｈＧＨ単独よりも大きい骨成長を与える(９
９±６対７２±１７ミクロン／日；ｐ＜０.０１)。

【０１０６】ｈＧＨＢＰ(０.３ｍｇ／ｋｇ)をｈＧＨ
(０.１ｍｇ／ｋｇ)と同時に投与した後、肝臓、脾臓お
よび腎臓は０.１ｍｇ／ｋｇ ｈＧＨ単独よりもすべて有
意に大きい；肝臓(５.５±０.４対４.６±０.６ｇ；ｐ
＜０．０１)、脾臓(２９２±４６対２４０±３４ｍｇ；
ｐ＜０.０５)および腎臓(８３６±６０対７１６±５７
ｍｇ；ｐ＜０.０５)。賦形剤で処置したラットにおける
肝臓、脾臓および腎臓の重量はそれぞれ４.５±０.２
ｇ、１９３±３２ｍｇおよび６８７±５８ｍｇである。
ｈＧＨに対するこれらの応答はｈＧＨＢＰによって少な
くとも２倍になる。最後の注射から２４時間後のＩＧＦ
-１およびｈＧＨの血清濃度は、ｈＧＨを伴うｈＧＨＢ
Ｐの２つの最高投与量の同時投与によって著しく上昇す
るが、ｈＧＨＢＰは２４時間後に２０倍のｈＧＨが存在
する原因となる。

【０１０７】血清での使用に適合させたｈＧＨＢＰのた
めのＥＬＩＳＡ(Fuh,G.ら,J.Biol.Chem.265:3111-3115
[1990])は７回目の皮下ボーラス注射をラットに与えた
２４時間後の血液中のＧＨの持続性の理由を示す。ｈＧ
ＨＢＰはｈＧＨＢＰとｈＧＨを同時に投与した動物での
み検出可能である。ＧＨＢＰを単独で与えると、ＧＨＢ
ＰをＧＨに錯化させて与えた場合より迅速に消失する。
血液中のＧＨＢＰを測定することによって得たこれらの
発見は上記の改善されたＧＨの活性の多くもしくはすべ
てを引き起こすものが、ＧＨ＋ＧＨＢＰ錯体のラットの
血中での持続性であることを示唆している。したがって
本発明のＬＩＦＡ法を用いて調製中、貯蔵中、およびＧ
ＨＢＰ投与後の体液中のＧＨＢＰを追跡する。

【０１０８】矮小ラット系 また我々は、下垂体ＧＨ含量が正常の５〜１０％であ
り、ゆっくりと成長し、ＧＨ処置に対して応答する矮小
ラット(Charlton,H.W.ら,J.Endo.119:51-58[1988])にお
いてｈＧＨとｈＧＨＢＰを比較した。０.２７ｍｇ／ｋ
ｇのｈＧＨと共に０.２７ｍｇ／ｋｇのｈＧＨＢＰを同
時に投与すると、０.２７ｍｇ／ｋｇ ｈＧＨ単独の場合
と比較して体重増加量が増大する(１１.１±４.２対７.
５±１.７ｇ；ｐ＜０.０５)。０.２７ｍｇ／ｋｇのｈＧ
Ｈと共に同時投与した３種のｈＧＨＢＰ投与量はすべて
０.２７ｍｇ／ｋｇ ｈＧＨ単独の場合と比較して骨成長
が有意に増大する(低３３.５±５.８、中３８.６±８.
６、高３５.５±５.５対２６.０±４.１ミクロン／日；
ｐ＜０.０５)。血清ＩＧＦ-１濃度は０.８１ｍｇ／ｋｇ
ｈＧＨ単独の場合と比較してもｈＧＨ濃度(高ｈＧＨＢ
Ｐ，６０９±２４０対７３±２２ｐｇ／ｍｌ；ｐ＜０.
０００１)と同様に同時投与によって上昇する(高ｈＧＨ
ＢＰ１３６±４５対９０±１６ｎｇ／ｍｌ；ｐ＜０.０
５)。

【０１０９】哺乳類２９３細胞から得られるＧＨＢＰ 著しく対照的に、ヒト２９３細胞中で生産されたｈＧＨ
ＢＰは下垂体切除ラットのＧＨ応答を完全に阻害する。
ｈＧＨ単独の皮下注射を１０日間毎日行った後の体重増
加は０.０３、０.１および０.３ｍｇ／ｋｇ／日でそれ
ぞれ１１.３±２.５、１６.４±２.１および２１.１±
２.１ｇである。０.０３および０.１ｍｇ／ｋｇ／日の
ｈＧＨを２倍モル過剰の２９３由来ｈＧＨＢＰと共に同
時投与した場合、ｈＧＨおよび賦形剤の群(２.３±１.
６ｇ)と比較してこの成長は廃止された(それぞれ３.０
±２.１および３.０±１.６ｇ)。これら２つの形態のｈ
ＧＨＢＰを用いて誘発される成長応答間のこれらの相違
は、大腸菌由来のＧＨＢＰ(Moore,J.A.ら,Proc.US Endo
cr.Soc.71,Abstract #1652[1989])または天然の供給源
から生成されたもの(Baumann,G.および Show,M.A.,J.Cl
in Endcrinol.Metabl.,70:680-686[1990]；Baumann,G.S
haw,M.A.及びBuchanan,T.A.,Metabolism.38:330-333[19
89])について約１０倍減少する循環系からのｈＧＨクリ
アランスの相違によるのであろう。

【０１１０】ｈＧＨのみの静脈内ボーラス後の正常な雄
ラットにおけるｈＧＨのクリアランス(ｍｌ／分／ｋｇ)
は１８.６±３.４であり、ウサギ血清から得たＧＨＢＰ
と同時投与したｈＧＨについては２.１±０.２であり、
大腸菌から得たＧＨＢＰについては１.９±０.４であ
り、２９３細胞からえたものについては４１.３±１６.
７である。したがって２９３由来のｈＧＨＢＰについて
はｈＧＨのクリアランスが２倍に増大しており、このこ
とは生体内効力とｈＧＨクリアランスの相関性を示唆し
ている。大腸菌由来ｈＧＨＢＰに錯化したｈＧＨのクリ
アランスの減少は、その錯体が腎臓による濾過を免れる
のに足る大きさ(Ｍｒ＞４０ｋＤａ)を有するからであろ
う。２９３細胞中で生産されたタンパク質は、おそらく
は不完全なグリコシル化ゆえに、異種の炭水化物様式を
有することができ、これが肝臓による迅速なそれらの清
掃を引き起こす。

【０１１１】しがってこの場合には、大腸菌由来のタン
パク質が活性を増大させることと比較して、２９３細胞
由来のＧＨＢＰはＧＨ作用の阻害因子として作用する。
この活性の相違は上記２分子の血液からのクリアランス
の相違によると思われる。本発明は阻害性および刺激性
結合タンパク質をそれらの血液からのクリアランスに基
づいて同様に識別する助けとなる。

【０１１２】ＧＨＢＰの持続性 この一連の実験はＧＨＢＰ検定から得られる知見の価値
を示しており、当然上記ラット実験に従う。大腸菌由来
のＧＨ＋ＧＨＢＰ錯体の血液中での半減期の延長に基づ
きＧＨＢＰはＧＨを血液中に充分な時間持続させるの
で、ＧＨをＧＨＢＰと結合させればＧＨ注射の頻度を少
なくすることができる。

【０１１３】２つの別個の研究において、我々はＧＨ欠
損矮小ラットにｈＧＨのみを注射するか、もしくはｈＧ
ＨＢＰと組み合わせて同時注射する。第１の研究ではｈ
ＧＨまたはｈＧＨ＋ｈＧＨＢＰを毎日、もしくは２日ま
たは４日毎に８日間与える。第２の実験はｈＧＨまたは
ｈＧＨ＋ｈＧＨＢＰを毎日、もしくは３日または６日毎
に１８日間与えるよう設計する。両研究において、ｈＧ
ＨＢＰは注射間隔にかかわらずｈＧＨ単独よりも大きい
成長応答を与える。これらの研究はｈＧＨをｈＧＨＢＰ
と共に注射すれば、成長応答の大きさを減少させること
なく、注射の頻度を１週間に１回か２回程度にまで著し
く減少させることができることを示している。

【０１１４】雌矮小ラット(研究Ａ、１２〜１５週齢，
１１０〜１３０ｇ；研究Ｂ，５０〜７０日齢，９５〜１
１０ｇ)を８(研究Ａ)または７(研究Ｂ)に無作為に割り
当て、テトラサイクリンを骨成長の生体内標識として腹
腔内注射する。ＧＨまたはＧＨＢＰの注射はすべて皮下
的に１００μｌの溶液体積で与える。各研究において、
すべてのラットに賦形剤または試験化合物を毎日与え
る。

【０１１５】使用したｈＧＨは滅菌水に溶解したｒｈＧ
Ｈ(Genentech Lot N9267AX,G042A)である。使用したＧ
ＨＢＰは大腸菌中で生産し、精製したものである。この
場合ＧＨＢＰは上で使用したＧＨＢＰとは異なる配列を
有し、その分子はエクソン３コード化ドメインを除去し
て１〜５、２７〜２３８ペプチド配列を得ることによっ
て生産されたものである。。

【０１１６】第１の実験ではｈＧＨとｈＧＨＢＰを０.
１ｍｌの体積中に、 ａ）ｈＧＨ ０.２５ｍｇ／ｍｌ、または、 ｂ）ｈＧＨ１ｍｇ／ｍｌ、 ｃ）ｈＧＨ(１ｍｇ／ｍｌ)＋ｈＧＨＢＰ(２ｍｇ／ｍｌ) になるように調製する。８種類の注射方法は次の通りで
ある： １）ａ）、ｂ）、およびｃ）を毎日注射 ２）ｂ）およびｃ）を２日毎に注射 ３）ｂ）およびｃ）を４日毎に注射 ４）賦形剤を毎日注射。

【０１１７】したがってこの設計では２日毎に皮下注射
された動物は毎日注射を受けた動物のＧＨ投与量の半分
だけ受容し、４日毎に注射されたラットは累積ＧＨ投与
量の４分の１だけ受容する。第２の実験ではｈＧＨを以
下の通りに調製する： ａ）０.３３ｍｇ／ｍｌ ｂ）１ｍｇ／ｍｌ、または、 ｃ）２ｍｇ／ｍｌ。

【０１１８】ｈＧＨ＋ｈＧＨＢＰ溶液は２倍のｈＧＨＢ
Ｐ(それぞれ０.６６、２または４ｍｇ／ｍｌ)と組み合
わせた０.３３、１または２ｍｇ／ｍｌのｈＧＨであ
る。すべて０.１ｍｌで皮下注射した９種類の方法は以
下の通りである： １）賦形剤対照 ２）毎日３３マイクログラム／日のｈＧＨ注射 ３）毎日１００マイクログラム／日のｈＧＨ注射 ４）毎日３３マイクログラム／日のｈＧＨ注射＋６６μ
ｇのＧＨＢＰ ５）毎日１００マイクログラム／日のｈＧＨ注射＋２０
０μｇのＧＨＢＰ ６）３日毎に１００マイクログラム／１注射のｈＧＨ注
射 ７）６日毎に２００マイクログラム／１注射のｈＧＨ注
射 ８）３日毎に１００マイクログラムのｈＧＨ注射＋２０
０μｇ ＧＨＢＰ／１注射 ９）６日毎に２００マイクログラムのｈＧＨ注射＋４０
０μｇのＧＨＢＰ／１注射。 したがってこの設計では、３日毎または６日毎に注射さ
れる動物は低ＧＨ投与量を皮下注射されたものと同じ累
積ＧＨ投与量(０.３３ｍｇ／ｋｇ／日)を受容する。

【０１１９】ｈＧＨＢＰをｈＧＨと組み合わせることに
よって、すべての注射頻度でｈＧＨに対する応答が増大
する。意外なことに、研究Ａでは注射の頻度を毎日から
２日毎に減じ、それによって累積ｈＧＨ投与量が半分に
減少したにもかかわらず、ＧＨＢＰ＋ＧＨ注射の重量増
加応答は同じである。ｈＧＨ注射については、２日毎ま
たは４日毎に注射すると重量増加応答が著しく減少す
る。０.２５ｍｇ／ｋｇｈＧＨの８日間の毎日注射に対
する応答としての重量増加は４日毎に与えた同じｈＧＨ
累積投与量の２回だけの注射のそれと同一であった。

【０１２０】第２の実験では、ｈＧＨの２つの投与量を
２倍過剰のｈＧＨＢＰと共に、もしくはｈＧＨＢＰなし
で毎日与える。ｈＧＨに対する応答はｈＧＨＢＰをｈＧ
Ｈと組み合わせることによって著しく増大する(下記参
照のこと)。(矮小ラットにおける以降の研究ではｈＧＨ
に対する最大重量増加応答が、ｈＧＨをｈＧＨＢＰと錯
化しこれを毎日皮下注射した場合に増大した。）先の実
験と同様に、ＧＨＢＰはＧＨに対するＩＧＦ-１応答を
改善した。これはＧＨＢＰ-ＧＨ錯体が、ＧＨを単独で
送達した時には欠く活性である、優先的で不均化した肝
臓の成長を引き起こすからであろう。３日または６日間
隔でｈＧＨを同じ総投与量で与えると(ｈＧＨを毎日与
えた場合、第２群と比較して)成長応答が乏しい。ＧＨ
＋ＧＨＢＰで組み合わせた処置に対する重量増加応答は
はるかに大きい。ｈＧＨのみを毎日の効果を３日毎また
は６日毎に与えるｈＧＨ＋ｈＧＨＢＰと直接比較する。
ｈＧＨＢＰ-ｈＧＨ組み合わせの頻繁でない注射はｈＧ
Ｈの毎日投与と同じ程度に効果的である。これらのデー
タはｈＧＨ＋ｈＧＨＢＰの同時投与がｈＧＨに対する成
長応答を頻繁でない注射方法で維持できることを明確に
示している。ＧＨ＋ＧＨＢＰの同時投与は注射間の間隔
を、同じ投与量のＧＨを毎日注射する場合と比較して
(テトラサイクリンラベル化技術によって測定した)縦骨
成長に対する活性を失うことなく、６日(毎週)まで延ば
すことを可能にする。ＧＨ＋ＧＨＢＰの同時投与は、等
価な成長応答のために、より少量のＧＨ投与量を少ない
頻度で与えること(ラットにおいて２日または４日毎に
１／２〜１／３の投与量の注射)を可能にする。

【０１２１】

【表５】 研究Ｂ：１８日間の骨成長および重量増加 群 骨成長 (ミクロン) 重量増加(ｇ) 及びＳＤ 及びＳＤ １)賦形剤 ３４.０ ８.０ １０.３ ３.６ ２)低ＧＨ ５３.８ ８.３ ２７.８ ３.３ ３)高ＧＨ ６２.１ ８.４ ３４.０ ５.４ ４)低ＧＨ＋ＧＨＢＰ ７３.４ ９.７ ２８.１ ４.９ ５)高ＧＨ＋ＧＨＢＰ ９５.１ ６.５ ４７.０ ７.４ ６)ＧＨ／３日 ３７.７ １０.３ １５.２ ３.７ ７)ＧＨ／６日 ３６.５ １１.７ １６.８ ６.２ ８)ＧＨ＋ＧＨＢＰ／３日 ５６.９ １５.８ ２８.０ ６.４ ９)ＧＨ＋ＧＨＢＰ／６日 ４７.０ ４. ６ １８.５ ４.８

【０１２２】霊長類において 正常な若いアカゲザル中で、ＧＨＢＰ＋ｈＧＨまたはｈ
ＧＨ単独を投与した後、ＧＨＢＰを監視した。ＩＧＦ-
１濃度を測定することにより体因性および同化作用応答
を決定した。サルにｈＧＨを毎日もしくはｈＧＨＢＰ＋
ｈＧＨを毎週与え、賦形剤を注射する対照群を作った。
主に血液ＩＧＦ-１濃度から得られるその結果はＧＨＢ
Ｐが霊長類においてＧＨの生物学的活性を増進すること
を示した。(２倍モル比のｈＧＨＢＰと共に投与された)
ｈＧＨの投与量は毎週０.３５ｍｇ／ｋｇであり、毎日
注射したｈＧＨの投与量は０.０５ｍｇ／ｋｇまたは０.
３５ｍｇ／ｋｇである。血清分析は、ｈＧＨ＋ｈＧＨＢ
Ｐに対する最大ＩＧＦ-１応答がいずれの投与量のｈＧ
Ｈ単独よりも大きいことを示した。測定によると、ｈＧ
ＨＢＰと組み合わせて投与された場合、ｈＧＨの血清寿
命はｈＧＨのみを投与した場合より２.２倍増大した。
毎日０.３５ｍｇ／ｋｇのｈＧＨの投与は、ｈＧＨＢＰ
と２：１のモル比で錯化したｈＧＨ(０.３５ｍｇ／ｋ
ｇ)の毎週１回の投与より血清ＩＧＦ-１を低く刺激し
た。ｈＧＨ＋ｈＧＨＢＰ(１：２モル比，ボーラスとし
て皮下投与)の毎週の投与は同じｈＧＨ投与量の毎日の
ｈＧＨ投与または７倍高い総投与量より大きい生理学的
応答をもたらした。したがって、ｈＧＨをｈＧＨＢＰと
錯化させると、より少ない量のｈＧＨをより少ない頻度
の注射で投与することができる。要約すると、ラットと
サルにおいて、ＧＨＢＰはＧＨ活性を増大させるので、
ヒトにおいても同様の増大が予期される。

【０１２３】ＧＨＢＰの身体成長に対する上記の効果の
作用機序は皮下注射からのＧＨ-ＧＨＢＰ錯体の極めて
遅延した吸収と、次いで、ＧＨ-ＧＨＢＰ錯体の血液か
らの遅延したクリアランスによって説明することができ
よう。これらの効果は共に立証されている。遊離のＧＨ
ＢＰの吸収はＧＨ単独の場合と類似であったので、この
効果の強度は極めて驚くべきことである。これらの薬動
力学的機序は増大した活性の大部分と、ＧＨＢＰ＋ＧＨ
錯体のより少ない頻度の注射を与えることができること
を説明する。血液中のＧＨの半減期を増大させることが
必然的に増大した活性を導くことを示す先行技術はない
ので、これらの発見は驚くべきことである。ある分子が
血液中に保持されるとすれば、組織への接近は制限され
るであろうが、それでもその分子の血液内での分解は続
くであろう。ＧＨをＧＨＢＰに結合させると、細胞ＧＨ
受容体に対するＧＨの接近が改変されると予期される。
組織上で活性であるべき分子にとって、それが血流から
組織中へ抜け出さなければならず、したがって望ましい
遅延したクリアランスの程度には限界があることは明ら
かである。

【０１２４】実施例６：健康な小児におけるＧＨＢＰ、
ＧＨ／ＧＨ-ＧＨＢＰ錯体およびＧＨの２４時間血漿特
性図の分析 我々は健康な小児から得られる血漿特性図中のＧＨＢＰ
を測定するためにＬＩＦＡを使用した。ＧＨはＩＲＭＡ
によって測定した。異なる年齢(６〜１７歳)、身長(−
３.７〜＋３.５ＳＤＳ)および思春期段階(１〜４)の１
２人の健康な小児(３人の少女と９人の少年)から得られ
る１５の２４時間血漿特性図を調べた。血液を連続的に
２４時間採取し、２０分毎に集めた。ＧＨ、ＧＨＢＰお
よびＧＨ／ＧＨＢＰ錯体について時間系列を交差相関と
フーリエ分析によって分析した。ＧＨはすべての対象に
おいて搏動性の様式で分泌された。ＧＨ／ＧＨＢＰ錯体
の濃度は試料採取期間中に変動し、その変化はＧＨパル
スと相関係数が最大ゼロ時間遅延に近づく有意な相関関
係にあった。対象的に総ＧＨＢＰ濃度の変化は微小(Ｃ
Ｖ〜１０％)であり、ＧＨパルスとは相関しなかった。
フーリエ分析はＧＨとＧＨ／ＧＨＢＰ錯体について類似
のスペクトラル・パワー様式を示し、より高い周波数の
成分と共に日周的リズム(１２〜２４時間期間)を示唆し
ている。総ＧＨＢＰ濃度の微細な変動にもかからわず、
フーリエ変換は著しい日周的リズムを明らかにし、より
高い周波数成分ははるかに少量であった。我々は、２４
時間の試料採取期間中の総ＧＨＢＰの変化が小さく、か
つ、そのレベルを単一の無作為血液試料から見積もるこ
とができると結論する。

【０１２５】材料および方法対象 異なる年齢(６〜１５歳)、身長(−３.７〜＋３.５ＳＤ
Ｓ)および思春期段階(段階１〜４)の１２人の小児(３人
の少女と９人の少年)をチルドレンズ・ホスピタル(Chil
dren's Hospital)(スウェーデン,ゲテボルグ)で調査し
た。これら対象のうち２人は２回以上調べた(表６)。研
究時の身長を正常なスウェーデン小児と比較したＳＤ値
で表した(Karlberg P,Taranger J,Engstr〓m I,Lichten
stein H,Svennberg-Redegren I.The somatic developme
nt of children in a Swedish urban community．Acta
Pediatrica Scand.1976；Suppl.258:1)。すべての小児
は健康であり栄養状態もよく、正常な甲状腺、肝臓およ
び腎臓機能を有していた。小児脂肪便症は除外した。古
典的なＧＨ欠損症を伴う小児はこの研究に含まれなかっ
た。睾丸の体積をオーキドメーターで測定し、思春期段
階をタナー(TannerJM,Whitehouse RH.Clinical longitu
dinal standards for height velocity,weight velocit
y and stages of puberty.Arch.Dis.Child.51:170-179
[1976])に従って分類した。

【０１２６】

【表６】 対象の特徴 フ゜ロフィール 対象 性別 年齢 身長 体重 思春期 番号 (ＳＤＳ) (ＳＤＳ ) Ｂ／Ｔ^a ＰＨ^b １ Ａ 女 6 0/12 ＋2.5 ＋2.0 1 1 ２ Ｂ 女 12 8/12 −1.9 −2.0 1 1 ３ Ｃ 女 13 3/12 −1.0 0 3 2 ４ Ｄ 男 7 11/12 −0.3 ＋0.5 1ml 1 ５ Ｅ 男 11 0/12 −2.3 −2.0 2ml 1 ６ Ｆ 男 11 2/12 −2.0 −1.5 3ml 1 ７ Ｇ 男 11 3/12 ＋3.0 ＋2 2ml 1 ８ Ｈ 男 13 0/12 ＋1.0 ＋1.0 15ml 3 ９ Ｈ 男 13 9/12 ＋0.8 ＋0.8 15ml 4 １０ Ｉ 男 12 5/12 ＋0.7 ＋0.1 4ml 1 １１ Ｉ 男 12 6/12 ＋0.7 0 4ml 1 １２ Ｉ 男 13 3/12 ＋0.4 −0.4 5ml 1 １３ Ｊ 男 14 0/12 −1.8 −1.8 6ml 1 １４ Ｋ 男 14 7/12 −2.5 −1.5 12ml 3１５ Ｌ 男 14 8/12 −3.7 −3.2 5ml 2 ^a胸発育(Ｂ)、睾丸体積(Ｔ) ^b陰毛(ＰＨ)

【０１２７】研究手法 子供たちは少なくとも２日間病院に滞在した。０８.０
０時に朝食、１２.００時に昼食、１７.００時に夕食と
して彼らに通常の食事を与え、正常な活動と睡眠を許し
た。ヘパリン処理した針(Carmeda,スウェーデン,ストッ
クホルム)を最初の晩に挿入した。翌朝０８.００時〜０
９.００時に針を通して挿入し一定吸引ポンプ(Swemed A
B,スウェーデン,ゲテボルグ)に連結したトロンボジェニ
ック・カテーテルを通して血液採取を開始した。吸引の
速度は０.５〜２ｍｌ／ｈであり、管の体積は０.１〜
０.２ｍｌであった。ヘパリン処理した貯蔵チューブを
２０分毎に２４時間交換し、７２試料を得た。血液試料
を室温に保存し、２４時間以内に遠心分離した。遠心分
離後、血漿を検定するまで凍結した。

【０１２８】ＧＨ測定 血漿ＧＨ濃度を、ポリクロナール抗体に基づくＩＲＭＡ
(Pharmacia,スウェーデン)を用い、ＷＨＯ First Inter
national Reference Preparation ｈＧＨ６６２１７を
標品として正副２回決定した。検定内偏差は２〜１００
ｍＵ／Ｌの間のＧＨレベルで３.２〜３．５％であっ
た。検定間偏差は１０ｍＵ／Ｌおよび４０ｍＵ／ＬのＧ
Ｈ濃度でそれぞれ５.０％および２.７％であった。適当
な場合には２.７Ｕ／ｍｇの変換因子と２２０００の分
子量を用いてＧＨ濃度をｐｍｏｌ／Ｌで表した。

【０１２９】ＧＨＢＰ測定 総ＧＨＢＰを既に詳述したようにＬＩＦＡで測定した。
簡単に述べると、コート緩衝液中１０μｇ／ｍＬの抗体
１００μＬ／ウェルと共に４℃で終夜インキュベートす
ることにより、９６穴微量滴定プレート(Corning Glass
Works,ニューヨーク州コーニング)をＧＨＢＰに対する
モノクローナル抗体(ＭＡｂ２６３,Agen,オーストラリ
ア)でコートした。コートしたウェルを遮断し、洗浄し
た。標品(組換えｈＧＨＢＰ，Genentech,Inc.)または試
料(５０μＬ／ウェル)を、５０μｌ／ウェルの２００ｎ
ｇ／ｍｌ ｒｈＧＨを含有するコートしたウェル中に分
配した。プレートを密封し、穏やかに撹拌しながら室温
で２時間インキュベートした後、洗浄してから、西洋ワ
サビペルオキシダーゼに結合させたモノクローナル抗ｈ
ＧＨ抗体(ＭＡｂ ＭＣＢ，Genentech,Inc.)を加えた(１
００μｌ／ウェル)。さらに室温で２時間インキュベー
トした後、プレートを洗浄緩衝液で６回洗浄した。新た
に調製した基質溶液(ＰＢＳ１リットル中０.４ｇのｏ-
フェニレンジアミン＋３０％過酸化水素０.４ｍｌ)をプ
レートに加え(１００μｌ／ウェル)、遮光下室温で１５
分間インキュベートした。２.２５ｍｏｌ／Ｌの硫酸１
００μｌを添加することによって反応を止め、４９０ｎ
ｍの吸光度を決定した。ＧＨ／ＧＨＢＰ錯体の血漿濃度
を測定するために、ｒｈＧＨを試料に加えないで同じ手
法を用いた。ＬＩＦＡでの検出範囲は１５.６〜１００
０ｐｍｏｌ／Ｌであった。検定内および検定間偏差係数
はそれぞれ７.３％および１１.３％であった。

【０１３０】統計学的分析 ２４時間特性図の周期性をフーリエ変換によって分析し
た。高周波数成分の影響を減じるために、元のＧＨ、Ｇ
ＨＢＰおよびＧＨ／ＧＨＢＰ錯体濃度時系列を３点移動
平均過程(重さｗ_-1＝ｗ₊₁＝１／４，ｗ₀＝１／２)で滑
らかにした。滑らかにした系列をフーリエ展開として分
析した(Chatfield C."The analysis oftime series."
チャップマン・アンド・ホール,ロンドン,1989)。その結
果を、周波数の関数として強度をプロットする累乗スペ
クトルとして表現した。ＧＨ、ＧＨＢＰおよびＧＨ／Ｇ
ＨＢＰ錯体間の相関関係についてデータを分析するため
に、相互相関とそれに続くボックス・ジェンキンス(Box
-Jenkins)自己回帰モデリング(Haugh L.Box GEP."Ident
ification of dynamic regression (distributed lag)
models connecting two series",Journal of the Ameri
can Statistics Association.1977;72:121-130)を用い
た。

【０１３１】結果ＧＨ、ＧＨ／ＧＨＢＰ錯体および総ＧＨＢＰの血漿特性
図 １つの代表的対象(プロフィール番号１５)から得たＧ
Ｈ、ＧＨ／ＧＨＢＰ錯体および総ＧＨＢＰの２４時間血
漿特性図を図７および８に示す。ＧＨ(上段)とＧＨ／Ｇ
ＨＢＰ錯体(中段)の血漿濃度は共に試料採取の期間中広
い範囲で変動し、その変化は同時性をもっているように
思われる。対照的に、ＧＨＢＰの総濃度(下段)は変動が
はるかに少なくＧＨおよびＧＨ／ＧＨＢＰ錯体濃度の変
化による影響を受けないように思われた。

【０１３２】ＧＨ、ＧＨＢＰおよびＧＨ／ＧＨＢＰ錯体
の血漿濃度 ＧＨ、ＧＨＢＰおよびＧＨ／ＧＨＢＰ錯体の血漿濃度を
表７に示す。与えられた値は個々の２４時間特性図それ
ぞれについての平均および変動の係数(ＣＶ)並びに群平
均である。ＧＨＢＰ、ＧＨ／ＧＨＢＰ錯体およびＧＨの
平均濃度は異なる個体間で変動した(ＧＨＢＰ、ＧＨ／
ＧＨＢＰ錯体およびＧＨについてそれぞれ１０９〜２４
７ｐｍｏｌ／Ｌ、１３〜１０９ｐｍｏｌ／Ｌおよび３２
〜２１５ｐｍｏｌ／Ｌ)。ＧＨおよびＧＨ／ＧＨＢＰ錯
体血漿特性図の高度な搏動性はそれらの高いＣＶに反映
された(それぞれ１５６.０％および４７.２％)。高いＧ
Ｈピーク(２５０ｐｍｏｌ／Ｌ)においてＧＨＢＰに結合
しているＧＨの百分率は１４.６％であった。総ＧＨＢ
Ｐの濃度は低い変動係数(９.６％)によって示されるよ
うに試料採取の期間中はるかに変動が少なかった(表
７)。すべての対照から得た総ＧＨＢＰ濃度の完全な２
４時間特性図は個体間でレベルが変動すること、並び
に、各対象についての濃度がその日を通して比較的一定
であることを明らかにした。

【０１３３】

【表７】 総ＧＨＢＰ、ＧＨ／ＧＨＢＰ錯体およびＧＨの平均血漿濃度 特性図 総ＧＨＢＰ ＧＨ／ＧＨＢＰ錯体 ＧＨ Ｐ 番号 平均 ＣＶ 平均 ＣＶ 平均 ＣＶ (pmol/L) (％) (pmol/L) (％) (pmol/L) (％) 1 109.3 9.4 34.8 25.6 73.1 129.6 2 235.2 9.5 12.9 113.9 83.3 178.5 3 179.0 12.7 26.2 111.0 99.8 128.9 4 148.5 8.1 24.1 25.8 40.4 107.7 5 198.9 7.8 47.3 51.0 167.9 176.7 6 160.1 8.6 25.7 28.6 36.6 160.7 7 215.0 5.5 39.8 22.5 31.6 151.0 8 247.4 7.7 108.8 15.3 215.2 121.6 9 217.5 9.3 80.1 17.2 189.1 133.7 10 126.2 11.8 28.2 46.4 163.4 151.3 11 120.4 13.8 20.7 37.0 101.9 125.7 12 168.7 9.2 34.3 43.4 99.8 119.4 13 130.0 11.1 29.5 41.5 140.9 154.9 14 191.1 11.8 19.8 107.5 103.7 99.1 15 199.8 7.0 45.4 21.9 39.3 153.5 平均 176.5 9.6±0.6 38.5 47.2±9.2 110.0 139±6.3

【０１３４】考察 ＧＨＢＰを監視する目的は、健康な小児におけるＧＨＢ
Ｐの血漿濃度の考え得る日周の変動を調べること、並び
に、ＧＨＢＰ濃度の変動がＧＨの一時的な放出と相関す
るかどうかを決定することであった。我々の研究に含ま
れた対象は年齢、性別、思春期段階、身長およびＧＨレ
ベルが異なった。実用的な観点からこのデータから得ら
れる最も有用な発見は、総ＧＨＢＰ濃度が２４時間の試
料採取期間中に小さな変動しか示さず、単一の血液試料
によって総ＧＨＢＰレベルのよい見積もりが得られるこ
とを意味しているということであると我々は考える。そ
れにもかかわらず、データの厳密な分析は総ＧＨＢＰ血
漿濃度の小さい(ＣＶ〜１０％)搏動が有意な概日リズム
の原因であることを明らかにした。ＧＨパルスと総ＧＨ
ＢＰ濃度の変化の間には有意な相互相関が認められなか
った。対照的にＧＨ／ＧＨＢＰ錯体の血漿濃度は迅速な
搏動を示し、それはＧＨ濃度の変化と高度に相関した。
フーリエ解析はＧＨとＧＨ／ＧＨＢＰ錯体の血漿様式が
共に日周的なリズムに従うが、より高い周波数の成分
(４時間付近)をも有することを示した。

【０１３５】ＧＨＢＰ測定に用いた記載のＬＩＦＡは機
能的なＧＨＢＰのみを検出すること、並びに、迅速に広
範囲で搏動する内因性ＧＨが総ＧＨＢＰ濃度の測定に影
響を与えないことという利点を有する。ＧＨ／ＧＨＢＰ
錯体の濃度を測定することもできる。ＧＨに対するＧＨ
ＢＰの比率が１：１を超えた場合、１つのＧＨ分子と２
つのＧＨＢＰ分子からなる三量体が形成し得ることが最
近報告された。この三量体は捕捉抗体によって結合され
得ないので、ＬＩＦＡで測定されるＧＨ／ＧＨＢＰ錯体
は１つのＧＨ分子と１つのＧＨＢＰ分子によって形成さ
れるヘテロ二量体である。ＧＨ濃度が増大した時(例え
ばＬＩＦＡの試料にｒｈＧＨを加えた時あるいは内因性
ＧＨピーク中)には、三量体［ＧＨ-(ＧＨＢＰ)２］が解
離して、二量体［ＧＨ-ＧＨＢＰ］が形成し、これはＭ
Ａｂ２６３によって結合され得る。このことは、内因的
に形成した三量体のＧＨＢＰ分子を含むすべてのＧＨＢ
Ｐが総ＧＨＢＰ濃度に関する検定で検出できることを意
味している。

【０１３６】我々は、高いピーク(＞２５０ｐｍｏｌ／
Ｌ)中のＧＨの約１５％がＧＨ／ＧＨＢＰ錯体中に結合
されていることを発見したが、いくらかのＧＨはＧＨＢ
Ｐと三量体を形成しているであろうから、ＧＨの総結合
部分はより高いであろう。

【０１３７】連続的試料中のＧＨＢＰの血漿濃度の変動
は既に２つの研究で扱われている(Snow,KJ,Shaw MA,Win
er LM,Baumann G."Diurnal pattern of plasma growth
hormone-binding protein in man",J Clin Endocrinol
Metab.;70:417-420(1990)；Hochberg Z,Amit T,Zadik
Z."Twentyfour-hour profile of plasma growth hormon
e-binding protein",J.Clin Endocrinol Metab.72:236-
239(1991))。Snowらによる研究は低ＧＨレベルを伴う成
人で行われ、試料採取期間中に総ＧＨＢＰレベルに大き
な変動がないという我々の結果と一致している。しか
し、Snowらの研究ではＧＨパルスがないか、もしくは極
めて低いので、搏動性ＧＨ分泌を伴う対象におけるＧＨ
が誘発するＧＨＢＰレベルの変動を排除することができ
なかった。Hochbergらによるもう１つの研究では、ＧＨ
とＧＨＢＰのレベルが搏動性ＧＨ分泌を伴う正常な小児
から得られた試料で測定され、３０分以内にＧＨパルス
の大部分がＧＨＢＰパルスを伴うと結論づけられた。こ
れは総ＧＨＢＰ濃度の微小な変化しか検出されず、ＧＨ
パルスと相関しなかった本結果とは対照的である。この
２つの研究間の不一致の理由は明らかではないが、ＧＨ
ＢＰ検定法間の相違によるものであり得る。ＬＩＦＡは
総ＧＨＢＰ(即ち遊離のＧＨＢＰとＧＨが結合したＧＨ
ＢＰの和)を直接測定するが、Hochbergらが用いた検定
法はＧＨＢＰに対する放射性標識ｈＧＨの結合に基づい
ており、次いでそれらの値が内因性ＧＨによる妨害につ
いて修正されている。ＧＨ／ＧＨＢＰ錯体に関するわれ
われのデータはこの錯体が迅速に形成し、清掃されるこ
とを示しているので、HochbergらがＧＨパルスの３０分
後に観測した見かけ上のＧＨＢＰパルスは、より多くの
標識ＧＨが結合することを可能にするＧＨＢＰの脱飽和
を反映しているのであろう。

【０１３８】総ＧＨＢＰレベルは異なる対象では広範囲
にわたって変動し(１０９〜２４７ｐｍｏｌ／Ｌ)、これ
らのレベルはおそらく年齢、性別、思春期段階、成長速
度などの相違と相関するのであろう。我々はＧＨＢＰレ
ベルがその日を通して比較的一定であり、総ＧＨＢＰ濃
度を見積もるには単一の、もしくは貯蔵された血液試料
で充分であると結論する。この発見はより大きな集団で
の比較を容易にし、診断手段としてのＧＨＢＰ測定の価
値を例示する。

【０１３９】実施例７：正常および低身長小児のＧＨＢ
Ｐ決定 ＬＩＦＡ検定法を用いてヒトＧＨＢＰについて成長ホル
モン結合タンパク質を検定した。その結果を下記の表
８、９、１０および１１に記載する。これらの表は正常
な小児(表８)並びに３種の異なる病因(特発性成長ホル
モン欠乏(ＧＨＤ)(表９)、(ＩＳＳ)(表１０)およびター
ナー症候群(表１１))による低身長の小児におけるＧＨ
ＢＰレベルに関する要約した統計を含んでいる。正常の
データはジェネンテク(Genentech)の対照中の試料と外
部の研究者との共同から得た。低身長の小児からの試料
はプロトロピン(Protropin（登録商標）)ヒト成長ホル
モンからの進行中の市販後監査プロジェクト、ジェネン
テク・ナショナル・コオペラティブ・グロウス・スタディ(G
enentech National Cooperative Growth Study)(ＮＣＧ
Ｓ)の一部として得た。今ではＩＳＳ小児はＧＨＢＰ欠損
症がおそらく基礎となる成長ホルモン受容体欠損症を反
映している点でもはや特発性でない。

【０１４０】正常な小児に関する要約した統計は性別と
年齢によって表され、ＧＨＢＰに関する成長範囲の我々
の最適な見積もりである。これらの統計は平均と平均±
２標準偏差(ＳＤ)からなり、ＧＨＢＰレベルの整理編集
された(ベース１０)値から決定した後、元の単位に変換
して戻した。３歳、４歳および６歳から１５歳の男性お
よび女性のみについてこれらの計算を行うに足るデータ
があったことに注意すること。他の年齢の小児からのデ
ータおよび成人からのデータは少なすぎて平均のよい見
積もりが可能でなかった。

【０１４１】低身長の病因のそれぞれについて記載した
要約した統計は同じ試料サイズ、平均および平均±１Ｓ
Ｄである。これらの値を正常者について記述したのと同
じ方法で計算した。統計は試料サイズにかからわず利用
できるすべてのデータについて年齢および性別によって
印刷した。ＧＨＢＰの単位はｐｍｏｌ／リットルであ
る。

【０１４２】

【表８】 成長ホルモン結合タンパク質平均 （ＧＨＢＰ正常範囲） 性別 年齢 Ｎ 平均−２ＳＤ 平均 平均＋２ＳＤ 男 ３ ２０ ５７.４ １２７.３ ２８２.５ 男 ４ ２１ ６４.６ １２０.２ ２２３.５ 男 ６ ３１ ５６.５ １１１.６ ２２０.６ 男 ７ ３１ ７８.２ １４３.０ ２６１.７ 男 ８ ３４ ６２.７ １７８.５ ５０７.７ 男 ９ ３６ ６４.９ １９８.１ ６０４.７ 男 １０ ３７ ６２.５ ２２６.９ ８２２.８ 男 １１ ４０ ７０.７ ２３４.６ ７７９.０ 男 １２ ４８ ７９.４ ２３８.０ ７１３.３ 男 １３ ３３ ７２.５ ２３１.７ ７３９.９ 男 １４ ３７ ６７.６ ９７.７ ５７８.４ 男 １５ ３３ ５１.７ １７３.４ ５８１.８ 女 ３ １５ ７７.４ １４９.３ ２８８.０ 女 ４ １７ ６２.０ １７９.３ ５１８.６ 女 ６ ３３ ５７.８ １４２.７ ３５１.９ 女 ７ ３２ ７３.５ １７５.２ ４１７.７ 女 ８ ３３ ９３.７ ２３０.９ ５６８.８ 女 ９ ３６ ９０.８ ２１５.７ ５１２.４ 女 １０ ３２ ７１.２ ２４４.６ ８４１.０ 女 １１ ３３ ９７.５ ２８５.８ ８２８.３ 女 １２ ３６ ８７.７ ２２８.７ ５９６.８ 女 １３ ３６ １１３.０ ３０５.９ ８２７.８ 女 １４ ３５ ９９.７ ２６０.２ ６７８.７ 女 １５ ２８ １２２.４ ３４５.８ ９７６.５

【０１４３】

【表９】 成長ホルモン結合タンパク質平均 （特発性ＧＨＤ：ＧＨＢＰレベル） 性別 年齢 Ｎ 平均−１ＳＤ 平均 平均＋１ＳＤ 男 １ １ − ７３.５ − 男 ３ ３ ４０.３ ６３.７ １００.７ 男 ４ ５ ５６.３ ９５.４ １６１.７ 男 ５ ３ ７９.５ ９６.５ １１７.１ 男 ６ ７ ７６.９ ９７.３ １２３.１ 男 ７ １ − ５９.４ − 男 ８ ４ ８７.３ １２７.８ １８７.１ 男 ９ ５ ８１.９ １２８.９ ２０３.０ 男 １０ １２ ７３.５ １５０.３ ３０７.２ 男 １１ ９ １０８.５ １７７.５ ２９０.２ 男 １２ １４ １０６.８ １９３.５ ３５０.４ 男 １３ １６ １０２.１ １６４.４ ２６４.６ 男 １４ １７ ８３.０ １４９.８ ２７０.４ 男 １５ １７ １２２.４ １９１.１ ２９８.３ 男 １６ ５ １３２.１ ２３１.４ ４０５.３ 男 １７ ４ １３６.０ １６５.０ ２００.２ 男 １８ １ − ７７２.５ − 女 ３ １ − ５５.８ − 女 ５ ２ ７７.４ ８２.５ ８７.９ 女 ６ ３ １１７.８ １５７.６ ２１０.８ 女 ８ ２ ２００.３ ２４１.３ ２９０.７ 女 ９ ２ ４３.８ ５９.７ ８１.３ 女 １０ ３ ８３.４ ２５３.９ ７７２.７ 女 １ １０ ９１.０ １６２.５ ２９０.３ 女 ２ ７ ８９.０ １８９.９ ４０５.２ 女 １３ ２ ８６.６ １５４.５ ２７５.９ 女 ５ ２ ２９４.０ ３９８.６ ５４０.４

【０１４４】

【表１０】 成長ホルモン結合タンパク質平均 （ターナー症候群：ＧＨＢＰレベル） 性別 年齢 Ｎ 平均−１ＳＤ 平均 平均＋１ＳＤ 女 ４ ２ ９３.２ １１８.１ １４９.５ 女 ５ ４ ８４.１ １０８.３ １３９.４ 女 ６ ７ ６５.３ １３５.８ ２８２.２ 女 ７ ４ ９７.５ １４６.１ ２１８.９ 女 ８ ５ １１６.３ １９４.５ ３２５.４ 女 ９ １０ １０７.９ １９９.０ ３６７.２ 女 １０ １１ １０５.８ １８２.７ ３１５.７ 女 １１ ８ １８１.０ ２４１.９ ３２３.２ 女 １２ ８ １３９.４ ２８６.４ ５８８.２ 女 ３ ９ １３３.３ ２４１.８ ４３８.７ 女 １４ １５ ２２２.２ ３２１.４ ４６４.８ 女 １５ ６ １０１.０ １８９.０ ３５３.５ 女 １６ ６ １４７.４ ２３７.６ ３８３.０ 女 １７ ２ １１７.６ １３６.０ １５７.４

【０１４５】

【表１１】 成長ホルモン結合タンパク質平均 （特発性低身長：ＧＨＢＰレベル） 性別 年齢 Ｎ 平均−１ＳＤ 平均 平均＋１ＳＤ 男 ２ １ − ３７.３ − 男 ３ ８ ４６.０ １００.２ ２１８.５ 男 ４ １４ ６８.６ ９６.３ １３５.４ 男 ５ ２４ ６１.０ ８６.１ １２１.６ 男 ６ １７ ４７.９ ６５.１ ８８.４ 男 ７ ３５ ５２.９ ８３.０ １３０.０ 男 ８ ２９ ６１.１ ９０.８ １３５.０ 男 ９ ２５ ６４.７ １１０.７ １８９.３ 男 １０ ４５ ６９.５ １０８.３ １６８.６ 男 １１ ４３ ６７.０ １０６.１ １６８.０ 男 １２ ７７ ７０.５ １０９.５ １７０.２ 男 １３ ７３ ７３.５ １１７.９ １８９.３ 男 １４ ７１ ７０.８ １１０.４ １７２.０ 男 １５ ５１ ６４.７ １１３.８ ２００.３ 男 １６ １２ ５５.９ １０２.９ １８９.４ 男 １７ ５ ８０.３ １１２.７ １５８.２ 男 １８ ２ ６４.５ １９５.０ ５８９.６ 男 １９ １ − ９３.８ − 男 ２１ １ − １８４.３ − 男 ２３ １ − ３６.９ − 女 １ １ − ６３.３ − 女 ２ ２ ５６.８ ５７.４ ５８.０ 女 ３ ２ ４５.３ ８８.２ １７１.４ 女 ４ ２ ８７.１ ８８.０ ８９.０ 女 ５ ４ ５０.８ ９１.４ １６４.５ 女 ６ ５ ４５.６ ８４.７ １５７.４ 女 ７ ６ ７６.６ １０９.２ １５５.６ 女 ８ ９ ７５.４ １１６.０ １７８.６ 女 ９ ９ ８９.８ １２０.７ １６２.２ 女 １０ １９ １０２.１ １７４.９ ２９９.７ 女 １１ ３１ ８４.３ １３９.３ ２３０.１ 女 １２ ２０ ８９.４ １５０.１ ２５２.２ 女 １３ １７ １１０.１ １４６.３ １９４.３ 女 １４ ９ １０２.１ １６０.９ ２５３.７ 女 １５ ４ ５６.５ １１０.７ ２１６.８ 女 １６ ２ １４８.１ １８２.２ ２２４.１

【０１４６】図９〜１３は正常ＧＨＢＰと様々な病因の
間の相違をグラフとして表したものである。ナショナル
・コオペラティブ・グロウス・スタディ患者から得られ
るＧＨ結合タンパク質レベルをプロットする(ＧＨＢＰ
の対数濃度対患者の年齢)。十字は平均値を表し、垂直
な実線は±１ＳＤを表し、垂直な点線は±２ＳＤを表
す。分離した黒点はそれぞれ１人の患者を表す。(図９)
男性に関する特発性ＧＨＤ；(図１０)女性に関する特発
性ＧＨＤ；(図１１)男性に関する特発性低身長；(図１
２)女性に関する特発性低身長；(図１３)ターナー症候
群。

【０１４７】正常と様々な病因の間を区別するためのＬ
ＩＦＡ検定法の臨床的利用を図９〜１３に見ることがで
きる。これは、特発性低身長患者が男性と女性の両方で
正常についての平均より顕著に低い図１１と１２におい
て特に著しい。これは、ＧＨＢＰのレベルを評価するた
めの臨床的に価値のある診断試験を提供し、かつ間接的
に成長ホルモン受容体の推定に基づく決定を提供する。

【０１４８】特発性低身長は、相対的ＧＨ耐性の状態と
見ることができるので、もはや特発性ではない。ＧＨＢ
Ｐの相対的欠失に基づいて、この耐性はＧＨに応答する
ことができるＧＨ受容体の欠乏によるものであろうと思
われる。ＩＳＳの現在の療法には毎日のｈＧＨ注射が含
まれる。ＧＨ受容体の欠乏に対する１つのアプローチは
存在する受容体を刺激するためにより高い投与量のＧＨ
を投与することである。現在使用されている１．１〜１
０倍の投与量がＧＨ応答を増大させると予期される。別
法として、ＩＳＳの根拠となる基礎が明らかにされたの
で、現在使用されているものとは異なる治療選択枝が示
唆される。正常なＧＨＢＰとおそらくは正常なＧＨ受容
体応答性の状況であるＧＨ欠乏症とターナー症候群では
ＧＨＢＰ＋ＧＨが論理的な治療である。ＩＳＳ患者で
は、存在するＧＨ受容体による応答を最大化するべく、
ＧＨＢＰ＋ＧＨを用いることもできる。しかし、ＩＳＳ
ではＩＧＦ-１療法的処置も必要である。ＩＧＦ-１は単
独で、あるいはＩＧＦ結合タンパク質と共に与えられ、
ＧＨおよび／またはＧＨＢＰと同時投与してもよい。Ｉ
ＳＳ患者はＧＨＢＰが減少しているので、ＧＨＢＰ＋Ｇ
Ｈの組み合わせが存在するＧＨ受容体による応答を上昇
させる。ＩＧＦ-１またはＩＧＦ-１＋ＩＧＦＢＰの治療
的量の投与は有効血清ＩＧＦ-１を上昇させ、それゆえ
に不完全なＧＨ応答を部分的に回避し、ＩＧＦ-１依存
性応答を刺激する。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒト成長ホルモン結合タンパク質を検出する
ための検定法の模式図である。

【図２】 ＭＡｂ５、４３および２６３によるＧＨ-Ｉ
¹²⁵を結合した被覆ＭＡｂ選択率(％)を３つの異なるイ
ンキュベーション方法に対するプロット。第１の実験で
は逐次的なインキュベーション操作を用いて、ＧＨＢＰ
をまずウェル上に被覆したＭＡｂと共にインキュベート
し、次いで放射性標識ＧＨ(ＧＨ-Ｉ¹²⁵)を添加した。第
２の実験では、ＧＨＢＰとＧＨ-Ｉ¹²⁵の反応をＭＡｂ被
覆ウェル中で同時に行った。第３の実験では、ＧＨＢＰ
をｈＧＨ-Ｉ¹²⁵と共に４℃で終夜予備インキュベート
し、次いでこれをＭＡｂ被覆ウェルに加えた。

【図３】 ＧＨとの予備インキュベーションを伴って作
成したものと、伴わずに作成したものの２つの標準曲線
の比較である。１組の標準はＧＨ(最終濃度２００ｎｇ
／ｍｌ)と共に＋４℃で終夜インキュベートし、対照標
準は検定緩衝液と共にインキュベートした。次いで、こ
のようにして作成した試料をＬＩＦＡで検定した。

【図４】 ２２ｋＤ ｈＧＨをリガンドとして用いたｈ
ＧＨＢＰ、２０ｋＤをリガンドとして用いたｈＧＨＢ
Ｐ、および２２ｋＤと２０ｋＤの組み合わせを用いたｈ
ＧＢＨＰの標準曲線である。

【図５】 検定緩衝液中に希釈しＬＩＦＡで測定したｈ
ＢＨＢＰに対する、３種の異なる血清試料の希釈液に基
づく理論的ｈＧＨＢＰ濃度のプロットである。

【図６】 １６人の健康な成人(試料番号１〜１６)と２
人のラロン(Laron)型矮小発育症患者(試料番号１７及び
１８)から得た無作為血清試料中の全ｈＧＨＢＰおよび
ｈＧＨ結合ｈＧＨＢＰレベルを示すグラフである。

【図７】 ＧＨとＧＨＢＰの相関関係を示す。１５歳の
少年から得た試料中のＧＨの２４時間血漿特性図(上パ
ネル)、ＧＨ／ＧＨＢＰ-錯体(中パネル)および全ＧＨＢ
Ｐ濃度(下パネル)(特性図番号１５，表６)。

【図８】 図７で得たデータの統計学的相関関係分析を
示す。

【図９】 患者の年齢に対するＧＨＢＰ対数濃度を示す
ナショナル・コーペラティブ・グロウス・スタディー(N
ational Cooperative Growth Study：ＮＣＧＳ)患者に
おけるＧＨ結合タンパク質レベルを示す（男性に関する
特発性成長ホルモン欠損症(ＧＨＤ)）。十字は平均値を
表す。垂直な実線は±１ＳＤである。垂直な点線は±２
標準偏差(ＳＤ)である。

【図１０】 患者の年齢に対するＧＨＢＰ対数濃度を示
すナショナル・コーペラティブ・グロウス・スタディー
(National Cooperative Growth Study：ＮＣＧＳ)患者
におけるＧＨ結合タンパク質レベルを示す（女性に関す
る特発性ＧＨＤ）。十字は平均値を表す。垂直な実線は
±１ＳＤである。垂直な点線は±２標準偏差(ＳＤ)であ
る。

【図１１】 患者の年齢に対するＧＨＢＰ対数濃度を示
すナショナル・コーペラティブ・グロウス・スタディー
(National Cooperative Growth Study：ＮＣＧＳ)患者
におけるＧＨ結合タンパク質レベルを示す（男性に関す
る特発性低身長(ＩＳＳ)）。十字は平均値を表す。垂直
な実線は±１ＳＤである。垂直な点線は±２標準偏差
(ＳＤ)である。

【図１２】 患者の年齢に対するＧＨＢＰ対数濃度を示
すナショナル・コーペラティブ・グロウス・スタディー
(National Cooperative Growth Study：ＮＣＧＳ)患者
におけるＧＨ結合タンパク質レベルを示す（女性に関す
るＩＳＳ）。十字は平均値を表す。垂直な実線は±１Ｓ
Ｄである。垂直な点線は±２標準偏差(ＳＤ)である。

【図１３】 患者の年齢に対するＧＨＢＰ対数濃度を示
すナショナル・コーペラティブ・グロウス・スタディー
(National Cooperative Growth Study：ＮＣＧＳ)患者
におけるＧＨ結合タンパク質レベルを示す（ターナー(T
urner)症候群）。十字は平均値を表す。垂直な実線は±
１ＳＤである。垂直な点線は±２標準偏差(ＳＤ)であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/00 Ｃ０７Ｋ 16/26 38/27 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ０７Ｋ 16/26 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 37/36 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 ウェイ・リー・タン・ウォン アメリカ合衆国カリフォルニア94022、ロ ス・アルトス、アリック・レイン26333番

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＡＴＣＣ番号ＨＢ-１０５９６を有する
   ラインＨＧＨ-Ｂからなるヒト成長ホルモンに特異的な
   抗体を生産するマウスハイブリドーマ。
2. 【請求項２】 マウスハイブリドーマＨＧＨ-Ｂによっ
   て生産される抗体。
3. 【請求項３】 哺乳動物の成長と同化作用を促進する方
   法であって、(ａ)成長ホルモンによって誘発される応答
   を促進するのに必要な成長ホルモン結合タンパク質の最
   適量を決定し、(ｂ)リガンド媒介免疫機能的検定法によ
   って、該誘発される応答が欠乏していると疑われる人の
   生物学的液体中に存在する成長ホルモン結合タンパク質
   の量を測定し、(ｃ)(ａ)と(ｂ)を比較して、もし(ａ)が
   (ｂ)より大きければ、該成長ホルモン結合タンパク質を
   使って、成長ホルモン結合ホルモンの血清濃度を該最適
   量まで増大させるに足る量の製剤を投与することができ
   る医薬製剤を製造する、ことからなる方法。
4. 【請求項４】 工程(ｃ)において成長ホルモン結合タン
   パク質を成長ホルモンと錯化させる請求の範囲第３項の
   方法。
5. 【請求項５】 該成長ホルモン結合タンパク質と成長ホ
   ルモンがヒト成長ホルモン結合タンパク質とヒト成長ホ
   ルモンである請求の範囲第４項の方法。
6. 【請求項６】 成長ホルモン結合タンパク質-成長ホル
   モン錯体の成長促進量を注射する頻度を減じる方法であ
   って、(ａ)最適成長を維持するのに必要な成長ホルモン
   -成長ホルモン結合タンパク質の最小必要限度の血清濃
   度レベルを決定し、(ｂ)リガンド媒介免疫機能的検定に
   よって成長ホルモン結合タンパク質-成長ホルモン錯体
   が欠乏していると疑われる患者中に存在する成長ホルモ
   ン結合タンパク質の血清濃度レベルを測定し、もし(ｂ)
   の錯体レベルが(ａ)の錯体レベルより低ければ、(ｃ)２
   日より長い期間錯体の血清濃度レベルを維持するに足る
   量の成長ホルモン結合タンパク質-成長ホルモン錯体を
   投与することができる医薬製剤を製造することからなる
   方法。
7. 【請求項７】 哺乳動物または鳥類の成長ホルモン応答
   性組織を刺激する方法であって、成長ホルモン結合タン
   パク質と成長ホルモンの治療的有効量を投与することが
   できる医薬製剤を製造することからなる方法。
8. 【請求項８】 該成長ホルモン結合タンパク質がヒト成
   長ホルモン結合タンパク質であり、該成長ホルモンがヒ
   ト成長ホルモンである請求の範囲第７項の方法。
9. 【請求項９】 インスリン様成長因子-Ｉの治療的有効
   量をさらに含有する請求の範囲第７項の方法。
10. 【請求項１０】 インスリン様成長因子結合タンパク質
    の治療的有効量をさらに含む請求の範囲第９項の方法。
11. 【請求項１１】 特発性低身長を有するヒトを刺激する
    方法であって、インスリン様成長因子-Ｉの治療的有効
    量を投与することができる医薬製剤を製造することから
    なる方法。
12. 【請求項１２】 インスリン様成長因子結合タンパク質
    の治療的有効量をさらに含む請求の範囲第１１項の方
    法。
13. 【請求項１３】 ヒト成長ホルモンの治療的有効量をさ
    らに含む請求の範囲第１２項の方法。
14. 【請求項１４】 ヒト成長ホルモン結合タンパク質の治
    療的有効量をさらに含む請求の範囲第１３項の方法。