EP1105424A1 - Verfahren zur herstellung einer ausgewogenen antikörperzusammensetzung und zur aufreinigung von bestandteilen biologischer flüssigkeiten - Google Patents

Verfahren zur herstellung einer ausgewogenen antikörperzusammensetzung und zur aufreinigung von bestandteilen biologischer flüssigkeiten

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EP1105424A1
EP1105424A1 EP99952394A EP99952394A EP1105424A1 EP 1105424 A1 EP1105424 A1 EP 1105424A1 EP 99952394 A EP99952394 A EP 99952394A EP 99952394 A EP99952394 A EP 99952394A EP 1105424 A1 EP1105424 A1 EP 1105424A1
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EP
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biological
matrix
biological fluid
antibody composition
purified
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Withdrawn
Application number
EP99952394A
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Inventor
Georg Orberger
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Individual
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Publication of EP1105424A1 publication Critical patent/EP1105424A1/de
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies

Definitions

  • the present invention relates to methods for producing balanced antibody compositions, furthermore to the antibody compositions obtainable by these methods and to methods for purifying constituents which are contained in a biological liquid, using the said antibody compositions
  • Adsorption chromatography is a widely used technique for the purification of molecules in biochemistry and molecular biology.
  • the principle of adsorption chromatography is based on the fact that molecules in solution, such as proteins, interact in a wide variety of ways with a substance immobilized on a carrier material. The cleaning effect is doing it twice.
  • some of the impurities are not bound to the carrier material and, on the other hand, the elution conditions are selected so that the bound impurities are not eluted together with the substance to be purified efficient cleaning can be achieved.
  • the disadvantage of this procedure is that the procedures for each individual protein are different and therefore have to be developed in a time-consuming process for each application
  • immunoaffinity chromatography is a widely used method.
  • Antibodies which are directed against the desired substance are immobilized on a solid phase and brought into contact with a solution which Contains substance to be cleaned, whereby the substance then binds to the immobilized antibodies. Impurities are washed away and the desired substance is then desorbed under changed conditions.
  • this procedure has some disadvantages and limitations. 1) Highly pure and special specific antibodies against this substance are available; 2) the antibodies must have sufficient affinity for the substance; 3) In many cases, conditions must be selected for the elution which can lead to damage to the substance, for example a protein. These include in particular alkaline or acidic conditions.
  • Another approach to purification was made possible by new molecular biological techniques. Genetic manipulation can be used to produce proteins which, for example, have an additional predetermined amino acid sequence at their N- or C-terminal end, with the aid of which the protein produced can be purified. Examples of this are sequences such as the so-called poly-His tag.
  • a disadvantage of this approach is that the proteins thus obtained contain an amino acid sequence which is additional to the natural sequence and which often proves to be disadvantageous for the subsequent analysis or use of the protein. For many applications, therefore, the additional amino acid sequence has to be split off either chemically or enzymatically after the purification of the proteins, which makes further process steps necessary.
  • the constituents of biological liquids are primarily proteins or glycoproteins, DNA and RNA molecules, lipids and glycolipids, as well as a large number of low molecular weight Substances.
  • negative purification is known, which is based on the removal of impurities from a solution and subsequent recovery of the remaining constituent (s) to be purified.
  • negative cleaning by immunoaffinity chromatography to remove trace contaminants in pharmaceutical preparations has been described; Lee-Huang, U.S. Patent No. 4,568,488 (1986); Katoh et al., J. Ferm. Bioeng.
  • a known immunization method is the "cascade immunization", which aims to generate antibodies against weak or only small amounts of immunogens; Thalhamer and Freund, J. Immunol. Methods 66 (1984), pp. 245-251.
  • Standard expression technologies using mammalian cells make it necessary to isolate individual cell clones which, for example, have a high expression and or growth rate after transfection of the cells with foreign DNA. This is usually achieved by serial dilution down to the individual cell level of a suspension of the transfected cells using a large number of compartments (for example a microtitre plate), the cell overhang of each compartment depending on the content Expression product must be checked and the populations or cell clones with the desired properties subsequently increased.
  • the quantification of the expression product formed is normally carried out by means of an ELISA (“enzyme-linked immunosorbent assay”) or related immunological assays, the substance to be determined being generally bound from the cell supernatant with the aid of an antibody bound to a solid phase and then bound via a second labeled antibody is detected, however, this means that the substance present in a mixture of substances can only be examined with regard to a few binding parameters, it is not possible to purify the substance using this method.
  • specific antibodies that are directed against the product produced must be used , be available.
  • an object of the present invention to provide an antibody composition which binds components of a biological fluid in an efficient manner. Another object is to provide a method for producing such an antibody composition. A further object of the present invention is to provide a method for cleaning one or more constituents contained in a biological liquid, which avoids the disadvantages of known cleaning methods and can be used in the recently developed methods with high sample throughput.
  • the present invention relates to a method for producing an antibody composition which is directed against constituents of a biological fluid, which comprises the following steps: a) dividing the biological fluid into a first part (native part) and a second part, the protein parts of which subsequently denatured and deglycosylated (modified part), b) immunizing a suitable animal with material derived from the native part and obtaining a first antibody composition from this animal and immunizing another suitable animal with material derived from the modified part and obtaining a second antibody composition from this animal, c) Mixing the antibody compositions obtained in the previous steps and then incubating with a solid matrix to which the components of the biological fluid are bound, washing the matrix and then eluting the antibodies to obtain a balanced antibody composition.
  • the method according to the invention additionally comprises the following steps: i) binding part of the first antibody composition obtained in step b) to a solid matrix to obtain matrix A and part of the second antibody composition obtained in step b) to a solid matrix Obtaining matrix B, ii) incubating material of the native part from step a) with matrix A and material of the modified part from step a) with matrix B and then obtaining the non-bound residual immunogens, iii) immunizing a suitable animal with Material of the residual immunogens of the native part and another suitable animal obtained in step ii) with material of the residual immunogens of the modified part obtained in step ii) and recovery of further antibody compositions from these animals, iv) optionally repeating steps i) to iii) at least once, with each repeat In step i), instead of the first and second antibody compositions obtained in step b), the antibody compositions obtained in the previous step iii) are used, and with each repetition in step ii) instead of the material
  • the present invention further relates to antibody compositions which can be obtained by one of the processes described above.
  • the present invention further relates to the use of the antibody compositions according to the invention for binding components of a biological fluid.
  • Another aspect of the invention relates to a method for purifying one or more constituents contained in a biological fluid, which comprises the following steps:
  • Fig. 1 is a flow chart showing a preferred method of the invention for obtaining a balanced antibody composition.
  • Fig. 2 is a further flow diagram, in which a further preferred embodiment of the method according to the invention for obtaining a balanced antibody composition is shown.
  • Fig. 3 is a schematic representation of a modular system according to the invention for performing the cleaning method according to the invention for components contained in a biological fluid.
  • the antibody compositions produced according to the method according to the invention are directed against constituents of a biological liquid. All molecules and molecular aggregates (such as DNA, RNA, lipids and glycolipids, proteins and glycoproteins, macro- and low-molecular substances etc.) present in biological liquids in solution or suspension are to be regarded as constituents.
  • the biological liquid against the components of which the antibody compositions according to the invention are directed, can originate from animal or plant cells or tissues in culture, for example cell or tissue extracts, or from cell extracts. or tissue culture supernatants. It can also come from yeasts, other fungi, bacteria or other microorganisms (both cell extracts and culture supernatants). Virus cultures or prion preparations are also suitable as sources.
  • the biological fluid can also be body fluids, for example urine, blood, lymph, spinal fluid, both human and animal origin.
  • cell debris and macromolecular aggregates can be removed before further processing of the liquid, e.g. by centrifugation or filtration.
  • the biological liquid can be treated with DNase and RNase before further processing in order to remove nucleic acids from the liquid.
  • it may be advantageous to remove lipids or hydrophobic components that may be contained in the biological fluid before further processing e.g. hydrophobic interaction chromatography with phenyl sepharose can be used as a chromatography medium. If column chromatography is used for this purpose, suitable flow rates are e.g. in the range of 0.1 to 5 ml / min.
  • part of the biological liquid (preferred protein concentration 0.5 to 20 mg / ml) is then modified, ie denaturation and deglycosylation of the protein parts of this part of the biological liquid is carried out (modified part), the other part of the biological Liquid remains untreated (native part).
  • the denaturation can be done, for example, by heating.
  • SDS sodium dodecyl sulfate; preferred final concentration range 0.01 to 0.2%) or other suitable detergents, for example cholate, can also be used for denaturation, the liquid preferably being heated briefly after the addition of detergent.
  • Deglycosylation can be carried out, preferably after adding a nonionic detergent, such as Triton X-100 or Tween 20, by means of a deglycosylating enzyme, for example N-glycanase F, in which 0.5 to 20 U N-glycanase F per ml of liquid are preferably used. be used (depending on the glycoprotein content of the proteins present in the solution), or also with one or more other suitable deglycosylating enzymes (eg Endo F). A combination of N-glycanase F and Endo F or one or more other deglycosylating enzymes is also preferred.
  • a deglycosylating enzyme for example N-glycanase F, in which 0.5 to 20 U N-glycanase F per ml of liquid are preferably used. be used (depending on the glycoprotein content of the proteins present in the solution), or also with one or more other suitable deglycosylating enzymes (eg Endo F).
  • the modified part of the biological liquid is preferably boiled briefly (for example for at least 4 min) after the enzymatic treatment in order to inactivate the enzyme.
  • denaturation and deglycosylation it is achieved, among other things, that otherwise weakly immunogenic components (eg glycoproteins) of the biological fluid are deglycosylated or denatured and thus become more immunogenic, or cryptic antigenic determinants are exposed, so that in the subsequent immunization also antibodies are formed against these antigenic determinants.
  • Animals suitable for immunization e.g. Camels, sheep, goats, rabbits, rabbits, rats or mice, immunized with material from the native or modified part of the biological fluid, as shown in Figures 1 and 2.
  • two groups of animals are formed, one group being immunized with material from the native part and a second group with material from the modified part of the biological fluid.
  • the parallel immunization of several animals with the same material has the advantage that possible individual fluctuations in the immune response of the animals can be compensated for by mixing the sera obtained in each case from a group of animals.
  • the use of one animal at a time for immunization with material from the native or modified part of the biological fluid may also be sufficient.
  • the test animals for example 2 groups of 3 animals each
  • rabbits are initially immunized in the presence of Freund's complete adjuvant, ie parts of the biological fluid (native or modified) are mixed with adjuvant before the immunization.
  • Freund's complete adjuvant ie parts of the biological fluid (native or modified) are mixed with adjuvant before the immunization.
  • protein-containing biological liquids about 0.15 to 8 mg protein per animal (amount varies depending on the size and weight of the animal) can be administered subcutaneously.
  • a second immunization then preferably follows a few weeks later with 0.05 to 2.5 mg protein per animal in the presence of Freund's incomplete adjuvant.
  • Egg- A third immunization can then take place a few weeks later under the same conditions as the second immunization.
  • the animals are sacrificed and their blood obtained a few days to weeks after the last immunization. After the cellular blood components have been separated off, the sera from the animals of each group are combined, if appropriate, and the immunoglobulin fraction is obtained by ammonium sulfate precipitation or another suitable technique.
  • ammonium sulfate precipitation the ammonium sulfate portion of the solution is preferably brought to about 35 to 45% with slow stirring, which leads to the precipitation of the antibodies.
  • the precipitate thus obtained is taken up in a suitable buffer, for example PBS buffer (pH 6.5 to 7.8), and then dialyzed against the same buffer, it being advantageous to counter the solution which is dialyzed (approximately 100 to 500 times the volume of the sample) to be renewed several times.
  • a suitable buffer for example PBS buffer (pH 6.5 to 7.8), and then dialyzed against the same buffer, it being advantageous to counter the solution which is dialyzed (approximately 100 to 500 times the volume of the sample) to be renewed several times.
  • the antibody compositions obtained in this way can then be used directly as first or second antibody compositions in the method according to the invention.
  • the immunoglobulins of the IgG class are first isolated from the antibody compositions obtained after dialysis and these are then used as first or second antibody compositions.
  • the IgGs can be isolated by affinity chromatography on protein G or protein A sepharose or by other suitable methods.
  • the immunoglobulin-containing composition is preferably applied to an affinity column containing protein G or protein A sepharose after the dialysis step, and the column is washed with the buffer used (advantageous here a minimum of 5 column volumes) and then the bound IgG immunoglobulins, preferably using an alkaline buffer for the elution and then neutralizing the eluate as soon as possible (eg with 1 M TRIS, pH 7.0).
  • a new dialysis can then be carried out against a suitable buffer. In this way, a first and a second antibody are put together. Get settlement, whose antibodies are immunoglobulins of the IgG class.
  • Isolation of antibodies of the IgG class can also be used advantageously in the context of the steps described below for obtaining further antibody compositions.
  • the first and second antibody compositions obtained by the methods described above can then, as described below, be mixed together and then brought into contact or incubated with a solid matrix to which the constituents of the biological fluid have been bound; see also Fig. 1. Then the bound antibodies are obtained to obtain a balanced antibody composition of the above. Matrix eluted with a suitable elution buffer.
  • part of the above-mentioned first antibody composition is first coupled to a solid matrix for obtaining a matrix A and part of the second antibody composition is first coupled to a solid matrix for obtaining a matrix B; see Fig. 2.
  • the coupling can e.g. on CNBr-activated Sepharose or another suitable carrier material that is chemically reactive with the antibodies. If CNBr-activated Sepharose (Pharmacia) is used to immobilize the antibodies, a coupling e.g. by pretreating the Sepharose according to the manufacturer's instructions and then using 1 to 10 mg of antibodies or IgG per ml of Sepharose and incubating the mixture for at least two hours (shaker).
  • the immunoaffinity matrices A or B are washed with a suitable buffer, e.g. PBS (pH 6.8 to 7.5).
  • material of the native part of the biological fluid is then brought into contact with matrix A and material of the modified part of the biological fluid is brought into contact with matrix B in order to produce strong or excess immunogens from these parts.
  • the incubation is preferably carried out by adding matrix A or matrix B to columns, which are then loaded with material from the native or modified part of the biological fluid.
  • the flow contains residual immunogens of the biological fluid and is collected for further use in the method according to the invention.
  • Incubation of the native or the modified part of the biological fluid with matrix A or matrix B can, however, also preferably be carried out in a batch process.
  • matrix A or B are mixed with material of the native or modified part of the biological liquid, the matrices are separated from the liquid after incubation (for example 2 hours) (for example by centrifugation or filtration) and those in the Liquid-containing residual immunogens are collected for further use in the method according to the invention.
  • the residual immunogens of the native or modified part of the biological fluid obtained by incubation with matrix A or B as described above have a comparatively increased proportion of weak immunogens, or an increased proportion of immunogens which are only present in the original biological fluid small relative amounts are present.
  • Material of the residual immunogens obtained by incubation with matrix A or B is used, optionally after concentration, for example by ultrafiltration, to increase the concentration of (residual) immunogens, in each case subsequently for a second immunization of further suitable animals or groups of animals ; see Fig. 2.
  • This immunization with the material containing residual immunogens and the subsequent recovery of further antibody compositions can be carried out as described in connection with the above-mentioned first immunization step.
  • antibody compositions against weaker immunogens or those which originally occur in smaller amounts in the biological fluid are obtained. Parts of these antibody compositions are then optionally used as further antibody compositions in the process according to the invention, as described below.
  • the rest of these antibody compositions are kept in order to be combined in a later process step with the other antibody compositions obtained in the method according to the invention.
  • This also applies to the further antibody compositions obtained in the process steps described below.
  • the further antibody compositions obtained in the second immunization step can optionally be coupled to a fixed matrix (matrix A ', B', or A ", B” etc.) in one or more repetitions of the aforementioned method steps, as described above. , with which the residual immunogens, which were obtained in the matrix incubation step in each case previous in the process, are then incubated; see Fig. 2.
  • the residual immunogens not bound in this step or in these steps can then be incubated with the respective matrix and, if necessary, concentrated for a further immunization in the above described manner can be used.
  • further immunization or immunizations further antibody compositions are obtained which are directed to an even greater extent against weaker immunogens or against immunogens which are only contained to a small extent in the original biological fluid.
  • the antibody compositions obtained in one or more of the immunizations described above, which are still separated according to the native and modified part of the biological fluid, are then combined or mixed; see Figures 1 and 2.
  • the combined antibody composition thus obtained is then incubated or brought into contact with a solid matrix to which the constituents of the biological fluid are bound in such a way that antibodies can be bound.
  • a balanced antibody composition is then obtained by subsequent washing of the matrix and subsequent elution of the antibodies bound to the matrix. This process step has the effect that the balanced antibody composition obtained is advantageously quantitatively and qualitatively matched to the constituents of the biological fluid.
  • the aforementioned matrix, to which the constituents of the biological fluid are bound or coupled is produced as follows:
  • the biological fluid is, if necessary, after removal of cell debris or insoluble components and optionally lipids or hydrophobic components brought into contact with a solid matrix which carries a group reactive with the components of the biological fluid.
  • this is CNBr-activated Sepharose.
  • the part of the biological liquid which has been in contact with the first matrix is brought into contact with at least one further matrix which carries a further group (different from the first) which is reactive with the constituents of the biological liquid.
  • this is epoxy activated Sepharose.
  • all the matrices to which constituents contained in the biological fluid are bound are mixed.
  • a matrix is obtained in this way, to which the constituents of the biological fluid are bound in a particularly efficient manner. This matrix is then used for incubation with the combined antibody composition obtained in the previous immunization steps.
  • the aforementioned matrix with the components of the biological fluid bound to it is used in a column.
  • the column after filling, settling the matrix and then equilibrating it, is loaded with a suitable buffer until it is saturated with the combined antibody composition obtained in the immunizations. It is advantageous to use the buffer already used for the combined antibody composition. Saturation with antibodies can be recognized by the flow of non-bound antibodies, preferably by an OD measurement or another suitable method for protein detection.
  • a Western blot analysis of the column flow can be carried out, for example, in which all protein-allergenic antigens are separated and via the antibodies contained in individual passage samples to be stained.
  • the column is preferably with about 3 to 10 volumes Order buffer washed.
  • the washing step removes antibodies which do not bind to the constituents of the biological fluid immobilized on the matrix or which are present in excess.
  • the antibodies bound to the matrix are then eluted, an alkaline buffer preferably being used for this.
  • the balanced antibody composition obtained in this way should be neutralized as quickly as possible (for example with 1 M TRIS, pH 7.0) in order to avoid denaturation of the antibodies.
  • the incubation of the combined antibody composition with the matrix to which the constituents of the biological fluid are bound can also be carried out in a preferred manner also in a batch process, whereby after incubation of the matrix with the antibody composition and subsequent washing, the bound antibodies are also preferably treated by treating the washed matrix with an alkaline buffer and, after separation of the matrix, neutralization can be obtained.
  • a balanced antibody composition against components of a biological fluid which has advantageous properties.
  • the present invention relates to an antibody composition against the constituents of a biological liquid, which can be obtained according to one of the methods described above.
  • the antibody composition according to the invention is coupled to a solid carrier material.
  • a membrane which binds antibodies efficiently for example nitrocellulose, reinforced nitrocellulose or other membranes as are known to the person skilled in the art, for example for use in western blotting, for example nylon or PVDF (polyvinylidene), is particularly preferred as the carrier material.
  • Membranes. Glass or plastic surfaces are also suitable as a carrier material. Solid matrices, such as CNBr-activated Sepharose or epoxy-activated Sepharose, are also particularly preferred as carrier material. Plastic or glass beads are also suitable.
  • the present invention relates to a method for purifying one or more constituents contained in a biological fluid.
  • the biological fluids in question in this connection can in turn come from animal or plant cells or tissues in culture, for example cell or tissue extracts, or from cell or tissue culture supernatants. They can also come from yeasts, other fungi, bacteria or other microorganisms (both cell extracts and culture supernatants). Virus cultures or prion preparations are also suitable as sources. It can also be body fluids, such as urine, blood, lymph or spinal fluid, both of human and animal origin.
  • the biological liquid is pretreated before use in the cleaning process according to the invention as described above, e.g. by removing cell debris and macromolecular aggregates, by treating with DNase and RNase or by separating lipids or hydrophobic components that may be contained in the biological fluid.
  • the pretreatment preferably corresponds to that which the biological fluid has received, against which the balanced antibody composition used in the cleaning process according to the invention is directed, or against which this antibody composition was produced.
  • the constituents to be purified can be the usual constituents of biological liquids.
  • they are polypeptides or (glyco) proteins, in particular polypeptides or (glyco) proteins heterologously expressed in a biological system, i.e. Polypeptides or (glyco) proteins derived from another biological system, for example by means of stable or transient transfection with expression vectors in the biological system in question, e.g. a cell line.
  • a balanced antibody composition corresponding to that described above is first used Process according to the invention against the constituents of the biological liquid with the exception of the constituent to be purified or the constituents to be purified.
  • an antibody composition against the constituents of the biological fluid is produced for this purpose, which was obtained from the biological system in question (for example a cell line) in the physiological standard state, which therefore corresponds to the physiological standard state of the biological system in question from which it is produced comes from.
  • the physiological standard state means the state in which the biological system is under defined culture or living conditions, for example the conditions which are used for cultivation in the case of cells, tissues or microorganisms.
  • the biological fluid originating from the biological system treated in this way can correspond to that obtained from the same system in the standard state biological fluid have additional or to an increased extent existing components, for example proteins.
  • biological fluids such as body fluids.
  • the composition of the constituents of body fluids of healthy people or animals corresponds to the standard state, whereby in certain diseases the body fluids, for example blood, urine, lymph or spinal fluid, have additional constituents or increased quantities of normally present constituents, for example proteins.
  • the biological liquid which contains the component (s) to be purified according to the cleaning method according to the invention is a liquid which corresponds to a changed physiological state of the biological system in question from which the liquid originates .
  • a changed physiological state means the state which does not correspond to the physiological standard state and in which, compared to the physiological standard state, certain additional components or increased quantities of normally present components, for example proteins, can be expressed in the biological system and thus in the biological fluid from this system is present.
  • the biological liquid corresponding to the constituent (s) to be purified contains part / constituents of the biological fluid against which the balanced antibody composition used in the cleaning process according to the invention is directed or was produced, ie it comes from the same biological system and was obtained in the same or essentially the same way.
  • the antibody composition is coupled to a solid carrier material.
  • a preferred carrier material in this connection is CNBr-activated Sepharose or other materials known to the person skilled in the art for the coupling of antibodies.
  • the coupling of the antibody composition to the carrier material can be carried out as described above.
  • the biological liquid is then incubated with the carrier material to which the antibody composition is bound.
  • the incubation is preferably carried out by loading the column with the biological liquid, which contains the carrier material. However, incubation in a batch process is also preferred.
  • the constituents of the biological fluid are bound to the matrix with the exception of the constituent (s) to be purified.
  • the component to be purified or the components to be purified can be obtained as unbound components by separating the matrix, in the case of the batch process, or by simply collecting the flow rate when using a column. If necessary, a concentration of the unbound material and further analyzes or biological tests can follow.
  • the biological liquid is cell or tissue culture supernatants, in particular supernatants from BHK or CHO cells in suspension culture.
  • a balanced antibody composition against the cell or tissue culture supernatant of cells or tissues, for example BHK cells, cultured under standard conditions is produced according to the method according to the invention.
  • the cells against whose supernatant the balanced antibody composition according to the invention is produced are preferably sham-transfected cells which are cultivated under the same transfection and culture conditions were like the cells whose culture supernatant is then subjected to the purification process according to the invention.
  • All pre-cleaning steps, ie steps carried out before immunization of the animals with respect to the biological liquid, which were carried out in the production of the balanced antibody composition used, are preferably also applied to the biological liquid to be treated in the cleaning process.
  • the cell supernatant to be purified is preferably first hydrophobic interaction chromatography, e.g. with Phenylsepharose (Phenylsepharose, Pharmacia) as chromatography material. This is followed by incubation with a matrix to which the above-mentioned balanced antibody composition against the components of the cell culture supernatant, e.g. the supernatant of BHK or CHO cells in culture, which corresponds to the physiological standard state, is coupled. Incubation takes place e.g. according to the principle of immunoaffinity chromatography on an immunoaffinity matrix which is formed by the matrix mentioned.
  • the biological liquids subjected to the purification process according to the invention can have a broad spectrum of protein concentrations.
  • a preferred concentration range is 0.1 ⁇ g / ml to 50 mg / ml protein, a concentration range from 1 ⁇ g / ml to 1 mg / ml protein being particularly preferred.
  • a wide range of column volumes is suitable for hydrophobic interaction chromatography and immunoaffinity chromatography, which can be determined by the person skilled in the art depending on the amount of the biological fluid and the protein or lipid concentration.
  • Column volumes in the range from 0.02 to 20 ml are preferred, with volumes in the range from 0.05 to 2 ml being particularly preferred. However, it can columns with different volumes are also used in the different process steps.
  • the volume of biological liquid to be applied can be 0.05 to 50 times the column volume; preferably 1 to 10 times the column volume is applied.
  • all or at least individual steps e.g. removal of the lipids via a hydrophobic interaction matrix, subsequent incubation of the biological fluid with an immunoaffinity matrix and elution of one or more proteins, in a batch process, i.e. without columns.
  • Another preferred embodiment of the claimed method comprises the preparative cleaning of components of the biological fluid, e.g. Proteins, the columns or reaction containers used having, for example, a volume between 20 ml and 500 l.
  • the desired protein After application of the biological liquid to the column or the column combination and its subsequent passage, or after incubation with the hydrophobic affinity matrix and the immunoaffinity matrix, the desired protein is in the breakthrough or supernatant and is then preferably obtained by standard biochemical methods, such as e.g. Concentrate ultrafiltration or centrifugation in a Centricon tube (Amicon).
  • An advantage of the claimed cleaning method is that components such as proteins or polypeptides that are expressed or overexpressed in a biological system that is in a changed physiological state compared to the standard physiological state, e.g. by transfection of cells in culture with an expression vector, can be easily isolated by the method according to the invention, without the exact properties of the additionally expressed or overexpressed components having to be known.
  • a possible application in this connection is the heating of bacterial cells with subsequent extraction of the heat shock proteins by the above.
  • Method Mutagenesis by chemical agents or radiation with subsequent analysis of the resulting gene products, which are characteristic of the cell in a physiological state caused by these influences, is also possible.
  • the biological fluid which corresponds to the physiological standard state of the respective biological system always serves as the control and starting material for the production of the antibody composition according to the invention.
  • the preparative isolation of the proteins or metabolic products which are contained in biological liquids from infected, transfected, transformed or otherwise modified or treated cells or tissues is also possible.
  • the effects of physical influences, such as ionizing radiation, on biological material can be analyzed, appropriate cells or tissues are analyzed before and after radiation.
  • the extraction of proteins from a body fluid is also readily possible by means of the above-mentioned method, for example the liquids (eg urine) from healthy and diseased organisms of the same species can be compared with one another and the isolation of proteins which additionally occur in the disease state is possible.
  • the cleaning method according to the present invention described above can also comprise further conventional cleaning steps, which can be combined with the mentioned method steps as required.
  • the invention also relates to a purification process which comprises further chromatography steps which are based on hydrophobic interaction, ionic interaction or hydrogen bonding and are carried out under conditions under which the constituent (s) to be purified contained in the biological fluid are not bound.
  • additional steps are used which e.g. include the detection of the protein to be purified after its isolation with the help of specific antibody tests or biological tests or further purification steps.
  • a modular system or a system consisting of compartments is preferably used according to the invention, which enables a combination of the purification method according to the invention with the extraction of the biological liquid up to the collection or detection of the isolated component (s), in particular proteins.
  • a suitable in this connection modular device for the purification of constituents contained in a biological fluid according to the present invention is exemplified in Fig. 3, and is preferably constructed as follows: At the top is a module or compartment that is for the cultivation of cells (eg BHK or CHO cells), tissues or microorganisms that secrete the component or components to be cleaned or desired ren, such as a mini cell reactor, or a module that is suitable as a container for any other desired biological fluid.
  • a filter is preferably installed between these modules containing the biological liquid and the subsequent module, which retains cell components and molecular aggregates.
  • a module with a chromatography medium for removing lipids such as e.g. Phenyl sepharose.
  • the interposition of this module can, however, also be dispensed with according to devices which are also suitable according to the invention.
  • a module preferably follows which, according to the invention, contains a solid matrix with a balanced, balanced antibody composition against the constituents of the biological liquid to be treated or purified, which contains the in the standard state of the biological system in question (immunoaffinity matrix; see Fig. 3).
  • it is a balanced antibody composition against cultivated and possibly sham-transfected plant or animal cells, in particular BHK or CHO cells.
  • matrices based on ion exchangers come into consideration. For example, in the case of a protein whose pI is known from the DNA sequence, it is possible to remove impurities by means of a suitable ion exchanger and to keep the protein in flow. For example, with a pI of the protein of 5.0 and a pH of the solution of 7.2, it is very unlikely that this protein will bind to a cation exchanger, whereas some contaminants will very well bind to it.
  • the next step is preferably a module for concentrating the solution or for immobilizing the purified component or components, which preferably occurs in that the module comprises a membrane.
  • the function of the The module is largely determined by the type of membrane used.
  • the purified component (s) is concentrated by using an ultrafiltration membrane.
  • immobilization of the purified component (s) can also be achieved, for example by means of a nitrocellulose membrane.
  • a more specific binding of the purified substance can be achieved by means of an appropriately pretreated membrane, which can contain, for example, immobilized receptors that interact with the component (s) isolated from the biological fluid.
  • the above arrangement of the individual modules in the device according to the invention is not mandatory. Rather, other sequences as well as the exchange or omission of individual modules are possible.
  • the suitable number and arrangement of the modules depends on the type of biological fluid, the conditions of the biological system used and the properties of the component (s) to be cleaned, and can be adapted to the particular situation by a person skilled in the art.
  • Any type of chromatography principle such as ion exchange, hydrophobic interaction or affinity chromatography in the form of modules of the type described, can be combined with the immunoaffinity matrix module according to the invention, which binds constituents of the biological fluid in accordance with the physiological standard state.
  • the device according to the invention is preferably designed such that the liquid passage or passage through the modules e.g. by centrifugal force or by positive or negative pressure, generated by suitable equipment, e.g. a vacuum pump, can be accelerated.
  • suitable equipment e.g. a vacuum pump
  • a preferred embodiment of the invention relates to devices in which a A large number of units, which are composed of the modules mentioned above, can be operated in parallel.
  • Example 1 Production of a balanced antibody composition against BHK cell antigens
  • Mock-transfected BHK cells are cultivated in suspension culture with the aid of microcarriers (Pharmacia) in serum and protein-free medium to a density of about 2 ⁇ 10 6 cells per milliliter. After 6 days of culture, the cells are broken up by freezing them in liquid nitrogen and thawing them in their medium. This process is repeated three times in total. The suspension is then centrifuged for one hour at 100,000 g and 4 ° C. The supernatant with a protein concentration of 0.8 mg / ml is now mixed with 10 U / ml DNase I (benzonase, Merck), incubated for two hours at room temperature and then prepurified by chromatography on phenyl source (Pharmacia).
  • DNase I benzoonase, Merck
  • each of the samples each containing about 1.5 mg of protein, is suspended in 2 ml of Freund's adjuvant (Sigma). Approximately 4 ml of the suspension is injected subcutaneously into several locations of a white New Zealand rabbit. Three rabbits are immunized for each of the two samples. A second immunization is performed after 21 days. For this purpose, 0.5 mg protein (0.7 ml solution) are mixed with 2 ml Freund's incomplete adjuvant (Sigma) per animal and again injected subcutaneously at several locations. A third immunization is carried out 49 days after the first injection, and the procedure is analogous to the second immunization. On day 56, the animals' blood is obtained by cardiac puncture.
  • Freund's adjuvant Sigma
  • the blood (approx. 50 ml) is placed in plastic tubes, mixed with a wooden spatula and left for 6 hours at room temperature. incubated. The blood cake is then removed and the sample is centrifuged at 40,000 g for 15 min. The three sera from each group are then pooled.
  • the two samples are slowly brought to a final concentration of 30% (w / v) ammonium sulfate at 5 ° C. with stirring. After addition of the ammonium sulfate, the mixture is stirred at 5 ° C. for a further two hours. The suspensions are then centrifuged at 40,000 g and 5 ° C for one hour. The precipitates which contain the immunoglobulins are then taken up in 15 ml of PBS (10 mM Na2HPO 4 / KH PO 4 , 140 mM NaCl, pH 7.4) and exhaustively dialyzed against the same buffer. Affinity chromatography on protein G Sepharose (Pharmacia) is carried out to obtain antibodies of the IgG class.
  • PBS 10 mM Na2HPO 4 / KH PO 4 , 140 mM NaCl, pH 7.4
  • the sample (16 ml) is slowly applied to a column with a volume of 10 ml.
  • the column is then washed with about 100 ml of PBS.
  • the bound antibodies are eluted with 25 ml elution buffer (100 mM ethanolamine, 140 mM NaCl, pH 11.0).
  • the eluate is immediately neutralized by adding 1 M Tris (pH 7.0) and then dialyzed exhaustively against PBS (pH 7.8).
  • an immunoaffinity matrix 20 mg of the immunoglobulins obtained are bound to 4 ml of CNBr-activated Sepharose (Pharmacia).
  • the gel is first pretreated according to the manufacturer's instructions. Then 4 ml of gel are added to about 10 ml of antibody solution (2 mg / ml) and the mixture is incubated on a head-over-shaker for two hours at room temperature. The gel is then washed, taken up in 1 M ethanolamine (pH 8.0), incubated for one hour and finally washed with 100 ml of PBS.
  • an immunoaffinity chromatography with the associated antibody columns is now carried out separately for both parts of the biological fluid (native and modified).
  • 2 ml of biological liquid, each with 1.5 mg of protein are added to the column at a flow rate of 0.5 ml / min.
  • the flow-through, which contains the unbound substances, is collected, lyophilized and adjusted to a protein concentration of about 0.5 mg / ml with water. This solution is now used for further immunization of rabbits.
  • the immunization procedure corresponds to the method described above, whereby for the first immunization 1.5 mg protein suspended in 2 ml Freund's complete adjuvant, for the second immunization after 21 days 0.5 mg protein suspended in 2 ml incompatible Freund's adjuvant, and for the third immunization after 49 days also 0.5 mg protein suspended in 2 ml incomplete Freund's adjuvant can be used.
  • Three rabbits are used for each of the two parts of the biological fluid (native and modified). After the immunization, the sera are obtained, the immunoglobulins isolated and immunoaffinity columns prepared according to the method described above.
  • the solution is then mixed with 4 ml, CNBr-activated Sepharose pretreated according to the manufacturer, for two hours Incubated at room temperature.
  • the Sepharose is then separated by centrifugation, incubated for a further two hours in 8 ml of 1 M ethanolamine solution (pH 8.0) and then washed with PBS (pH 7.4).
  • the supernatant from the centrifugation which contains not yet immobilized components, is now mixed with 4 ml of epoxy-activated Sepharose and incubated for two hours at room temperature.
  • the Sepharose is then separated by centrifugation, mixed with 8 ml of 1 M ethanolamine solution (pH 8.0), incubated for two hours and washed with PBS (pH 7.4). Both matrices with immobilized components of the biological liquid are mixed and filled into a column with a volume of 8 ml.
  • the antibody solution is added to the column at a flow rate of 0.5 ml / min.
  • the flow is fractionated and the specificity of the antibodies contained therein is examined by Western blot analysis.
  • the loading process is ended. This determines the amount of antibody solution that is necessary to saturate all immobilized antigens in the chromatography column.
  • 5 ml of solution which contain about 5 mg of antibody, are obtained.
  • the bound antibodies are detached from the column with elution buffer, immediately neutralized with 1 M TRIS (pH 7.0) and then dialyzed exhaustively against PBS (pH 7.8).
  • the solution is then brought to a protein concentration of approx. 1 mg / ml by centrifugation in a Centricon 100 tube (Amicon). About 8 ml of this solution are then incubated for two hours with 2 ml of a CNBr-activated Sepharose pretreated according to the manufacturer's instructions at room temperature. The Sepharose is then separated by centrifugation, incubated in 8 ml of 1 M ethanolamine solution (pH 8.0) for two hours and then washed with PBS (pH 7.4).
  • a column with a volume of 1 ml is packed.
  • the column is loaded with antigen solution at a flow rate of 0.2 ml / min, which is prepared as described above.
  • the flow-through is collected in 0.2 ml fractions and checked for contamination using SDS-PAGE and then the Coomassie or silver staining and by means of "Reversed Phase HPLC” (rHPLC).
  • CDNA coding for human erythropoietin is cloned into a suitable expression vector and introduced into BHK cells by means of liposome-mediated transfection.
  • the BHK cells transfected in this way are cultivated in suspension culture with serum- and protein-free medium to a density of approximately 2 ⁇ 10 6 cells per milliliter. After 6 days of culture, the cells are centrifuged off and the supernatant with a protein concentration of about 40 ⁇ g / ml and an EPO content of about 20 ⁇ g / ml is mixed with 10 U / ml DNase I (benzonase, Merck) and added for two hours Incubated at room temperature.
  • DNase I benzoonase, Merck
  • the pretreated cell supernatant is then processed for purification by chromatography using an immunoaffinity column which is directed against the components of the biological liquid of the BHK cell supernatant in the standard state.
  • Two coupled columns with a volume of 0.2 ml and 0.1 ml are used for this.
  • the first column (0.2 ml) contains phenyl source (Pharmacia) as chromatography material
  • the second column is filled with an immunoaffinity matrix, which was prepared as described in Example 1.
  • 5 ml of cell culture supernatant are applied to the column combination equilibrated with PBS at a flow rate of 0.2 ml per minute.
  • the first 0.3 ml of the run which corresponds to the dead volume of the column combination, is discarded.
  • the subsequent EPO-containing flow with a volume of about 3.5 ml is collected separately. This flow, which contains EPO in a protein-related purity of more than 90%, can then be used for further investigations.
  • Example 3 Physical-chemical characterization of erythropoietin (EPO) purified in situ, recombinantly expressed in BHK cells
  • the volume of the solution is reduced from 3.5 ml to about 0.5 ml by ultrafiltration with a Centricon 10 unit.
  • a Centricon 10 unit Through this step, low-molecular compounds with a mass of less than 10 kDa are depleted and the EPO is simultaneously brought to a concentration of about 140 ⁇ g / ml.
  • the homogeneity of the preparation is determined by electrophoretic methods such as SDS-PAGE and IEF with subsequent Coomassie or silver staining. Certain glycosylation patterns are determined after electrophoretic separation by lectin affinity blotting or directly by an ELISA technique.
  • the purified glycoproteins are applied directly to a nitrocellulose membrane (BA85, Schleicher & Schüll) and incubated with labeled lectins in accordance with the method developed by Haslbeck; Haselbeck et al., Anal. Biochem. 191 (1990), pp. 25-20.
  • a nitrocellulose membrane BA85, Schleicher & Schüll
  • An improved method in which the glycoproteins are immobilized in microtiter plates and with which certain carbohydrate structures can be determined semiquantitatively by a method related to the ELISA is described in Orberger et al., Anal. Biochem. 214 (1993), pp. 195-204.
  • the purity is determined by “reversed phase” chromatography, capillary electrophoresis and UV absorption at 218 nm and 280 nm, respectively.
  • erythropoietin 0.75 ml of the solution from Example 2, which contains about 15 ⁇ g EPO, is sucked through a nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell) using a vacuum apparatus (BioRad). After blocking the membrane with a 1% milk powder solution, it is incubated for one hour with a preparation of radioactively labeled reticulocyte membranes, which were prepared by the Speyer and Fielding method; Speyer and Fielding, Biochim. Biophys. Acta 332 (1974), pp. 192-200. After briefly washing with PBS, the membrane is dried and exposed on an X-ray film for 24 hours.
  • Example 5 Biological activity of erythropoietin (EPO) purified in situ, recombinantly expressed in BHK cells An in vitro proliferation assay was used to determine the biological activity of EPO purified in situ; Keller, WO 91/18973 (1991).
  • EPO erythropoietin
  • 0.7 ⁇ g of purified EPO are taken up in 700 ⁇ l of culture medium.
  • a 1: 2 dilution series is made up to a final dilution of 0.006 ⁇ g / ml.
  • 10 ⁇ l of this solution are added in a microtiter plate to 200 ⁇ l cell solution with a density of 3 ⁇ 10 5 E31 cells (ECACC No. 90032211) per ml.
  • 0.8 ⁇ Ci / ml of 3 H-thymidine (Amer- sham) are added and the cells are incubated for two hours (labeling approach).
  • the cell suspensions are then aspirated through a glass fiber filter and washed with PBS.
  • the filters are then transferred to scintillation vessels, mixed with 4 ml of scintillation liquid (Zinser) and measured in a scintillation counter.
  • the column combination from Example 2 consisting of a phenylsepharose column and the immunoaffinity column against the components of the biological fluid, is expanded by a lectin affinity column.
  • a column filled with streptavidin-Sepharose (Sigma) (volume approx. 0.3 ml), which was previously loaded with biotinylated Datura stramonium-Agglui m (Boehringer Mannheim), is used.
  • streptavidin-Sepharose Sigma
  • the immobilized agglutinin specifically binds terminal galactose residues which are not substituted by, for example, neuraminic acid residues (which is described in detail in Crowley et al., Arch.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von ausgewogenen Antikörperzusammensetzungen, die so erhaltenen Antikörperzusammensetzungen und Verfahren zur Aufreinigung von in einer biologischen Flüssigkeit enthaltenen Bestandteilen, unter Verwendung der genannten Antikörperzusammensetzungen. Es umfaßt unter anderem die Immunisierung von Tieren mit einer biologischen Flüssigkeit, die jeweils im nativen bzw. im modifizierten Zustand (denaturiert und deglykosyliert) injiziert wird, die Gewinnung von Antikörperzusammensetzungen aus diesen Tieren und die anschließende Bindung und Elution dieser Antikörperzusammensetzungen an einer Matrix mit aus der biologischen Flüssigkeit stammenden immobilisierten Antigenen, deren Herstellung ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist. Schließlich umfaßt die Erfindung ein Aufreinigungsverfahren für Bestandteile einer biologischen Flüssigkeit unter Zuhilfenahme der im genannten Verfahren erhaltenen ausgewogenen Antikörperzusammensetzung.

Description

Verfahren zur Herstellung einer ausgewogenen Antikorperzusammensetzung und zur Aufreinigung von Bestandteilen biologischer Flüssigkeiten
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung ausgewogener Antikorper- zusammensetzungen, ferner die durch diese Verfahren erhaltlichen Antikorperzusammen- setzungen sowie Verfahren zur Aufreinigung von Bestandteilen, die in einer biologischen Flüssigkeit enthalten sind, unter Verwendung der genannten Antikorperzusammensetzun- gen
Die Adsorptionschromatographie ist eine weit verbreitete Technik zur Reinigung von Molekülen in der Biochemie und Molekularbiologie Das Prinzip der Adsorptionschromatographie beruht darauf, daß Moleküle in Losung, wie zum Beispiel Proteine, Wech- selwirkungen der verschiedensten Art mit einer auf einem Tragermaterial immobilisierten Substanz eingehen Der Reinigungseffekt ist dabei zweifach. Zum einen wird ein Teil der Verunreinigungen nicht an das Tragermaterial gebunden und zum anderen werden die Elutionsbedingungen so gewählt, daß die gebundenen Verunreinigungen nicht zusammen mit der aufzureinigenden Substanz eluiert werden Durch Kombination verschiedener Chromatographieprinzipien, wie zum Beispiel Ionenaustausch-, hydrophobe Interaktionsoder Affinitatschromatographie, kann so eine effiziente Reinigung erzielt werden Der Nachteil dieser Vorgehensweise liegt jedoch darin, daß die Prozeduren für jedes einzelne Protein unterschiedlich sind und daher in einem zeitraubendem Prozeß für jede Anwendung neu entwickelt werden müssen
Insbesondere für Reinigungsverfahren im Labormaßstab sind daher alternative Techniken entwickelt worden So ist zum Beispiel die Immunaffinitatschromatographie eine weit verbreitete Methode Hierbei werden Antikörper, die gegen die gewünschte Substanz gerichtet sind, auf einer festen Phase immobilisiert und in Kontakt mit einer Losung ge- bracht, die die zu reinigende Substanz enthalt, wobei die Substanz dann an die immobilisierten Antikörper bindet Verunreinigungen werden weggewaschen und die gewünschte Substanz wird anschließend unter geänderten Bedingungen desorbiert Diese Prozedur weist jedoch einige Nachteile und Einschränkungen auf 1) Es müssen hochreine und spe- zifische Antikörper gegen diese Substanz verfügbar sein; 2) die Antikörper müssen eine ausreichende Affinität zu der Substanz aufweisen; 3) für die Elution müssen in vielen Fällen Bedingungen gewählt werden, die zu einer Schädigung der Substanz, z.B. eines Proteins, führen können. Hierzu zählen insbesondere alkalische oder saure Bedingungen.
Ein weiterer Aufreinigungsansatz wurde durch neue molekularbiologische Techniken ermöglicht. Durch genetische Manipulation können Proteine hergestellt werden, die zum Beispiel an ihrem N- oder C-terminalen Ende eine zusätzliche vorgegebene Aminosäuresequenz aufweisen, mit deren Hilfe eine Reinigung des hergestellten Proteins durchgeführt werden kann. Beispiele hierfür sind Sequenzen wie der sogenannte poly-His-Tag. Nachteilig bei diesem Ansatz ist jedoch, daß die so erhaltenen Proteine eine gegenüber der natürlichen Sequenz zusätzliche Aminosäuresequenz enthalten, die sich oft für die anschließende Analyse bzw. Verwendung des Proteins als nachteilig erweist. Daher muß für viele Anwendungen die zusätzliche Aminosäuresequenz nach der Reinigung der Proteine ent- weder chemisch oder enzymatisch abgespalten werden, was weitere Verfahrensschritte notwendig macht.
Bei den Bestandteilen biologischer Flüssigkeiten, wie z.B. Zeil- oder Gewebeextrakten, Zellkultur- oder Gewebekulturüberständen oder Körperflüssigkeiten, handelt es sich in erster Linie um Proteine bzw. Glykoproteine, DNA- und RNA-Moleküle, Lipide und Gly- kolipide, sowie eine größere Anzahl niedermolekularer Substanzen. Im Rahmen von Verfahren zur Aufreinigung bestimmter Bestandteile aus biologischen Flüssigkeiten ist die sog. Negativreinigung bekannt, die auf der Entfernung von Verunreinigungen aus einer Lösung und anschließender Gewinnung des/der verbliebenen aufzureinigenden Bestand- teils/Bestandteile basiert. Zum Beispiel wurde die Negativreinigung durch Immunaffini- tätschromatographie zur Entfernung von Spurenverunreinigungen in pharmazeutischen Präparaten beschrieben; Lee-Huang, US-Patent No. 4,568,488 (1986); Katoh et al., J. Ferm. Bioeng. 79 (1995), S. 545-555; Chapman et al., J. Chem. Technol. Biotechnol. 59 (1994), S. 108-109. Ein weiteres Verfahren der Negativreinigung, bei dem eine bestimmte biologische Aktivität aus einer biologischen Flüssigkeit entfernt wurde, ist aus Beare et al., Biochim. Biophys. Acta 1310 (1996), S. 81-85, bekannt. In einem weiteren bekannten Verfahren wurden bestimmte Proteine vorgereinigt, um Antikörper gegen diese zu erzeugen; Kaiser et al., Biomed. Biochim. Acta 50 (1991), S. 1033-1039; Matsubara et al., Comp. Biochem. Physiol. 4 (1994), S. 545-555; oder um eine Vorreinigung von besonders instabilen Proteinen aus Urin zu erreichen; Yokoigawa et al., Agric. Biol. Chem. 48 (1984), S. 1587-1593. Die beschriebenen Verfahren haben allerdings den Nachteil, daß die darin verwendeten Antiköφerzusammensetzungen nur einen geringen Anteil der Be- standteile, die in der biologischen Flüssigkeit vorhanden sind, binden. Eine Ursache hierfür liegt darin, daß bei der Erzeugung von Antiköφerzusammensetzungen, die gegen komplexe Antigengemische gerichtet sind und bei Standardimmunisierungsmethoden eingesetzt werden (Weir, Handbook of Experimental Immunology, Vol I-II (1986), Oxford, Blackwell Scientific Publications) Phänomene wie die Immunkompetition die Bildung von Antiköφern gegen schwache bzw. nur in geringen Mengen vorhandene Immunogene unterbinden; Abbas und Klaus, Eur. J. Immunol. Methods 66 (1984), S. 245-251.
Ein bekanntes Immunisierungsverfahren ist die „Kaskadenimmunisierung", die auf die Erzeugung von Antiköφern gegen schwache oder nur in geringen Mengen vorhandene Immunogene abzielt; Thalhamer und Freund, J. Immunol. Methods 66 (1984), S. 245-251.
Eine weitere Ursache dafür, daß nach herkömmlichen Verfahren hergestellte Antiköφerzusammensetzungen nur einen Teil der Bestandteile einer biologischen Flüssigkeit binden, liegt darin, daß z.B. einige in der Flüssigkeit vorhandene Glykoproteine nur eine sehr schwache Immunantwort hervorrufen. Dies kann daran liegen, daß einige der potentiell immunogenen Epitope durch den Kohlenhydratanteil „maskiert" sind; Klenk, „Influence of glycosylation on antigenicity of viral proteins", in: Immunochemistry of Viruses II, Elsevier Publishers B.V. (1990), Eds. Regenmortel und Neurath. Ein direkter Zusammenhang zwischen der Immunogenität eines Epitops, dem Einfluß von denaturierenden Agen- tien und der abschirmenden Wirkung von Oligosaccharid-Seitenketten wurde z.B. für ein Virushüllprotein beschrieben; Guirakhoo et al., Virology 169 (1989), S. 90-99.
Standard-Expressionstechnologien unter Verwendung von Säugerzellen machen es notwendig, nach der Transfektion der Zellen mit Fremd-DNA einzelne Zeilklone zu isolieren, die zum Beispiel eine hohe Expressions- und oder Wachstumsrate aufweisen. Dies wird in der Regel durch serielles Verdünnen bis auf Einzelzellniveau einer Suspension der transfi- zierten Zellen unter Verwendung einer Vielzahl von Kompartimenten (etwa einer Mikro- titeφlatte) erreicht, wobei der Zeilüberstand eines jeden Kompartiments auf den Gehalt an Expressionsprodukt übeφriift werden muß und die Populationen bzw. Zellklone mit den gewünschten Eigenschaften anschließend vermehrt werden. Die Quantifizierung des gebildeten Expressionsproduktes wird normalerweise durch einen ELISA („enzyme-linked immunosorbent assay") oder verwandte immunologische Assays vorgenommen, wobei in der Regel mit Hilfe eines an eine feste Phase gebundenen Antiköφers die zu bestimmende Substanz aus dem Zeilüberstand gebunden und dann über einen zweiten markierten Antiköφer nachgewiesen wird. Damit kann die in einem Stoffgemisch vorliegende Substanz jedoch lediglich im Hinblick auf einige Bindungsparameter untersucht werden. Eine Reinigung der Substanz ist mit diesem Verfahren nicht möglich. Darüber hinaus müssen spe- zifische Antiköφer, die gegen das hergestellte Produkt gerichtet sind, zur Verfügung stehen.
Entsprechend besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung einer Antiköφerzusammensetzung, die in effizienter Weise Bestandteile einer biologischen Flüssigkeit bindet. Eine weitere Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung einer solchen Antiköφerzusammensetzung. Ferner besteht eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein Verfahren zur Reinigung eines oder mehrerer in einer biologischen Flüssigkeit enthaltenen Bestandteile bereitzustellen, das die Nachteile bekannter Reinigungsverfahren vermeidet und in den in letzter Zeit entwickelten Ver- fahren mit hohem Probendurchsatz einsetzbar ist.
Diese und weitere Aufgaben werden durch den Gegenstand von Anspruch 1 und den nachfolgenden Ansprüchen gelöst. Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Antiköφerzusammensetzung, die gegen Bestandteile einer bio- logischen Flüssigkeit gerichtet ist, das folgende Schritte umfaßt: a) Aufteilen der biologischen Flüssigkeit in einen ersten Teil (nativer Teil) und einen zweiten Teil, dessen Proteinanteile anschließend denaturiert und deglykosyliert werden (modifizierter Teil), b) Immunisierung eines geeigneten Tieres mit vom nativen Teil stammenden Material und Gewinnung einer ersten Antiköφerzusammensetzung aus diesem Tier und Immunisierung eines weiteren geeigneten Tieres mit vom modifizierten Teil stammenden Material und Gewinnung einer zweiten Antiköφerzusammensetzung aus diesem Tier, c) Mischen der in den vorausgehenden Schritten erhaltenen Antiköφerzusammensetzungen und anschließende Inkubation mit einer festen Matrix, an die die Bestandteile der biologischen Flüssigkeit gebunden sind, Waschen der Matrix und anschließende Elution der Antiköφer zur Gewinnung einer ausgewogenen Antiköφer- Zusammensetzung.
In einer weiteren Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren zusätzlich folgende Schritte: i) Bindung eines Teils der in Schritt b) erhaltenen ersten Antiköφerzusammensetzung an eine feste Matrix zur Gewinnung von Matrix A und eines Teils der in Schritt b) erhaltenen zweiten Antiköφerzusammensetzung an eine feste Matrix zur Gewinnung von Matrix B, ii) Inkubation von Material des nativen Teils aus Schritt a) mit Matrix A und von Material des modifizierten Teils aus Schritt a) mit Matrix B und anschließende Gewinnung der j ewei ls nichtgebundenen Restimmunogene, iii) Immunisierung eines geeigneten Tieres mit Material der in Schritt ii) gewonnenen Restimmunogene des nativen Teils und eines weiteren geeigneten Tieres mit Material der in Schritt ii) gewonnenen Restimmunogene des modifizierten Teils und Gewinnung weiterer Antiköφerzusammensetzungen aus diesen Tieren, iv) gegebenenfalls mindestens einmalige Wiederholung der Schritte i) bis iii), wobei bei jeder Wiederholung in Schritt i) statt der in Schritt b) erhaltenen ersten und zweiten Antiköφerzusammensetzung die im jeweils vorhergehenden Schritt iii) gewonnenen Antiköφerzusammensetzungen verwendet werden, und wobei bei jeder Wiederholung in Schritt ii) statt des Materials des nativen und des modifizierten Teils aus Schritt a) Material der im jeweils vorhergehenden Schritt ii) gewonnenen Restimmunogene des nativen bzw. des modifizierten Teils verwendet wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Antiköφerzusammensetzungen, die nach einem der vorstehend beschriebenen Verfahren erhältlich sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen Antiköφerzusammensetzungen zur Bindung von Bestandteilen einer biologischen Flüssigkeit. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufreinigung eines oder mehrerer in einer biologischen Flüssigkeit enthaltenen Bestandteile, das folgende Schritte umfaßt:
1) Herstellung einer ausgewogenen Antiköφerzusammensetzung gegen die Bestandteile der biologischen Flüssigkeit mit Ausnahme des/der aufzureinigenden Bestandteils/Bestandteile,
2) Kopplung der Antiköφerzusammensetzung an ein festes Trägermaterial und
3) Bindung der Bestandteile der biologischen Flüssigkeit mit Ausnahme des/der aufzureinigenden Bestandteils/Bestandteile durch Inkubation der biologischen Flüs- sigkeit mit dem in Schritt 2) erhaltenen Trägermaterial.
Abb. 1 ist ein Fließschema, in dem ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren zur Gewinnung einer ausgewogenen Antiköφerzusammensetzung dargestellt ist.
Abb. 2 ist ein weiteres Fließschema, in dem eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Gewinnung einer ausgewogenen Antiköφerzusammensetzung dargestellt ist.
Abb. 3 ist eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen modularen Systems zur Durchführung des erfindungsgemäßen Reinigungsverfahrens für in einer biologischen Flüssigkeit enthaltene Bestandteile.
Die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Antiköφerzusammensetzungen sind gegen Bestandteile einer biologischen Flüssigkeit gerichtet. Als Bestandteile sind alle in biologischen Flüssigkeiten in Lösung bzw. Suspension vorhandenen Moleküle und Molekülaggregate (wie z.B. DNA, RNA, Lipide und Glykolipide, Proteine und Glykoproteine, makro- und niedermolekulare Stoffe etc.) anzusehen.
Die biologische Flüssigkeit, gegen deren Bestandteile die erfindungsgemäßen Antikörperzusammensetzungen gerichtet sind, kann von tierischen oder pflanzlichen Zellen oder Geweben in Kultur stammen, z.B. Zeil- oder Gewebeextrakten, oder von Zeil- oder Gewebekulturüberständen. Sie kann auch von Hefen, anderen Pilzen, Bakterien oder sonstigen Mikroorganismen stammen (hierbei sowohl von Zellextrakten als auch von Kulturüberständen). Geeignet als Quellen sind auch Virenkulturen oder Prionen- präparationen. Bei der biologischen Flüssigkeit kann es sich aber auch um Köφerflüs- sigkeiten handeln, z.B. Urin, Blut, Lymphe, Spinalflüssigkeit, sowohl menschlichen als auch tierischen Ursprungs.
Wurde die biologische Flüssigkeit durch Zellaufschluß bzw. Solubilisierung von Zellen erhalten, z.B. durch Homogenisierung oder Ultraschallbehandlung von Zellen, so kön- nen in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens Zelltrümmer und makromolekulare Aggregate vor der Weiterverarbeitung der Flüssigkeit entfernt werden, z.B. durch Zentrifugation oder Filtration. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die biologische Flüssigkeit vor der Weiterverarbeitung mit DNase und RNase behandelt werden, um Nukleinsäuren aus der Flüssigkeit zu entfer- nen. Ferner ist es unter Umständen vorteilhaft, vor der Weiterverarbeitung möglicherweise in der biologischen Flüssigkeit enthaltene Lipide oder hydrophobe Komponenten zu entfernen, wobei z.B. hydrophobe Interaktionschromatographie mit Phenylsepharose als Chromatographiemedium zum Einsatz kommen kann. Verwendet man hierzu Säulenchromatographie, so liegen geeignete Flußraten z.B. im Bereich von 0.1 bis 5 ml/min.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird anschließend ein Teil der biologischen Flüssigkeit (bevorzugte Proteinkonzentration 0.5 bis 20 mg/ml) modifiziert, d.h. es wird eine Denaturierung und eine Deglykosylierung der Proteinanteile dieses Teils der biologischen Flüssigkeit durchgeführt (modifizierter Teil), wobei der andere Teil der biologischen Flüssigkeit unbehandelt bleibt (nativer Teil). Die Denaturierung kann beispielsweise durch Erhitzen erfolgen. Zur Denaturierung kann können auch SDS (Natriumdodecylsulfat; bevorzugter Endkonzentrationsbereich 0.01 bis 0,2%) oder andere geeignete Detergentien verwendet werden, z.B. Cholat, wobei die Flüs- sigkeit nach Zugabe von Detergens vorzugsweise kurzzeitig erhitzt wird. Die Deglykosylierung kann, vorzugsweise nach Zusatz eines nichtionischen Detergens, wie z.B. Triton X-100 oder Tween 20, mittels eines deglykosylierenden Enzyms erfolgen, z.B. N-Glykanase F, bei der bevorzugt 0.5 bis 20 U N-Glykanase F je ml Flüssigkeit ver- wendet werden (je nach Glykoproteinanteil der in der Lösung vorhandenen Proteine), oder auch mit einem oder mehreren anderen geeigneten deglykosylierenden Enzymen (z.B. Endo F). Bevorzugt ist auch eine Kombination aus N-Glykanase F und Endo F oder einem oder mehreren anderen deglykosylierenden Enzymen. Der modifizierte Teil der biologischen Flüssigkeit wird nach der enzymatischen Behandlung vorzugsweise kurz (z.B. für mindestens 4 min) gekocht, um das Enzym zu inaktivieren. Mit der Denaturierung und Deglykosylierung wird u.a. erreicht, daß ansonsten schwach immunogene Bestandteile (z.B. Glykoproteine) der biologischen Flüssigkeit deglyko- syliert bzw. denaturiert und damit stärker immunogen werden, bzw. kryptische anti- gene Determinanten exponiert werden, so daß bei der nachfolgenden Immunisierung auch gegen diese antigenen Determinanten Antiköφer gebildet werden.
Anschließend werden zur Immunisierung geeignete Tiere, z.B. Kamele, Schafe, Ziegen, Hasen, Kaninchen, Ratten oder Mäuse, mit Material des nativen bzw. des modi- fizierten Teils der biologischen Flüssigkeit immunisiert, wie in den Abbildungen 1 und 2 dargestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden dabei zwei Gruppen von Tieren gebildet, wobei eine Gruppe mit Material des nativen Teils und eine zweite Gruppe mit Material des modifizierten Teils der biologischen Flüssigkeit immunisiert wird. Die parallele Immunisierung von mehreren Tieren mit gleichem Ma- terial hat den Vorteil, daß durch Mischen der jeweils von einer Gruppe von Tieren erhaltenen Seren mögliche individuelle Schwankungen in der Immunantwort der Tiere kompensiert werden können. Die Verwendung jeweils eines Tieres für die Immunisierung mit Material vom nativen bzw. modifizierten Teil der biologischen Flüssigkeit kann jedoch gegebenenfalls ebenfalls ausreichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Versuchstiere (z.B. 2 Gruppen zu je 3 Tieren), z.B. Hasen, zunächst in Anwesenheit von Freunds komplettem Adjuvans immunisiert, d.h. Teile der biologischen Flüssigkeit (nativ bzw. modifiziert) werden vor der Immunisierung mit Adjuvans gemischt. Bei proteinhalti- gen biologischen Flüssigkeiten können z.B. etwa 0.15 bis 8 mg Protein pro Tier (Menge variiert je nach Größe und Gewicht des Tieres) subkutan verabreicht werden. Vorzugsweise folgt dann eine zweite Immunisierung einige Wochen später mit 0.05 bis 2.5 mg Protein pro Tier in Anwesenheit von Freunds inkomplettem Adjuvans. Ei- ne dritte Immunisierung kann dann einige Wochen später unter den gleichen Bedingungen wie die zweite Immunisierung stattfinden. Es sind jedoch auch andere dem Fachmann bekannte Immunisierungsverfahren geeignet, z.B. solche, bei denen Aluminiumoxid als Adjuvans verwendet wird. Einige Tage bis Wochen nach der letzten Immunisierung werden die Tiere getötet und ihr Blut gewonnen. Nach dem Abtrennen der zellulären Blutbestandteile werden ggf. die Seren der Tiere jeder Gruppe vereinigt und die Immunglobulinfraktion durch Ammoniumsulfatfällung oder eine andere geeignete Technik gewonnen. Bei Anwendung der Ammoniumsulfatfallung wird der Ammoniumsulfatanteil der Lösung unter langsamem Rühren vorzugsweise auf etwa 35 bis 45%o gebracht, was zur Präzipitation der Antiköφer führt. Nach Zentrifugation oder Filtrieren und Abtrennen des Überstandes wird das so gewonnene Präzipitat in einem geeigneten Puffer, z.B. PBS-Puffer (pH 6,5 bis 7,8), aufgenommen und anschließend gegen denselben Puffer dialysiert, wobei es vorteilhaft ist, die Lösung, gegen die dialysiert wird (etwa das 100 bis 500-fache Volumen der Probe), mehrfach zu erneuern. Die auf diese Weise gewonnenen Antiköφerzusammensetzungen können dann direkt als erste bzw. zweite Antiköφerzusammensetzung im erfindungsgemäßen Verfahren weiter verwendet werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden jedoch zunächst aus den nach Dialyse erhaltenen Antiköφerzusammensetzungen jeweils die Immunglobuline der IgG-Klasse isoliert und diese anschließend als erste bzw. zweite Antiköφerzusammensetzung weiterverwendet. Die Isolierung der IgGs kann durch Affinitätschromatographie an Protein-G- bzw. Protein-A-Sepharose oder durch andere geeignete Verfahren erfolgen. Bei Verwendung von Protein-G- oder Protein-A-Sepharose wird die Immunglobulin-enthaltende Zusammensetzung nach dem Dialyseschritt vorzugsweise auf eine Protein-G- oder Protein-A-Sepharose enthaltende Affinitätssäule gegeben, die Säule mit dem verwendeten Puffer gewaschen (vorteilhaft ist hier ein Minimum von 5 Säulenvolumina) und anschließend die gebundenen IgG-Immunglobuline eruiert, wobei für die Elution vorzugsweise ein alkalischer Puffer verwendet und das Eluat anschließend sobald wie möglich neutralisiert wird (z.B. mit 1 M TRIS, pH 7.0). Anschließend kann eine erneute Dialyse gegen einen geeigneten Puffer durchgeführt werden. Auf diese Weise wird eine erste und eine zweite Antiköφerzusammen- Setzung erhalten, bei deren Antiköφer es sich um Immunglobuline der IgG-Klasse handelt.
Eine Isolierung von Antiköφern der IgG-Klasse kann auch im Rahmen der nachste- hend beschriebenen Schritte zur Gewinnung weiterer Antiköφerzusammensetzungen in vorteilhafter Weise angewandt werden.
Die nach den vorstehend beschriebenen Verfahren erhaltenen ersten und zweiten Antiköφerzusammensetzungen können dann, wie weiter unten beschrieben, miteinander gemischt und anschließend mit einer festen Matrix, an die die Bestandteile der biologischen Flüssigkeit gebunden wurden, in Kontakt gebracht bzw. inkubiert werden; siehe auch Abb. 1. Anschließend werden die gebundenen Antiköφer zur Gewinnung einer ausgewogenen Antiköφerzusammensetzung von o.g. Matrix mit einem geeigneten Elutionspuffer eluiert.
In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung wird ein Teil der vorstehend genannten ersten Antiköφerzusammensetzung zunächst an eine feste Matrix zur Gewinnung einer Matrix A und ein Teil der zweiten Antiköφerzusammensetzung zunächst an eine feste Matrix zur Gewinnung einer Matrix B gekoppelt; siehe Abb. 2. Die Kopplung kann z.B. an CNBr-aktivierte Sepharose oder ein anderes geeignetes, mit den Antiköφern chemisch reaktives Trägermaterial erfolgen. Verwendet man zur Immobilisierung der Antiköφer CNBr-aktivierte Sepharose (Pharmacia), so kann eine Kopplung z.B. dadurch erfolgen, daß man die Sepharose gemäß den Herstellerangaben vorbehandelt und anschließend 1 bis 10 mg Antiköφer bzw. IgG pro ml Sepharose einsetzt und den Ansatz wenig- stens zwei Stunden inkubiert (Schüttler). Danach erfolgt Absättigen der überschüssigen reaktiven Gruppen (d.h. der Gruppen, die noch nicht reagiert haben), was bevorzugt mit 1 M Ethanolaminlösung (pH 8.0) geschieht. Anschließend wäscht man die Immunaffini- tätsmatrices A bzw. B mit einem geeigneten Puffer, z.B. PBS (pH 6.8 bis 7.5).
Gemäß der genannten alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird anschließend Material des nativen Teils der biologischen Flüssigkeit mit Matrix A und Material des modifizierten Teils der biologischen Flüssigkeit mit Matrix B in Kontakt gebracht bzw. inkubiert, um starke oder im Überschuß vorhandene Immunogene aus die- sen Teilen zu entfernen. Die Inkubation erfolgt vorzugsweise dadurch, daß man Matrix A bzw. Matrix B jeweils in Säulen gibt, die dann mit Material des nativen bzw. des modifizierten Teils der biologischen Flüssigkeit beladen werden. Der Durchfluß enthält Restimmunogene der biologischen Flüssigkeit und wird zur weiteren Verwendung im erfmdungs- gemäßen Verfahren gesammelt. Die Inkubation des nativen bzw. des modifizierten Teils der biologischen Flüssigkeit mit Matrix A bzw. Matrix B kann jedoch in ebenfalls bevorzugter Weise auch im Batch- Verfahren erfolgen. In diesem Fall werden Matrix A bzw. B mit Material des nativen bzw. des modifizierten Teils der biologischen Flüssigkeit gemischt, die Matrices nach Inkubation (z.B. 2 Stunden) jeweils von der Flüssigkeit abge- trennt (z.B. durch Zentrifugation oder Filtration) und die in der Flüssigkeit enthaltenen Restimmunogene zur Weiterverwendung im erfindungsgemäßen Verfahren gesammelt. Die wie vorstehend beschrieben durch Inkubation mit Matrix A bzw. B erhaltenen Restimmunogene des nativen bzw. des modifizierten Teils der biologischen Flüssigkeit weisen einen vergleichsweise erhöhten Anteil an schwachen Immunogenen auf, bzw. einen erhöhten Anteil an Immunogenen, die in der ursprünglichen biologischen Flüssigkeit nur in geringen relativen Mengen vorhanden sind.
Material der durch Inkubation mit Matrix A bzw. B erhaltenen Restimmunogene wird, gegebenenfalls nach Konzentrierung, z.B. durch Ultrafiltration, zur Erhöhung der Konzen- tration an (Rest-)Immunogenen, jeweils anschließend für eine zweite Immunisierung weiterer geeigneter Tiere bzw. Gruppen von Tieren verwendet; siehe Abb. 2. Bei dieser Immunisierung mit dem Restimmunogene enthaltenden Material und der anschließenden Gewinnung von weiteren Antiköφerzusammensetzungen kann, wie im Zusammenhang mit dem vorstehend genannten ersten Immunisierungsschritt beschrieben, verfahren wer- den. Bei diesem Verfahrensschritt werden Antiköφerzusammensetzungen gegen schwächere oder in der biologischen Flüssigkeit ursprünglich in geringeren Mengen vorkommende Immunogene erhalten. Teile dieser Antiköφerzusammensetzungen werden dann gegebenenfalls, wie nachstehend beschrieben, als weitere Antiköφerzusammensetzungen im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet. Der Rest dieser Antiköφerzusammensetzun- gen wird aufbewahrt, um dann in einem späteren Verfahrensschritt mit den anderen im erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Antiköφerzusammensetzungen vereinigt zu werden. Dies gilt auch für die in den nachstehend beschriebenen Verfahrensschritten erhaltenen weiteren Antiköφerzusammensetzungen. Die im zweiten Immunisierungsschritt erhaltenen weiteren Antiköφerzusammensetzungen können gegebenenfalls in einmaliger bzw. mehrmaliger Wiederholung der vorstehend genannten Verfahrensschritte jeweils, wie vorstehend beschrieben, wiederum an eine feste Matrix gekoppelt werden (Matrix A', B', bzw. A", B" etc.), mit der dann die Restimmu- nogene, die in dem im Verfahren insgesamt jeweils vorhergehenden Matrixinkubationsschritt gewonnen wurden, inkubiert werden; siehe Abb. 2. Die in diesem Schritt bzw. in diesen Schritten jeweils nicht gebundenen Restimmunogene (abgeleitet vom nativen Teil bzw. vom modifizierten Teil) können dann nach der Inkubation mit der jeweiligen Matrix und gegebenenfalls einer Konzentrierung für eine weitere Immunisierung in der vorste- hend beschrieben Weise eingesetzt werden. Mittels der weiteren Immunisierung bzw. Immunisierungen werden weitere Antiköφerzusammensetzungen erhalten, die in noch stärkerem Maße gegen schwächere Immunogene gerichtet sind bzw. gegen Immunogene, die in der ursprünglichen biologischen Flüssigkeit lediglich in geringem Maße enthalten sind. Durch das einmalige oder mehrmalige Wiederholen der genannten Verfahrensschritte, wie in Abb. 2 dargestellt, ist es entsprechend möglich, den Effekt der Immunkompetition deutlich abzuschwächen oder gar ganz zu beseitigen.
Die in einer oder mehreren der vorstehend beschriebenen Immunisierungen gewonnenen Antiköφerzusammensetzungen, die immer noch entsprechend dem nativen und modifi- zierten Teil der biologischen Flüssigkeit getrennt sind, werden anschließend vereinigt bzw. gemischt; siehe Abbildungen 1 und 2. Anschließend wird die so erhaltene vereinigte Antiköφerzusammensetzung mit einer festen Matrix, an die die Bestandteile der biologischen Flüssigkeit gebunden sind, so inkubiert bzw. in Kontakt gebracht, daß Antiköφer gebunden werden können. Durch anschließendes Waschen der Matrix und nachfolgende Elution der an die Matrix gebundenen Antiköφer wird dann eine ausgewogene Antikörperzusammensetzung erhalten. Dieser Verfahrensschritt bewirkt, daß die erhaltene ausgewogene Antiköφerzusammensetzung in vorteilhafter Weise quantitativ und qualitativ auf die Bestandteile der biologischen Flüssigkeit abgestimmt ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die vorstehend genannte Matrix, an die die Bestandteile der biologischen Flüssigkeit gebunden bzw. gekoppelt sind, wie folgt hergestellt: Die biologische Flüssigkeit wird, falls erforderlich nach Entfernung von Zelltrümmern bzw. unlöslichen Komponenten und gegebenenfalls Lipiden oder hydrophoben Komponenten, mit einer festen Matrix in Kontakt gebracht, die eine mit den Bestandteilen der biologischen Flüssigkeit reaktive Gruppe trägt. In einer vorteilhaften Ausführungsform ist dies CNBr-aktivierte Sepharose. Nach Beendigung der Kopplungsreaktion und Absättigen der überschüssigen reaktiven Gruppen z.B. mit Ethanolamin und anschließendem Waschen (wie oben für die Immobilisierung der Antiköφer beschrieben), werden Matrix und Flüssigkeit getrennt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Teil der biologischen Flüssigkeit, der Kontakt mit der ersten Matrix hatte, mit wenigstens einer weiteren Matrix in Kontakt gebracht, die eine weitere (von der ersten verschiedene) mit den Bestandteilen der biologischen Flüssigkeit reaktive Gruppe trägt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist dies Epoxy-aktivierte Sepharose. Nach Beendigung dieser Reaktion und Absättigen der verbliebenen reaktiven Gruppen durch Ethanolamin werden sämtliche Matrices, an die in der biologischen Flüssigkeit enthaltene Bestandteile gebunden sind, gemischt. Auf diese Weise wird in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung eine Matrix erhalten, an die die Bestandteile der biologischen Flüssigkeit in besonder effizienter Weise gebunden sind. Diese Matrix wird dann zur Inkubation mit der in den vorhergehenden Immunisierungsschritten erhaltenen, vereinigten Antiköφerzusammensetzung verwendet.
In einer bevorzugte Ausführungsform wird die vorstehend genannte Matrix mit den daran gebundenen Bestandteilen der biologischen Flüssigkeit in einer Säule verwendet. Hierzu wird die Säule nach dem Befüllen, Absetzen der Matrix und anschließendem Äquilibrieren mit einem geeigneten Puffer, bis zur Sättigung mit der in den Immunisierungen gewonnenen vereinigten Antiköφerzusammensetzung beladen. Es ist hierbei vorteilhaft, den bereits für die vereinigte Antiköφerzusammensetzung verwendeten Puffer einzusetzen. Die Sättigung mit Antiköφern kann am Durchfluß von nichtgebundenen Antiköφern erkannt werden, bevorzugt durch eine OD-Messung oder ein anderes geeignetes Verfahren zur Proteindetektion. Um zu klären, ob Antiköφer gegen alle Bestandteile der biologischen Flüssigkeit in ausreichender Menge an die Matrix gebunden sind, kann z.B. eine Western- Blot-Analyse des Säulendurchflusses durchgeführt werden, bei der alle proteinergen Anti- gene aufgetrennt und über die in einzelnen Durchlauφroben enthaltenen Antiköφer angefärbt werden. Nimmt die Anzahl der im Vergleich zu einer Coomassie- oder Silberfärbung detektierbaren Banden nicht mehr zu, so kann von einer Sättigung der Antigenmatrix ausgegangen werden. Anschließend wird die Säule vorzugsweise mit etwa 3 bis 10 Volumina Auftragspuffer gewaschen. Durch den Waschschritt werden Antiköφer entfernt, die nicht an die auf der Matrix immobilisierten Bestandteile der biologischen Flüssigkeit binden oder im Überschuß vorhanden sind. Anschließend werden die an die Matrix gebundenen Antiköφer eluiert, wobei dafür vorzugsweise ein alkalischer Puffer verwendet wird. Nach der Elution der Antiköφer sollte die so erhaltene ausgewogene Antiköφerzusammensetzung möglichst schnell neutralisiert werden (z.B. mit 1 M TRIS, pH 7.0), um eine Denaturierung der Antiköφer zu vermeiden.
Die Inkubation der vereinigten Antiköφerzusammensetzung mit der Matrix, an die die Bestandteile der biologischen Flüssigkeit gebunden sind, kann in ebenfalls bevorzugter Weise auch im Batch-Verfahren erfolgen, wobei nach Inkubation der Matrix mit der Antiköφerzusammensetzung und anschließendem Waschen die gebundenen Antiköφer ebenfalls vorzugsweise durch Behandlung der gewaschenen Matrix mit einem alkalischen Puffer und, nach Abtrennung der Matrix, Neutralisation erhalten werden.
Gemäß den vorstehend beschriebenen Verfahren wird eine ausgewogene Antiköφerzusammensetzung gegen Bestandteile einer biologischen Flüssigkeit erhalten, die vorteilhafte Eigenschaften aufweist.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Antiköφerzusammensetzung gegen die Bestandteile einer biologischen Flüssigkeit, die gemäß einem der vorstehend beschriebenen Verfahren erhältlich ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Antiköφerzusammensetzung an ein festes Trägermaterial gekoppelt. Besonders bevorzugt als Trägermaterial ist in diesem Zusammenhang eine Membran, die Antiköφer in effizienter Weise bindet, z.B. Nitrozellulose, verstärkte Nitrozellulose oder andere Membranen, wie sie dem Fachmann z.B. zur Verwendung für das Western- blotting bekannt sind, z.B. Nylon- oder PVDF(Polyvinyliden)-Membranen. Geeignet als Trägermaterial sind auch Glas- oder Kunststoffoberflächen. Besonders bevorzugt als Trägermaterial sind auch feste Matrices, wie CNBr-aktivierte Sepharose oder Epoxy- aktivierte Sepharose. Geeignet sind auch Kunstoff- oder Glas-Beads. Durch die Kopplung der erfindungsgemäßen Antiköφerzusammensetzungen an ein festes Trägermaterial werden Trägermaterialien erhalten, die sich besonders zur Bindung von in biologischen Flüssigkeiten enthaltenen Bestandteilen eignen. In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Aufreinigung eines oder mehrerer in einer biologischen Flüssigkeit enthaltenen Bestandteile. Die in diesem Zusammenhang in Frage kommenden biologischen Flüssigkeiten können wiederum von tierischen oder pflanzlichen Zellen oder Geweben in Kultur stammen, z.B. Zeil- oder Gewebeextrakten, oder von Zeil- oder Gewebekulturüberständen. Sie können auch von Hefen, anderen Pilzen, Bakterien oder sonstigen Mikroorganismen stammen (hierbei sowohl von Zellextrakten als auch von Kulturüberständen). Geeignet als Quellen sind auch Virenkulturen oder Prionenpräparationen. Es kann sich ferner um Köφerflüs- sigkeiten handeln, z.B. Urin, Blut, Lymphe oder Spinalflüssigkeit, sowohl menschlichen als auch tierischen Ursprungs.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die biologische Flüssigkeit vor Verwendung im erfmdungsgemäßen Reinigungsverfahren, wie vorstehend beschrieben, vorbehandelt, z.B. durch Entfernen von Zelltrümmern und makromolekularen Aggregaten, durch Be- handlung mit DNase und RNase oder durch Abtrennung von möglicherweise in der biologischen Flüssigkeit enthaltenen Lipiden oder hydrophoben Komponenten. Die Vorbehandlung entspricht vorzugsweise derjenigen, die die biologische Flüssigkeit erhalten hat, gegen die die im erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren wie nachstehend beschrieben eingesetzte ausgewogene Antiköφerzusammensetzung gerichtet ist bzw. gegen die diese Antiköφerzusammensetzung hergestellt wurde.
Bei den aufzureinigenden Bestandteilen kann es sich um die üblichen Bestandteile biologischer Flüssigkeiten handeln. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um Polypeptide bzw. (Glyko-)Proteine, insbesondere in einem biologischen System heterolog exprimierte Polypeptide oder (Glyko-)Proteine, d.h. Polypeptide oder (Glyko-)Proteine, die von einem anderen biologischen System stammen und etwa mittels stabiler oder tran- sienter Transfektion mit Expressionsvektoren in dem betreffenden biologischen System, z.B. einer Zellinie, exprimiert werden. Bevorzugt ist auch die Aufreinigung von homologen Polypeptiden bzw. (Glyko-)Proteinen, die in einem biologischen System überexpri- miert werden.
Entsprechend dem Reinigungsverfahren der vorliegenden Erfindung wird zunächst eine ausgewogene Antiköφerzusammensetzung entsprechend den vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren gegen die Bestandteile der biologischen Flüssigkeit mit Ausnahme des aufzureinigenden Bestandteils bzw. der aufzureinigenden Bestandteile hergestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird hierzu eine Antiköφerzusammensetzung gegen die Bestandteile der biologischen Flüssigkeit hergestellt, die von dem betref- fenden biologischen System (z.B. einer Zellini e) im physiologischen Standardzustand erhalten wurde, die also dem physiologischen Standardzustand des betreffenden biologischen Systems entspricht, von dem sie stammt. Physiologischer Standardzustand bedeutet in diesem Zusammenhang den Zustand, in dem sich das biologische System unter definierten Kultur- bzw. Lebensbedingungen befindet, z.B. den Bedingungen, wie sie im Falle von Zellen, Geweben oder Mikroorganismen zur Kultivierung verwendet werden. Verändert man die Bedingungen bzw. den physiologischen Zustand des biologischen Systems, z.B. durch heterologe Expression eines Proteins oder durch chemische, physikalische oder biologische Einflüsse, so kann die von dem so behandelten biologischen System stammende biologische Flüssigkeit gegenüber der vom gleichen System im Standardzustand stammenden, entsprechenden biologischen Flüssigkeit zusätzliche oder in erhöhtem Maße vorhandene Bestandteile, z.B. Proteine, aufweisen. Entsprechendes gilt auch für biologische Flüssigkeiten wie Köφerflüssigkeiten. Die Zusammensetzung der Bestandteile von Köφerflüssigkeiten gesunder Personen oder Tieren entspricht dem Standardzustand, wobei bei bestimmten Erkrankungen die Köφerflüssigkeiten, z.B. Blut, Urin, Lymphe oder Spinalflüssigkeit, zusätzliche Bestandteile bzw. erhöhte Quantitäten normalerweise vorhandener Bestandteile, z.B. Proteine, aufweisen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des beanspruchten Reinigungsverfahren handelt es sich ferner bei der biologischen Flüssigkeit, die den/die gemäß dem erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren aufzureinigenden Bestandteil/Bestandteile enthält, um eine Flüssigkeit, die einem veränderten physiologischen Zustand des betreffenden biologischen Systems entspricht, von dem die Flüssigkeit stammt. Mit verändertem physiologischen Zustand ist der Zustand gemeint, der nicht dem physiologischen Standardzustand entspricht, und in dem gegenüber dem physiologischen Standardzustand bestimmte zusätzliche Be- standteile bzw. erhöhte Quantitäten normalerweise vorhandener Bestandteile, z.B. Proteine, in dem biologischen System exprimiert werden können und somit in der von diesem System stammenden biologischen Flüssigkeit vorhanden sind. Im übrigen entspricht erfindungsgemäß die biologische Flüssigkeit, die den/die aufzureinigenden Bestand- teil/Bestandteile enthält, der biologischen Flüssigkeit, gegen die die im erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren verwendete ausgewogene Antiköφerzusammensetzung gerichtet ist bzw. erzeugt wurde, d.h. sie stammt vom gleichen biologischen System und wurde auf die gleiche oder im wesentlichen die gleiche Art und Weise gewonnen.
Anschließend an die Herstellung der ausgewogenen Antiköφerzusammensetzung gegen die Bestandteile der biologischen Flüssigkeit mit Ausnahme des/der aufzureinigenden Bestandteils/Bestandteile wird die Antiköφerzusammensetzung an ein festes Trägermaterial gekoppelt. Ein bevorzugtes Trägermaterial ist in diesem Zusammenhang CNBr- aktivierte Sepharose oder andere dem Fachmann für die Kopplung von Antiköφera bekannte Materialien. Die Kopplung der Antiköφerzusammensetzung an das Trägermaterial kann wie vorstehend beschrieben durchgeführt werden.
Anschließend wird die biologische Flüssigkeit mit dem Trägermaterial, an das die Anti- köφerzusammensetzung gebunden ist, inkubiert. Die Inkubation erfolgt vorzugsweise durch Beladen einer Säule, die das Trägermaterial enthält, mit der biologischen Flüssigkeit. Bevorzugt ist jedoch auch eine Inkubation im Batch- Verfahren. Durch die Inkubation mit dem Trägermaterial, an das die ausgewogene Antiköφerzusammensetzung gekoppelt ist, werden die Bestandteile der biologischen Flüssigkeit mit Ausnahme des/der aufzurei- nigenden Bestandteils/Bestandteile an die Matrix gebunden. Der aufzureinigende Bestandteil bzw. die aufzureinigenden Bestandteile können als nichtgebundene Bestandteile durch Abtrennen der Matrix, im Falle des Batch- Verfahrens, oder durch einfaches Sammeln des Durchflusses im Falle der Verwendung einer Säule gewonnen werden. Gegebenenfalls können sich dann eine Konzentrierung des nichtgebundenen Materials und weite- re Analysen oder biologische Tests anschließen.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der biologischen Flüssigkeit um Zeil- oder Gewebekulturüberstände, insbesondere Überstände von BHK- oder CHO- Zellen in Suspensionskultur. In diesem Falle wird eine ausgewogene Antiköφerzusam- mensetzung gegen den Zell-oder Gewebekulturüberstand von unter Standardbedingungen kultivierten Zellen oder Geweben, z.B. BHK-Zellen, gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt. Wird die Reinigung von Bestandteilen aus dem Zeil- oder Gewebekulturüberstand von mit Expressionsvektoren oder viralen Vektoren transfizierten oder trans- formierten tierischen oder pflanzlichen Zellen angestrebt, z.B. mit einem Expressionsvektor transfizierte BHK-Zellen, so handelt es sich bei den Zellen, gegen deren Überstand die erfindungsgemäße ausgewogene Antiköφerzusammensetzung hergestellt wird, vorzugsweise um scheintransfizierte Zellen, die unter den gleichen Transfektions- und Kul- turbedingungen kultiviert wurden wie die Zellen, deren Kulturüberstand anschließend dem erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren unterzogen wird. Vorzugsweise werden alle Vorreinigungsschritte, d.h. vor Immunisierung der Tiere bezüglich der biologischen Flüssigkeit vorgenommene Schritte, die bei der Herstellung der verwendeten ausgewogenen Antiköφerzusammensetzung vorgenommen wurden, auch auf die im Reinigungsverfahren zu behandelnde biologische Flüssigkeit angewandt.
Bei der Aufreinigung von Bestandteilen aus Zeil- oder Gewebekulturüberständen, z.B. Überstände von transfizierten BHK oder CHO-Zellen, wird der zu reinigende Zeilüberstand vorzugsweise zunächst hydrophober Interaktionschromatographie, z.B. mit Phenyl- sepharose (Phenylsepharose, Pharmacia) als Chromatographiematerial, unterworfen. Anschließend folgt die Inkubation mit einer Matrix, an die die vorstehend genannte ausgewogene Antiköφerzusammensetzung gegen die Bestandteile des Zellkulturüberstandes, z.B. des Überstandes von BHK oder CHO-Zellen in Kultur, der dem physiologischen Standardzustand entspricht, gekoppelt ist. Die Inkubation erfolgt z.B. nach dem Prinzip der Immunaffmitätschromatographie an einer Immunaffinitätsmatrix, die von der genannten Matrix gebildet wird.
Die dem erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren unterworfenen biologische Flüssigkeiten können ein breites Spektrum an Proteinkonzentrationen aufweisen. Ein bevorzugter Konzentrationsbereich liegt bei 0.1 μg/ml bis 50 mg/ml Protein, wobei ein Konzentrationsbereich von 1 μg/ml bis 1 mg/ml Protein besonders bevorzugt ist.
Für die hydrophobe Interaktionschromatographie und die Immunaffmitätschromatographie ist ein breites Spektrum an Säulenvolumina geeignet, das vom Fachmann abhängig von der Menge der biologischen Flüssigkeit und der Protein- bzw. Lipidkonzentration bestimmt werden kann. Bevorzugt sind Säulenvolumina im Bereich von 0.02 bis 20 ml, wobei Volumina im Bereich von 0.05 bis 2 ml besonders bevorzugt sind. Es können jedoch in den verschiedenen Verfahrensschritten auch Säulen mit jeweils unterschiedlichen Volumina verwendet werden.
Im Falle der Verwendung von Säulen zur Entfernung von Lipiden bzw. zur Inkubation der biologischen Flüssigkeit mit der die ausgewogene Antiköφerzusammensetzung enthaltenen Matrix kann das aufzutragende Volumen an zu reinigender biologischer Flüssigkeit das 0.05- bis 50-fache des Säulenvolumens betragen; vorzugsweise wird das 1- bis 10- fache des Säulenvolumens aufgetragen. In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform werden alle, oder zumindest einzelne Schritte, z.B. die Entfernung der Lipide über eine hydrophobe Interaktionsmatrix, anschließende Inkubation der biologischen Flüssigkeit mit einer Immunaffinitätsmatrix und Elution eines oder mehrerer Proteine, im Batch- Verfahren, d.h. ohne Säulen, durchgeführt. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des beanspruchten Verfahrens umfaßt die präparative Reinigung von Bestandteilen der biologischen Flüssigkeit, z.B. Proteinen, wobei die verwendeten Säulen bzw. Reaktionsbehälter beispielsweise ein Volumen zwischen 20 ml und 500 1 aufweisen. Nach Auftragen der biologischen Flüssigkeit auf die Säule bzw. die Säulenkombination und deren anschließender Passage, bzw. nach Inkubation mit der hydrophoben Affinitätsmatrix und der Immunaffinitätsmatrix, befindet sich das gewünschte Protein im Durchbruch bzw. Überstand und wird vorzugsweise anschließend durch biochemische Standardverfahren, wie z.B. Ultrafiltration oder Zentrifugation in einem Centricon-Röhrchen (Amicon), aufkonzentriert.
Ein Vorteil des beanspruchten Reinigungsverfahrens besteht darin, daß man Bestandteile wie Proteine bzw. Polypeptide, die in einem biologischen System exprimiert bzw. überex- primiert werden, das sich gegenüber dem physiologischen Standardzustand in einem veränderten physiologischen Zustand befindet, z.B. durch Transfektion von Zellen in Kultur mit einem Expressionsvektor, durch das erfindungsgemäße Verfahren leicht isolieren kann, ohne daß die genauen Eigenschaften der zusätzlich exprimierten oder überexpri- mierten Bestandteile bekannt sein müssen.
Es sind weitere vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung möglich, wie z.B. die auf der chemischen, physikalischen oder biologischen Modifikation von Zellen basierende Differenzanalyse. Dabei wird wie folgt verfahren: Zunächst wird, wie bereits oben be- schrieben, eine ausgewogene Antiköφerzusammensetzung gegen das Ausgangsmaterial, z.B. eine von einem bestimmten Zelltyp oder Organismus stammende biologische Flüssigkeit, gewonnen. Anschließend ist es ohne komplizierte Zusatzschritte möglich, direkt den Effekt von bestimmten chemischen, physikalischen oder biologischen Einflüssen auf das biologische System (Gewebe, Zelle, Mikroorganismus, Virus, Prion) zu testen. Hierzu verwendet man das System bzw. die daraus gewonnene biologische Flüssigkeit, die dem Standardzustand des Systems entspricht, als Kontrolle, gegen die im erfindungsgemäßen Verfahren die ausgewogene Antiköφerzusammensetzung gerichtet ist. Anschließend analysiert man den Bestandteil oder die Bestandteile der entsprechenden biologischen Flüssigkeit, die aus dem gleichen System erhalten wurde, nachdem es biologischen, chemischen oder physikalischen Einflüssen ausgesetzt wurde, indem man diese Flüssigkeit dem erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren unterwirft.
Eine mögliche Anwendung ist in diesem Zusammenhang das Erhitzen von Bakterienzellen mit anschließender Gewinnung der Hitzeschockproteine durch das o.g. Verfahren. Auch Mutagenese durch chemische Agentien oder Bestrahlung mit darauf folgender Analyse der hierbei entstandenen Genprodukte, die charakteristisch für die Zelle in einem durch diese Einflüsse hervorgerufenen physiologischen Zustand sind, ist möglich. Es ergeben sich weitere vorteilhafte Ausführungsformen für die Analyse unbekannter Viren, Pilze, Prionen oder Mikroorgansimen, deren Genprodukte mit dem o.g. Verfahren direkt aus der befallenen/infizierten Zelle bzw. der davon stammenden biologischen Flüssigkeit isoliert werden können und die durch sie hervorgerufene Differenz bzw. physiologische Veränderung einen wichtigen Hinweis auf Stoffwechselprodukte infizierter Zellen und deren Pathoge- nese liefern können. Als Kontrolle und Ausgangsmaterial für die Herstellung der erfin- dungsgemäßen Antiköφerzusammensetzung dient hierbei immer die biologische Flüssigkeit, die dem physiologischen Standardzustand des jeweiligen biologischen Systems entspricht.
Erfindungsgemäß ist auch die präparative Isolierung der Proteine bzw. Stoffwechselpro- dukte möglich, die in biologischen Flüssigkeiten aus infizierten, transfizierten, transformierten oder anderweitig modifizierten oder behandelten Zellen oder Geweben enthalten sind. Weiterhin können gemäß der vorliegenden Erfindung die Effekte von physikalischen Einflüssen, wie z.B. ionisierender Strahlung, auf biologisches Material analysiert werden, wobei entsprechende Zellen oder Gewebe vor und nach Bestrahlung analysiert werden. Auch die Gewinnung von Proteinen aus einer Köφerflüssigkeit ist durch das o.g. Verfahren ohne weiteres möglich, wobei z.B. die Flüssigkeiten (z.B. Urin) von gesunden und kranken Organismen derselben Spezies miteinander verglichen werden können und die Isolierung von im Krankheitszustand zusätzlich auftretenden Proteinen möglich ist. Diese Ausführungsformen des beanspruchten Verfahrens sind speziell für den diagnostischen Bereich wertvoll und sind auch bei der Analyse bisher unbekannter oder schwer zu diagnostizierender Krankheiten von großem Nutzen.
Das vorstehend beschriebene Reinigungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann noch weitere konventionelle Reinigungsschritte umfassen, die je nach Bedarf mit den genannten Verfahrensschritten kombiniert werden können. Insbesondere betrifft die Erfindung auch ein Reinigungsverfahren, das weitere Chromatographieschritte umfaßt, die auf hydrophober Interaktion, ionischer Wechselwirkung oder Wasserstoffbrückenbindung beruhen und unter Bedingungen durchgeführt werden, unter denen der/die in der biologischen Flüssigkeit enthaltenen aufzureinigenden Bestandteil/Bestandteile nicht gebunden werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des beanspruchten Verfahrens werden zusätzlich weitere Schritte verwendet, die z.B. die Detektion des aufzureinigenden Proteins nach dessen Isolierung mit Hilfe von spezifischen Antiköφernachweisen oder biologischen Tests oder weitere Reinigungsschritte umfassen.
Zu diesem Zweck wird erfindungsgemäß vorzugsweise ein modulares bzw. ein aus Kom- partimenten bestehendes System verwendet, das eine Kombination des erfindungsgemäßen Aufreinigungsverfahrens mit der Gewinnung der biologischen Flüssigkeit bis hin zum Auffangen oder Nachweis des/der isolierten Bestandteils/Bestandteile, insbesondere Proteine, ermöglicht. Eine in diesem Zusammenhang geeignete modulare Vorrichtung zur Aufreinigung von in einer biologischen Flüssigkeit enthaltenen Bestandteilen gemäß der vorliegenden Erfindung ist in Abb. 3 beispielhaft dargestellt, und ist vorzugsweise wie folgt aufgebaut: Zuoberst befindet sich ein Modul bzw. Kompartiment, daß sich zur Kultivierung von Zellen (z.B. BHK- oder CHO-Zellen), Geweben oder Mikroorganismen eignet, die den zu reinigenden oder gewünschten Bestandteil bzw. die Bestandteile sezernie- ren, etwa ein Minizellreaktor, oder ein Modul, das sich als Behälter für eine anderweitige gewünschte biologische Flüssigkeit eignet. Zwischen diesen die biologische Flüssigkeit enthaltenden Modulen und dem jeweils nachfolgenden Modul ist vorzugsweise ein Filter installiert, das Zellbestandteile und Molekülaggregate zurückhält.
Daran kann sich in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ein Modul mit Chroma- tographiemedium zur Entfernung von Lipiden, wie z.B. Phenylsepharose, anschließen. Auf die Zwischenschaltung dieses Moduls kann jedoch auch gemäß ebenfalls geeigneter erfmdungsgemäßer Vorrichtungen verzichtet werden. Enweder direkt nach dem die biolo- gische Flüssigkeit enthaltenden Modul oder gegebenenfalls nach dem Modul mit Chromatographiemedium folgt vorzugsweise ein Modul, das gemäß der Erfindung eine feste Matrix mit daran gebundener ausgewogener Antiköφerzusammensetzung gegen die Bestandteile der zu behandelnden bzw. zu reinigenden biologischen Flüssigkeitenthält, die dem im Standardzustand des betreffenden biologischen Systems entsprichtt (Immunaffi- nitätsmatrix; siehe Abb. 3). In einer bevorzugten Ausfuhrungsform handelt es sich um eine ausgewogene Antiköφerzusammensetzung gegen kultivierte und gegebenenfalls scheintransfizierte pflanzliche oder tierische Zellen, insbesondere BHK- oder CHO- Zellen.
Anschließend an die Immunaffinitätsmatrix kann es vorteilhaft sein, die Flüssigkeit durch ein weiteres Chromatographiemedium zu leiten, um eventuell noch vorhandene niedermolekulare Bestandteile der biologischen Flüssigkeit zu entfernen (in Abb. 3 nicht explizit dargestellt). Hierbei kommen Matrices auf Ionenaustauscherbasis in Betracht. Zum Beispiel ist es bei einem Protein, dessen pl aufgrund der DNA-Sequenz bekannt ist, möglich, durch einen geeigneten Ionenaustauscher Verunreinigungen zu entfernen und das Protein im Durchfluß zu erhalten. Bei einem pl des Proteins von 5.0 und einem pH- Wert der Lösung von 7.2 ist es beispielsweise sehr unwahrscheinlich, daß dieses Protein an einen Kationenaustauscher bindet, wohingegen einige Verunreinigungen sehr wohl daran binden werden.
Als nächstes folgt dann vorzugsweise ein Modul zur Konzentrierung der Lösung oder zur Immobilisierung des aufgereinigten Bestandteils bzw. der aufgereinigten Bestandteile, was vorzugsweise dadurch geschieht, daß das Modul eine Membran umfaßt. Die Funktion des Moduls wird dabei maßgeblich durch die Art der verwendeten Membran bestimmt. So erfolgt im einfachsten Fall eine Konzentrierung des/der aufgereinigten Bestandteils/Bestandteile durch Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran. In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform kann auch eine Immobilisierung des/der aufgereinigten Bestandteils/Bestandteile, z.B. durch eine Nitrozellulosemembran, erreicht werden. Eine spezifischere Bindung der aufgereinigten Substanz kann durch eine entsprechend vorbehandelte Membran erreicht werden, die z.B. immobilisierte Rezeptoren enthalten kann, die mit dem/den aus der biologischen Flüssigkeit isolierten Bestandteil/Bestandteilen intera- gieren.
Die vorstehend genannte Anordnung der einzelnen Module in der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist nicht zwingend. Vielmehr sind auch andere Reihenfolgen sowie das Austauschen oder Weglassen einzelner Module möglich. Die geeignete Anzahl und Anordnung der Module hängt von der Art der biologischen Flüssigkeit, den Gegebenheiten des verwendeten biologischen Systems und den Eigenschaften des/der zu reinigenden Bestandteils/Bestandteile ab, und kann vom Fachmann an die jeweilige Situation angepaßt werden. So ist z.B. jede Art von Chromatographieprinzip, wie etwa Ionenaustausch-, hydrophobe Interaktions- oder Affinitätschromatographie in Form von Modulen der beschriebenen Art mit dem erfindungsgemäßen Immunaffmitätsmatrixmodul, das Bestand- teile der biologischen Flüssigkeit gemäß dem physiologischen Standardzustand bindet, kombinierbar.
Um eine effektive und schnelle Passage der Flüssigkeit durch eine Kombination von Modulen zu ermöglichen, ist die erfindungsgemäße Vorrichtung vorzugsweise so gestaltet, daß der Flüssigkeitsdurchtritt bzw. die -passage durch die Module z.B. durch Zentrifugalkraft oder durch Über- bzw. Unterdruck, erzeugt durch eine geeignete Apparatur, z.B. eine Vakuumpumpe, beschleunigt werden kann.
Die o.g. modulare Ausführungsform der Erfindung eignet sich besonders für den Einsatz in Verfahren, die einen hohen Probendurchsatz erfordern („high throughput"), da in einer geeigneten Apparatur eine Vielzahl von Einheiten parallel betrieben werden können, was z.B. in der Diagnostik, Analytik und Biochemie häufig der Fall ist. Entsprechend betrifft eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung solche Vorrichtungen, bei denen eine Vielzahl von Einheiten, die aus den vorstehend genannten Modulen zusammengesetzt sind, parallel betrieben werden können.
Beispiel 1 ; Herstellung einer ausgewogenen Antiköφerzusammensetzung gegen BHK- Zell-Antigene
Scheintransfizierte BHK-Zellen werden in Suspensionskultur unter Zuhilfenahme von Microcarriern (Pharmacia) in serum- und proteinfreiem Medium zu einer Dichte von etwa 2 x 106 Zellen pro Milliliter kultiviert. Nach 6 Tagen Kultur werden die Zellen durch Ein- frieren in flüssigem Stickstoff und Wiederauftauen in ihrem Medium aufgebrochen. Dieser Vorgang wird insgesamt dreimal wiederholt. Anschließend wird die Suspension für eine Stunde bei 100.000 g und 4°C zentrifugiert. Der Überstand mit einer Proteinkonzentration von 0.8 mg/ml wird nun mit 10 U/ml DNase I (Benzonase, Merck) versetzt, zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und dann durch Chromatographie an Phenyl- Source (Pharmacia) vorgereinigt. Hierzu werden 5 ml Überstand auf eine Säule mit einem Volumen von 2 ml aufgetragen, wobei die Flußrate 1 ml/min beträgt. Der Durchfluß wird gesammelt und in zwei Aliquots von jeweils 2 ml mit je 1.5 mg Protein aufgeteilt. Zur Denaturierung mit anschließender Deglykosylierung wird ein Aliquot mit 0.016%) SDS (Endkonzentration) versetzt, 10 min gekocht, und nach dem Abkühlen mit 0.016 % Triton X-100 (Endkonzentration) versetzt. Anschließend werden 10 U N-Glykosidase F (Boeh- ringer Mannheim) zugesetzt und der Ansatz 12 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach dem enzymatischen Verdau wird die Probe 5 min gekocht, um das Enzym zu inaktivieren.
Zur Immunisierung wird jede der Proben, die jeweils etwa 1.5 mg Protein enthalten, in 2 ml Freunds Adjuvans (Sigma) suspendiert. Etwa 4 ml der Suspension werden an mehreren Stellen eines weißen Neuseelandhasen subkutan injiziert. Für beide Proben werden jeweils drei Hasen immunisiert. Nach 21 Tagen wird eine zweite Immunisierung durchgeführt. Hierzu werden pro Tier jeweils 0.5 mg Protein (0.7 ml Lösung) mit 2 ml Freunds inkomplettem Adjuvans (Sigma) versetzt und wiederum an mehreren Stellen subkutan injiziert. 49 Tage nach der ersten Injektion wird eine dritte Immunisierung vorgenommen, wobei man analog der zweiten Immunisierung verfährt. Am Tag 56 wird das Blut der Tiere durch Herzpunktion gewonnen. Zur Gewinnung des Serums wird das Blut (ca. 50 ml) in Plastikröhrchen gegeben, mit einem Holzspatel versetzt und 6 Stunden bei Raumtempe- ratur inkubiert. Anschließend wird der Blutkuchen entfernt und die Probe 15 min bei 40.000 g zentrifugiert. Die drei Seren jeder Gruppe werden danach vereinigt.
Zur Gewinnung der Antiköφer werden die beiden Proben bei 5° C unter Rühren langsam auf eine Endkonzentration von 30 %> (w/v) Ammoniumsulfat gebracht. Nach Zugabe des Ammoniumsulfates wird noch weitere zwei Stunden bei 5° C gerührt. Anschliessend werden die Suspensionen eine Stunde bei 40.000 g und 5° C zentrifugiert. Die Niederschläge, welche die Immunglobuline enthalten, werden nun in jeweils 15 ml PBS (10 mM Na2HPO4/KH PO4, 140 mM NaCl, pH 7.4) aufgenommen und erschöpfend gegen densel- ben Puffer dialysiert. Zur Gewinnung von Antiköφern der IgG-Klasse wird eine Affinitätschromatographie an Protein-G-Sepharose (Pharmacia) durchgeführt. Hierzu wird die Probe (16 ml) langsam auf eine Säule mit einem Volumen von 10 ml aufgegeben. Anschliessend wird die Säule mit ca. 100 ml PBS gewaschen. Die gebundenen Antiköφer werden mit 25 ml Elutionspuffer (100 mM Ethanolamin, 140 mM NaCl, pH 11.0) eluiert. Das Eluat wird sofort durch Zugabe von 1 M Tris (pH 7.0) neutralisiert und anschließend erschöpfend gegen PBS (pH 7.8) dialysiert.
Zur Herstellung einer Immunaffinitätsmatrix werden jeweils 20 mg der gewonnenen Immunglobuline an jeweils 4 ml CNBr-aktivierte Sepharose (Pharmacia) gebunden. Hierzu wird das Gel zunächst entsprechend den Herstellerangaben vorbehandelt. Anschließend werden 4 ml Gel zu ca. 10 ml Antiköφerlösung (2 mg/ml) gegeben und der Ansatz an einem Kopf-über-Kopf Schüttler zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird das Gel gewaschen, in 1 M Ethanolamin (pH 8.0) aufgenommen, eine Stunde inkubiert und abschließend mit 100 ml PBS gewaschen.
Um Bestandteile aus der biologischen Flüssigkeit zu isolieren, gegen die keine oder nur sehr wenig Antiköφer gebildet wurden, wird nun separat für beide Teile der biologischen Flüssigkeit (nativ und modifiziert) eine Immunaffmitätschromatographie mit den dazugehörigen Antiköφersäulen durchgeführt. Hierzu werden pro Lauf 2 ml biologische Flüssig- keit mit jeweils 1.5 mg Protein bei einer Flußrate von 0.5 ml/min auf die Säule gegeben. Der Durchfluß, der die ungebundenen Substanzen enthält, wird gesammelt, lyophilisiert und mit Wasser auf eine Proteinkonzentration von ca. 0.5 mg/ml eingestellt. Diese Lösung wird nun für eine weitere Immunisierung von Hasen verwendet. Die Immunisierungsprozedur entspricht der oben beschriebenen Methode, wobei für die erste Immunisierung 1.5 mg Protein suspendiert in 2 ml Freunds komplettem Adjuvans, für die zweite Immunisierung nach 21 Tagen 0.5 mg Protein suspendiert in 2 ml inkom- plettem Freunds Adjuvans, und für die dritte Immunisierung nach 49 Tagen ebenfalls 0.5 mg Protein suspendiert in 2 ml inkomplettem Freunds Adjuvans verwendet werden. Für jeden der beiden Teile der biologischen Flüssigkeit (nativ und modifiziert) werden drei Hasen verwendet. Nach der Immunisierung werden die Seren gewonnen, die Immunglo- buline isoliert und entsprechend der oben beschriebenen Methode Immunaffinitätssäulen hergestellt.
Mit diesen Immunaffinitätsssäulen werden nun Bestandteile der biologischen Flüssigkeit isoliert, gegen die keine oder nur sehr wenige Antiköφer gebildet wurden. Hierzu wird der Durchfluß der Lösungen, die zuvor über die Immunaffinitätssäulen der ersten Immuni- sierung gegeben wurden, auf die im jeweils letzten Schritt hergestellten Immunaffinitätssäulen gegeben. Der Durchfluß, welcher die nicht gebundenen Verunreinigungen enthält, wird erneut gesammelt, lyophilisiert und mit Wasser auf eine Proteinkonzentration von 0.5 mg/ml eingestellt.
Mit diesen Lösungen werden nun analog der oben beschriebenen Methode weitere Hasen immunisiert und die IgG-Fraktionen isoliert.
Die isolierten IgG-Fraktionen sämtlicher Immunisierungen (3x gegen native Antigene, 3x gegen modifizierte (denaturierte und deglykosylsierte) Antigene) wurden nun vereinigt. Zur Herstellung einer ausgewogenen Antiköφerzusammensetzung, die Antiköφer enthält, die Antigenstrukturen aus BHK-Zellen erkennen, wird eine Affinitätschromatographie an immobilisierten Bestandteilen der von den BHK-Zellen stammenden biologischen Flüssigkeit durchgeführt. Hierzu werden diese Bestandteile unter Verwendung von zwei verschiedenen Kopplungsreaktionen auf einer Festphase immobilisiert. In einem ersten Schritt werden 20 ml der biologischen Flüssigkeit mit einer Proteinkonzentration von 0.8 mg/ml erschöpfend gegen PBS pH 7.8 in einem Dialyseschlauch mit einer molekularen Ausschlußgrenze von 500 Da (Sialomed) dialysiert. Die Lösung wird anschließend mit 4 ml, nach Herstellerangaben vorbehandelter, CNBr-aktivierter Sepharose zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Sepharose wird anschließend durch Zentrifugation abgetrennt, weitere zwei Stunden in 8 ml 1 M Ethanolaminlösung (pH 8.0) inkubiert und an- schliessend mit PBS (pH 7.4) gewaschen. Der Überstand der Zentrifugation, welcher noch nicht immobilisierte Bestandteile enthält, wird nun mit 4 ml Epoxy-aktivierter Sepharose versetzt und zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Sepharose wird dann durch Zentrifugation abgetrennt, mit 8 ml 1 M Ethanolaminlösung (pH 8.0) versetzt, für zwei Stunden inkubiert und mit PBS (pH 7.4) gewaschen. Beide Matrices mit immobilisierten Bestandteilen der biologischen Flüssigkeit werden gemischt und in eine Säule mit einem Volumen von 8 ml gefüllt.
Um die ausgewogene Antiköφerzusammensetzung zu isolieren, wird die Antiköφerlö- sung bei einer Flußrate von 0.5 ml/min auf die Säule gegeben. In Vorversuchen wird der Durchfluß fraktioniert und die darin enthaltenen Antiköφer durch Western-Blot Analyse auf ihre Spezifität untersucht. Sobald im Durchfluß Antiköφer gegen sämtliche Antigene vorhanden sind, wird der Beladungs Vorgang beendet. Hiermit wird die Menge an Antikörperlösung bestimmt, die notwendig ist, um sämtliche immobilisierten Antigene in der Chromatographiesäule abzusättigen. Für eine typische Chromatographie mit der eine ausgewogene Antiköφerzusammensetzung hergestellt werden kann, ergeben sich unter den beschriebenen Bedingungen für die Beladung der Immunaffinitätssäule 5 ml Lösung, die etwa 5 mg Antiköφer enthalten. Nach ausführlichem Waschen mit PBS werden die gebundenen Antiköφer mit Elutionspuffer von der Säule abgelöst, sofort mit 1 M TRIS (pH 7.0) neutralisiert und dann erschöpfend gegen PBS (pH 7.8) dialysiert. Die Lösung wird anschließend durch Zentrifugation in einem Centricon 100-Röhrchen (Amicon) auf eine Proteinkonzentration von ca. 1 mg/ml gebracht. Etwa 8 ml dieser Lösung werden dann zwei Stunden mit 2 ml einer nach Herstellerangaben vorbehandelten CNBr-aktivierten Sepharose bei Raumtemperatur inkubiert. Die Sepharose wird anschließend durch Zentrifugation abgetrennt, zwei Stunden in 8 ml 1 M Ethanolaminlösung (pH 8.0) inkubiert und anschliessend mit PBS (pH 7.4) gewaschen.
Um die Kapazität dieser Immunaffmitätsmatrix zu ermitteln, wird eine Säule mit einem Volumen von 1 ml gepackt. Die Säule wird bei einer Flußrate von 0.2 ml /min mit Anti- genlösung beladen, die wie oben beschrieben hergestellt wird. Der Durchfluß wird in 0.2 ml Fraktionen gesammelt und auf Verunreinigungen mittels SDS-PAGE und anschließen- der Coomassie- oder Silberfärbung sowie mittels „Reversed Phase HPLC" (rHPLC) untersucht.
Beispiel 2: Reinigung von heterolog exprimiertem Erythropoietin (EPO) aus BHK- Zellkulturüberständen
Für humanes Erythropoietin kodierende cDNA wird in einen geeigneten Expressionsvektor kloniert und mittels Liposomen-vermittelter Transfektion in BHK-Zellen eingebracht. Die so transfizierten BHK-Zellen werden in Suspensionskultur mit serum- und protein- freiem Medium zu einer Dichte von etwa 2 x 106 Zellen pro Milliliter kultiviert. Nach 6 Tagen Kultur werden die Zellen abzentrifugiert und der Überstand mit einer Proteinkonzentration von etwa 40 μg/ml und einem EPO-Gehalt von etwa 20 μg/ml wird mit 10 U/ml DNase I (Benzonase, Merck) versetzt und für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Der vorbehandelte Zellüberstand wird nun einer Reinigung durch Chromatogra- phie unter Verwendung einer Immunaffmitätssäule, die gegen die Bestandteile der biologischen Flüssigkeit des BHK-Zellüberstandes im Standardzustand gerichtet ist, aufgearbeitet. Hierzu werden zwei aneinander gekoppelte Säulen mit einem Volumen von 0.2 ml und 0.1 ml verwendet. Die erste Säule (0.2 ml) enthält Phenyl-Source (Pharmacia) als Chromatographiematerial, die zweite Säule wird mit einer Immunaffmitätsmatrix gefüllt, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde. Zur Reinigung werden 5 ml Zellkul- turüberstand auf die mit PBS äquilibrierte Säulenkombination bei einer Flußrate von 0.2 ml pro Minute aufgegeben. Die ersten 0.3 ml des Durchlaufs, die dem Totvolumen der Säulenkombination entsprechen, werden verworfen. Der nachfolgende EPO-haltige Durchfluss mit einem Volumen von etwa 3.5 ml wird separat gesammelt. Dieser Durch- fluss, der EPO in einer proteinbezogenen Reinheit von mehr als 90 %> enthält, kann anschließend für weitere Untersuchungen eingesetzt werden.
Beispiel 3: Physikalisch-Chemische Charakterisierung von in situ gereinigtem, rekom- binant in BHK-Zellen exprimiertem Erythropoietin (EPO)
Im einfachsten Fall wird das Volumen der Lösung durch Ultrafiltration mit einer Centri- con 10-Einheit von 3.5 ml auf etwa 0.5 ml reduziert. Durch diesen Schritt werden niedermolekulare Verbindungen mit einer Masse kleiner als 10 kDa abgereichert und das EPO wird gleichzeitig auf eine Konzentration von etwa 140 μg/ml gebracht. Eine solche Lösung eignet sich für eine Vielzahl von Untersuchungsmethoden. Die Homogenität des Präparates wird durch elektrophoretische Methoden wie SDS-PAGE und IEF mit nachfolgender Coomassie- oder Silberfärbung ermittelt. Bestimmte Glykosylierungsmuster wer- den nach der elektrophoretischen Auftrennung durch Lektinaffinitätsblotting oder direkt durch eine ELISA-Technik ermittelt. Zur Bestimmung von Oligosaccharidstrukturen durch Lektinaffinitätsblotting werden die gereinigten Glykoproteine direkt auf eine Ni- trocellulosemembran (BA85, Schleicher & Schüll) aufgebracht und mit markierten Lekti- nen entsprechend der von Haslbeck entwickelten Methode inkubiert; Haselbeck et al., Anal. Biochem. 191 (1990), S. 25-20. Eine verbesserte Methode, bei der die Glykoproteine in Mikrotiteφlatten immobilisiert werden und mit der bestimmte Kohlenhydratstrukturen semiquantitativ durch eine dem ELISA verwandte Methode bestimmt werden können, ist bei Orberger et al., Anal. Biochem. 214 (1993), S. 195-204, beschrieben.
Die Reinheit, auch hinsichtlich nicht proteinerger Verunreinigungen, wird durch „Rever- sed Phase" Chromatographie, Kapillarelektrophorese und UV-Absorbtion bei 218 nm bzw. 280 nm bestimmt.
Beispiel 4: Untersuchungen zur Funktion von in situ gereinigtem rekombinant in BHK Zellen exprimiertem Erythropoietin
Um die Funktion von in situ gereinigtem, rekombinant exprimiertem Erythropoietin zu untersuchen, werden 0.75 ml der Lösung aus Beispiel 2, die etwa 15 μg EPO enthält, mittels einer Vakuumapparatur (BioRad) durch eine Nitrozellulosemembran (Schleicher und Schüll) gesaugt. Nach dem Blockieren der Membran mit einer einprozentigen Milchpulverlösung, wird diese eine Stunde mit einer Präparation radioaktiv markierter Retikulo- zytenmembranen inkubiert, die nach der Methode von Speyer und Fielding hergestellt wurden; Speyer und Fielding, Biochim. Biophys. Acta 332 (1974), S. 192-200. Nach kurzem Waschen mit PBS wird die Membran getrocknet und auf einem Röntgenfilm für 24 Stunden exponiert.
Beispiel 5: Biologische Aktivität von in situ gereinigtem, rekombinant in BHK-Zellen exprimiertem Erythropoietin (EPO) Zur Bestimmung der biologischen Aktivität von in situ gereinigtem EPO wurde ein in vitro Proliferationsassay verwendet; Keller, WO 91/18973 (1991).
Dazu werden 0.7 μg gereinigtes EPO in 700 μl Kulturmedium aufgenommen. Mit dieser Stammlösung wird eine 1 :2 Verdünnungsserie bis zu einer Endverdünnung von 0.006 μg/ml hergestellt. Jeweils 10 μl dieser Lösung werden in einer Mikrotiteφlatte zu 200 μl Zellösung mit einer Dichte von 3 x 105 E31 Zellen (ECACC No. 90032211) pro ml gegeben. Nach 48 Stunden Inkubation werden die Zellen mit 0.8 μCi/ml 3H-Thymidin (Amer- sham) versetzt und zwei Stunden inkubiert (Markierungsansatz). Die Zellsuspensionen wird dann über ein Glasfaserfilter abgesaugt und mit PBS gewaschen. Anschließend werden die Filter in Szintillationsgefäße überführt, mit 4 ml Szintillationflüssigkeit (Zinser) versetzt und in einem Szintillationszähler gemessen.
Beispiel 6: Isolierung von Glykosylierungsvarianten von in situ gereinigtem, rekombinant in BHK-Zellen exprimiertem Erythropoietin (EPO)
Um hochsialylierte Glykosylierungsisoformen des EPO zu isolieren, wird die Säulenkombination aus Beispiel 2, bestehend aus einer Phenylsepharose-Säule und der Immunaffmi- tätssäule gegen die Bestandteile der biologischen Flüssigkeit, um eine Lektinaffmitäts- säule erweitert. Hierzu wird eine mit Streptavidin-Sepharose (Sigma) gefüllte Säule (Volumen ca. 0.3 ml), die zuvor mit biotinyliertem Datura stramonium- Agglui m (Boehrin- ger Mannheim) beladen wurde, verwendet. Das immobilisierte Agglutinin bindet spezifisch terminale Galaktosereste, welche nicht durch z.B. Neuraminsäurereste substituiert sind (was bei Crowley et al., Arch. Biochem. Biophys. 231 (1984), S. 524-533 detailliert beschrieben ist). Zur Reinigung werden 5 ml Zellkulturüberstand auf die mit TBS (50 mM TRIS, 150 mM NaCl, 2 mM MnCl2, 2 mM CaCl2, pH 7.4) äquilibrierte Säulenkombination aufgegeben, wobei die Flußgeschwindigkeit 0.2 ml pro Minute beträgt. Die ersten 0.7 ml des Durchlaufs, die dem Totvolumen der Säulenkombination entsprechen, werden verworfen. Der nachfolgende EPO-haltige Durchfluß mit einem Volumen von etwa 3.3 ml wird separat gesammelt und für Untersuchungen gemäß Beispiel 5 sowie für Lektinaffi- nitätsblots (wie in Beispiel 1 beschrieben) eingesetzt.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung einer Antiköφerzusammensetzung gegen Bestandteile einer biologischen Flüssigkeit, das folgende Schritte umfaßt: a) Aufteilen der biologischen Flüssigkeit in einen ersten Teil (nativer Teil) und einen zweiten Teil, dessen Proteinanteile anschließend denaturiert und deglykosy- liert werden (modifizierter Teil), b) Immunisierung eines geeigneten Tieres mit vom nativen Teil stammenden Material und Gewinnung einer ersten Antiköφerzusammensetzung aus diesem Tier und Immunisierung eines weiteren geeigneten Tieres mit vom modifizierten Teil stammenden Material und Gewinnung einer zweiten Antiköφerzusammensetzung aus diesem Tier, c) Mischen der in den vorausgehenden Schritten erhaltenen Antiköφerzusammensetzungen und anschließende Inkubation mit einer festen Matrix, an die die Bestandteile der biologischen Flüssigkeit gebunden sind, Waschen der Matrix und anschließende Elution der Antiköφer zur Gewinnung einer ausgewogenen Antiköφerzusammensetzung.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, das weiterhin umfaßt: i) Bindung eines Teils der in Schritt b) erhaltenen ersten Antiköφerzusammensetzung an eine feste Matrix zur Gewinnung von Matrix A und eines Teils der in Schritt b) erhaltenen zweiten Antiköφerzusammensetzung an eine feste Matrix zur Gewinnung von Matrix B, ii) Inkubation von Material des nativen Teils aus Schritt a) mit Matrix A und von Material des modifizierten Teils aus Schritt a) mit Matrix B und anschließende
Gewinnung der jeweils nichtgebundenen Restimmunogene, iii) Immunisierung eines geeigneten Tieres mit Material der in Schritt ii) gewonnenen Restimmunogene des nativen Teils und eines weiteren geeigneten Tieres mit Material der in Schritt ii) gewonnenen Restimmunogene des modifizierten Teils und Gewinnung weiterer Antiköφerzusammensetzungen aus diesen Tieren, iv) gegebenenfalls mindestens einmalige Wiederholung der Schritte i) bis iii), wobei bei jeder Wiederholung in Schritt i) statt der in Schritt b) erhaltenen ersten und zweiten Antiköφerzusammensetzung die im jeweils vorhergehenden Schritt iii) gewonnenen Antiköφerzusammensetzungen verwendet werden, und wobei bei jeder Wiederholung in Schritt ii) statt des Materials des nativen und des modifizierten Teils aus Schritt a) Material der im jeweils vorhergehenden Schritt ii) gewonnenen Restimmunogene des nativen bzw. des modifizierten Teils verwendet wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem die in Schritt c) verwendete Matrix dadurch erhalten wird, daß die biologische Flüssigkeit zunächst mit einem festen Trägermaterial inkubiert wird, das eine mit den Bestandteilen der biologischen Flüssig- keit reaktive chemische Gruppe trägt, die Flüssigkeit anschließend mit wenigstens einem zweiten festen Trägermaterial inkubiert wird, das eine andere mit den Bestandteilen der biologischen Flüssigkeit reaktive chemische Gruppe trägt, und die erhaltenen Trägermaterialien anschließend vereinigt werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem vor dem Aufteilen gemäß Schritt a) aus der biologischen Flüssigkeit die Lipide entfernt werden.
5. Verfahren gemäß Anspruch 3 oder 4, bei dem das erste feste Trägermaterial CNBr- aktivierte Sepharose und das zweite feste Trägermaterial Epoxy-aktivierte Sepharose ist.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die biologische Flüssigkeit von Zellen oder Mikroorganismen stammt.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem die biologische Flüssigkeit von solubilisierten BHK- oder CHO-Zellen stammt.
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die biologische Flüssigkeit eine Köφerflüssigkeit ist.
9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem die Deglykosylierung gemäß Schritt a) mittels PNGase F und oder Endo F in Gegenwart von Detergentien erfolgt.
10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem die Gewinnung der Antikörperzusammensetzungen gemäß Schritt b) oder iii) durch Isolierung der IgG-Fraktion mittels Protein-G- oder Protein- A-Affinitätschromatographie erfolgt.
11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 10, bei dem das in Schritt i) verwendete feste Trägermaterial CNBr-aktivierte Sepharose ist.
12. Antiköφerzusammensetzung, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11.
13. Antiköφerzusammensetzung gemäß Anspruch 12, die an ein festes Trägermaterial gebunden ist.
14. Antiköφerzusammensetzung gemäß Anspruch 13, bei der das feste Trägermaterial eine Membran ist.
15. Antiköφerzusammensetzung gemäß Anspruch 13, bei der das feste Trägermaterial eine Matrix ist, die sich für die Immunaffinitätschromatographie eignet.
16. Verfahren zur Aufreinigung eines oder mehrerer in einer biologischen Flüssigkeit enthaltenen Bestandteile, das folgende Schritte umfaßt:
1) Herstellung einer ausgewogenen Antiköφerzusammensetzung gegen die Bestandteile der biologischen Flüssigkeit mit Ausnahme des/der aufzureinigenden Bestandteils/Bestandteile, 2) Kopplung der Antiköφerzusammensetzung an ein festes Trägermaterial und
3) Bindung der Bestandteile der biologischen Flüssigkeit mit Ausnahme des/der aufzureinigenden BestandteilsBestandteile durch Inkubation der biologischen Flüssigkeit mit dem in Schritt 2) erhaltenen Trägermaterial.
17. Verfahren gemäß Anspruch 16, weiterhin umfassend Chromatographieschritte, die auf hydrophober Interaktion, ionischer Wechselwirkung oder Wasserstoffbrückenbindung basieren und unter Bedingungen durchgeführt werden, unter denen der bzw. die in der biologischen Flüssigkeit enthaltene, aufzureinigende Bestandteil bzw. die enthaltenen, aufzureinigenden Bestandteile nicht gebunden werden.
18. Verfahren gemäß Anspruch 16 oder 17, bei dem nach Schritt 3) eine Nachweisreakti- on erfolgt, die für das aufzureinigende Protein bzw. die aufzureinigenden Proteine spezifisch ist.
19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei die Expression des/der in der biologischen Flüssigkeit enthaltenen aufzureinigenden Bestandteils/Bestandteile durch chemische, physikalische oder biologische Einflüsse induziert wurde.
20. Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei die Expression des/der in der biologischen Flüssigkeit enthaltenen aufzureinigenden Bestandteils/Bestandteile durch ein Bakteri- um, Pilz, Virus oder Prion induziert wurde.
21. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 20, bei dem nach Schritt 3) eine Konzentrierung des aufzureinigenden Bestandteils bzw. der aufzureinigenden Bestandteile stattfindet.
22. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 21, bei dem das in Schritt 2) verwendete Trägermaterial CNBr-aktivierter Sepharose ist.
23. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 22, bei dem jeder Schritt in einem getrennten Kompartiment ausgeführt wird und die Kompartimente miteinander verbun- den sind.
24. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 23, bei dem es sich bei dem/den aufzureinigenden Bestandteilen um ein Polypeptid oder ein (Glyko-) Protein handelt.
25. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 24, bei dem ein hoher Probendurchsatz erreicht wird.
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