WO2009147060A1 - Verfahren zur aufreinigung von erythropoietin - Google Patents

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WO2009147060A1
WO2009147060A1 PCT/EP2009/056544 EP2009056544W WO2009147060A1 WO 2009147060 A1 WO2009147060 A1 WO 2009147060A1 EP 2009056544 W EP2009056544 W EP 2009056544W WO 2009147060 A1 WO2009147060 A1 WO 2009147060A1
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chromatography
erythropoietin
anion exchange
exchange chromatography
hydroxyapatite
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PCT/EP2009/056544
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Wolfgang Wienand
Franz-Rudolf Kunz
Dietmar Reichert
Wilfried Eul
Rudolf Hanko
Christian Birr
Monika Singhofer-Wowra
Dagmar KÖNIG
Lars Faber
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Evonik Degussa Gmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]

Definitions

  • the present invention relates to a method for the purification of erythropoietin, wherein erythropoietin-containing culture supernatant of erythropoietin-producing eukaryotic cells is processed by certain chromatographic purification steps carried out in a fixed manner one after the other.
  • EPO Erythropoietin
  • EPO Erythropoietin
  • EPO is primarily produced in the kidneys and from there via the bloodstream to its destination.
  • the damaged kidneys produce too little or no EPO at all, with the result that too few erythrocytes emerge from the stem cells of the bone marrow.
  • This so-called renal anemia can be treated by administering EPO in physiological amounts that stimulate the formation of erythrocytes in the bone marrow.
  • the EPO used for administration can either be obtained from human urine or generated by genetic engineering methods. Since EPO is present in trace amounts in the human body, isolating EPO from the natural source is virtually impossible for therapeutic applications. Therefore, genetic engineering methods provide the only economic opportunity to produce this substance in larger quantities.
  • erythropoietin The recombinant production of erythropoietin is usually carried out in CHO host cells. While these were formerly cultivated in culture media to which fetal calf serum and sometimes also bovine insulin had been added, cultivation nowadays regularly takes place in serum- and protein-free medium. In this way, the risk of contamination with bovine proteins, bovine viruses, bovine DNA or other unwanted substances of bovine origin can be completely avoided.
  • suitable serum and protein free media are available from various commercial manufacturers, e.g. the medium MAM-PF2, marketed by, among others by Bioconcept, Allschwil, Switzerland, or the media DMEM and DMENU12, offered e.g. by Invitrogen / Gibco, Eggenstein, Germany.
  • EP-A-0 228 452 describes a process for purifying biologically active erythropoietin from a liquid, comprising the chromatographic steps of anion exchange chromatography and reversed-phase chromatography.
  • EP-A-0 267 678 describes the purification of an erythropoietin prepared in serum-free culture, followed by dialysis, ion exchange chromatography, preparative reversed-phase HPLC and gel filtration chromatography.
  • the gel filtration chromatography step can be replaced by ion exchange chromatography. It is also proposed to carry out dye affinity chromatography on a blue trisacryl column before (first) ion exchange chromatography.
  • EP-AO 830 376 describes a process for the purification of erythropoietin, in which EPO from the culture supernatant is subjected to dye affinity chromatography in the first step of the chromatographic purification. The second step is followed by chromatography on a hydrophobic support, followed by hydroxyapatite chromatography. This is followed by reversed-phase HPLC, followed by anion exchange chromatography as the last chromatography step.
  • EP-A-1 127 063 describes a purification process for
  • Erythropoietin comprising the following steps: differential precipitation, hydrophobic interaction chromatography, diafiltration, anion exchange chromatography, cation exchange chromatography and size exclusion chromatography.
  • the individual purification steps are carried out in EP-A-1 127 063 in the order mentioned.
  • purification comprises the following steps: differential precipitation, hydrophobic interaction chromatography, diafiltration, anion exchange chromatography, cation exchange chromatography, further diafiltration and size exclusion chromatography.
  • the method provides for precipitation followed by centrifugation.
  • gel filtration is mandatory to complete the chromatographic purification.
  • WO2005 / 121173 specifies a process for the purification of EPO produced by means of fermentative processes. This method is based on a chromatographic purification with at least four different chromatographic separation methods. The first anion exchange chromatography is followed by affinity chromatography, hydrophobic interaction chromatography and hydroxyapatite chromatography, the order of these 3 latter types of chromatography being arbitrary. Finally, anion exchange chromatography is again used.
  • EPO which satisfies the purity criteria required by the European Pharmacopoeia.
  • Criteria for a suitable EPO include i.a. a content of foreign proteins originating from the host cell of ⁇ 100 ppm, content of DNA from the host cell of ⁇ 100 pg / mg EPO and finally a composition which corresponds to the standard with respect to the isoform composition (Ph. Eur., 01/2002: 1316).
  • Object of the present invention is to provide a further purification process.
  • This should provide an EPO end product that complies with the European Pharmacopoeia (Ph. Eur. 01/2002: 1316) standard or the Guidance on Biosimilar Medicinal Products Containing Recombinant Erythropoietins (EMEA / CHMP / 94256/2005), and in a suitable manner in a technical, especially fermentative EPO production is used.
  • the present method should, from the economic point of view, be superior to the state of the art.
  • the process according to the invention should not require any significant worsening of the cleaning performance with fewer chromatographic purification steps and should be able to do without special technically complicated chromatography steps, such as, for example, affinity chromatography.
  • the technical object is achieved by a method for the purification of erythropoietin, wherein erythropoietin-containing culture supernatant of erythropoietin-producing eukaryotic cells is subjected to the following steps: a) removal of cell constituents; and b) treating the product from a) by the following Chroma ⁇ tographie suitse in the order given i) reversed-phase chromatography; ii) anion exchange chromatography; iii) hydroxyapatite chromatography.
  • step a) In a preferred embodiment of the method of any ⁇ their chromatographic methods are applied before step a) and between the steps a) to b iii). Moreover, it is further preferred that) no other Chro ⁇ chromatography methods are also applied to step b iii.
  • an erythropoietin product is produced that the poeia in of the European Pharmacopeia (Ph.Eur .; 01/2002: 1316) standard defined or guidance on biosimilar medicinal products Containing Recombi ⁇ nant erythropoietin (EMEA / CHMP / 94256/2005).
  • the erythropoietin so produced meets the following Kri ⁇ criteria: a content of foreign proteins from the host cell derived from ⁇ 100 ppm, content of DNA from the host cell of ⁇ 100 pg / mg EPO and finally in terms of isoforms composition standard corresponding Caribbeanset ⁇ injection (Ph. Eur .; 01/2002: 1316).
  • the resulting EPO product also has a biological activity of at least 150,000 IE / mg in bioassay.
  • the band structure in the IEF and the glycosylation pattern correspond to a commercial Erypo® preparation.
  • chromatographic principles used in the process according to the invention are known from the literature and are available to the technical man (Meyer, practice of high-performance liquid chromatography, Wiley-VCH Weinheim 2004, Unger, Handbook of HPLC, Part 1 and 2, GIT Verlag Darmstadt 1994). In addition, detailed and detailed information on the chromatography media can be found in the product information of the respective manufacturer or supplier.
  • the eukaryotic erythropoietin-producing cells mammalian cells, more preferably human cells, and most preferably Chinese hamster ovary cells (CHO), express human recombinant erythropoietin.
  • an ultrafiltration is carried out after steps i), ii) and / or iii).
  • step a) comprises microfiltration and subsequent ultrafiltration.
  • the reversed-phase chromatography is carried out on a carrier material as a stationary phase, which is selected from the group Ci to Cs-modified silica gels, hydrophobized polymer supports based on polystyrene / divinylbenzene and hydrophobized monolithic phase materials on silica gel. or polymer base, and an aqueous alkanol solution is used as eluent.
  • a carrier material is selected from the group Ci to Cs-modified silica gels, hydrophobized polymer supports based on polystyrene / divinylbenzene and hydrophobized monolithic phase materials on silica gel. or polymer base, and an aqueous alkanol solution is used as eluent.
  • a carrier material as a stationary phase
  • a carrier material as a stationary phase which is selected from the group Ci to Cs-modified silica gels, hydrophobized polymer supports based on polystyrene /
  • the anion exchange chromatography is carried out on a support material as a stationary phase having functional groups which are selected from diethylaminoethyl groups (DEAE), quaternary aminoethyl groups (QAE), quaternary ammonium groups or dimethylamines. noethyl groups (DMAE).
  • DEAE diethylaminoethyl groups
  • QAE quaternary aminoethyl groups
  • DMAE noethyl groups
  • the anion exchange chromatography comprises at least one washing step with an aqueous buffer system, preferably with a buffer system based on an organic acid, in particular with an acetate buffer.
  • the anion exchange chromatography comprises at least one washing step with an aqueous buffer solution having a pH of 3.5 to 5.5, more preferably having a pH of 4.0 to 5.0, and most preferably having a pH of about 4 ; 5.
  • an aqueous buffer solution having a pH of 3.5 to 5.5, more preferably having a pH of 4.0 to 5.0, and most preferably having a pH of about 4 ; 5.
  • Particularly suitable as a buffer is an acetate buffer, preferably a sodium acetate buffer.
  • the eluent used in the anion exchange chromatography is preferably inorganic acid in an aqueous buffer solution.
  • chloride ions in an aqueous buffer solution are used as the eluent in anion exchange chromatography.
  • the hydroxyapatite chromatography comprises at least one washing step with an organic acid-based buffer system, preferably with an acetate buffer.
  • an organic acid-based buffer system preferably with an acetate buffer.
  • a buffer system based on an inorganic acid particularly preferably a phosphate buffer.
  • the present invention provides a method of purifying erythropoietin, wherein erythropoietin-containing culture supernatant of erythropoietin-producing eukaryotic cells is subjected to the steps of: a) removing cell constituents; and b) treating the product from a) by the following chromatographic steps in the order given: i) reversed-phase chromatography; ii) anion-exchange chromatography; iü) hydroxyapatite chromatography.
  • Reversed-phase chromatography is used as a "capture step.”
  • EPO is enriched from the fermentation supernatant, whereby different hydrophobic interactions between the sample molecules and the stationary phase are important.
  • Preferred reversed-phase materials are nonporous polystyrene / divinylbenzene-based hydrophobic polymer supports. Particularly preferred are SOURCE 30RPC or the corresponding 15 ⁇ m material (SOURCE 15RPC) from GE Healthcare.
  • the eluents used can preferably be alcohols such as ethanol or 2-propanol or mixtures thereof with appropriately buffered aqueous systems. Particularly preferred is the use of 2-propanol, since the organic solvent content in the eluent, compared to ethanol, is significantly lower and so there are safety and economic advantages. Moreover, due to its miscibility and solubility properties, 2-propanol is particularly suitable as a solution mediator (Unger, Handbuch der
  • the anion exchange chromatography is based on the competitive interaction of charged ions of the sample charge with the buffer medium used. It can be carried out with conventional, commercially available anion exchange resins with diethylaminoethyl (DEAE), quaternary aminoethyl (QAE), quaternary ammonium or dimethylaminoethyl (DMAE). These phase materials are available, for example, from GE Healthcare, Tosoh Biosience, Bio-Rad or Merck. Preference is given to using diethylaminoethyl (DEAE) -functionalized anion exchange resins. TSKgel DEAE-5PW (30 ⁇ m), available from Tosoh Bioscience, is particularly preferably used in the anion exchange chromatography.
  • the anion exchange chromatography comprises an acidic wash, with which the basic isoforms of erythropoietin are eluted by the pH reduction and thus separated off (EP-1428878) the pH of the wash buffer is between 3.5 and 5.5, more preferably between 4.0 and 5.0, and most preferably about 4.5.
  • a buffer especially a sodium acetate buffer is suitable.
  • hydroxyapatite chromatography conventional hydroxyapatite (or hydroxyapatite) materials can be used. Hydroxylapatite is hexagonal crystalline calcium phosphate and is particularly suitable for the separation of proteins and other biopolymers. This purification step is carried out to remove the "phosphated" EPO molecules, preferably CHT ceramic hydroxyapatite (Bio-Rad), more preferably CHT ceramic hydroxyapatite type 1 (Bio-Rad).
  • CHT ceramic hydroxyapatite Bio-Rad
  • CHT ceramic hydroxyapatite type 1 Bio-Rad
  • Both reversed-phase chromatography and anion exchange chromatography, as well as hydroxyapatite chromatography, can be repeated in order to increase the overall product yield in terms of reprocessing for those eluate fractions which do not have the product quality, in particular their band or glycosylation pattern Correspond to reference material. These are typically the early or late edge fractions of the main fractions, which as such already have the desired product properties after the first purification step.
  • the grading of the fractions of the various purification steps is carried out by standard methods (isoelectric focusing (IEF) and high performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD): Lasne, Nature 2000, 405 605-635, Hollander et al , LaborPraxis 2004, 56-59; Hokke et al., Eur. J. Biochem. 1995, 228, 981-1008; Dionex Technical Note 42, 1997.
  • the reference material used in each case is a commercially available Erypo® preparation (JANSSEN-CILAG).
  • microfiltration is carried out via 1.2 ⁇ m and 0.65 ⁇ m filters for cell separation. Subsequently, an ultrafiltration (cut off 10,000 Da) of the cell-free filtrate to 1/10 of the starting volume. After ultrafiltration, the concentrated cell supernatant is sterile filtered and used in the first chromatographic step (reversed-phase chromatography).
  • filtration steps in particular the sterile filtration, are known from the literature and familiar to the person skilled in the art (Munir, Handbook Ultrafiltration, Behr Hamburg 1990, Ullmann B2, 10-2, 10-21 and B3 11-6, Gasper, Handbook of Industrial Solid-Flow Filtration, Huthig Heidelberg 1990, Ullmann Al 6, 187-258).
  • the EPO obtained by the process according to the invention fulfills the quality criteria defined in the European Pharmacopoeia.
  • the isoform composition and the glycosylation pattern correspond to the standard defined in the European Pharmacopoeia (Ph.Eur.E01 / 2002: 1316) or the Guidance on Biosimilar Medicinal Products Containing Recombinant Erythropoietins (EMEA / CHMP / 94256/2005).
  • the reference material used is a commercially available Erypo® preparation (JANSSEN-CILAG).
  • the activity of the protein should be at least 100,000 IU / mg, preferably at least 125,000 IU / mg and more preferably at least 150,000 IU / mg (see also Europaische Pharmacopoeia 01/2002: 1316).
  • the EPO purified according to the invention is preferably recombinant human erythropoietin produced in eukaryotic cells.
  • the recombinant EPO is in mammalian cells, particularly preferably produced in CHO cells, as described, for example, in EP-AO 205 564 and EP-AO 148 605.
  • the fermentation is carried out according to conventional protocols in commercially available culture media.
  • erythropoietin is understood as meaning any protein which is capable of stimulating erythrocyte formation in the bone marrow and according to the assay described in the European Pharmacopoeia (Ph. Eur., 01/2002: 1316) can be clearly identified as erythropoietin (determination of activity in polycythemic or normocytamic mice).
  • the erythropoietin may be the wild-type human erythropoietin or a variant thereof having one or more amino acid substitutions, deletions or additions.
  • this variant is replaced only by 1 to 20, preferably only 1 to 15, more preferably in only 1 to 10 amino acid positions of the human wild-type erythropoietin by amino acid substitutions, deletions or additions.
  • Purification of erythropoietin or enrichment of erythropoietin means in the present case that the protein erythropoietin is obtained from a mixture in a very pure form, that is, the erythropoietin contained in the mixture is enriched until substantially no further proteins are present in addition to standard rythropoietin are included.
  • FIG. 1 shows, by way of example, the chromatographic separation of the erythropoietin peak in reversed-phase chromatography. Plotted is the peak intensity in the form of milli-absorption units (mAU) over the elution time (in min.) At a UV wavelength of 280 nm.
  • FIG. 2 shows, by way of example, the chromatographic separation of the erythropoietin peak under the conditions of anion exchange chromatography. The peak intensity is plotted as milli-absorption units (mAU) over the elution time (in min.) At a UV wavelength of 280 nm.
  • mAU milli-absorption units
  • FIG. 3 shows by way of example the IEF gel of the isolated EPO eluate fraction after anion exchange chromatography in comparison to the Erypo® preparation.
  • FIG. 4 shows by way of example the chromatographic separation of the erythropoietin peak in the case of the hydroxyapatite
  • FIG. 5 shows, by way of example, the IEF gel of the isolated EPO eluate fraction after hydroxyapatite chromatography in comparison to the Erypo® preparation.
  • Figure 6 shows the native glycosylation status of the purified final EPO product.
  • FIG. 7 shows the glycosylation status of a commercially available Erypo® preparation (JANSSEN-CILAG).
  • EPO is produced fermentatively in CHO cells.
  • the fermentation is carried out according to standard methods, as described in the patent and scientific literature for eukaryotic, in particular CHO cells.
  • the cultivation takes place in the perfusion reactor in culture medium that is free from animal components.
  • the harvest takes place continuously over a period of up to 50 days.
  • microfiltration is performed using a suitable filter (eg Opticap XLT30 Capsule with Milligard Medium 0.5-l, 2 ⁇ m, Millipore and Sarotbran P Midi-caps 0.45 - 0.65 ⁇ m, Sartorius) Flow rate of 1-2 L / min performed.
  • a suitable filter eg Opticap XLT30 Capsule with Milligard Medium 0.5-l, 2 ⁇ m, Millipore and Sarotbran P Midi-caps 0.45 - 0.65 ⁇ m, Sartorius
  • an ultrafiltration (cut off 10,000 Da) of the cell-free filtrate eg Ultran Pilot, polyethersulfone 4 ⁇ 0.45 m 2 , Schleicher & Schull
  • a sterile filtration eg via Opticap filter units with 0.5 ⁇ m Milligard Pre-filter and 0.2 ⁇ m Durapore sterile filter, Millipore.
  • Reversal phase chromatography on SOURCE 30RPC is carried out as a "capture step.”
  • EPO is enriched from the fermentation supernatant
  • several washing steps are carried out, and the first washing step is carried out with PBS buffer (phosphate buffered saline)
  • the next washing step is carried out with a mixture of water / isopropanol / TFA in a volume ratio of 10/2 / 0.1 to 10/1 / 0.1 at a flow rate of 40-50 mL / min.
  • the product elution is treated with a mixture Water / isopropanol / TFA in a volume ratio of 10/4 / 0.1 at a flow rate of 30-40 mL / min.
  • the flow rates were optimized for this separation accordingly. tempered and adapted.
  • a washing step with isopropanol / 0.1% TFA solution in the volume ratio 60/40 is performed.
  • the trifluoroacetic acid product fraction is added immediately after the elution in the ratio 1: 1 with a phosphate buffer (pH 10) and diluted with 15 mM sodium phosphate buffer to pH 7.2.
  • the neutralized EPO-containing solution is now filtered sterile.
  • the in-process control (IPC) for EPO enrichment is carried out on an analytical RP-HPLC separation column in the TFA / acetonitrile system.
  • the yield of EPO after this chromatography step is at least 50%, preferably at least 65% and particularly preferably at least 80%.
  • the buffer content is increased slowly, linearly from 0 to 80%.
  • the eluate fractions are analyzed and divided according to the band position in the IEF into product pool (main fraction) and marginal fractions.
  • the reference material used is a commercially available the Erypo® preparation.
  • the EPO content of the main fraction is determined by means of RP chromatography.
  • the selected eluate fractions are concentrated by ultrafiltration and rebuffered for subsequent hydroxyaptatite chromatography.
  • the yield of erythropoietin after this chromatography step is at least 20%, preferably at least 30% and particularly preferably at least 40%.
  • Isoelectric focusing is performed on an ultra-thin layer polyacrylamide gel.
  • the sample solutions must be desalted and concentrated before application with the aid of a microcentrifugation kit (cutoff 10,000 Da).
  • the focusing takes place at voltages of 300 - 2,000 V. After 5,000 Vh the development is completed.
  • the gel is then stained with silver nitrate or Coomassie and evaluated.
  • This purification step is suitable for removing the "phosphated" EPO molecules and the main fraction of the anion exchange chromatography is buffered by ultrafiltration into the starting buffer of the hydroxyapatite column and then sterile filtered.
  • the sample is injected at a rate of 30 mL / min onto a CHT Ceramic Hydroxyapatite Type 1 phase.
  • the washing step is carried out with a sodium acetate buffer (pH 6.8), the sample elution with a phosphate buffer at pH 6, 8 and a flow rate of 50 mL / min under gradient conditions.
  • the phosphate buffer content is increased slowly, linearly from 0 to 25%.
  • the specification-compliant EPO fractions are in a sodium acetate-sodium phosphate buffer and are mixed with PBS (Final completion buffer) buffered by ultrafiltration and deep-frozen at -20 0 C.
  • the EPO content of the individual fractions is determined by means of RP chromatography.
  • the yield of erythropoietin after this chromatography step is at least 30%, preferably at least 40% and particularly preferably at least 50%.
  • the analysis of the glycosylation pattern by means of HPAEC-PAD is carried out after enzymatic cleavage of the carbohydrate chains by means of PNGase F (Roche Diagnostics GmbH) from the protein. After isolation and desalination, the sugar residues are analyzed on a high-performance anion exchanger with pulsed amperometric detection.
  • the final EPO product has a biological activity of at least 150,000 IU / mg in the bio-assay and meets all the requirements of the European Pharmacopoeia

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufreinigung von Erythropoietin, wobei Erythropoietin enthaltender Kulturüberstand von Erythropoietin-produzierenden eukaryontischen Zellen folgenden Schritten unterworfen wird: a) Entfernen von Zellbestandteilen; und b) Behandlung des Produktes aus a) durch folgende Chromatographieschritte in der angegebenen Reihenfolge i) Reversed-Phase-Chromatographie; ii) Anionenaustausch-Chromatographie; iii) Hydroxyapatit-Chromatographie.

Description

Verfahren zur Aufreinigung von Erythropoietin
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Aufreinigung von Erythropoietin, wobei Erythropoietin enthaltender Kulturuberstand von Erythropoietin-produzierenden eu- karyontischen Zellen durch bestimmte, in einer festgelegten Art und Weise nacheinander ausgeführten chromatographischen Aufreinigungsschritte aufgearbeitet wird.
Erythropoietin, kurz EPO genannt, ist ein Glykoprotein, das die Bildung von Erythrocyten im Knochenmark anregt. EPO wird hauptsachlich in den Nieren gebildet und gelangt von dort aus über den Blutkreislauf zu seinem Zielort. Bei Niereninsuffizienz produzieren die geschadigten Nieren zu wenig oder überhaupt kein EPO, was zur Folge hat, dass aus den Stammzellen des Knochenmarks zu wenig Erythrocyten hervorgehen. Diese so- genannte renale Anämie kann durch Verabreichung von EPO in physiologischen Mengen, die die Bildung von Erythrocyten im Knochenmark stimulieren, behandelt werden. Das zur Verabreichung verwendete EPO kann entweder aus Humanurin gewonnen o- der durch gentechnologische Methoden erzeugt werden. Da EPO im menschlichen Korper nur in geringen Spuren enthalten ist, ist die Isolierung von EPO aus der naturlichen Quelle für therapeutische Anwendungen praktisch unmöglich. Daher bieten gentechnische Methoden die einzige wirtschaftliche Möglichkeit, diesen Stoff in größeren Mengen zu produzieren.
Die rekombinante Herstellung von Erythropoietin ist seit der Identifizierung des humanen Erythropoietin-Gens im Jahr 1984 möglich. Seit Anfang der 90er Jahre sind verschiedene Arzneimittel entwickelt worden, die humanes Erythropoietin enthalten, das auf gentechnologischem Weg in eukaryontischen ZeI- len, vor allem in CHO-Zellen (Chinese Hamster Ovary) produziert wurde. Die Herstellung von rekombinantem humanen Erythropoietin ist beispielsweise beschrieben in EP-A-O 148 605 und EP-A-205 564.
Die rekombinante Herstellung von Erythropoietin erfolgt üblicherweise in CHO-Wirtszellen . Wahrend diese früher in Kultur- medien kultiviert wurden, denen fötales Kalberserum und manchmal auch Rinderinsulin zugesetzt war, findet die Kultivierung heutzutage regelmäßig in serum- und proteinfreiem Medium statt. Auf diese Weise kann das Risiko von Kontaminationen mit bovinen Proteinen, bovinen Viren, boviner DNA oder anderen unerwünschten Substanzen bovinen Ursprungs ganz vermieden werden. Für die Kultivierung von eukaryontischen Zellen werden geeignete, serum- und proteinfreie Medien von verschiedenen kommerziellen Herstellern angeboten, z.B. das Medium MAM-PF2, vertrieben von u.a. durch Bioconcept, Allsch- wil, Schweiz, oder die Medien DMEM und DMENU12, angeboten z.B. von Invitrogen/Gibco, Eggenstein, Deutschland.
Auch verschiedene chromatographische Reinigungsverfahren für Erythropoietin sind bereits im Stand der Technik beschrieben worden. EP-A-O 228 452 beschreibt ein Verfahren zur Aufreini- gung von biologisch aktivem Erythropoietin aus einer Flüssigkeit, umfassend die chromatographischen Schritte Anionenaus- tausch-Chromatographie und Reversed-Phase-Chromatographie .
In EP-A-O 267 678 wird die Aufreinigung eines in serumfreier Kultur hergestellten Erythropoietins beschrieben, wobei auf- einander folgend eine Dialyse, eine Ionenaustausch- Chromatographie, eine praparative Reversed-Phase-HPLC und eine Gelfiltrationschromatographie durchgeführt werden. Dabei kann der GeIfiltrationschromatographieschritt durch eine Io- nenaustauschchromatographie ersetzt werden. Ebenso wird vor- geschlagen, vor der (ersten) Ionenaustauschchromatographie eine Farbstoffäffinitatschromatographie an einer Blue Trisac- ryl-Saule durchzufuhren. In EP-A-O 830 376 ist ein Verfahren zur Reinigung von E- rythropoietin beschrieben, bei dem EPO aus dem Kulturuber- stand im ersten Schritt der chromatographischen Aufreinigung einer Farbstoffaffinitatschromatographie unterzogen wird. Im zweiten Schritt folgt eine Chromatographie an einem hydropho- bierten Trager, gefolgt von einer Hydroxyapatit- Chromatographie . Hieran schließt sich dann eine Reversed- Phase-HPLC an, gefolgt von einer Anionenaustausch- Chromatographie als letztem Chromatographieschritt.
EP-A-I 127 063 beschreibt ein Aufreinigungsverfahren für
Erythropoietin, das folgende Schritte umfasst: differentielle Präzipitation, hydrophobe Interaktionschromatographie, Diafiltration, Anionenaustausch-Chromatographie, Kationenaustausch-Chromatographie und Size-Exclusion- Chromatographie. Die einzelnen Reinigungsschritte werden in EP-A-I 127 063 in der genannten Reihenfolge durchgeführt. In einer Variante des Verfahrens umfasst die Reinigung die folgenden Schritte: differentielle Präzipitation, hydrophobe Interaktionschromatographie, Diafiltration, Anionenaustausch- Chromatographie, Kationenaustausch-Chromatographie, eine weitere Diafiltration und Size-Exclusion-Chromatographie . In jedem Fall sieht das Verfahren im ersten Schritt eine Präzipitation, gefolgt von einer Zentrifugation vor. Ebenso ist eine Gelfiltration zum Abschluss der chromatographischen Reinigung zwingend vorgesehen.
Die internationale Anmeldung WO-A-03/045996 beschreibt ein Reinigungsverfahren für EPO, umfassend eine Anionenaustausch- Chromatographie, gefolgt von einer Reversed-Phase- Chromatographie und einer weiteren Anionenaustausch- Chromatographie. An die zweite Anionenaustausch- Chromatographie schließt sich eine Size-Exclusion- Chromatographie unter Einsatz eines Gelfiltrationsmediums an. Die Reinigung von Erythropoietin ist auch Gegenstand von EP- A-O 428 267. Hier wird eine Chromatographie an einer Q Sepha- rose-Saule durchgeführt, teilweise gefolgt von Reversed- Phase-Chromatographie und Gelfiltration.
In der WO2005/121173 wird ein Verfahren zur Aufreinigung von mittels fermentativer Verfahren hergestelltem EPO angegeben. Dieses Verfahren geht von einer chromatographischen Reinigung mit mindestens vier verschiedenen chromatographischen Trennmethoden aus. Die erste Anionenaustausch-chromatographie wird gefolgt von einer Affinitatschromatographie, einer hydrophoben Interaktionschromatographie und einer Hydroxyapatit- Chromatographie, wobei die Reihenfolge dieser 3 letztgenannten Chromatographiearten beliebig sein kann. Abschließend kommt wieder eine Anionenaustauschchromatographie zum Ein- satz .
Es werden mittels dieses Verfahrens also mindestens 5 Chromatographieschritte benotigt, um EPO herzustellen, welches den von der Europaischen Pharmacopoeia geforderten Reinheitskriterien genügt. Kriterien für ein geeignetes EPO sind u.a. ein Gehalt von Fremdproteinen, die aus der Wirtszelle stammen von <100 ppm, Gehalt an DNA aus der Wirtszelle von <100 pg/mg EPO und schließlich eine hinsichtlich der Isoformen- Zusammensetzung dem Standard entsprechende Zusammensetzung (Ph. Eur. ; 01/2002:1316) .
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein weiteres Aufreinigungsverfahren anzugeben. Dieses sollte ein EPO- Endprodukt liefern, das dem in der Europaischen Pharmacopoeia (Ph. Eur.; 01/2002:1316) definierten Standard bzw. der Guidance on Biosimilar Medicinal Products Containing Recombinant Erythropoietins (EMEA/CHMP/94256/2005) entspricht und in geeigneter Weise in einer technischen, insbesondere fermentati- ven EPO-Produktion einsetzbar ist. Insbesondere sollte das vorliegende Verfahren vom ökonomischen Gesichtspunkt den Ver- fahren des Standes der Technik überlegen sein. Weiterhin sollte das erfindungsgemaße Verfahren bei nicht erheblicher Verschlechterung der Reinigungsleistung mit weniger chromatographischen Reinigungsschritten auskommen und auf spezielle technisch aufwendige Chromatographieschritte, wie z.B. der Affinitats-Chromatographie verzichten können.
Die technische Aufgabe wird gelost durch ein Verfahren zur Aufreinigung von Erythropoietin, wobei Erythropoietin enthaltender Kulturuberstand von Erythropoietin-produzierenden eu- karyontischen Zellen folgenden Schritten unterworfen wird: a) Entfernen von Zellbestandteilen; und b) Behandlung des Produktes aus a) durch folgende Chroma¬ tographieschritte in der angegebenen Reihenfolge i) Reversed- Phase -Chromatographie; ii) Anionenaustausch-Chromatographie; iii) Hydroxyapatit-Chromatographie .
In eine bevorzugten Ausfuhrungsform des Verfahrens werden vor Schritt a) und zwischen den Schritten a) bis b iii) keine an¬ deren Chromatographie-Verfahren angewandt. Zudem ist weiter bevorzugt, dass auch nach Schritt b iii) keine anderen Chro¬ matographie-Verfahren angewandt werden.
Mit dem erfindungsgemaßen Verfahren wird ein Erythropoietin Produkt hergestellt, das dem in der Europaischen Pharmaco- poeia (Ph.Eur.; 01/2002:1316) definierten Standard bzw. der Guidance on Biosimilar Medicinal Products Containing Recombi¬ nant Erythropoietins (EMEA/CHMP/94256/2005) entspricht. Dabei erfüllt das so hergestellte Erythropoietin die folgenden Kri¬ terien: ein Gehalt von Fremdproteinen, die aus der Wirtszelle stammen von <100 ppm, Gehalt an DNA aus der Wirtszelle von <100 pg/mg EPO und schließlich eine hinsichtlich der Isoformen-Zusammensetzung dem Standard entsprechende Zusammenset¬ zung (Ph. Eur.; 01/2002:1316) . Das erhaltene EPO-Produkt hat weiterhin eine biologische Aktivität von mindestens 150.000 IE/mg im Bio-Assay. Darüber hinaus entsprechen die Bandenstruktur in der IEF und das Glycosylierungsmuster einem marktublichen Erypo®-Praparat .
Dadurch, dass in einem Verfahren zur Aufreinigung des Fermen- tationsuberstandes einer biotechnologischen EPO-Herstellung aus Saugerzellkulturen der von Zellbestandteilen gereinigte Fermentationsuberstand durch folgende Chromatographieschritte in der angegebenen Reihenfolge behandelt wird
i) Reversed-Phase-Chromatographie (RP-Chromatographie) ii) Anionenaustausch-Chromatographie (DEAE- Chroma tographie) iii) Hydroxyapatit-Chromatographie (HA-Chromatographie)
gelangt man äußerst vorteilhaft und trotzdem in überraschender Art und Weise zur Losung der gestellten Aufgaben. Der Fachmann, der sich mit der formulierten Aufgabenstellung konfrontiert sieht, hatte angesichts des bestehenden Standes der Technik - insbesondere der WO2005/121173, wonach eine RP- Chromatographie möglichst vermieden werden sollte - nicht mit Aussicht auf Erfolg in Betracht gezogen, dass eine Verminde- rung der Anzahl an erforderlichen Chromatographieschritte zur Aufreinigung von standardgemaßem EPO möglich ist. Dadurch resultieren ein geringerer apparativer, personeller und Materialaufwand sowie eine Zeitersparnis, vor allem aber höchste Sicherheit gegen virale Kontaminationen. Auch können mit dem erfindungsgemaßen Verfahren weniger Hilfsstoffe und nur unbedenkliche organische Losungsmittel, wie z.B. Ethanol oder 2- Propanol verwendet werden. Dieses Ziel wird in geeigneter Weise dadurch erreicht, dass die oben angeführten Chromatographieschritte in der angegebenen Reihenfolge durchgeführt werden.
Die in dem erfindungsgemaßen Verfahren genutzten chromatographischen Prinzipien sind literaturbekannt und dem Fach- mann gelaufig (Meyer, Praxis der Hochleistungs- Flussigchromatographie, Wiley-VCH Weinheim 2004; Unger, Handbuch der HPLC, Teil 1 und 2, GIT Verlag Darmstadt 1994) . Darüber hinaus finden sich weiterfuhrende und detaillierte In- formationen zu den Chromatographiemedien in den Produktinformationen der jeweiligen Hersteller bzw. Lieferanten.
Weiterhin ist bevorzugt, dass die eukaryontischen Erythropoi- etin-produzierenden Zellen, Saugetierzellen, besonders bevorzugt menschliche Zellen und ganz besonders bevorzugt Chinese- Hamster-Ovary Zellen (CHO) sind, die humanes rekombinantes Erythropoietin exprimieren.
In einem weiteren bevorzugten Verfahren ist vorgesehen, dass zusatzlich solche Eluatfraktionen, die in ihrem Banden- bzw. Glycosylierungmuster nicht dem Referenzmaterial entsprechen, einer weiteren Anionenaustausch-Chromatographie nach ii) und/oder Hydroxyapatit-Chromatographie nach iii) unterzogen werden .
Weiterhin ist bevorzugt, dass nach den Schritten i) , ii) und/oder iii) eine Ultrafiltration durchgeführt wird.
In einem weiteren bevorzugten Verfahren enthalt Schritt a) eine Mikrofiltration und eine anschließende Ultrafiltration.
In bevorzugter Weise erfolgt die Reversed-Phase- Chromatographie an einem Tragermaterial als stationäre Phase, die ausgewählt ist aus der Gruppe Ci bis Cs-modifizierte Kie- selgele, hydrophobierte Polymertrager auf Basis von Polysty- rol-/Divinylbenzol und hydrophobierte monolithische Phasenmaterialien auf Kieselgel- oder Polymerbasis, und als Eluent wird eine wassrige Alkanollosung verwendet. Besonders bevorzugt werden Ethanol oder 2-Propanol oder deren Mischungen, und ganz besonders bevorzugt 2-Propanol, mit entsprechend gepufferten wässrigen Systemen als Eluent verwendet.
In einem weiteren bevorzugten Verfahren erfolgt die Anionen- austausch-Chromatographie an einem Trägermaterial als statio- näre Phase mit funktionellen Gruppen, die ausgewählt sind aus Diethylaminoethyl-Gruppen (DEAE) , quarternäre Aminoethyl- Gruppen (QAE) , quaternäre Ammonium-Gruppen oder Dimethylami- noethyl-Gruppen (DMAE) .
Weiterhin ist bevorzugt, dass die Anionenaustausch- Chromatographie mindestens einen Waschschritt mit einem wässrigen Puffersystem, vorzugsweise mit einem Puffersystem auf Basis einer organischen Säure, insbesondere mit einem Acetat- puffer umfasst.
Besonders bevorzugt, umfasst die Anionenaustausch- Chromatographie mindestens einen Waschschritt mit einer wässrigen Pufferlösung mit einem pH von 3,5 bis 5,5, besonders bevorzugt mit einem pH von 4,0 bis 5,0 und am meisten bevorzugt mit einem pH bei etwa 4,5. Als Puffer eignet sich vor allem ein Acetat-Puffer, vorzugsweise ein Natriumacetat- Puffer.
In bevorzugter Weise wird als Eluent bei der Anionenaus- tausch-chromatographie anorganische Säure in einer wässrigen Pufferlösung verwendet. In außerdem und besonders bevorzugter Weise werden als Eluent bei der Anionenaustausch- Chromatographie Chloridionen in einer wässrigen Pufferlösung verwendet .
In einem weiteren bevorzugten Verfahren umfasst die Hydroxya- patit-Chromatographie mindestens einen Waschschritt mit einem Puffersystem auf Basis einer organischen Säure, vorzugsweise mit einem Acetatpuffer . Ebenfalls bevorzugt wird als Eluent bei der Hydroxyapatit- Chromatographie ein Puffersystem auf Basis einer anorganischen Saure, besonders bevorzugt ein Phosphatpuffer verwendet.
Erläuterung der besonders bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit zur Aufreinigung von Erythropoietin, wobei Erythropoietin enthaltender Kulturuberstand von Erythropoietin-produzierenden eu- karyontischen Zellen folgenden Schritten unterworfen wird: a) Entfernen von Zellbestandteilen; und b) Behandlung des Produktes aus a) durch folgende Chromatographieschritte in der angegebenen Reihenfolge i) Reversed-Phase-Chromatographie; ii) Anionenaustauseh-Chromatographie; iü) Hydroxyapatit-Chromatographie .
Die Reversed-Phase-Chromatographie wird als „Capture-Schritt" eingesetzt. In diesem ersten Reinigungsschritt wird EPO aus dem Fermentationsuberstand angereichert. Dabei sind unterschiedliche hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den Proben- molekulen und der stationären Phase von Bedeutung. Die Probenkomponenten werden umso starker festgehalten, je weniger sie in Wasser loslich sind, d.h. je unpolarer sie sind. Die Reversed-Phase-Chromatographie kann mit herkömmlichen, kommerziell erhaltlichen Phasenmaterialien sowohl auf Kieselgel- als auch auf Polymerbasis durchgeführt werden, die speziell zur Proteinanalytik geeignet sind. Typischerweise werden großporige Kieselgelmaterialien, z.B. 300 Ä oder 500 Ä, mit kurzkettiger Kohlenstoffbelegung, z.B. Cl, C2, C3 und C4, un- porose hydrophobierte Polymertrager auf Polystyrol- /Divinylbenzolbasis und speziell hydrophobierte monolithische Phasenmaterialien ebenfalls auf Kieselgel- oder Polymerbasis eingesetzt. Zu den Herstellern bzw. Lieferanten dieser stationären Phasen zahlen u.a. die Firmen Merck, Waters, GE Healthcare, Tosoh Biosience, Bio-Rad, Dionex, YMC, Phenome- nex, Macherey-Nagel und BIA Separations.
Bevorzugte Reversed-Phase-Materialien sind unporose hydropho- bierte Polymertrager auf Polystyrol-/ Divinylbenzolbasis . Be- sonders bevorzugt werden SOURCE 30RPC oder das entsprechende 15 μm-Material (SOURCE 15RPC) von GE Healthcare.
Als Eluenten können vorzugsweise Alkohole wie Ethanol oder 2- Propanol oder deren Mischungen mit entsprechend gepufferten wassrigen Systemen Verwendung finden. Besonders bevorzugt wird der Einsatz von 2-Propanol, da der organische Losungsmittelanteil im Eluenten, im Vergleich zu Ethanol, deutlich geringer ist und so sicherheitstechnische und ökonomische Vorteile bestehen. Darüber hinaus ist 2-Propanol aufgrund seiner Mischbarkeits- und Loslichkeitseigenschaften als Lo- sungsvermittler vorzuglich geeignet (Unger, Handbuch der
HPLC, Teill, GIT Verlag Darmstadt 1994; Nowotny et al . , Chro- matographia 1988, 25, 409-412) .
Die Anionenaustausch-Chromatographie beruht auf der kompeti- tiven Wechselwirkung geladener Ionen der Probelosung mit dem eingesetzten Puffermedium. Sie kann mit herkömmlichen, kommerziell erhaltlichen Anionenaustausch-Harzen mit Diethylami- noethyl- (DEAE) , quaternarer Aminoethyl- (QAE) , quaternarer Ammonium- oder Dimethylaminoethylfunktionalisierung (DMAE) durchgeführt werden. Erhaltlich sind diese Phasenmaterialien z.B. bei GE Healthcare, Tosoh Biosience, Bio-Rad oder Merck. Bevorzugt werden Diethylaminoethyl (DEAE) -funktionalisierte Anionenaustauscherharze eingesetzt. Besonders bevorzugt wird in der Anionenaustausch-Chromatographie TSKgel DEAE-5PW (30 μm) , erhaltlich von Tosoh Bioscience, verwendet. Dieser Chro- matographieschritt ist im Hinblick auf das notwendige Glyco- sylierungsmuster im EPO-Endprodukt von Bedeutung. Die Anionenaustausch-Chromatographie beinhaltet in der bevorzugten Ausfuhrungsform einen sauren Waschschritt („Saurer Wash"), mit dem die basischen Isoformen des Erythropoietin durch die pH-Absenkung eluiert und somit abgetrennt werden (EP-1428878) . „Saurer Wash" bedeutet dabei, dass der pH-Wert des Waschpuffers zwischen 3,5 und 5,5, besonders bevorzugt zwischen 4,0 und 5,0 und am meisten bevorzugt bei etwa 4,5 liegt. Als Puffer eignet sich vor allem ein Natriumacetat- Puffer.
Für die Hydroxyapatit-Chromatographie können übliche Hydroxy- apatit- (bzw. Hydroxylapatit-) Materialien eingesetzt werden. Hydroxylapatit ist hexagonal kristallines Calciumphosphat und eignet sich besonders zur Trennung von Proteinen und anderen Biopolymeren. Dieser Aufreinigungsschritt wird zur Entfernung der „phosphatierten" EPO-Molekule durchgeführt. Bevorzugt wird CHT keramisches Hydroxyapatit (Bio-Rad) eingesetzt, besonders bevorzugt CHT keramisches Hydroxyapatit Typ 1 (Bio- Rad) .
Sowohl die Reversed-Phase-Chromatographie als auch die Anio- nenaustausch-Chromatographie als auch die Hydroxyapatit- Chromatographie kann zur Steigerung der Gesamtproduktausbeute im Sinne einer Reprozessierung für solche Eluatfraktionen wiederholt werden, die in ihrer Produktqualitat, insbesondere ihrem Banden- bzw. Glycosylierungsmuster nicht dem Referenz- material entsprechen. Dabei handelt es sich typischerweise um die frühen bzw. spaten Randfraktionen der Hauptfraktionen, die als solche bereits nach dem ersten Aufreinigungsschritt die gewünschten Produkteigenschaften aufweisen. Die Einstufung der Gute der Fraktionen auf den verschiedenen Aufreini- gungsstufen erfolgt mit Standardmethoden (Isoelektrische Fo- kussierung (IEF) und Hochleistungsanionenaustausch- Chromatographie mit gepulster amperometrischer Detektion (HPAEC-PAD) : Lasne, Nature 2000, 405 605-635; Hollander et al., LaborPraxis 2004, 56-59; Hokke et al . , Eur. J. Biochem. 1995, 228, 981-1008; Dionex Technical Note 42, 1997. Als Referenzmaterial dient jeweils ein kommerziell erhaltliches Erypo®-Praparat ( JANSSEN-CILAG) .
Vor der Aufreinigung des Kulturuberstandes mit den genannten Chromatographie-Verfahren wird zur Zellabtrennung eine Mikro- filtration über 1,2 μm- und 0,65 μm-Filter durchgeführt. Anschließend erfolgt eine Ultrafiltration (cut off 10.000 Da) des zellfreien Filtrats auf 1/10 des Ausgangsvolumens. Nach der Ultrafiltration wird der konzentrierte Zelluberstand ste- rilfiltriert und im ersten Chromatographieschritt (Reversed- Phase-Chromatographie) eingesetzt. Die Filtrationsschritte, insbesondere die Sterilfiltration, sind literaturbekannt und dem Fachmann gelaufig (Munir, Handbuch Ultrafiltration, Behr Hamburg 1990; Ullmann B2, 10-2,10-21 und B3 11-6; Gasper, Handbuch der industriellen Fest-Flussig-Filtration, Huthig Heidelberg 1990; Ullmann Al 6, 187-258) .
Es wurde gefunden, dass das mit dem erfindungsgemaßen Verfahren erhaltene EPO die in der Europaischen Pharmacopoeia definierten Qualitatskriterien erfüllt. Insbesondere entsprechen die Isoformen-Zusammensetzung und das Glycosylierungsmuster dem in der Europaischen Pharmacopoeia (Ph.Eur.; 01/2002:1316) bzw. der Guidance on Biosimilar Medicinal Products Containing Recombinant Erythropoietins (EMEA/CHMP/94256/2005) definierten Standard. Als Referenzmaterial dient ein kommerziell er- haltliches Erypo®-Praparat (JANSSEN-CILAG) .
Die Aktivität des Proteins sollte mindestens 100.000 IE/mg betragen, vorzugsweise mindestens 125.000 IE/mg und besonders bevorzugt mindestens 150.000 IE/mg (siehe auch Europaische Pharmacopoeia 01/2002:1316) .
Das erfindungsgemaß aufgereinigte EPO ist bevorzugt rekombi- nantes humanes Erythropoietin, hergestellt in eukaryontischen Zellen. Bevorzugt wird das rekombinante EPO in Saugerzellen, besonders bevorzugt in CHO-Zellen hergestellt, wie z.B. beschrieben in EP-A-O 205 564 und EP-A-O 148 605. Die Fermentation erfolgt nach herkömmlichen Protokollen in kommerziell erhaltlichen Kulturmedien.
Unter Erythropoietin (EPO) wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung jedes Protein verstanden, das in der Lage ist, die Erythrocyten-Bildung im Knochenmark zu stimulieren und gemäß dem in der Europaischen Pharmacopoeia (Ph. Eur.; 01/2002:1316) beschriebenen Assay eindeutig als Erythropoie- tin identifiziert werden kann (Bestimmung der Aktivität in polyzythämischen oder normozythamischen Mausen) . Bei dem E- rythropoietin kann es sich um das wildtypische humane Eythro- poetin oder um eine Variante davon mit einem oder mehreren Aminosaureaustauschen, -deletionen oder -additionen handeln. Wenn es sich um eine Variante von Erythropoietin handelt, dann ist bevorzugt, dass diese Variante sich lediglich in 1 bis 20, bevorzugt in lediglich 1 bis 15, besonders bevorzugt in lediglich 1 bis 10 Aminosaurepositionen vom humanen WiId- typ-Erythropoietin durch Aminosaureaustausche, -deletionen oder -additionen unterscheidet.
Unter Reinigung von Erythropoietin oder Anreicherung von E- rythropoietin wird vorliegend verstanden, dass das Protein Erythropoietin aus einem Gemisch in sehr reiner Form erhalten wird, das in dem Gemisch enthaltene Erythropoietin wird also angereichert, bis im Wesentlichen neben standardgemaßem E- rythropoietin keine weiteren Proteine mehr enthalten sind.
Beschreibung der Figuren
Figur 1 zeigt exemplarisch die chromatographische Abtrennung des Erythropoietin-Peaks bei der Reversed-Phase- Chromatographie. Aufgetragen ist die Peakintensitat in Form von milli-Absorption Units (mAU) über der Elutionszeit (in min.) bei einer UV-Wellenlange von 280 nm. Figur 2 zeigt exemplarisch die chromatographische Abtrennung des Erythropoietin-Peaks unter den Bedingungen der Anionen- austausch-Chromatographie . Aufgetragen ist die Peakintensitat in Form von milli-Absorption Units (mAU) über der Elutions- zeit (in min.) bei einer UV-Wellenlange von 280 nm.
Figur 3 zeigt exemplarisch das IEF-GeI der isolierten EPO- Eluatfraktion nach der Anionenaustausch-Chromatographie im Vergleich zum Erypo®-Praparat .
Figur 4 zeigt exemplarisch die chromatographische Abtrennung des Erythropoietin-Peaks bei der Hydroxyapatit-
Chromatographie . Aufgetragen ist die Peakintensitat in Form von milli-Absorption Units (mAU) über der Elutionszeit (in min.) bei einer UV-Wellenlange von 280 nm.
Figur 5 zeigt exemplarisch das IEF-GeI der isolierten EPO- Eluatfraktion nach der Hydroxyapatit-Chromatographie im Vergleich zum Erypo®-Praparat .
Figur 6 zeigt den nativen Glycosylierungsstatus des aufgereinigten EPO-Endproduktes .
Figur 7 zeigt den Glycosylierungsstatus eines kommerziell er- haltlichen Erypo®-Praparates ( JANSSEN-CILAG) .
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern, ohne sie einzuschränken. Beispiele
Beispiel 1: Produktion von EPO in CHO-Zellen
EPO wird fermentativ in CHO-Zellen produziert. Die Fermentation erfolgt nach Standardverfahren, wie sie in der patent- und wissenschaftlichen Literatur für eukaryontische, insbesondere CHO-Zellen beschrieben sind. Die Kultivierung erfolgt im Perfusionsreaktor in Kulturmedium, das frei von tierischen Komponenten ist. Die Ernte findet in einem Zeitraum bis zu 50 Tagen kontinuierlich statt. Zur Zellabtrennung wird eine Mik- rofiltration über einen geeigneten Filter (z.B. Opticap XLT30 Capsule mit Milligard-Medium 0,5 -l,2μm, Millipore und Sar- tobran P Midi-caps 0,45 - 0,65 μm, Sartorius) bei einer Flussrate von 1-2 L/min durchgeführt. Anschließend erfolgt zunächst eine Ultrafiltration (cut off 10.000 Da) des zell- freien Filtrats (z.B. Ultran Pilot, Polyethersulfon 4 x 0,45 m2, Schleicher & Schull) und dann eine Sterilfiltration (z.B. über Opticap-Filtereinheiten mit 0,5 μm Milligard-Vorfilter und 0,2 μm Durapore Sterilfilter, Millipore) .
Beispiel 2: Reversed-Phase-Chromatographie ( „Capture- Schritt")
Als „Capture-Schritt" wird eine Reversed-Phase- Chromatographie an SOURCE 30RPC durchgeführt. In diesem ersten Reinigungsschritt wird EPO aus dem Fermentationsuberstand angereichert. Dabei werden mehrere Waschschritte durchge- fuhrt. Der erste Waschschritt wird mit PBS Puffer (Phosphat buffered saline) durchgeführt. Der nächste Waschschritt wird mit einer Mischung aus Wasser/Isopropanol/TFA im Volumen- Verhältnis von 10/2/0.1 bis 10/1/0.1 bei einer Flussrate 40 - 50 mL/min durchgeführt. Die Produktelution wird mit einer Mi- schung aus Wasser/Isopropanol/TFA im Volumen-Verhältnis von 10/4/0.1 bei einer Flussrate von 30-40 mL/min durchgeführt. Die Flussraten wurden für diese Trennung entsprechend opti- miert und angepasst. Danach wird ein Waschschritt mit Isopro- panol/0,1% TFA-Losung im Volumen-Verhältnis 60/40 durchgeführt.
Die trifluoressigsaure Produktfraktion wird direkt nach der 5 Elution im Verhältnis 1:1 mit einem Phosphatpuffer (pH-Wert 10) versetzt und mit 15 mM Natriumphosphatpuffer bis auf pH 7,2 verdünnt. Die dabei neutralisierte EPO-haltige Losung wird jetzt steril filtriert.
Die Inprozesskontrolle (IPC) zur EPO-Anreicherung wird auf lo einer analytischen RP-HPLC-Trennsaule im TFA / Acetonitril- System durchgeführt. Die Ausbeute an EPO nach diesem Chromatographieschritt betragt mindestens 50 %, bevorzugt mindestens 65 % und besonders bevorzugt mindestens 80 %.
Beispiel 3: Anionenaustauseh-Chromatographie
15 Die neutralisierte EPO-Produktfraktion aus der Reversed- Phase-Chromatographie wird mit einer Forderleistung von 20 mL/min aufgetragen. Die EPO-haltige Losung wird jetzt durch drei Waschschritte bei konstanter Flussrate von 40 mL/min aufgereinigt, wobei der erste und dritte Waschschritt jeweils
20 bei einem pH von 7,2 mit 20 mM Natriumacetatlosung und der zweite bei einem pH von 4,5 mit einer entsprechenden Natriumacetatlosung durchgeführt wird. Die Produktelution wird unter Gradientenbedingungen mit einem Natriumace- tat/Natriumchlorid-Puffer (pH 7,2) durchgeführt (Flussrate
25 30-40 mL/min) . Dabei wird der Pufferanteil langsam, linear von 0 auf 80% erhöht.
Mit Hilfe der isoelektrischen Fokussierung (IEF) werden die Eluatfraktionen analysiert und entsprechend der Bandenlage im IEF in Produkt-Pool (Hauptfraktion) und Randfraktionen unter- 30 teilt. Als Referenzmaterial dient ein kommerziell erhaltli- ches Erypo®-Praparat . Der EPO-Gehalt der Hauptfraktion wird mittels RP-Chromatographie ermittelt. Die ausgewählten EIu- atfraktionen werden mittels Ultrafiltration konzentriert und für die nachfolgende Hydroxyaptatit-Chromatographie umgepuf- fert . Die Ausbeute an Erythropoietin nach diesem Chromatographieschritt betragt mindestens 20 %, bevorzugt mindestens 30 % und besonders bevorzugt mindestens 40 %.
Die isoelektrische Fokussierung wird auf einem Ultradunn- schicht-Polyacrylamidgel durchgeführt. Dazu müssen die Probe- losungen vor der Applikation mit Hilfe eines Mikrozentrifuga- tionskit (cutoff 10.000 Da) entsalzt und aufkonzentriert werden. Die Fokussierung erfolgt bei Spannungen von 300 - 2.000 V. Nach 5.000 Vh ist die Entwicklung beendet. Das Gel wird anschließend mit Silbernitrat oder Coomassie angefärbt und ausgewertet.
Beispiel 4: Hydroxyapatit-Chromatographie
Dieser Aufreinigungsschritt ist zur Entfernung der „phospha- tierten" EPO-Molekule geeignet. Die Hauptfraktion der Anio- nenaustausch-Chromatographie wird mittels Ultrafiltration in den Startpuffer der Hydroxyapatit-Saule umgepuffert und anschließend sterilfiltriert.
Die Probeninjektion erfolgt mit einer Forderleistung von 30 mL/min auf eine CHT Ceramic Hydroxyapatit Typ 1-Phase. Der Waschschritt wird mit einem Natriumacetatpuffer (pH 6,8), die Probenelution mit einem Phosphatpuffer bei pH 6, 8 und einer Flussrate von 50 mL/min unter Gradientenbedingung durchgeführt. Dabei wird der Phosphatpufferanteil langsam, linear von 0 auf 25% erhöht.
Die spezifikationsgerechten EPO-Fraktionen liegen in einem Natriumacetat-Natriumphosphat-Puffer vor und werden mit PBS (Endabfullungspuffer) mittels Ultrafiltration umgepuffert und bei -200C tiefgefroren. Der EPO-Gehalt der einzelnen Fraktionen wird mittels RP-Chromatographie ermittelt. Die Ausbeute an Erythropoietin nach diesem Chromatographieschritt betragt mindestens 30 %, bevorzugt mindestens 40 % und besonders bevorzugt mindestens 50 %.
Die Analyse des Glycosylierungsmusters mittels HPAEC-PAD erfolgt nach enzymatischer Abspaltung der Kohlenhydratketten mittels PNGase F (Roche Diagnostics GmbH) vom Protein. Nach Isolierung und Entsalzung erfolgt die Analyse der Zuckerreste auf einem Hochleistungsanionenaustauscher mit gepulster ampe- rometrischer Detektion.
Das schließlich erhaltene EPO-Produkt hat eine biologische Aktivität von mindestens 150.000 IE/mg im Bio-Assay und er- füllt alle Anforderungen der Europaischen Pharmacopoeia
(Ph.Eur.; 01/2002:1316) bzw. der Guidance on Biosimilar Medi- cinal Products Containing Recombinant Erythropoietins (EMEA/CHMP/94256/2005) . Darüber hinaus entsprechen die Bandenstruktur in der IEF und das Glycosylierungsmuster einem marktublichen Erypo®-Praparat .

Claims

Patentansprüche
1. Ein Verfahren zur Aufreinigung von Erythropoietin, wobei Erythropoietin enthaltender Kulturuberstand von Erythro- poietin-produzierenden eukaryontischen Zellen folgenden Schritten unterworfen wird: a) Entfernen von Zellbestandteilen; und b) Behandlung des Produktes aus a) durch folgende Chromatographieschritte in der angegebenen Reihen- folge i) Reversed- Phase -Chromatographie; ii) Anionenaustauseh-Chromatographie; iii) Hydroxyapatit-Chromatographie .
2. Das Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vor Schritt a) und zwischen den Schritten a) bis b iii) keine anderen Chromatographie-Verfahren angewandt werden .
3. Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die eukaryontischen Erythropoietin- produzierenden Zellen Saugetier-Zellen, bevorzugt menschliche Zellen und besonders bevorzugt Chinese- Hamster-Ovary Zellen sind, die humanes rekombinantes Erythropoietin exprimieren.
4. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass zusatzlich solche Eluatfraktionen, deren Produktqualitat nicht dem Referenzmaterial ent¬ sprechen, einer weiteren Reversed-Phase-Chromatographie nach i) und/oder Anionenaustausch-Chromatographie nach ii) und/oder Hydroxyapatit-Chromatographie nach iii) un- terzogen werden.
5. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass nach den Schritten i) , ii) und/oder iii) eine Ultrafiltration durchgeführt wird.
6. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt a) eine Mikrofiltration und eine anschließende Ultrafiltration enthalt.
7. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Reversed-Phase-Chromatographie an einem Tragermaterial als stationäre Phase erfolgt, die ausgewählt ist aus der Gruppe Ci bis C8-modifizierte Kieselgele, hydrophobierte Polymertrager auf Basis von Polystyrol-/Divinylbenzol und hydrophobierte monolithische Phasenmaterialien auf Kieselgel- oder Polymerbasis, und wobei als Eluent eine wassrige Alkanollosung verwen- det wird.
8. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Anionenaustausch- Chromatographie an einem Tragermaterial als stationärer Phase erfolgt mit funktionellen Gruppen, die ausgewählt sind aus Diethylaminoethyl-Gruppen (DEAE) , quarternare Aminoethyl-Gruppen (QAE) , quaternare Ammonium-Gruppen oder Dimethylaminoethyl-Gruppen (DMAE) .
9. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Anionenaustausch- Chromatographie mindestens einen Waschschritt mit einem wassrigen Puffersystem umfasst.
10. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Anionenaustausch- Chromatographie mindestens einen Waschschritt mit einem Puffersystem auf Basis einer organischen Saure umfasst.
11. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Anionenaustausch- Chromatographie mindestens einen Waschschritt mit einer wassrigen Pufferlosung mit einem pH von 3,5 bis 5,5 um- fasst.
12. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass als Eluent bei der Anionenaus- tausch-Chromatographie anorganische Saure in einer wassrigen Pufferlosung verwendet wird.
13. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass als Eluent bei der Anionenaus- tausch-Chromatographie Chloridionen in einer wassrigen Pufferlosung verwendet werden.
14. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydroxyapatit-Chromatographie mindestens einen Waschschritt mit einem Puffersystem auf Basis einer organischen Saure umfasst.
15. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydroxyapatit-Chromatographie mindestens einen Waschschritt mit einem Acetatpuffer umfasst .
16. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass als Eluent bei der Hydroxyapatit- Chromatographie ein Puffersystem auf Basis einer anorga- nischen Saure verwendet wird.
17. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass als Eluent bei der Hydroxyapatit- Chromatographie ein Phosphatpuffer verwendet wird.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016096071A1 (en) 2014-12-15 2016-06-23 Merck Patent Gmbh Target molecule capture from crude solutions
US11993630B2 (en) 2016-07-15 2024-05-28 Hoffmann-La Roche Inc Method for purifying PEGylated erythropoietin

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2325194A1 (de) * 2009-11-24 2011-05-25 Glycotope GmbH Verfahren zur Reinigung von Glykoproteinen
WO2017044530A1 (en) * 2015-09-08 2017-03-16 Waters Technologies Corporation Multidimensional chromatoggraphy method for analysis of antibody-drug conjugates
KR101847169B1 (ko) * 2015-10-07 2018-04-09 주식회사 녹십자 지속형 에리트로포이에틴 함유 조성물
WO2017154869A1 (ja) * 2016-03-09 2017-09-14 Ｊｃｒファーマ株式会社 変異型ヒトエリスロポエチンの製造方法
CN109415427A (zh) * 2016-07-15 2019-03-01 豪夫迈·罗氏有限公司 用于纯化聚乙二醇化的促红细胞生成素的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1986007594A1 (en) * 1985-06-20 1986-12-31 Kirin-Amgen, Inc. Protein purification
EP1548031A1 (de) * 2003-12-22 2005-06-29 Dubai Genetics FZ-LLC Naturidentischer Erythropoietin

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
IL77081A (en) 1984-12-04 1999-10-28 Genetics Inst AND sequence encoding human erythropoietin, a process for its preparation and a pharmacological preparation of human erythropoietin
US4954437A (en) 1986-09-15 1990-09-04 Integrated Genetics, Inc. Cell encoding recombinant human erythropoietin
AU646822B2 (en) 1989-10-13 1994-03-10 Kirin-Amgen Inc. Erythropoietin isoforms
IL118201A (en) 1995-05-11 2004-12-15 Roche Diagnostics Gmbh Preparation comprising a protein with human erythropoietin activity which is free of serum and non-recombinant mammalian protein and process for the preparation thereof
US6265542B1 (en) * 1997-10-24 2001-07-24 Genentech, Inc. Purification of molecules
BR9917606A (pt) 1998-11-06 2002-12-31 Bio Sidus S A Procedimento para a purificação de eritropoetina humana recombinante a partir de sobrenadantes de cultivo de células e eritropoetina humana recombinante obtida com tal procedimento
CN1596268A (zh) 2001-11-28 2005-03-16 桑多斯有限公司 重组人红细胞生成素的层析纯化
US20060234226A1 (en) * 2002-04-26 2006-10-19 Fahner Robert L Non-affinity purification of proteins
DK1428878T3 (da) 2002-12-13 2008-12-08 Bioceuticals Arzneimittel Ag Fremgangsmåde til produktion og oprensning af erythropoietin
DE102004027816A1 (de) 2004-06-08 2006-01-05 Bioceuticals Arzneimittel Ag Verfahren zur Reinigung von Erythropoietin
CA3005835C (en) * 2004-12-22 2023-01-31 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1986007594A1 (en) * 1985-06-20 1986-12-31 Kirin-Amgen, Inc. Protein purification
EP1548031A1 (de) * 2003-12-22 2005-06-29 Dubai Genetics FZ-LLC Naturidentischer Erythropoietin

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HU YUNLONG ET AL: "An improved, inexpensive procedure for the large-scale purification of recombinant human erythropoietin.", BIOTECHNOLOGY AND APPLIED BIOCHEMISTRY AUG 2004, vol. 40, no. Pt 1, August 2004 (2004-08-01), pages 89 - 94, XP000912276, ISSN: 0885-4513 *
QIAN R L ET AL: "Purification of murine erythropoietin produced in serum-free cultures of erythroleukemia cells.", BLOOD JUL 1986, vol. 68, no. 1, July 1986 (1986-07-01), pages 258 - 262, XP002546001, ISSN: 0006-4971 *
ZANETTE D ET AL: "EVALUATION OF PHENYLBORONATE AGAROSE FOR INDUSTRIAL-SCALE PURIFICATION OF ERYTHROPOIETIN FROM MAMMALIAN CELL CULTURES", JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, AMSTERDAM, NL, vol. 101, no. 3, 1 January 2003 (2003-01-01), pages 275 - 287, XP008065442, ISSN: 0168-1656 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016096071A1 (en) 2014-12-15 2016-06-23 Merck Patent Gmbh Target molecule capture from crude solutions
US11993630B2 (en) 2016-07-15 2024-05-28 Hoffmann-La Roche Inc Method for purifying PEGylated erythropoietin

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