JPH1057054A - 自在なドナー細胞 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 補体を介する攻撃を阻害するタンパク質を発
現する、ヒトまたは動物への移植用の遺伝学的に操作さ
れた哺乳動物およびこの哺乳動物から単離された細胞を
提供する。 【解決手段】 ヒトまたは動物への移植用の遺伝学的に
操作された哺乳動物細胞であって、細胞あたり103より
多いかまたは等しいCD59分子、あるいは、原形質膜表面
の１μm2あたり１分子より多いかまたは等しいCD59抗原
を、その表面上に有する、哺乳動物細胞。
現する、ヒトまたは動物への移植用の遺伝学的に操作さ
れた哺乳動物およびこの哺乳動物から単離された細胞を
提供する。 【解決手段】 ヒトまたは動物への移植用の遺伝学的に
操作された哺乳動物細胞であって、細胞あたり103より
多いかまたは等しいCD59分子、あるいは、原形質膜表面
の１μm2あたり１分子より多いかまたは等しいCD59抗原
を、その表面上に有する、哺乳動物細胞。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝学的に操作さ
れた内皮細胞、特に、非自己の宿主中へ導入されたとき
に、補体による溶解を阻害し、異質の細胞を排除する宿
主の免疫機構を回避するように改変された内皮細胞およ
びそのような細胞を含有する哺乳動物に関する。
れた内皮細胞、特に、非自己の宿主中へ導入されたとき
に、補体による溶解を阻害し、異質の細胞を排除する宿
主の免疫機構を回避するように改変された内皮細胞およ
びそのような細胞を含有する哺乳動物に関する。
【０００２】
【従来の技術】内皮細胞は、心臓および血管の内層を形
成する特殊化した細胞である。それらは循環する血液と
直接接触するため、上記細胞を遺伝学的に操作し、そし
てそれらを「インビボ」のドラッグデリバリーシステム
として使用するための、多数の提案が、例えばCullito
n, B. J. 1989「ドラッグデリバリーのために設計する
細胞」Science 246:746-751;およびZwiebelら、「レト
ロウイルスベクターによりウサギの内皮細胞中に導入さ
れた組み換え遺伝子の高発現」Science 243:220-222(ヒ
トアデノシンデアミナーゼ遺伝子およびラット成長ホル
モン遺伝子のレトロウイルスのベクターを使用する大動
脈内皮細胞への転移、および合成血管移植片上への接種
後のこのような細胞からのラット成長ホルモンの分泌の
証明)によりなされている。
成する特殊化した細胞である。それらは循環する血液と
直接接触するため、上記細胞を遺伝学的に操作し、そし
てそれらを「インビボ」のドラッグデリバリーシステム
として使用するための、多数の提案が、例えばCullito
n, B. J. 1989「ドラッグデリバリーのために設計する
細胞」Science 246:746-751;およびZwiebelら、「レト
ロウイルスベクターによりウサギの内皮細胞中に導入さ
れた組み換え遺伝子の高発現」Science 243:220-222(ヒ
トアデノシンデアミナーゼ遺伝子およびラット成長ホル
モン遺伝子のレトロウイルスのベクターを使用する大動
脈内皮細胞への転移、および合成血管移植片上への接種
後のこのような細胞からのラット成長ホルモンの分泌の
証明)によりなされている。
【０００３】天然の内皮細胞は、正常な生理に重要な役
割を演ずる。特に、これらの細胞は血液と血管壁との間
のインターフェイスおよび体の器官を構成する。このよ
うに、内皮細胞は種々の天然の産生物を直接に血流中に
分泌し、血管内層の抗血栓性の表面を維持し、白血球が
血管壁を透過するのを制限し、平滑筋細胞の種々の生物
学的特性を調節し、そして血管壁の緊張をコントロール
することに関与する。それゆえ、内皮細胞の欠損はこれ
らの正常な生理的過程の欠損を引き起こし、そして結
局、冠動脈疾患、臓器移植拒絶および血管炎のような病
理学的状態に至る。
割を演ずる。特に、これらの細胞は血液と血管壁との間
のインターフェイスおよび体の器官を構成する。このよ
うに、内皮細胞は種々の天然の産生物を直接に血流中に
分泌し、血管内層の抗血栓性の表面を維持し、白血球が
血管壁を透過するのを制限し、平滑筋細胞の種々の生物
学的特性を調節し、そして血管壁の緊張をコントロール
することに関与する。それゆえ、内皮細胞の欠損はこれ
らの正常な生理的過程の欠損を引き起こし、そして結
局、冠動脈疾患、臓器移植拒絶および血管炎のような病
理学的状態に至る。
【０００４】したがって、治療上のインビボでの実施の
ための媒体としてのそれらの使用に加えて、疾病または
手術のために失われた天然の内皮細胞に置換する遺伝学
的に操作された内皮細胞を供給する必要がある。
ための媒体としてのそれらの使用に加えて、疾病または
手術のために失われた天然の内皮細胞に置換する遺伝学
的に操作された内皮細胞を供給する必要がある。
【０００５】過去において、治療の実施または細胞置換
のための内皮細胞の使用の提案および／または試みは、
一般に、自己の細胞すなわち処置中の生物由来の細胞に
限られてきた。被検体は免疫抑制されなければならず、
それは費用が高く、被検体を感染しやすい状態に放置す
ることになる。
のための内皮細胞の使用の提案および／または試みは、
一般に、自己の細胞すなわち処置中の生物由来の細胞に
限られてきた。被検体は免疫抑制されなければならず、
それは費用が高く、被検体を感染しやすい状態に放置す
ることになる。
【０００６】このアプローチは多数の問題を被った。例
えば、処置される個体から十分な量の健常な内皮細胞を
採取することは難しい。実行するための手順としては、
血管系のセグメントを取り出し、そして血管の壁から内
皮細胞を掻き取るまたはさもなければ取り外すことを、
必要とする。結果的に、治療の実施または細胞の置換の
ために有用であるためには、多数の自己由来の内皮細胞
が培地中で増殖されなければならない。実際の使用、特
に細胞の置換の場合には、この培養は迅速に行わなけれ
ばならない。残念ながら、内皮細胞の細胞倍加時間は少
なくとも24〜48時間のオーダーであり、遺伝子操作また
は細胞の置換が可能となるに十分な量の内皮細胞が得ら
れるまでに、一週間あるいはそれより多いオーダーの時
間がかかる。加えて、正常な生理的条件下では、インビ
ボでの天然の内皮細胞の細胞倍加時間はさらに延長さ
れ、内皮細胞の欠損または損傷に引き続き、インビボで
天然に存在する細胞の置換の効率が極めて悪くなる。
えば、処置される個体から十分な量の健常な内皮細胞を
採取することは難しい。実行するための手順としては、
血管系のセグメントを取り出し、そして血管の壁から内
皮細胞を掻き取るまたはさもなければ取り外すことを、
必要とする。結果的に、治療の実施または細胞の置換の
ために有用であるためには、多数の自己由来の内皮細胞
が培地中で増殖されなければならない。実際の使用、特
に細胞の置換の場合には、この培養は迅速に行わなけれ
ばならない。残念ながら、内皮細胞の細胞倍加時間は少
なくとも24〜48時間のオーダーであり、遺伝子操作また
は細胞の置換が可能となるに十分な量の内皮細胞が得ら
れるまでに、一週間あるいはそれより多いオーダーの時
間がかかる。加えて、正常な生理的条件下では、インビ
ボでの天然の内皮細胞の細胞倍加時間はさらに延長さ
れ、内皮細胞の欠損または損傷に引き続き、インビボで
天然に存在する細胞の置換の効率が極めて悪くなる。
【０００７】異質の細胞を宿主中に移植すると、その細
胞を破壊し、そしてそれにより宿主を防御するために、
宿主の免疫システムが急速に稼働する。異質の細胞に対
する免疫システムの攻撃は、移植拒絶と呼ばれる。生物
の防御の第１線は、宿主の補体システムの活性化の結果
起こるドナー内皮細胞の溶解性破壊、または、前凝血お
よび前血栓特性の活性化であり、一般的に「超急性拒絶
反応」または単に「超急性反応」として知られている。
胞を破壊し、そしてそれにより宿主を防御するために、
宿主の免疫システムが急速に稼働する。異質の細胞に対
する免疫システムの攻撃は、移植拒絶と呼ばれる。生物
の防御の第１線は、宿主の補体システムの活性化の結果
起こるドナー内皮細胞の溶解性破壊、または、前凝血お
よび前血栓特性の活性化であり、一般的に「超急性拒絶
反応」または単に「超急性反応」として知られている。
【０００８】異種の(異なる種由来の)およびアロタイプ
の(同種の異個体由来の)器官の移植に対する超急性反応
は、例えばPlattら、1990「一致しない異種移植片の移
植：進行状況のレビュー」Immunology Today 11:450-45
6に議論されているように、ドナー内皮の表面での補体
システムの抗体依存性の活性化を介することを、いくつ
かの研究は示している。すなわち、上記補体システム
は、移植された器官の血管の内側の内皮細胞を攻撃す
る。
の(同種の異個体由来の)器官の移植に対する超急性反応
は、例えばPlattら、1990「一致しない異種移植片の移
植：進行状況のレビュー」Immunology Today 11:450-45
6に議論されているように、ドナー内皮の表面での補体
システムの抗体依存性の活性化を介することを、いくつ
かの研究は示している。すなわち、上記補体システム
は、移植された器官の血管の内側の内皮細胞を攻撃す
る。
【０００９】上記補体システムは、宿主生物の他の免疫
システムと同時に、多段階の多タンパク質のカスケード
連鎖(cascade sequence)に作用する血漿タンパク質と膜
補助因子との複雑な相互作用である。古典的補体活性化
経路は、第１に抗体の標的細胞上の抗原部位に対する認
識と結合とを包含する。この表面に結合した抗体は、引
き続き最初の補体成分であるC1qと反応し、Ca2+、C1r、
およびC1sとタンパク分解活性のC1-抗体複合体を形成す
る。C1sは、C2とC4を活性成分C2aとC4aに分裂させる。C
4b,2a複合体はC3変換酵素と呼ばれる活性プロテアーゼ
で、C3に作用しC3aとC3bに分裂させる。C3bは、C4b,2a
と複合体を形成し、C5をC5aとC5bに分裂させるC4b,2a,3
bを生成する。C5bはC6と複合体を形成し、そしてこの複
合体は液相中でC7と相互作用し、それによって細胞膜中
のC5b,6,7の３成分複合体を安定化させるC5bおよびC6中
の疎水性のドメインが露出する。そこで、液相中のC8は
C5b,6,7の３成分複合体に結合し、この複合体は機能膜
の損傷の進展に寄与し、細胞溶解を遅延し得る。C9がC5
b-8膜複合体中のC8に結合すると、異質の細胞の溶解が
急激に加速する。
システムと同時に、多段階の多タンパク質のカスケード
連鎖(cascade sequence)に作用する血漿タンパク質と膜
補助因子との複雑な相互作用である。古典的補体活性化
経路は、第１に抗体の標的細胞上の抗原部位に対する認
識と結合とを包含する。この表面に結合した抗体は、引
き続き最初の補体成分であるC1qと反応し、Ca2+、C1r、
およびC1sとタンパク分解活性のC1-抗体複合体を形成す
る。C1sは、C2とC4を活性成分C2aとC4aに分裂させる。C
4b,2a複合体はC3変換酵素と呼ばれる活性プロテアーゼ
で、C3に作用しC3aとC3bに分裂させる。C3bは、C4b,2a
と複合体を形成し、C5をC5aとC5bに分裂させるC4b,2a,3
bを生成する。C5bはC6と複合体を形成し、そしてこの複
合体は液相中でC7と相互作用し、それによって細胞膜中
のC5b,6,7の３成分複合体を安定化させるC5bおよびC6中
の疎水性のドメインが露出する。そこで、液相中のC8は
C5b,6,7の３成分複合体に結合し、この複合体は機能膜
の損傷の進展に寄与し、細胞溶解を遅延し得る。C9がC5
b-8膜複合体中のC8に結合すると、異質の細胞の溶解が
急激に加速する。
【００１０】1989年6月12日に出願され、許可され、Okl
ahoma Medical Research Foundationに譲渡された係属
中の米国特許出願第07/365,199号公報は、その細胞と共
に溶液中に供給される時または遺伝学的に操作された細
胞中で発現する時に、例えばブタの内皮細胞のようなヒ
ト以外の内皮細胞をヒト補体による攻撃から防御するた
めに、ヒトの補体調節タンパク質CD59が使用され得るこ
とを開示する。Zhaoら、1991「ヒト補体の複合体を攻撃
する膜に対する防御を与えるCD59-導入チャイニーズハ
ムスター細胞の増幅された遺伝子発現」 J. Biol. Che
m. 266:13418-13422もまた参照せよ。CD59の相同補体の
阻害活性は、RollinsおよびSims, 1990「C5b-9膜へのC9
の結合を阻止する能力に帰するCD59の補体阻害活性」
J. Immunol. 144:3478-3483にさらに報告されているよ
うに、最終の補体成分のC8およびC9との種特異的な相互
作用に帰する。
ahoma Medical Research Foundationに譲渡された係属
中の米国特許出願第07/365,199号公報は、その細胞と共
に溶液中に供給される時または遺伝学的に操作された細
胞中で発現する時に、例えばブタの内皮細胞のようなヒ
ト以外の内皮細胞をヒト補体による攻撃から防御するた
めに、ヒトの補体調節タンパク質CD59が使用され得るこ
とを開示する。Zhaoら、1991「ヒト補体の複合体を攻撃
する膜に対する防御を与えるCD59-導入チャイニーズハ
ムスター細胞の増幅された遺伝子発現」 J. Biol. Che
m. 266:13418-13422もまた参照せよ。CD59の相同補体の
阻害活性は、RollinsおよびSims, 1990「C5b-9膜へのC9
の結合を阻止する能力に帰するCD59の補体阻害活性」
J. Immunol. 144:3478-3483にさらに報告されているよ
うに、最終の補体成分のC8およびC9との種特異的な相互
作用に帰する。
【００１１】CD59の使用は、補体の攻撃の結果である超
急性拒絶の問題をうまく取り扱っているが、それは異質
の内皮細胞に対する宿主生物の免疫攻撃全般に対してそ
の細胞を防御しない。
急性拒絶の問題をうまく取り扱っているが、それは異質
の内皮細胞に対する宿主生物の免疫攻撃全般に対してそ
の細胞を防御しない。
【００１２】免疫応答を刺激することで、抗原は多くの
分子および細胞の変化を誘引する。白血球は抗原が異質
であると認識し、存在する抗原に対して細胞および体液
の両方の反応を開始する原因となる。Ｂリンパ球細胞は
存在する抗原に対して抗体を産生することにより抗原と
反応し、Ｔリンパ球細胞は存在する抗原に対して細胞応
答を開始することにより反応する。Ｔ細胞の２つの主要
なサブセットは、Ｂ細胞に提供するために抗原を処理す
ることに関与し、CD4と呼ばれる細胞表面の糖タンパク
質の存在により特徴づけられるTH細胞、および、細胞表
面上の抗原の認識および異質と認められた細胞の溶解に
関与し、CD8と呼ばれる細胞表面の糖タンパク質の存在
により特徴づけられる細胞溶解性Ｔリンパ球(cytolytic
T lymphocytes)(CTLs)である。Ｔ細胞は主要組織適合
遺伝子複合体(MHC)の細胞表面の糖タンパク質の２つの
主要なクラスのうちの１つ(クラスＩ(MHC-Ｉ)またはク
ラスII(MHC-II)タンパク質のいずれか)と結合するペプ
チドフラグメントを認識する：CD8+Ｔ細胞はMHC-Ｉと共
に抗原を認識する一方、CD4+Ｔ細胞はMHC-IIと共に抗原
を認識する。
分子および細胞の変化を誘引する。白血球は抗原が異質
であると認識し、存在する抗原に対して細胞および体液
の両方の反応を開始する原因となる。Ｂリンパ球細胞は
存在する抗原に対して抗体を産生することにより抗原と
反応し、Ｔリンパ球細胞は存在する抗原に対して細胞応
答を開始することにより反応する。Ｔ細胞の２つの主要
なサブセットは、Ｂ細胞に提供するために抗原を処理す
ることに関与し、CD4と呼ばれる細胞表面の糖タンパク
質の存在により特徴づけられるTH細胞、および、細胞表
面上の抗原の認識および異質と認められた細胞の溶解に
関与し、CD8と呼ばれる細胞表面の糖タンパク質の存在
により特徴づけられる細胞溶解性Ｔリンパ球(cytolytic
T lymphocytes)(CTLs)である。Ｔ細胞は主要組織適合
遺伝子複合体(MHC)の細胞表面の糖タンパク質の２つの
主要なクラスのうちの１つ(クラスＩ(MHC-Ｉ)またはク
ラスII(MHC-II)タンパク質のいずれか)と結合するペプ
チドフラグメントを認識する：CD8+Ｔ細胞はMHC-Ｉと共
に抗原を認識する一方、CD4+Ｔ細胞はMHC-IIと共に抗原
を認識する。
【００１３】MHCは、３つの主要な遺伝子のクラスを包
含する。クラスＩ遺伝子群は、ヒトではヒト白血球抗原
と呼ばれるMHC-Ｉ糖タンパク質の主サブユニットをコー
ドし、主要なものはHLA-A、B、およびCである。これら
は、実質上すべての細胞に存在し、同種移植片を拒絶す
る主要な役割を演じる。それらは、ウイルスに感染され
た細胞上にウイルス性の抗原のペプチドフラグメントと
の複合体を形成する：CD8+CTLsによりその複合体が認識
されると、結果的にウイルスに感染された細胞は破壊さ
れる。複合体の認識は、MHCと共に抗原を認識するＴ細
胞上の単一のレセプターによる。
含する。クラスＩ遺伝子群は、ヒトではヒト白血球抗原
と呼ばれるMHC-Ｉ糖タンパク質の主サブユニットをコー
ドし、主要なものはHLA-A、B、およびCである。これら
は、実質上すべての細胞に存在し、同種移植片を拒絶す
る主要な役割を演じる。それらは、ウイルスに感染され
た細胞上にウイルス性の抗原のペプチドフラグメントと
の複合体を形成する：CD8+CTLsによりその複合体が認識
されると、結果的にウイルスに感染された細胞は破壊さ
れる。複合体の認識は、MHCと共に抗原を認識するＴ細
胞上の単一のレセプターによる。
【００１４】クラスII遺伝子群は、DP、DQ(サブクラス
β2、α2、およびβ1α1)およびDR(サブクラスβ1、β
2、β3、およびα1)として知られるヒトにおける主要な
クラスであるが、抗原提示細胞、主にＢ細胞、マクロフ
ァージおよび樹枝状細胞により発現される細胞表面の糖
タンパク質をコード化する。抗原のペプチドフラグメン
トと共に、クラスIIのタンパク質はヘルパーＴ細胞によ
り認識されるエピトープ(CD4+)を形成する。クラスII遺
伝子群は、細胞を破壊する広範な免疫反応に関与する補
体カスケード(complement cascade)の少なくとも３つの
タンパク質、ならびに組織壊死因子およびリンホトキシ
ンの２つの細胞障害性タンパク質をコードする。
β2、α2、およびβ1α1)およびDR(サブクラスβ1、β
2、β3、およびα1)として知られるヒトにおける主要な
クラスであるが、抗原提示細胞、主にＢ細胞、マクロフ
ァージおよび樹枝状細胞により発現される細胞表面の糖
タンパク質をコード化する。抗原のペプチドフラグメン
トと共に、クラスIIのタンパク質はヘルパーＴ細胞によ
り認識されるエピトープ(CD4+)を形成する。クラスII遺
伝子群は、細胞を破壊する広範な免疫反応に関与する補
体カスケード(complement cascade)の少なくとも３つの
タンパク質、ならびに組織壊死因子およびリンホトキシ
ンの２つの細胞障害性タンパク質をコードする。
【００１５】Ｔ細胞を介する免疫反応は３つの連続的な
活性化ステップで組織され得る。第１に、CD4+およびCD
8+Ｔリンパ球(Ｔ細胞)は、非自己のMHCクラスIIおよび
クラスＩのタンパク質の存在を、異質の細胞表面上でそ
れぞれ認識する。
活性化ステップで組織され得る。第１に、CD4+およびCD
8+Ｔリンパ球(Ｔ細胞)は、非自己のMHCクラスIIおよび
クラスＩのタンパク質の存在を、異質の細胞表面上でそ
れぞれ認識する。
【００１６】第２に、Ｔ細胞は、リガンドがＴ細胞レセ
プターおよび他の補助的な刺激性分子と相互作用をする
ことにより活性化され、そのため活性化は、細胞表面の
タンパク質レセプターにより受容されるサイトカインの
ような液性シグナルを包含する種々の可変物に依存す
る。最も大切なことは、抗原提示細胞(APC)上での、リ
ガンド、MHCの複合体および抗原性ペプチドと抗原特異
的Ｔ細胞レセプターとの相互作用である。Ｔ細胞上に存
在する他のレセプターもまた、活性化を確実にするた
め、APC上のそれらのリガンドにより接触されなければ
ならない。一旦活性化されると、Ｔ細胞はインターロイ
キン２(IL-2)および他のサイトカイン類を合成し分泌す
る。
プターおよび他の補助的な刺激性分子と相互作用をする
ことにより活性化され、そのため活性化は、細胞表面の
タンパク質レセプターにより受容されるサイトカインの
ような液性シグナルを包含する種々の可変物に依存す
る。最も大切なことは、抗原提示細胞(APC)上での、リ
ガンド、MHCの複合体および抗原性ペプチドと抗原特異
的Ｔ細胞レセプターとの相互作用である。Ｔ細胞上に存
在する他のレセプターもまた、活性化を確実にするた
め、APC上のそれらのリガンドにより接触されなければ
ならない。一旦活性化されると、Ｔ細胞はインターロイ
キン２(IL-2)および他のサイトカイン類を合成し分泌す
る。
【００１７】例えばPoberら、1990 「免疫反応での血管
内皮細胞の潜在的な役割」Human Immun ol. 28:258-262
にリビューされるように、活性化されたＴ細胞により分
泌されたサイトカイン類は、共に細胞溶解を引き起こす
リンパ球、単球、および他の白血球の補給および活性化
に関与する免疫応答がされるの第３段階の、すなわちエ
フェクターを導く。
内皮細胞の潜在的な役割」Human Immun ol. 28:258-262
にリビューされるように、活性化されたＴ細胞により分
泌されたサイトカイン類は、共に細胞溶解を引き起こす
リンパ球、単球、および他の白血球の補給および活性化
に関与する免疫応答がされるの第３段階の、すなわちエ
フェクターを導く。
【００１８】歴史的に、Ｔ細胞の免疫応答を阻害する試
みは、一般的に限定的な成功しか納めていない。例え
ば、Ｔ細胞と異質の細胞が付着するのを阻害するため
に、抗体および遮断タンパク質を含有する種々のタイプ
の試薬を使用するいくつかの戦略が試みられた。Lider
ら、1988 「実験的自己免疫脳脊髄炎に対するＴ細胞ワ
クチン接種により引き起こされる抗イディオタイプ性ネ
ットワーク」Scie nce 239:181は、Ｔ細胞ワクチンの使
用について報告し；Owhashiandら、1988「ミエリン基礎
タンパク質(myelin basic protein)に特異的なラットＴ
細胞レセプターに割り当てられたイディオタイプに対す
るモノクローナル抗体により与えられるアレルギー性脳
脊髄炎からの防御」J. Exp. Med . 168:2153は、Ｔ細胞
レセプター遮断抗体の使用について報告し；Brostoffan
dら、1984「実験的アレルギー性脳脊髄炎：インビボで
ヘルパーＴ細胞を認識するモノクローナル抗体を用いる
効果的処置」J. Immunol. 133:1938は、CD4に対する抗
体の使用について報告し；そしてAdoriniら、1988「Ｔ
細胞ハイブリドーマの生物学的な応答からの加水分解お
よびCa2+フラックス(Ca2+ fluxes)の解離」Nature 334:
623-628は、Ｔ細胞レセプターを占有する遮断ペプチド
の使用について報告した。これらの戦略は、一般的に、
所望するＴ細胞結合の阻害よりも、試薬に対する免疫応
答を引き起こした。
みは、一般的に限定的な成功しか納めていない。例え
ば、Ｔ細胞と異質の細胞が付着するのを阻害するため
に、抗体および遮断タンパク質を含有する種々のタイプ
の試薬を使用するいくつかの戦略が試みられた。Lider
ら、1988 「実験的自己免疫脳脊髄炎に対するＴ細胞ワ
クチン接種により引き起こされる抗イディオタイプ性ネ
ットワーク」Scie nce 239:181は、Ｔ細胞ワクチンの使
用について報告し；Owhashiandら、1988「ミエリン基礎
タンパク質(myelin basic protein)に特異的なラットＴ
細胞レセプターに割り当てられたイディオタイプに対す
るモノクローナル抗体により与えられるアレルギー性脳
脊髄炎からの防御」J. Exp. Med . 168:2153は、Ｔ細胞
レセプター遮断抗体の使用について報告し；Brostoffan
dら、1984「実験的アレルギー性脳脊髄炎：インビボで
ヘルパーＴ細胞を認識するモノクローナル抗体を用いる
効果的処置」J. Immunol. 133:1938は、CD4に対する抗
体の使用について報告し；そしてAdoriniら、1988「Ｔ
細胞ハイブリドーマの生物学的な応答からの加水分解お
よびCa2+フラックス(Ca2+ fluxes)の解離」Nature 334:
623-628は、Ｔ細胞レセプターを占有する遮断ペプチド
の使用について報告した。これらの戦略は、一般的に、
所望するＴ細胞結合の阻害よりも、試薬に対する免疫応
答を引き起こした。
【００１９】移植細胞に対するＴ細胞を介する反応、確
率を、補体を介する攻撃および細胞の溶解と同様に減少
し得るならば、明らかに有効である。
率を、補体を介する攻撃および細胞の溶解と同様に減少
し得るならば、明らかに有効である。
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】それゆえ、異質の宿主
中に移植された場合、補体および細胞の攻撃の両方に対
して抵抗性の内皮細胞を構築するための改良された方法
および組成物を提供することが、本発明の目的である。
中に移植された場合、補体および細胞の攻撃の両方に対
して抵抗性の内皮細胞を構築するための改良された方法
および組成物を提供することが、本発明の目的である。
【００２１】本発明のさらなる目的は、異質の宿主細胞
中に移植された場合異質であるとして認識されず、その
ため免疫システムによる攻撃を回避する遺伝学的に操作
された細胞を提供することである。
中に移植された場合異質であるとして認識されず、その
ため免疫システムによる攻撃を回避する遺伝学的に操作
された細胞を提供することである。
【００２２】本発明のなおさらなる目的は、移植後に補
体を介する攻撃に抵抗し、そしてリンパ球、特にCD4+Ｔ
リンパ球、そして好適にはCD8+Ｔリンパ球を介する溶解
を回避し得る遺伝学的に操作された細胞を提供すること
である。
体を介する攻撃に抵抗し、そしてリンパ球、特にCD4+Ｔ
リンパ球、そして好適にはCD8+Ｔリンパ球を介する溶解
を回避し得る遺伝学的に操作された細胞を提供すること
である。
【００２３】本発明のもう１つの目的は、このような遺
伝学的操作で作られた細胞を宿主中での存在がもはや望
ましくなくなった場合に、選択的に死滅させるためのメ
カニズムを提供することである。
伝学的操作で作られた細胞を宿主中での存在がもはや望
ましくなくなった場合に、選択的に死滅させるためのメ
カニズムを提供することである。
【００２４】本発明のさらにもう１つの目的は、治療用
産生物の送達のための生物学的な媒体を提供することで
ある。
産生物の送達のための生物学的な媒体を提供することで
ある。
【００２５】
【課題を解決するための手段】本発明は、ヒトまたは動
物への移植用の遺伝学的に操作された哺乳動物に関す
る。ここで、上記哺乳動物は、細胞あたり103より多い
かまたは等しいCD59分子、あるいは、原形質膜表面の１
μm2あたり１分子より多いかまたは等しいCD59抗原をそ
の表面上に有する細胞を含有する。
物への移植用の遺伝学的に操作された哺乳動物に関す
る。ここで、上記哺乳動物は、細胞あたり103より多い
かまたは等しいCD59分子、あるいは、原形質膜表面の１
μm2あたり１分子より多いかまたは等しいCD59抗原をそ
の表面上に有する細胞を含有する。
【００２６】
【発明の実施の形態】細胞で発現する、そして通常は細
胞中で発現しない補体阻害活性を有するタンパク質をコ
ードするDNA配列を含有する遺伝学的に操作された細胞
が提供される。これらの細胞は、細胞表面上でヒト細胞
中の、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスII遺伝子
群、HLA DP、DQおよびDR遺伝子群、または異なる種の細
胞中のこれらに匹敵するものによりコードされる機能タ
ンパク質を発現しないようにも操作され得る。一方、遺
伝学的に操作された細胞は、細胞表面上で、ヒト細胞中
の、MHCクラスＩ遺伝子群、HLA A、BおよびC遺伝子群、
または異なる種の細胞中のそれらに匹敵するものにより
コードされるタンパク質を発現しないか、あるいはクラ
スＩおよびクラスIIのMHC遺伝子群のどちらをも発現し
ない。いくつかの実施例では、細胞で発現し、そして選
択された試薬の存在下で細胞死を引き起こすタンパク質
をコードする遺伝子(DNA)配列を、上記細胞は含有す
る。
胞中で発現しない補体阻害活性を有するタンパク質をコ
ードするDNA配列を含有する遺伝学的に操作された細胞
が提供される。これらの細胞は、細胞表面上でヒト細胞
中の、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスII遺伝子
群、HLA DP、DQおよびDR遺伝子群、または異なる種の細
胞中のこれらに匹敵するものによりコードされる機能タ
ンパク質を発現しないようにも操作され得る。一方、遺
伝学的に操作された細胞は、細胞表面上で、ヒト細胞中
の、MHCクラスＩ遺伝子群、HLA A、BおよびC遺伝子群、
または異なる種の細胞中のそれらに匹敵するものにより
コードされるタンパク質を発現しないか、あるいはクラ
スＩおよびクラスIIのMHC遺伝子群のどちらをも発現し
ない。いくつかの実施例では、細胞で発現し、そして選
択された試薬の存在下で細胞死を引き起こすタンパク質
をコードする遺伝子(DNA)配列を、上記細胞は含有す
る。
【００２７】補体調節活性を有するタンパク質をコード
する遺伝子配列は、補体システムの活性化の結果起こる
攻撃と溶解による、超急性拒絶から、上記細胞を防御す
る。MHCクラスＩ(例えば、HLA A、BおよびC)ならびにク
ラスII(例えば、HLA DP、DQ、およびDR)遺伝子群でコー
ドされる細胞表面タンパク質の除去は、上記細胞がそれ
ぞれ宿主のCD8+のおよびCD4+Ｔリンパ球による、実質的
な認識をしないようにする。細胞死を引き起こすタンパ
ク質をコードする遺伝子配列は、宿主から遺伝学的操作
で作られた細胞を、その存在がもはや望ましくない場合
に、排除するメカニズムを提供する。
する遺伝子配列は、補体システムの活性化の結果起こる
攻撃と溶解による、超急性拒絶から、上記細胞を防御す
る。MHCクラスＩ(例えば、HLA A、BおよびC)ならびにク
ラスII(例えば、HLA DP、DQ、およびDR)遺伝子群でコー
ドされる細胞表面タンパク質の除去は、上記細胞がそれ
ぞれ宿主のCD8+のおよびCD4+Ｔリンパ球による、実質的
な認識をしないようにする。細胞死を引き起こすタンパ
ク質をコードする遺伝子配列は、宿主から遺伝学的操作
で作られた細胞を、その存在がもはや望ましくない場合
に、排除するメカニズムを提供する。
【００２８】その細胞は、標準的なインビトロのトラン
スフェクション技術を使用して培地中で改変されるか、
あるいは胚として改変されたトランスジェニック動物か
ら得られ得る。これらの改変された細胞は、宿主に治療
剤を投与するための自在な(universal)ドナー細胞とし
て、あるいは、損傷しまたは欠損した天然の細胞の代わ
りとして働き得る。最も好適な実施態様では、上記細胞
は離された内皮細胞である。
スフェクション技術を使用して培地中で改変されるか、
あるいは胚として改変されたトランスジェニック動物か
ら得られ得る。これらの改変された細胞は、宿主に治療
剤を投与するための自在な(universal)ドナー細胞とし
て、あるいは、損傷しまたは欠損した天然の細胞の代わ
りとして働き得る。最も好適な実施態様では、上記細胞
は離された内皮細胞である。
【００２９】Ｉ．超急性拒絶反応からの防御 補体による細胞の溶解には、例えば、PCT出願WO91/0585
5に記載のように、C3ステージでの補体の活性化を妨害
することが不可欠であり得るという先の報告とは異な
り、最終の補体成分のみが典型的に要求されることが確
定された。
5に記載のように、C3ステージでの補体の活性化を妨害
することが不可欠であり得るという先の報告とは異な
り、最終の補体成分のみが典型的に要求されることが確
定された。
【００３０】C5bへのC6、7、8、および9の連続的な添加
により、ターゲット細胞の原形質膜中に挿入されたとき
に、カルシウムおよび他のイオンの膜透過性を高める細
孔様の複合体である膜攻撃性複合体(MAC)の形成が引き
起こされる。その結果、原形質膜の溶解が続いて起こ
り、細胞が破壊されるか、あるいは血管の血流遮断に影
響する特定の細胞機能の非溶解性の改変が生じる。ヒト
血清補体に曝されたヒト内皮細胞の場合、C5b-9複合体
の膜への付着により、次の例に記載のように、血餅およ
び血栓形成を促進すると考えられる、細胞での種々の前
凝血性および前血栓性の変化が始まる。Hattoriら、198
9「補体タンパク質C5b-9は、内皮細胞のフォンビルブラ
ント因子の高分子量マルチマーの分泌および顆粒膜タン
パク質GMP-140の細胞表面への転移を引き起こす」J. Bi
ol. Chem. 264:9053-9060; Hamiltonら、1990「ヒト内
皮細胞での最終補体タンパク質の調節コントロール：CD
59の抗体によるC5b-9インヒビターの中性化」Blood 76:
2572-2577;およびHamiltonおよびSims、1991「最終補体
タンパク質C5b-9は、高密度リポタンパク質およびその
アポタンパク質A-I、A-IIのヒト内皮細胞への結合を高
める」J. Clin. Invest. 88:1833-1840。これらの反応
はターゲット細胞の原形質膜中へのC9の挿入に依存して
いると考えられ、そのためその反応はC5b-9複合体の組
立てを妨げることで阻害し得る。
により、ターゲット細胞の原形質膜中に挿入されたとき
に、カルシウムおよび他のイオンの膜透過性を高める細
孔様の複合体である膜攻撃性複合体(MAC)の形成が引き
起こされる。その結果、原形質膜の溶解が続いて起こ
り、細胞が破壊されるか、あるいは血管の血流遮断に影
響する特定の細胞機能の非溶解性の改変が生じる。ヒト
血清補体に曝されたヒト内皮細胞の場合、C5b-9複合体
の膜への付着により、次の例に記載のように、血餅およ
び血栓形成を促進すると考えられる、細胞での種々の前
凝血性および前血栓性の変化が始まる。Hattoriら、198
9「補体タンパク質C5b-9は、内皮細胞のフォンビルブラ
ント因子の高分子量マルチマーの分泌および顆粒膜タン
パク質GMP-140の細胞表面への転移を引き起こす」J. Bi
ol. Chem. 264:9053-9060; Hamiltonら、1990「ヒト内
皮細胞での最終補体タンパク質の調節コントロール：CD
59の抗体によるC5b-9インヒビターの中性化」Blood 76:
2572-2577;およびHamiltonおよびSims、1991「最終補体
タンパク質C5b-9は、高密度リポタンパク質およびその
アポタンパク質A-I、A-IIのヒト内皮細胞への結合を高
める」J. Clin. Invest. 88:1833-1840。これらの反応
はターゲット細胞の原形質膜中へのC9の挿入に依存して
いると考えられ、そのためその反応はC5b-9複合体の組
立てを妨げることで阻害し得る。
【００３１】補体を阻害する膜タン パク質 補体カスケードに対して有効な阻害活性を示す特異的な
膜タンパク質が、単離され分子クローニングされた。
膜タンパク質が、単離され分子クローニングされた。
【００３２】特に、ヒト補体システムに関しては、C5b-
9複合体の細孔形成作用に対する防御は、ヒト補体調節
タンパク質CD59をコードするcDNAを用いるこのような細
胞のトランスフェクションにより、霊長類以外の細胞に
与えられ得る。
9複合体の細孔形成作用に対する防御は、ヒト補体調節
タンパク質CD59をコードするcDNAを用いるこのような細
胞のトランスフェクションにより、霊長類以外の細胞に
与えられ得る。
【００３３】チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞でC
D59が安定的に発現する能力により、通常はCD59もHRFも
どちらも発現しない哺乳類細胞で選択的にCD59が発現さ
れるときに与えられるC5bー9阻害活性の直接的測定が可
能となった。この結果は、ヒト血清補体の膜攻撃性複合
体に対するヒト血球の阻害活性が、CD59 cDNAを用いて
トランスフェクションすることで非ヒト哺乳類細胞へ転
移し得ることを証明し、そしてこのタンパク質のC5b-9
阻害機能が、新たに発現された表面CD59抗原の量に関係
することを証明した。
D59が安定的に発現する能力により、通常はCD59もHRFも
どちらも発現しない哺乳類細胞で選択的にCD59が発現さ
れるときに与えられるC5bー9阻害活性の直接的測定が可
能となった。この結果は、ヒト血清補体の膜攻撃性複合
体に対するヒト血球の阻害活性が、CD59 cDNAを用いて
トランスフェクションすることで非ヒト哺乳類細胞へ転
移し得ることを証明し、そしてこのタンパク質のC5b-9
阻害機能が、新たに発現された表面CD59抗原の量に関係
することを証明した。
【００３４】これらのタンパク質の存在および以下に詳
述する研究は、これらの細胞表面成分の欠如または不活
性化が、血管血栓症の危険を増大し、そして血小板およ
び血小板が豊富な血漿(PRP)の蓄積時間を短縮し、臓器
および移植組織を潅流させることを示唆する。したがっ
て、血小板の生存能および止血能、造血幹細胞（例え
ば、CFU-S、CFU-GEMM、およびCFU-L）、およびそれらの
子孫細胞（例えば、BFU-E、BFU-MK、およびCFU-GM）、
および骨髄移植後これらの幹細胞から生じ得る赤血球、
血小板、単球、顆粒球、およびリンパ球を含む成熟血球
の生存および機能、および採取され、インビトロで保持
される移植用臓器および組織の生存は、C5bー9インヒビ
ターの貯蔵緩衝液または潅流液への添加により、および
／または防御されるべき細胞中のCD59をコードする遺伝
子の導入および発現により、増加され得る。自己免疫不
全、および狼瘡、リューマチ様関節炎、および他の型の
免疫性脈管炎を包含する他の病的状態は、有効な量のイ
ンヒビターまたは機能的に活性なそれらのポリペプチド
の脈管内投与および／またはトランスフェクションおよ
び発現により、このような処置を要する被検体のC5b-9
活性を阻害するよう処置され得る。インヒビターの同様
な使用法は、ヒト血液由来の培養培地中での細胞培養に
適用し得る。
述する研究は、これらの細胞表面成分の欠如または不活
性化が、血管血栓症の危険を増大し、そして血小板およ
び血小板が豊富な血漿(PRP)の蓄積時間を短縮し、臓器
および移植組織を潅流させることを示唆する。したがっ
て、血小板の生存能および止血能、造血幹細胞（例え
ば、CFU-S、CFU-GEMM、およびCFU-L）、およびそれらの
子孫細胞（例えば、BFU-E、BFU-MK、およびCFU-GM）、
および骨髄移植後これらの幹細胞から生じ得る赤血球、
血小板、単球、顆粒球、およびリンパ球を含む成熟血球
の生存および機能、および採取され、インビトロで保持
される移植用臓器および組織の生存は、C5bー9インヒビ
ターの貯蔵緩衝液または潅流液への添加により、および
／または防御されるべき細胞中のCD59をコードする遺伝
子の導入および発現により、増加され得る。自己免疫不
全、および狼瘡、リューマチ様関節炎、および他の型の
免疫性脈管炎を包含する他の病的状態は、有効な量のイ
ンヒビターまたは機能的に活性なそれらのポリペプチド
の脈管内投与および／またはトランスフェクションおよ
び発現により、このような処置を要する被検体のC5b-9
活性を阻害するよう処置され得る。インヒビターの同様
な使用法は、ヒト血液由来の培養培地中での細胞培養に
適用し得る。
【００３５】以下の実施例で示されるデータは、CD59の
遺伝子でのトランスフェクションが、補体の膜攻撃性複
合体に対する防御を、通常はヒトC5bー9タンパク質の活
性化を制限しない細胞に付与するために使用され得るこ
との証拠である。これらのデータは、ヒト赤血球に存在
するCD59抗原に以前は帰されていたC5b-9阻害機能をDNA
トランスフェクションにより確認し、このタンパク質と
関連して見出される活性が、CD59抗原と共に精製する、
補体阻害活性を有する他の膜構成物の存在を反映してい
るという可能性を排除する。グリコシル化(glycosylati
on)の明かな相違に反して、CHO細胞で発現される組み換
えCD59について観察されるC5b-9阻害機能は、ヒト赤血
球膜についておよび精製された赤血球CD59抗原について
観察されるのと類似するヒトC8およびC9(C5b-9の範囲
内)についての特異性を示す。CD59配列をコードするcDN
Aを用いた非ヒト細胞のトランスフェクションによるヒ
トC5b-9タンパク質に対する種選択的な防御を付与す
る、この能力は、この18-21kDのタンパク質が、ヒト血
球上の相同な補体制限因子として機能することを明かに
示し、そして発作性夜間血色素尿症候群が赤血球CD59の
単離した欠損に関係し得るという観察と一致する。
遺伝子でのトランスフェクションが、補体の膜攻撃性複
合体に対する防御を、通常はヒトC5bー9タンパク質の活
性化を制限しない細胞に付与するために使用され得るこ
との証拠である。これらのデータは、ヒト赤血球に存在
するCD59抗原に以前は帰されていたC5b-9阻害機能をDNA
トランスフェクションにより確認し、このタンパク質と
関連して見出される活性が、CD59抗原と共に精製する、
補体阻害活性を有する他の膜構成物の存在を反映してい
るという可能性を排除する。グリコシル化(glycosylati
on)の明かな相違に反して、CHO細胞で発現される組み換
えCD59について観察されるC5b-9阻害機能は、ヒト赤血
球膜についておよび精製された赤血球CD59抗原について
観察されるのと類似するヒトC8およびC9(C5b-9の範囲
内)についての特異性を示す。CD59配列をコードするcDN
Aを用いた非ヒト細胞のトランスフェクションによるヒ
トC5b-9タンパク質に対する種選択的な防御を付与す
る、この能力は、この18-21kDのタンパク質が、ヒト血
球上の相同な補体制限因子として機能することを明かに
示し、そして発作性夜間血色素尿症候群が赤血球CD59の
単離した欠損に関係し得るという観察と一致する。
【００３６】以下の例から説明されるように、組み換え
CD59の補体阻害活性は、表面抗原の発現が1.3×106分子
/CHO細胞に等しいかそれ以上に増幅されたときに、飽和
することが見い出された。CHO細胞の球径が約25μmであ
ると仮定すると、これは600分子のCD59抗原/（原形質膜
表面の１μm2）と等しいかそれ以上に相当する。比較す
ると、ヒト補体による活性化および溶解に対し非常に抵
抗性を有する、ヒト赤血球は、CD59抗原の約2.5×104分
子/細胞を発現し、これは約200分子/（膜表面の１μ
m2）に相当する。このデータから推定すると、CD59の1
×103分子/細胞またはCD59抗原の1分子/（原形質膜表面
の１μm2）に等しいかそれ以上が、補体介在の活性化お
よび溶解を阻害するのに効果的であるはずである。
CD59の補体阻害活性は、表面抗原の発現が1.3×106分子
/CHO細胞に等しいかそれ以上に増幅されたときに、飽和
することが見い出された。CHO細胞の球径が約25μmであ
ると仮定すると、これは600分子のCD59抗原/（原形質膜
表面の１μm2）と等しいかそれ以上に相当する。比較す
ると、ヒト補体による活性化および溶解に対し非常に抵
抗性を有する、ヒト赤血球は、CD59抗原の約2.5×104分
子/細胞を発現し、これは約200分子/（膜表面の１μ
m2）に相当する。このデータから推定すると、CD59の1
×103分子/細胞またはCD59抗原の1分子/（原形質膜表面
の１μm2）に等しいかそれ以上が、補体介在の活性化お
よび溶解を阻害するのに効果的であるはずである。
【００３７】このデータは、CHO細胞中で発現された組
み換えCD59が、Ｎ-結合性グリコシル化における明かな
相違に反して、ヒト赤血球中のCD59のヒトC5b-9特性の
種選択的な認識を示すこともまた証明する。これらのデ
ータは、ヒトC8(C5b-8の範囲内)およびヒトC9(C5b-9の
範囲内)についての認識を包含する、CD59により示され
た種選択性が、その炭水化物とは関係なく、コアタンパ
ク質により与えられること、あるいは関連した炭水化物
の構造が、CHO細胞中で発現されたときに組み換えタン
パク質中に保存されることを示唆する。血小板および臓
器の生存の延長、および治療効率の増強または補体を介
する障害の抑制のための組成物および方法において本明
細書中で使用されるように、「C5b-9不活性化物質」
は、赤血球膜上の18kDaタンパク質、C5b-9阻害活性を有
するそれらのペプチドフラグメント、好適には膜結合領
域を含有し、天然産生物から単離された、あるいは組み
換えで処理された配列を含有する如何なるCD59分子をも
示す。この用語は、CD59またはそれらの生物学的に機能
的な部分の遺伝子で感染またはトランスフェクションさ
れ、そしてそれを発現する細胞、およびネズミKd MHCク
ラスＩプロモーターのようなプロモーターと結合する遺
伝子がマイクロインジェクションのような技術を使用し
て動物の胚中に安定的に導入されたトランスジェニック
動物の細胞をもまた包含する。すべての分子量は、非還
元条件下でSDS-PAGEにより決定される。
み換えCD59が、Ｎ-結合性グリコシル化における明かな
相違に反して、ヒト赤血球中のCD59のヒトC5b-9特性の
種選択的な認識を示すこともまた証明する。これらのデ
ータは、ヒトC8(C5b-8の範囲内)およびヒトC9(C5b-9の
範囲内)についての認識を包含する、CD59により示され
た種選択性が、その炭水化物とは関係なく、コアタンパ
ク質により与えられること、あるいは関連した炭水化物
の構造が、CHO細胞中で発現されたときに組み換えタン
パク質中に保存されることを示唆する。血小板および臓
器の生存の延長、および治療効率の増強または補体を介
する障害の抑制のための組成物および方法において本明
細書中で使用されるように、「C5b-9不活性化物質」
は、赤血球膜上の18kDaタンパク質、C5b-9阻害活性を有
するそれらのペプチドフラグメント、好適には膜結合領
域を含有し、天然産生物から単離された、あるいは組み
換えで処理された配列を含有する如何なるCD59分子をも
示す。この用語は、CD59またはそれらの生物学的に機能
的な部分の遺伝子で感染またはトランスフェクションさ
れ、そしてそれを発現する細胞、およびネズミKd MHCク
ラスＩプロモーターのようなプロモーターと結合する遺
伝子がマイクロインジェクションのような技術を使用し
て動物の胚中に安定的に導入されたトランスジェニック
動物の細胞をもまた包含する。すべての分子量は、非還
元条件下でSDS-PAGEにより決定される。
【００３８】同定され、単独でまたはCD59と共に使用さ
れ得る他の補体インヒビターは、以下を包含する： (1)膜補助因子タンパク質(MCP)としても周知なCD46、Pu
rcellら、1990「ヒト細胞表面糖タンパク質HuLy-m5、補
体システムの膜補助因子タンパク質(MCP)、およびトロ
ホブラスト白血球コモン(TLX)抗原は、CD46である」J.
Immu nol. 70:150-161；およびSeyaおよびAtkinson, 198
9「補体の膜補助因子タンパク質の機能特性」Bi ochem.
J. 264:581-588、により記載。このインヒビターは、そ
れによりC3bを開裂し、C3bの蓄積を防止する不活性フラ
グメントとする分子を活性化する、補体成分C3bに結合
することで、機能しそしてそうすることでMACの形成に
貢献する。Whiteら、1991「ヒト膜補助因子タンパク質
(MCP)または崩壊促進因子(DAF)のトランスフェクション
によるヒト補体を介する溶解からの哺乳類細胞の防御」
Int. Meeting on Xenotranspl antation-:---(ヒト補体
による溶解からの非霊長類細胞の防御を提供するために
示さされた組み換えヒトCD46)をも参照せよ。
れ得る他の補体インヒビターは、以下を包含する： (1)膜補助因子タンパク質(MCP)としても周知なCD46、Pu
rcellら、1990「ヒト細胞表面糖タンパク質HuLy-m5、補
体システムの膜補助因子タンパク質(MCP)、およびトロ
ホブラスト白血球コモン(TLX)抗原は、CD46である」J.
Immu nol. 70:150-161；およびSeyaおよびAtkinson, 198
9「補体の膜補助因子タンパク質の機能特性」Bi ochem.
J. 264:581-588、により記載。このインヒビターは、そ
れによりC3bを開裂し、C3bの蓄積を防止する不活性フラ
グメントとする分子を活性化する、補体成分C3bに結合
することで、機能しそしてそうすることでMACの形成に
貢献する。Whiteら、1991「ヒト膜補助因子タンパク質
(MCP)または崩壊促進因子(DAF)のトランスフェクション
によるヒト補体を介する溶解からの哺乳類細胞の防御」
Int. Meeting on Xenotranspl antation-:---(ヒト補体
による溶解からの非霊長類細胞の防御を提供するために
示さされた組み換えヒトCD46)をも参照せよ。
【００３９】(2)崩壊促進因子(DAF)としても周知なCD5
5、Nicholson-Wellerら、1982「補体システムのC3コン
バターゼに対して崩壊促進活性を有するヒト上皮細胞膜
糖タンパク質の単離」J. Immunol. 129:184；Lublinお
よびAtkinson, 1989「崩壊促進因子：生化学、分子生物
学、および機能」Annu. Rev . Immunol. 7:35；Lublin
ら、1987「崩壊促進因子(DAF)をコードする遺伝子は、
染色体1のロングアームの補体調節座に位置する」J. Ex
p. Med. 165:1731；およびMedofら、1987「ヒト補体の
崩壊促進因子の完全な配列をコードするcDNAのクローニ
ングと確認」Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2007によ
り記載。このインヒビターは、C3コンバターゼの組立て
を妨げる分子量約70kDの膜結合タンパク質である。組み
換えDAFが、ヒト補体による溶解からの非霊長類細胞の
防御を提供するという、Whitera、1991の報告も参照せ
よ。
5、Nicholson-Wellerら、1982「補体システムのC3コン
バターゼに対して崩壊促進活性を有するヒト上皮細胞膜
糖タンパク質の単離」J. Immunol. 129:184；Lublinお
よびAtkinson, 1989「崩壊促進因子：生化学、分子生物
学、および機能」Annu. Rev . Immunol. 7:35；Lublin
ら、1987「崩壊促進因子(DAF)をコードする遺伝子は、
染色体1のロングアームの補体調節座に位置する」J. Ex
p. Med. 165:1731；およびMedofら、1987「ヒト補体の
崩壊促進因子の完全な配列をコードするcDNAのクローニ
ングと確認」Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2007によ
り記載。このインヒビターは、C3コンバターゼの組立て
を妨げる分子量約70kDの膜結合タンパク質である。組み
換えDAFが、ヒト補体による溶解からの非霊長類細胞の
防御を提供するという、Whitera、1991の報告も参照せ
よ。
【００４０】Rooneyら、1990「補体を介する溶解からの
ヒト羊膜上皮細胞(HEAC)の防御：細胞上での、３つの補
体阻害膜タンパク質の発現」Immunology 71:308-311に
報告のように、補体を介する溶解からの防御の提供につ
いてのCD46、CD55、およびCD59の相対的な寄与は、特異
的遮断抗体の使用によりヒト羊膜の上皮細胞中で測定さ
れてきた。その結果は、CD59が、CD46とCD55とを比較し
て、補体の攻撃に対し最大の防御を提供することを証明
した。さらに、補体の溶解作用に対する赤血球の異常な
感受性により引き起こされる希な疾病である発作性夜間
血色素尿症の被検体は、Yamasinaら、1990「発作性夜間
血色素尿症の原因としての20キロダルトン(CD59)の遺伝
された完全欠損」N ew Engl. J. Med. 323:1184-1189に
よれば、CD55の欠損を伴わずに、CD59の遺伝的欠損を有
することが記載された。
ヒト羊膜上皮細胞(HEAC)の防御：細胞上での、３つの補
体阻害膜タンパク質の発現」Immunology 71:308-311に
報告のように、補体を介する溶解からの防御の提供につ
いてのCD46、CD55、およびCD59の相対的な寄与は、特異
的遮断抗体の使用によりヒト羊膜の上皮細胞中で測定さ
れてきた。その結果は、CD59が、CD46とCD55とを比較し
て、補体の攻撃に対し最大の防御を提供することを証明
した。さらに、補体の溶解作用に対する赤血球の異常な
感受性により引き起こされる希な疾病である発作性夜間
血色素尿症の被検体は、Yamasinaら、1990「発作性夜間
血色素尿症の原因としての20キロダルトン(CD59)の遺伝
された完全欠損」N ew Engl. J. Med. 323:1184-1189に
よれば、CD55の欠損を伴わずに、CD59の遺伝的欠損を有
することが記載された。
【００４１】Daniels, G. 1989「崩壊促進因子でのクロ
マー関連(Cromer-related)抗原血液群決定因子」Vox. S
ang. 56:205；Holguinら、1992「崩壊促進因子の単離さ
れた欠損を伴う赤血球上での補体の他の経路の活性化の
効果の分析」J. Immunol. 148:498-502に報告されてい
るように、CD59は欠損しているが、崩壊促進因子は正常
(そして、おそらく他の補体インヒビターも正常)である
と報告されたこの被検体について観察された脈管内溶血
反応とは異なり、赤血球CD55(崩壊促進因子)に遺伝的な
欠乏または欠損を有する個体は、一般的に脈管内溶血反
応を示さない。これらの報告は、CD59が、ヒト血漿中の
補体の細胞溶解効果からこれらの細胞を防御するのに、
必要且つ十分であることを示唆している。
マー関連(Cromer-related)抗原血液群決定因子」Vox. S
ang. 56:205；Holguinら、1992「崩壊促進因子の単離さ
れた欠損を伴う赤血球上での補体の他の経路の活性化の
効果の分析」J. Immunol. 148:498-502に報告されてい
るように、CD59は欠損しているが、崩壊促進因子は正常
(そして、おそらく他の補体インヒビターも正常)である
と報告されたこの被検体について観察された脈管内溶血
反応とは異なり、赤血球CD55(崩壊促進因子)に遺伝的な
欠乏または欠損を有する個体は、一般的に脈管内溶血反
応を示さない。これらの報告は、CD59が、ヒト血漿中の
補体の細胞溶解効果からこれらの細胞を防御するのに、
必要且つ十分であることを示唆している。
【００４２】異質の宿主中への移植に適した細胞は、そ
の細胞中にタンパク質または、例えばCD59、CD55、CD4
6、および／または他のC8またはC9のインヒビターのよ
うな、補体を介する溶解を阻害する、タンパク質の組合
せをコードするDNAを導入することで、補体を介する溶
解から防御される。CD59は好適なインヒビターで、CD59
タンパク質をコードするベクターを用いるトランスフェ
クションまたは感染することにより細胞中に導入され、
そしてトランスフェクトされた／感染された細胞の表面
上で発現される。このインヒビターは、その細胞が移植
される宿主と起源が同じ種で有ることが望ましい。
の細胞中にタンパク質または、例えばCD59、CD55、CD4
6、および／または他のC8またはC9のインヒビターのよ
うな、補体を介する溶解を阻害する、タンパク質の組合
せをコードするDNAを導入することで、補体を介する溶
解から防御される。CD59は好適なインヒビターで、CD59
タンパク質をコードするベクターを用いるトランスフェ
クションまたは感染することにより細胞中に導入され、
そしてトランスフェクトされた／感染された細胞の表面
上で発現される。このインヒビターは、その細胞が移植
される宿主と起源が同じ種で有ることが望ましい。
【００４３】補体インヒビターをコードする遺伝子は、
起源が異なる種の細胞に導入され得る。例えば、ヒトCD
59遺伝子が、ブタの細胞に導入され得、その結果、ヒト
に移植されたときその細胞が攻撃に抵抗する。あるいは
この遺伝子は、起源が同一の種の細胞に導入され得、そ
の結果、その細胞の表面に、より多くの量のタンパク質
が発現される。例えば、この遺伝子は、この遺伝子の発
現を高めるプロモーターの制御下に置かれ得、次に、そ
の遺伝子は相同的組み換えにより宿主細胞の染色体中
の、その遺伝子が通常位置するが発現を高めるプロモー
ターの制御下にある部位に挿入されるか、または染色体
の他の遺伝子座に挿入され得る。
起源が異なる種の細胞に導入され得る。例えば、ヒトCD
59遺伝子が、ブタの細胞に導入され得、その結果、ヒト
に移植されたときその細胞が攻撃に抵抗する。あるいは
この遺伝子は、起源が同一の種の細胞に導入され得、そ
の結果、その細胞の表面に、より多くの量のタンパク質
が発現される。例えば、この遺伝子は、この遺伝子の発
現を高めるプロモーターの制御下に置かれ得、次に、そ
の遺伝子は相同的組み換えにより宿主細胞の染色体中
の、その遺伝子が通常位置するが発現を高めるプロモー
ターの制御下にある部位に挿入されるか、または染色体
の他の遺伝子座に挿入され得る。
【００４４】CD46、CD55およびCD59のDNA配列情報が、
文献中に報告されている。
文献中に報告されている。
【００４５】Lublinら、1988「ヒト膜補助因子タンパク
質(MCP)の分子クローニングと染色体局在化(chromosoma
l localization)：補体調節タンパク質のマルチジーン
ファミリー(multi-gene family)中での細胞含有物(incl
usion)の証拠」J. Exp. Med.168:181-194により報告さ
れたCD46の配列を以下に示す(配列番号１)。
質(MCP)の分子クローニングと染色体局在化(chromosoma
l localization)：補体調節タンパク質のマルチジーン
ファミリー(multi-gene family)中での細胞含有物(incl
usion)の証拠」J. Exp. Med.168:181-194により報告さ
れたCD46の配列を以下に示す(配列番号１)。
【００４６】GenBankから得られたHUMCD46 cDNA配列:HU
MCD46Q
MCD46Q
【００４７】
【表１】
【００４８】
【表２】
【００４９】
【表３】
【００５０】Medofら1987、により報告されたCD55の配
列を、以下に示す(配列番号２)。
列を、以下に示す(配列番号２)。
【００５１】GenBank HUMDAFから得られたヒトDAF cDNA
配列：ＨＵＭＤＡＦＣ１
配列：ＨＵＭＤＡＦＣ１
【００５２】
【表４】
【００５３】
【表５】
【００５４】
【表６】
【００５５】ＢＯＬＤ ＴＥＸＴ ＝ ＨＵＭＤＡＦＣ
１ （プロモーターおよびエキソン1、ゲノム配列の5'
末端) PLAIN TEXT = HUMDAF cDNA Philbrick, W.M.ら、1990 Eur . J. Immunol. 20,87-92
により報告されたCD59のアミノ酸および核酸の配列を以
下に示す（配列番号３）。
１ （プロモーターおよびエキソン1、ゲノム配列の5'
末端) PLAIN TEXT = HUMDAF cDNA Philbrick, W.M.ら、1990 Eur . J. Immunol. 20,87-92
により報告されたCD59のアミノ酸および核酸の配列を以
下に示す（配列番号３）。
【００５６】このタンパク質のアミノ酸配列は：
【００５７】
【表７】
【００５８】CD59タンパク質をコードするcDNA配列(配
列番号４)は：
列番号４)は：
【００５９】
【表８】
【００６０】適合するオリゴヌクレオチドプライマーは
容易に設計され、ヒトcDNAのポリメラーゼ連鎖反応の増
幅により、これらのタンパク質に対する全鎖長のcDNA配
列を得るために使用し得る。好適には、このオリゴヌク
レオチドプライマーは、特異的制限酵素部位を有するよ
う設計されることが好ましく、その結果、全鎖長のcDNA
配列がターゲットドナー細胞をトランスフェクト／感染
するのに使用するために、ベクター中に容易にサブクロ
ーニングされ得る。
容易に設計され、ヒトcDNAのポリメラーゼ連鎖反応の増
幅により、これらのタンパク質に対する全鎖長のcDNA配
列を得るために使用し得る。好適には、このオリゴヌク
レオチドプライマーは、特異的制限酵素部位を有するよ
う設計されることが好ましく、その結果、全鎖長のcDNA
配列がターゲットドナー細胞をトランスフェクト／感染
するのに使用するために、ベクター中に容易にサブクロ
ーニングされ得る。
【００６１】補体インヒビターをコ ードするDNAの内皮
細胞への 導入 補体インヒビターをコードするDNAは、トランスフェク
ションを使用して培地中の細胞へ、あるいは補体インヒ
ビターをそれらの細胞表面で発現させるトランスジェニ
ック動物を生産するために胚中へ導入され得る。
細胞への 導入 補体インヒビターをコードするDNAは、トランスフェク
ションを使用して培地中の細胞へ、あるいは補体インヒ
ビターをそれらの細胞表面で発現させるトランスジェニ
ック動物を生産するために胚中へ導入され得る。
【００６２】培養細胞への導入 当該技術分野ですでに周知のように、トランスフェクシ
ョンは、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈降法、リポフ
ェクチンベースの処理(lipofectin-based procedure)、
またはマイクロインジェクションにより、または「遺伝
子銃」の使用によりなされ得る。いずれの場合も、CD59
のような阻害タンパク質のcDNAは、遺伝学的に操作され
た細胞中で十分発現するための分子をコードするプラス
ミドベースのベクター中にサブクローニングされる。こ
のプラスミドベースのベクターは、好適には真核細胞中
では細胞毒性アミノグリコシドG418を用いての安定なト
ランスフェクタント（transfectant）の選別のためのネ
オマイシン遺伝子のようなマーカーおよび細菌中ではプ
ラスミドの選別のためにアンピシリン遺伝子を含有す
る。
ョンは、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈降法、リポフ
ェクチンベースの処理(lipofectin-based procedure)、
またはマイクロインジェクションにより、または「遺伝
子銃」の使用によりなされ得る。いずれの場合も、CD59
のような阻害タンパク質のcDNAは、遺伝学的に操作され
た細胞中で十分発現するための分子をコードするプラス
ミドベースのベクター中にサブクローニングされる。こ
のプラスミドベースのベクターは、好適には真核細胞中
では細胞毒性アミノグリコシドG418を用いての安定なト
ランスフェクタント（transfectant）の選別のためのネ
オマイシン遺伝子のようなマーカーおよび細菌中ではプ
ラスミドの選別のためにアンピシリン遺伝子を含有す
る。
【００６３】内皮細胞に対して好適である感染は、レト
ロウイルスベクター中に阻害タンパク質の遺伝子配列を
取り込むことで達成される。このような取り込みについ
ては、当該技術分野では種々の方法が知られている。当
該技術分野で広く使用されてきたそのような方法の１つ
は、レトロウイルスをパッケージングする欠陥ネズミレ
トロウイルスPsi-2細胞、およびターゲットドナー細胞
の感染に使用する感染性両種性ウイルスを準備するため
の両種性パッケージング細胞系Psi-AMを、Kohnら、1987
「レトロウイルスを介する遺伝子は哺乳類細胞中へ転移
される」BloodCells 13:285-298に記載のように、採用
する。
ロウイルスベクター中に阻害タンパク質の遺伝子配列を
取り込むことで達成される。このような取り込みについ
ては、当該技術分野では種々の方法が知られている。当
該技術分野で広く使用されてきたそのような方法の１つ
は、レトロウイルスをパッケージングする欠陥ネズミレ
トロウイルスPsi-2細胞、およびターゲットドナー細胞
の感染に使用する感染性両種性ウイルスを準備するため
の両種性パッケージング細胞系Psi-AMを、Kohnら、1987
「レトロウイルスを介する遺伝子は哺乳類細胞中へ転移
される」BloodCells 13:285-298に記載のように、採用
する。
【００６４】または、欠陥モロニーネズミレトロウイル
スでなく、Hantzopoulosら、1989「レトロウイルスベク
ターの転写単位外のアデノシンデアミナーゼミニジーン
の転移での改善された遺伝子発現」Proc . Natl. Acad.
Sci. USA 86:3519-3523に記載のように、自己不活性化
およびダブルコピータイプのレトロウイルスが、使用さ
れ得る。
スでなく、Hantzopoulosら、1989「レトロウイルスベク
ターの転写単位外のアデノシンデアミナーゼミニジーン
の転移での改善された遺伝子発現」Proc . Natl. Acad.
Sci. USA 86:3519-3523に記載のように、自己不活性化
およびダブルコピータイプのレトロウイルスが、使用さ
れ得る。
【００６５】細胞の表面で補体イン ヒビターを発現する
トランスジェニック動物の生産のための胚 への導入 移植用に改変された細胞の供給源として使用される細胞
群の表面で補体阻害タンパク質を発現するトランスジェ
ニック動物を作るための種々の方法が、当業者に知られ
ている。トランスジェニックなマウス、ラット、ウサ
ギ、ブタ、ヒツジ、およびウシが、標準的な技術を使用
して作られたが、特に有用な動物の例は、ウサギおよび
ブタを包含する。最もよく知られた、トランスジェニッ
ク動物を作る方法は、ドナーである雌の過剰排卵、卵子
の外科的な摘出そして胚の前核への遺伝物質の注入であ
る。このことは、Wagnerへの米国特許番号第4,873,191
号に教示されており、その特許の教示は本明細書中に援
用する。他の一般的に使用される技術は、後述の実施例
２で特に記載のように、胚幹細胞(ES cell)の遺伝子操
作を包含する。
トランスジェニック動物の生産のための胚 への導入 移植用に改変された細胞の供給源として使用される細胞
群の表面で補体阻害タンパク質を発現するトランスジェ
ニック動物を作るための種々の方法が、当業者に知られ
ている。トランスジェニックなマウス、ラット、ウサ
ギ、ブタ、ヒツジ、およびウシが、標準的な技術を使用
して作られたが、特に有用な動物の例は、ウサギおよび
ブタを包含する。最もよく知られた、トランスジェニッ
ク動物を作る方法は、ドナーである雌の過剰排卵、卵子
の外科的な摘出そして胚の前核への遺伝物質の注入であ
る。このことは、Wagnerへの米国特許番号第4,873,191
号に教示されており、その特許の教示は本明細書中に援
用する。他の一般的に使用される技術は、後述の実施例
２で特に記載のように、胚幹細胞(ES cell)の遺伝子操
作を包含する。
【００６６】ES細胞は、例えば、Teratoc aricinomas a n
d embryonic stem cells: A p ractical app roach E.J.
Robertson編集、71-112(Oxford-Washington, D.C. IRL
Press, 1987)中のRobertson, E.J.「胚由来の幹細胞
系」に記載のように増殖される。遺伝物質は、例えば、
McMahon, A.P.およびBradley, A. Cell 62,1073-1085(1
991)の方法に従い電気穿孔法により胚幹細胞中に導入さ
れる。コロニーは、第６日から第９日に選別され、96ま
たは24ウェルディッシュ(Costar)に移され、増殖され、
そしてサザンブロッティング分析のためのDNA単離に使
用される。
d embryonic stem cells: A p ractical app roach E.J.
Robertson編集、71-112(Oxford-Washington, D.C. IRL
Press, 1987)中のRobertson, E.J.「胚由来の幹細胞
系」に記載のように増殖される。遺伝物質は、例えば、
McMahon, A.P.およびBradley, A. Cell 62,1073-1085(1
991)の方法に従い電気穿孔法により胚幹細胞中に導入さ
れる。コロニーは、第６日から第９日に選別され、96ま
たは24ウェルディッシュ(Costar)に移され、増殖され、
そしてサザンブロッティング分析のためのDNA単離に使
用される。
【００６７】キメラマウスは、E.J. Robertson編集のTe
ratocarcinom as and embryonic stem cells: A practic
al approach(Oxford, Washington, D.C. IRL Press 198
7) p113-151のBradley,「キメラマウスの生産と分析」
に記載のように生成される。その教示は本明細書中に援
用する。遺伝物質は、胚盤胞に注入される。キメラはそ
れらのインプラントされた妊娠し得る雌の子孫から選別
され、そしてそのキメラは、ドナー動物として使用する
ため生殖系列キメラを生産するために飼育される。
ratocarcinom as and embryonic stem cells: A practic
al approach(Oxford, Washington, D.C. IRL Press 198
7) p113-151のBradley,「キメラマウスの生産と分析」
に記載のように生成される。その教示は本明細書中に援
用する。遺伝物質は、胚盤胞に注入される。キメラはそ
れらのインプラントされた妊娠し得る雌の子孫から選別
され、そしてそのキメラは、ドナー動物として使用する
ため生殖系列キメラを生産するために飼育される。
【００６８】ＩＩ．Ｔ細胞からの防御 抗体または遮断化合物を使用するＴ細胞の免疫を介する
応答の阻害のための先の試みとは異なり、細胞の遺伝学
的操作が、Ｔ細胞の免疫応答を阻害するために使用され
る。ドナー内皮細胞が、それらの表面でMHCクラスＩ分
子が発現しないように遺伝学的に操作される。さらに好
適には、その細胞は、実質的にすべての細胞表面でクラ
スＩおよびクラスIIのMHC分子を発現しないように、遺
伝学的に操作される。本明細書中で使用されるように、
用語「発現しない」は、応答を引き起こすには十分な量
が細胞表面上に発現しないこと、あるいは発現されるタ
ンパク質に欠陥があり、そのため応答を引き起こさない
ことを意味し得る。
応答の阻害のための先の試みとは異なり、細胞の遺伝学
的操作が、Ｔ細胞の免疫応答を阻害するために使用され
る。ドナー内皮細胞が、それらの表面でMHCクラスＩ分
子が発現しないように遺伝学的に操作される。さらに好
適には、その細胞は、実質的にすべての細胞表面でクラ
スＩおよびクラスIIのMHC分子を発現しないように、遺
伝学的に操作される。本明細書中で使用されるように、
用語「発現しない」は、応答を引き起こすには十分な量
が細胞表面上に発現しないこと、あるいは発現されるタ
ンパク質に欠陥があり、そのため応答を引き起こさない
ことを意味し得る。
【００６９】本明細書中に使用されるように、MHC分子
はHLA分子、特にクラスＩのHLA A、B、およびC、並びに
クラスIIのHLA DP、DQ、およびDR、並びにそれらのサブ
クラスを指していう。この用語は、一般的にヒトMHCに
特有であると解釈されるが、本明細書ではドナー細胞種
由来の同意義のMHC遺伝子を包含することを意味する。
例えばその細胞がブタ由来であれば、MHC ＩまたはMHC
IIのいずれの場合も、用語HLAは同意義のブタMHC分子を
指す。
はHLA分子、特にクラスＩのHLA A、B、およびC、並びに
クラスIIのHLA DP、DQ、およびDR、並びにそれらのサブ
クラスを指していう。この用語は、一般的にヒトMHCに
特有であると解釈されるが、本明細書ではドナー細胞種
由来の同意義のMHC遺伝子を包含することを意味する。
例えばその細胞がブタ由来であれば、MHC ＩまたはMHC
IIのいずれの場合も、用語HLAは同意義のブタMHC分子を
指す。
【００７０】クラスIIのMHC分子が除去されるとき、CD4
＋Ｔ細胞は遺伝学的に操作された内皮細胞を認識せず；
クラスＩおよびクラスIIのMHC分子の両方が除去された
とき、CD4+およびCD8+細胞のいずれもが改変された細胞
を認識しない。
＋Ｔ細胞は遺伝学的に操作された内皮細胞を認識せず；
クラスＩおよびクラスIIのMHC分子の両方が除去された
とき、CD4+およびCD8+細胞のいずれもが改変された細胞
を認識しない。
【００７１】特定の同種移植片の拒絶において、免疫応
答を取りもつCD4+およびCD8+Ｔ細胞の系統群の相対的重
要性は、実験的に研究された。ターゲットとする性質お
よび遺伝子の相同的組み換えによる実験が、いくつかの
洞察を提供した。例えば、AIDSウイルス(HIV)は、選択
的にCD4+Ｔ細胞を減らすが、CD8+Ｔ細胞は減らさない、
そして実質的に体の免疫防御を破壊する。さらに、Zijl
straら、1989「胚幹細胞において、相同的組み換えによ
り生産される破壊されたβ2ミクログロブリン遺伝子の
生殖系列伝達」Nat ure 342:435438；およびKollerら、1
990「β2M、MHCクラスＩタンパク質およびCD8+Ｔ細胞を
欠くマウスの正常な発生」Science 248:1227-1230に報
告のように、マウスでは相同的組み換えおよびβ2ミク
ログロブリン遺伝子の破壊が、CD8+Ｔ細胞の消失を引き
起こすが、この遺伝子型を引き継ぐマウスは健康を保
ち、そしてウイルスのような異質の生物による感染に抵
抗し得る。これら2つの観察は共に、CD8+Ｔ細胞は宿主
の防御メカニズムで、特殊であり、そして本質的でない
役割を演じるが、CD4+Ｔ細胞は一般的に免疫応答で中心
的で、そして本質的な役割を演じていることを示唆す
る。
答を取りもつCD4+およびCD8+Ｔ細胞の系統群の相対的重
要性は、実験的に研究された。ターゲットとする性質お
よび遺伝子の相同的組み換えによる実験が、いくつかの
洞察を提供した。例えば、AIDSウイルス(HIV)は、選択
的にCD4+Ｔ細胞を減らすが、CD8+Ｔ細胞は減らさない、
そして実質的に体の免疫防御を破壊する。さらに、Zijl
straら、1989「胚幹細胞において、相同的組み換えによ
り生産される破壊されたβ2ミクログロブリン遺伝子の
生殖系列伝達」Nat ure 342:435438；およびKollerら、1
990「β2M、MHCクラスＩタンパク質およびCD8+Ｔ細胞を
欠くマウスの正常な発生」Science 248:1227-1230に報
告のように、マウスでは相同的組み換えおよびβ2ミク
ログロブリン遺伝子の破壊が、CD8+Ｔ細胞の消失を引き
起こすが、この遺伝子型を引き継ぐマウスは健康を保
ち、そしてウイルスのような異質の生物による感染に抵
抗し得る。これら2つの観察は共に、CD8+Ｔ細胞は宿主
の防御メカニズムで、特殊であり、そして本質的でない
役割を演じるが、CD4+Ｔ細胞は一般的に免疫応答で中心
的で、そして本質的な役割を演じていることを示唆す
る。
【００７２】内皮細胞上になされる好適な遺伝的改変
は、１)MHCクラスII分子の組立ておよび細胞表面への輸
送、そして抗原性ペプチドのローディングにおいて機能
する内在インバリアント鎖遺伝子を破壊すること、およ
び２)すべてのMHCクラスＩ分子の細胞表面での発現に必
要なタンパク質をコードする内在β2ミクログロブリン
遺伝子(β2M 遺伝子)を破壊すること、を包含する。ま
たは、インバリアント鎖遺伝子のみが、破壊される。イ
ンバリアント鎖は、抗原性ペプチドフラグメントをMHC
クラスII分子に挿入するために必要であると考えられて
いる。抗原性ペプチドおよびMHCは共に、Ｔ細胞により
認識される。抗原性ペプチドの非存在下では、Ｔ細胞の
認識は正常に得られず、またMHCクラスII分子も正しく
組まれない。このように、インバリアント鎖を欠く細胞
では、ペプチドの発現は止まり、そして微量の細胞表面
のMHCが得られるときでさえ、それらはペプチドを欠
き、そのため非免疫原性である。
は、１)MHCクラスII分子の組立ておよび細胞表面への輸
送、そして抗原性ペプチドのローディングにおいて機能
する内在インバリアント鎖遺伝子を破壊すること、およ
び２)すべてのMHCクラスＩ分子の細胞表面での発現に必
要なタンパク質をコードする内在β2ミクログロブリン
遺伝子(β2M 遺伝子)を破壊すること、を包含する。ま
たは、インバリアント鎖遺伝子のみが、破壊される。イ
ンバリアント鎖は、抗原性ペプチドフラグメントをMHC
クラスII分子に挿入するために必要であると考えられて
いる。抗原性ペプチドおよびMHCは共に、Ｔ細胞により
認識される。抗原性ペプチドの非存在下では、Ｔ細胞の
認識は正常に得られず、またMHCクラスII分子も正しく
組まれない。このように、インバリアント鎖を欠く細胞
では、ペプチドの発現は止まり、そして微量の細胞表面
のMHCが得られるときでさえ、それらはペプチドを欠
き、そのため非免疫原性である。
【００７３】Zijlstraら、1989; Kollerら、1990;およ
びインバリアント鎖遺伝子の破壊を示す以下の実施例２
に記載のように、これらの遺伝子の破壊は、相同的組み
換え遺伝子ターゲッティング技術によりなされる。
びインバリアント鎖遺伝子の破壊を示す以下の実施例２
に記載のように、これらの遺伝子の破壊は、相同的組み
換え遺伝子ターゲッティング技術によりなされる。
【００７４】この技術は、以下のように細胞表面のMHC
クラスＩタンパク質の発現を抑制することに適用され
る。まず、ターゲットドナー内皮細胞については完全な
β2M遺伝子が、クローニングされる。例えば、ブタ内皮
細胞についてはブタβ2M遺伝子がクローニングされる。
これは、まず、マウスβ2M遺伝子のような、相同なβ2M
遺伝子についてのcDNAを得ることによりなされる。マウ
スβ2M cDNAについてのDNA配列の情報は、Parnesら、19
83 Nature 302:449-452に報告されている。適合するオ
リゴヌクレオチドプライマーは、マウスβ2M cDNAの5'
および3'の末端と完全に対になる相補的塩基によりハイ
ブリダイズするように容易に設計される。そして、これ
らのオリゴヌクレオチドプライマーは、マウスcDNA上で
のポリメラーゼ連鎖反応増幅をなすことにより、マウス
β2Mタンパク質の全鎖長のcDNA配列を得るために使用さ
れる。このオリゴヌクレオチドプライマーは、それらの
末端で特異的制限部位をコードするように選択的に設計
され、その結果、全鎖長のcDNA配列がプラスミド中に容
易にサブクローニングされる。
クラスＩタンパク質の発現を抑制することに適用され
る。まず、ターゲットドナー内皮細胞については完全な
β2M遺伝子が、クローニングされる。例えば、ブタ内皮
細胞についてはブタβ2M遺伝子がクローニングされる。
これは、まず、マウスβ2M遺伝子のような、相同なβ2M
遺伝子についてのcDNAを得ることによりなされる。マウ
スβ2M cDNAについてのDNA配列の情報は、Parnesら、19
83 Nature 302:449-452に報告されている。適合するオ
リゴヌクレオチドプライマーは、マウスβ2M cDNAの5'
および3'の末端と完全に対になる相補的塩基によりハイ
ブリダイズするように容易に設計される。そして、これ
らのオリゴヌクレオチドプライマーは、マウスcDNA上で
のポリメラーゼ連鎖反応増幅をなすことにより、マウス
β2Mタンパク質の全鎖長のcDNA配列を得るために使用さ
れる。このオリゴヌクレオチドプライマーは、それらの
末端で特異的制限部位をコードするように選択的に設計
され、その結果、全鎖長のcDNA配列がプラスミド中に容
易にサブクローニングされる。
【００７５】その後、全鎖長のマウスβ2M cDNAが、タ
ーゲットドナー内皮細胞の供給源から調製されたcDNAラ
イブラリーをスクリーニングするための放射性標識ハイ
ブリダイゼーションプローブとして使用され得る。例え
ば、ブタ内皮細胞について、マウスβ2M cDNAが、λフ
ァージベクター中にクローニングされた、ブタcDNAライ
ブラリーをスクリーニングするためのハイブリダイゼー
ションプローブとして使用される。陽性のハイブリダイ
ゼーションクローンが選別され、精製され、プラスミド
ベクター中にサブクローニングされ、次に、当該技術分
野で周知の方法を使用して配列決定される。
ーゲットドナー内皮細胞の供給源から調製されたcDNAラ
イブラリーをスクリーニングするための放射性標識ハイ
ブリダイゼーションプローブとして使用され得る。例え
ば、ブタ内皮細胞について、マウスβ2M cDNAが、λフ
ァージベクター中にクローニングされた、ブタcDNAライ
ブラリーをスクリーニングするためのハイブリダイゼー
ションプローブとして使用される。陽性のハイブリダイ
ゼーションクローンが選別され、精製され、プラスミド
ベクター中にサブクローニングされ、次に、当該技術分
野で周知の方法を使用して配列決定される。
【００７６】未翻訳のヌクレオチド残基および発現され
たタンパク質をコードする遺伝子の部分を含む、完全な
ブタβ2M遺伝子は、ハイブリダイゼーションプローブと
して放射性標識したブタβ2M cDNAを用いてλファージ
ベクター中にクローニングされたブタゲノムDNAライブ
ラリーをスクリーニングすることによりクローニングさ
れ得る。陽性のクローンが選別され、精製され、プラス
ミドベクター中にサブクローニングされ、そして当該技
術分野で周知の方法を使用して配列決定される。
たタンパク質をコードする遺伝子の部分を含む、完全な
ブタβ2M遺伝子は、ハイブリダイゼーションプローブと
して放射性標識したブタβ2M cDNAを用いてλファージ
ベクター中にクローニングされたブタゲノムDNAライブ
ラリーをスクリーニングすることによりクローニングさ
れ得る。陽性のクローンが選別され、精製され、プラス
ミドベクター中にサブクローニングされ、そして当該技
術分野で周知の方法を使用して配列決定される。
【００７７】ひとたびクローニングされると、β2M遺伝
子は、プラスミドベースのまたは優先的にレトロウイル
スベースのベクター(「遺伝子ターゲッティングベクタ
ー」)中にサブクローニングされる。例えば、ネオマイ
シン抵抗性遺伝子(本明細書ではこれ以降「陽性選択遺
伝子」と呼ぶ)のような、内皮細胞中で組み換えの陽性
選択をさせる短いDNA配列の挿入により、β2M遺伝子の
読み取り枠が破壊される遺伝子ターゲッティングベクタ
ーは、非相同的組み換えに対する選別、すなわち破壊さ
れたβ2M遺伝子を有するプラスミドの部分だけではな
く、プラスミド全体を細胞の遺伝情報中に取り入れるこ
とに対する選別を可能にする破壊されたβ2M遺伝子領域
以外に、追加選択遺伝子(「陰性選択遺伝子」)をもまた
有する。陰性選択遺伝子は、例えば、単純ヘルペスチミ
ジンキナーゼ遺伝子であり得る。
子は、プラスミドベースのまたは優先的にレトロウイル
スベースのベクター(「遺伝子ターゲッティングベクタ
ー」)中にサブクローニングされる。例えば、ネオマイ
シン抵抗性遺伝子(本明細書ではこれ以降「陽性選択遺
伝子」と呼ぶ)のような、内皮細胞中で組み換えの陽性
選択をさせる短いDNA配列の挿入により、β2M遺伝子の
読み取り枠が破壊される遺伝子ターゲッティングベクタ
ーは、非相同的組み換えに対する選別、すなわち破壊さ
れたβ2M遺伝子を有するプラスミドの部分だけではな
く、プラスミド全体を細胞の遺伝情報中に取り入れるこ
とに対する選別を可能にする破壊されたβ2M遺伝子領域
以外に、追加選択遺伝子(「陰性選択遺伝子」)をもまた
有する。陰性選択遺伝子は、例えば、単純ヘルペスチミ
ジンキナーゼ遺伝子であり得る。
【００７８】その後、遺伝子ターゲットベクターは、上
述のように細胞中にトランスフェクション／感染され、
そして陽性選択遺伝子を発現するが、陰性選択遺伝子を
発現しないクローンのスクリーニングにより、相同的組
み換えの事象が選択される。
述のように細胞中にトランスフェクション／感染され、
そして陽性選択遺伝子を発現するが、陰性選択遺伝子を
発現しないクローンのスクリーニングにより、相同的組
み換えの事象が選択される。
【００７９】同じ処理が、実施例３で以下に証明される
ように、インバリアント鎖遺伝子の相同的組み換えを達
成するために使用される。
ように、インバリアント鎖遺伝子の相同的組み換えを達
成するために使用される。
【００８０】III．処理され操作される細胞および宿主Ａ．補体およびＴ細胞を介 する溶解から防御するための
細胞の遺伝学的操作 本明細書中に記載の好適な実施態様では、遺伝学的に操
作された細胞が、宿主中に移植され、宿主の免疫システ
ムに抵抗しそしてそれを回避し得る。宿主は、通常ヒト
または家畜化された動物である。
細胞の遺伝学的操作 本明細書中に記載の好適な実施態様では、遺伝学的に操
作された細胞が、宿主中に移植され、宿主の免疫システ
ムに抵抗しそしてそれを回避し得る。宿主は、通常ヒト
または家畜化された動物である。
【００８１】内皮細胞、特に宿主へのインプランテーシ
ョンまたは注入のために離された内皮細胞に関して記載
するが、本明細書中に記載の方法および組成物は、内皮
細胞に限定されない。他の細胞のタイプも移植のために
同様に改変され得る。他の細胞のタイプの例は、離した
または組織として使用されていた(すなわち器官)線維芽
細胞、上皮細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、
肝細胞、膵島細胞、骨髄細胞、星状細胞、シュヴァン細
胞、ならびに他の細胞のタイプを包含する。本明細書中
に記載されるように、「内皮細胞」とは、実施例で特別
に特定されまたは限定されない限り、これらの他の細胞
のタイプの改変を包含するものとして解釈される。
ョンまたは注入のために離された内皮細胞に関して記載
するが、本明細書中に記載の方法および組成物は、内皮
細胞に限定されない。他の細胞のタイプも移植のために
同様に改変され得る。他の細胞のタイプの例は、離した
または組織として使用されていた(すなわち器官)線維芽
細胞、上皮細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、
肝細胞、膵島細胞、骨髄細胞、星状細胞、シュヴァン細
胞、ならびに他の細胞のタイプを包含する。本明細書中
に記載されるように、「内皮細胞」とは、実施例で特別
に特定されまたは限定されない限り、これらの他の細胞
のタイプの改変を包含するものとして解釈される。
【００８２】細胞は、種々の起源から得られ得る。その
ような細胞を大量におよび低コストで入手し得るので、
好適にはこの細胞は非ヒト由来である。例えば、細胞は
ブタまたはウシ由来であり得る。ヒトを含む霊長類由来
の細胞も、好適であれば使用し得る。ヒトの細胞が使用
されても、アロタイプ移植の後でさえ補体を介する細胞
攻撃が起こり得るので、超急性拒絶反応からの防御が一
般的にはまだ必要とされる。
ような細胞を大量におよび低コストで入手し得るので、
好適にはこの細胞は非ヒト由来である。例えば、細胞は
ブタまたはウシ由来であり得る。ヒトを含む霊長類由来
の細胞も、好適であれば使用し得る。ヒトの細胞が使用
されても、アロタイプ移植の後でさえ補体を介する細胞
攻撃が起こり得るので、超急性拒絶反応からの防御が一
般的にはまだ必要とされる。
【００８３】遺伝学的に操作された細胞は、通常、単個
クローン、またはいくつかの使用法では個別に選択され
たクローンの群から導かれる。このように、最終的な治
療用調製品の特徴は、細胞の全体的な特性および遺伝学
的な構成の両方に関して正確にコントロールされ得るこ
とである。このようなコントロールは、特定の治療プロ
トコルの効果を評価し、そのようなプロトコルに対する
規制の認可を得ることに重要である。
クローン、またはいくつかの使用法では個別に選択され
たクローンの群から導かれる。このように、最終的な治
療用調製品の特徴は、細胞の全体的な特性および遺伝学
的な構成の両方に関して正確にコントロールされ得るこ
とである。このようなコントロールは、特定の治療プロ
トコルの効果を評価し、そのようなプロトコルに対する
規制の認可を得ることに重要である。
【００８４】上記細胞は、補体阻害タンパク質またはタ
ンパク質類が細胞表面上に発現するように、遺伝学的に
操作される。上記細胞は、それらがクラスII、クラス
Ｉ、または好適にはクラスＩおよびクラスIIのMHC遺伝
子によりコードされるタンパク質が、細胞表面上に発現
しないようにも、遺伝学的に操作され得る。ヒトの細胞
が使用される場合でさえ、細胞が治療される個体以外の
個体から得られる場合、その細胞群は一般的に非自己細
胞を含有するので、本明細書中に記載のように、細胞を
操作することが有益である。
ンパク質類が細胞表面上に発現するように、遺伝学的に
操作される。上記細胞は、それらがクラスII、クラス
Ｉ、または好適にはクラスＩおよびクラスIIのMHC遺伝
子によりコードされるタンパク質が、細胞表面上に発現
しないようにも、遺伝学的に操作され得る。ヒトの細胞
が使用される場合でさえ、細胞が治療される個体以外の
個体から得られる場合、その細胞群は一般的に非自己細
胞を含有するので、本明細書中に記載のように、細胞を
操作することが有益である。
【００８５】内皮細胞は、例えば、血管または毛細血管
のような血管系の一部の内層から得られ、組織培地また
は他の適切な生物学的な培地中で、成長されそして保持
される。
のような血管系の一部の内層から得られ、組織培地また
は他の適切な生物学的な培地中で、成長されそして保持
される。
【００８６】例えば、ブタの大血管内皮細胞は、雄ブタ
の胸部大動脈から単離される。
の胸部大動脈から単離される。
【００８７】1.大動脈弓および腎動脈口のすぐ上で滅菌
クランプを使用してクロスクランピングする滅菌技術を
使用して、屠殺された動物から、胸部大動脈を摘出す
る。
クランプを使用してクロスクランピングする滅菌技術を
使用して、屠殺された動物から、胸部大動脈を摘出す
る。
【００８８】2.組織／器官を、10Xのペニシリン、スト
レプトマイシンおよびフンギゾン(fungizone)を含有す
る滅菌PBS緩衝液中に入れる。これらを、氷上に移す。
レプトマイシンおよびフンギゾン(fungizone)を含有す
る滅菌PBS緩衝液中に入れる。これらを、氷上に移す。
【００８９】3.大動脈を、層流クリーンベンチ中の滅菌
フィールドに置いた後、大動脈周辺の脂肪および外膜組
織を、大動脈から切除する。補助者に大動脈を押さえさ
せ、クランプおよび無菌はさみを使用して、血管を長軸
に切開し、内皮を露出させる。次いで、その内皮を無菌
PBS／抗生物質含有緩衝液でリンスする。
フィールドに置いた後、大動脈周辺の脂肪および外膜組
織を、大動脈から切除する。補助者に大動脈を押さえさ
せ、クランプおよび無菌はさみを使用して、血管を長軸
に切開し、内皮を露出させる。次いで、その内皮を無菌
PBS／抗生物質含有緩衝液でリンスする。
【００９０】4.引き続き、上記内皮を、滅菌メスで削り
取り、そして採取された内皮を、滅菌PBS緩衝液の流勢
での剥胱により、細胞を無菌15cc円錐遠沈管中に移す。
この遠沈管を1200RPMで遠心分離し、上清を吸引する。
取り、そして採取された内皮を、滅菌PBS緩衝液の流勢
での剥胱により、細胞を無菌15cc円錐遠沈管中に移す。
この遠沈管を1200RPMで遠心分離し、上清を吸引する。
【００９１】5.5.0mlの滅菌媒地(10%の熱不活性化ウシ
胎児血清)、ペニシリン(100U/ml)、ストレプトマイシン
(100U/ml)、5mMHepes、5mMピルビン酸塩および5mMグル
タミンを含有するDMEMを各遠沈管に加え、そして細胞ペ
レットを、滅菌5mlピペットで溶液を穏やかにピペッテ
ィングし、媒地中に再懸濁する。
胎児血清)、ペニシリン(100U/ml)、ストレプトマイシン
(100U/ml)、5mMHepes、5mMピルビン酸塩および5mMグル
タミンを含有するDMEMを各遠沈管に加え、そして細胞ペ
レットを、滅菌5mlピペットで溶液を穏やかにピペッテ
ィングし、媒地中に再懸濁する。
【００９２】6.(各大動脈から採取された)細胞の5.0ml
アリコートを、Corning製T25組織培養フラスコ中に入
れ、この培養物を5%CO2、95%に過湿された空気中で、37
℃でインキュベートする。
アリコートを、Corning製T25組織培養フラスコ中に入
れ、この培養物を5%CO2、95%に過湿された空気中で、37
℃でインキュベートする。
【００９３】7.プレートから上記細胞を取り除くため、
および、細胞を分離させるために0.02%のトリプシン(Wo
rthington Biochemical Corp.)0.01%のEDTAを含有するC
a++およびMg++フリーのPBSを使用して、1:3の分割比
で、上記細胞を集密継代する。
および、細胞を分離させるために0.02%のトリプシン(Wo
rthington Biochemical Corp.)0.01%のEDTAを含有するC
a++およびMg++フリーのPBSを使用して、1:3の分割比
で、上記細胞を集密継代する。
【００９４】下記の方法で遺伝学的に処理された後、上
記細胞は、特定の被検体の処置に必要とされるまで、通
常は、液体窒素タンク中に保存される。ドナー細胞を準
備し得ることおよび必要になるまでそれを保存し得るこ
とは、重要な利点である。
記細胞は、特定の被検体の処置に必要とされるまで、通
常は、液体窒素タンク中に保存される。ドナー細胞を準
備し得ることおよび必要になるまでそれを保存し得るこ
とは、重要な利点である。
【００９５】その後、細胞は移植のため基質上に接種さ
れる。例えば、以下のように分離された内皮細胞が、Go
rtexTMの内面への接種に提供される。
れる。例えば、以下のように分離された内皮細胞が、Go
rtexTMの内面への接種に提供される。
【００９６】1.滅菌GortexTM材料を無菌FalconTM15cc円
錐ディスポーザブル試験管中に入れる。0.1M、pH9.3の
炭酸ナトリウム緩衝液および100μg/ml酸溶解I型コラー
ゲンから成るコーティング溶液を試験管に加える。一晩
4℃でのインキュベーションに引き続き、GortexTMを無
菌PBSでリンスする。I型コラーゲンは、最も効果的で急
速な内皮細胞接着(30分で75%が接着、そして1時間で80%
が接着)、および移動を提供するので、コーティングに
使用される。Madriら、「内皮下層の膠原性成分：構造
と機能の相関関係」Lab. Invest. 43:303-315(1980)を
参照せよ。
錐ディスポーザブル試験管中に入れる。0.1M、pH9.3の
炭酸ナトリウム緩衝液および100μg/ml酸溶解I型コラー
ゲンから成るコーティング溶液を試験管に加える。一晩
4℃でのインキュベーションに引き続き、GortexTMを無
菌PBSでリンスする。I型コラーゲンは、最も効果的で急
速な内皮細胞接着(30分で75%が接着、そして1時間で80%
が接着)、および移動を提供するので、コーティングに
使用される。Madriら、「内皮下層の膠原性成分：構造
と機能の相関関係」Lab. Invest. 43:303-315(1980)を
参照せよ。
【００９７】2.次いで、GortexTMチェービングを一方の
末端でクロスラビングし、内皮細胞を導入し、そして、
他の末端をクロスラビングする。
末端でクロスラビングし、内皮細胞を導入し、そして、
他の末端をクロスラビングする。
【００９８】3.次いでGortexTMのセグメントを無菌試験
管中に入れ、その試験管を培地で満たし、5%CO2、湿度9
5%、37℃で１時間、5rev/minで回転する。
管中に入れ、その試験管を培地で満たし、5%CO2、湿度9
5%、37℃で１時間、5rev/minで回転する。
【００９９】4.GortexTMのセグメントを試験管から取り
出し、そしてそれらを無菌媒地で洗浄する。
出し、そしてそれらを無菌媒地で洗浄する。
【０１００】5.GortexTMのセグメントを宿主の血管系に
移植する。
移植する。
【０１０１】Ｂ．補体を介する攻撃 を阻害する、C5b-9
不活性 化物質を用いる細胞および 被検体の処置 択一的に、C5b-9不活性化物質が、補体を介する攻撃を
阻害するために、細胞または被検体に対し溶液で投与さ
れ得る。被検体が血小板または内皮細胞の活性化を遮断
するような処置を要する場合の、インヒビター、すなわ
ち、単離された本来の生成するインヒビター、またはイ
ンヒビターを発現する(または、より好ましくは分泌す
る)遺伝学的に操作された細胞から生産される、機能ド
メインを表わし、C5b-9阻害作用を有するポリペプチド
の投与または発現は、C5b-9を介する凝固促進および血
栓促進応答から被検体をその方法により防御し得る。
不活性 化物質を用いる細胞および 被検体の処置 択一的に、C5b-9不活性化物質が、補体を介する攻撃を
阻害するために、細胞または被検体に対し溶液で投与さ
れ得る。被検体が血小板または内皮細胞の活性化を遮断
するような処置を要する場合の、インヒビター、すなわ
ち、単離された本来の生成するインヒビター、またはイ
ンヒビターを発現する(または、より好ましくは分泌す
る)遺伝学的に操作された細胞から生産される、機能ド
メインを表わし、C5b-9阻害作用を有するポリペプチド
の投与または発現は、C5b-9を介する凝固促進および血
栓促進応答から被検体をその方法により防御し得る。
【０１０２】後天性幹細胞障害の発作性ヘモグロビン尿
症被検体から採取された血小板は、静脈血栓の非常に高
い危険性により特徴づけられる、液相補体活性化にに対
する異常な感受性を示す。特に、上記インヒビターがそ
うして内皮細胞の表面に見出されたという発見を考える
と、同様の所見が、補体を介する障害の他のタイプにも
あてはまり得る。その結果、細胞から精製された、また
は組換え技術を使用して操作された細胞から発現され
た、または同様の無視できない活性を有するペプチド部
分である上記インヒビタータンパク質の投与は、これら
の被検体に障害の強度を緩和するために投与され得る。
症被検体から採取された血小板は、静脈血栓の非常に高
い危険性により特徴づけられる、液相補体活性化にに対
する異常な感受性を示す。特に、上記インヒビターがそ
うして内皮細胞の表面に見出されたという発見を考える
と、同様の所見が、補体を介する障害の他のタイプにも
あてはまり得る。その結果、細胞から精製された、また
は組換え技術を使用して操作された細胞から発現され
た、または同様の無視できない活性を有するペプチド部
分である上記インヒビタータンパク質の投与は、これら
の被検体に障害の強度を緩和するために投与され得る。
【０１０３】免疫障害、および免疫性血管炎、慢性関節
リウマチ、強皮症、汎発性血管内凝固症候群、狼瘡、発
作性ヘモグロビン尿症、血栓性血栓崩壊性紫斑病(throm
botic thrombolytic purpura)、血管閉塞、手術後の再
閉塞、冠動脈血栓症、および心筋梗塞のような疾病の被
検体の処置は、凝血促進過程を抑制する上記で定義した
C5b-9不活性化物質を含有する組成物の有効量を投与す
ることで達成される。
リウマチ、強皮症、汎発性血管内凝固症候群、狼瘡、発
作性ヘモグロビン尿症、血栓性血栓崩壊性紫斑病(throm
botic thrombolytic purpura)、血管閉塞、手術後の再
閉塞、冠動脈血栓症、および心筋梗塞のような疾病の被
検体の処置は、凝血促進過程を抑制する上記で定義した
C5b-9不活性化物質を含有する組成物の有効量を投与す
ることで達成される。
【０１０４】輸血された血球、骨髄由来あるいはそれに
含有し、移植に使用される始原造血幹細胞、または移植
された器官または組織の場合、C5b-9に対する精製され
た膜インヒビター、すなわち機能の等しい、ポリペプチ
ドまたは抗体がまず細胞表面上にコーティングされる、
すなわち受容体への移植または輸血前に上記の前駆細胞
に遺伝子が導入される。上記前駆細胞は、受容体とした
器官と同じ種から、または受容体の種のCD59をコードす
る遺伝子が、マイクロインジェクションのような当業者
に周知の技術を使用して胚中に導入された異種のトラン
スジェニック動物から導入され得る。このような処置を
要する被検体に投与されるべき組成物の量は、特定の障
害または疾病および苦痛の程度に依存して変化する。投
与量は、処置に対する反応、遺伝的変異性、および同時
に投与する薬剤に依存しても変化する。しかしながら、
一般的に、本明細書に開示された組成物は、ミリリット
ルあたりおよそ数ナノグラムの阻害タンパク質またはペ
プチドの用量、すなわち少なくとも1×103分子/細胞ま
たは1分子のCD59/μm2の濃度で表面発現の為に使用され
る遺伝子発現で、静脈中に投与される。処置は、組成物
の１回の投与形式を取り得、または、必要により、定期
的にまたは長期にわたり連続的に投与され得る。免疫障
害または疾病の処置には、C5b-9不活性化物質は、生理
食塩水または生理的に受容可能な緩衝液のような薬学的
に受容可能な担体中で、静脈内へ投与される。いくつか
の場合では、効果を最大にするため、遺伝学的に操作さ
れた細胞と共にCD59を投与することが有利であり得る。
含有し、移植に使用される始原造血幹細胞、または移植
された器官または組織の場合、C5b-9に対する精製され
た膜インヒビター、すなわち機能の等しい、ポリペプチ
ドまたは抗体がまず細胞表面上にコーティングされる、
すなわち受容体への移植または輸血前に上記の前駆細胞
に遺伝子が導入される。上記前駆細胞は、受容体とした
器官と同じ種から、または受容体の種のCD59をコードす
る遺伝子が、マイクロインジェクションのような当業者
に周知の技術を使用して胚中に導入された異種のトラン
スジェニック動物から導入され得る。このような処置を
要する被検体に投与されるべき組成物の量は、特定の障
害または疾病および苦痛の程度に依存して変化する。投
与量は、処置に対する反応、遺伝的変異性、および同時
に投与する薬剤に依存しても変化する。しかしながら、
一般的に、本明細書に開示された組成物は、ミリリット
ルあたりおよそ数ナノグラムの阻害タンパク質またはペ
プチドの用量、すなわち少なくとも1×103分子/細胞ま
たは1分子のCD59/μm2の濃度で表面発現の為に使用され
る遺伝子発現で、静脈中に投与される。処置は、組成物
の１回の投与形式を取り得、または、必要により、定期
的にまたは長期にわたり連続的に投与され得る。免疫障
害または疾病の処置には、C5b-9不活性化物質は、生理
食塩水または生理的に受容可能な緩衝液のような薬学的
に受容可能な担体中で、静脈内へ投与される。いくつか
の場合では、効果を最大にするため、遺伝学的に操作さ
れた細胞と共にCD59を投与することが有利であり得る。
【０１０５】単離された、C5b-9を阻害する適切な３次
構造を有する機能的に活性のポリペプチドは、止血効果
を増大しおよび血液および血小板の調製物のインビトロ
での保存時間を延長する効用を有する。インビトロで保
存される血小板の半減時間および治療効果を延長すると
いう大きな要望がある。血小板を含有する溶液、特に血
小板リッチ血漿(PRP)は、輸血に関する医学上の多大な
需要がある。現在の血小板調製物の貯蔵寿命は、約72時
間である。このような調製物の有用な寿命の増加は、本
技術分野の大きな進展を意味し、そして切迫したヒトお
よび医学上の要望に答える。
構造を有する機能的に活性のポリペプチドは、止血効果
を増大しおよび血液および血小板の調製物のインビトロ
での保存時間を延長する効用を有する。インビトロで保
存される血小板の半減時間および治療効果を延長すると
いう大きな要望がある。血小板を含有する溶液、特に血
小板リッチ血漿(PRP)は、輸血に関する医学上の多大な
需要がある。現在の血小板調製物の貯蔵寿命は、約72時
間である。このような調製物の有用な寿命の増加は、本
技術分野の大きな進展を意味し、そして切迫したヒトお
よび医学上の要望に答える。
【０１０６】移植のためのヒトの器官および組織の場
合、C5b-9不活性化物質は、インビトロでの保存の間、
進行する補体活性化から血管内層細胞を防御するため
に、潅流液または貯蔵培地に添加され得る。さらに、こ
れらの内皮細胞を、膜に固定されるC5b-9不活性化物質
でコーティングすること、または、以下に、より詳細に
記載するC5b-9不活性化物質を発現するために、その遺
伝子を細胞中に挿入することにより、器官または組織
は、移植により開始される補体活性化由来の細胞溶解お
よび血栓性の影響から防御され、それにより補体を介す
る急性拒絶反応を阻止する。
合、C5b-9不活性化物質は、インビトロでの保存の間、
進行する補体活性化から血管内層細胞を防御するため
に、潅流液または貯蔵培地に添加され得る。さらに、こ
れらの内皮細胞を、膜に固定されるC5b-9不活性化物質
でコーティングすること、または、以下に、より詳細に
記載するC5b-9不活性化物質を発現するために、その遺
伝子を細胞中に挿入することにより、器官または組織
は、移植により開始される補体活性化由来の細胞溶解お
よび血栓性の影響から防御され、それにより補体を介す
る急性拒絶反応を阻止する。
【０１０７】C5b-9不活性化物質が単独で投与される、
好適な実施態様では、C5b-9不活性化物質は、血小板中
またはPRP中の濃度が、ナノグラム程度の不活性化物質/
mlである、ACD、CPD、ヘパリン、またはシュウ酸塩のよ
うな抗凝固剤と共に投与されるか、または、少なくとも
1×103コのインヒビター/mlの濃度で発現する。同様
に、器官の保存の為に、上記C5b-9不活性化物は、濃度
がナノグラム程度の不活性化物/mlになるように、潅流
液または貯蔵溶液、または培地と共に投与される。
好適な実施態様では、C5b-9不活性化物質は、血小板中
またはPRP中の濃度が、ナノグラム程度の不活性化物質/
mlである、ACD、CPD、ヘパリン、またはシュウ酸塩のよ
うな抗凝固剤と共に投与されるか、または、少なくとも
1×103コのインヒビター/mlの濃度で発現する。同様
に、器官の保存の為に、上記C5b-9不活性化物は、濃度
がナノグラム程度の不活性化物/mlになるように、潅流
液または貯蔵溶液、または培地と共に投与される。
【０１０８】インビトロで貯蔵される血小板調製物の貯
蔵寿命を延長するのに有用な組成物は、C5b-9を介する
血小板活性化を阻害するのに十分な量のC5b-9インヒビ
ターを含有する。一般的に、これらの組成物は、調製物
中の阻害ポリペプチドの最終濃度が、溶液中で2Ki(Ki=
最大阻害の半分の濃度)の不活性化物質よりも大きい範
囲になるように、血小板リッチ血漿のような血小板調製
物に、添加される。CD59および膜結合ドメインを取り込
まれた他のポリペプチドについては、治療学的に有効な
用量は、1μg不活性化物/mlより少ないか、またはせい
ぜい1×103分子不活性化物／血小板または他の細胞、で
ある。有用な組成物は、さらにシュウ酸塩、クエン酸
塩、およびヘパリンのような付加的な抗凝血剤を含有し
得る。組成物を含有する上記C5b-9インヒビターは、採
集された全血、または血液からの血小板濃縮物を単離す
る処理後、それが血小板調製物に、添加され得る。
蔵寿命を延長するのに有用な組成物は、C5b-9を介する
血小板活性化を阻害するのに十分な量のC5b-9インヒビ
ターを含有する。一般的に、これらの組成物は、調製物
中の阻害ポリペプチドの最終濃度が、溶液中で2Ki(Ki=
最大阻害の半分の濃度)の不活性化物質よりも大きい範
囲になるように、血小板リッチ血漿のような血小板調製
物に、添加される。CD59および膜結合ドメインを取り込
まれた他のポリペプチドについては、治療学的に有効な
用量は、1μg不活性化物/mlより少ないか、またはせい
ぜい1×103分子不活性化物／血小板または他の細胞、で
ある。有用な組成物は、さらにシュウ酸塩、クエン酸
塩、およびヘパリンのような付加的な抗凝血剤を含有し
得る。組成物を含有する上記C5b-9インヒビターは、採
集された全血、または血液からの血小板濃縮物を単離す
る処理後、それが血小板調製物に、添加され得る。
【０１０９】上記タンパク質に関するmRNA転写物のレベ
ルを増大することにより原形質膜でのこれらの補体イン
ヒビターの表面濃度を増加することで、注入または組織
器官移植後上記細胞は、活性化された補体C5b-9から、
防御される。
ルを増大することにより原形質膜でのこれらの補体イン
ヒビターの表面濃度を増加することで、注入または組織
器官移植後上記細胞は、活性化された補体C5b-9から、
防御される。
【０１１０】IV．細胞終末 上記の操作された細胞が、補体系による攻撃を阻止し、
ならびにＴ細胞系を回避することから、上記細胞および
それらの後代は、理論上、本質的に無期限に、宿主生体
内で存在し得る。上記宿主から、これらの細胞を除去す
ることが所望される場合も起こり得るので、さらに遺伝
子工学技術が好ましく実施され、上記細胞に、内的な
「自己破壊」または「自殺」機構が与えられる。
ならびにＴ細胞系を回避することから、上記細胞および
それらの後代は、理論上、本質的に無期限に、宿主生体
内で存在し得る。上記宿主から、これらの細胞を除去す
ることが所望される場合も起こり得るので、さらに遺伝
子工学技術が好ましく実施され、上記細胞に、内的な
「自己破壊」または「自殺」機構が与えられる。
【０１１１】一般的用語として、このような機構は、細
胞環境下に通常では存在しない試薬に対して、該細胞の
致死感受性を付与する、一般には酵素である、タンパク
質を発現させる遺伝子を該細胞内に含有すること、を伴
なう。例えば、細菌のシトシンデアミナーゼ(CyD)は無
毒の薬剤5-フルオロシトシンを5-フルオロウラシルに変
換し、これは次いで細胞内で、5-フルオロウリジン-5'-
トリホスフェートおよび5-フルオロ-2'ーデオキシウリジ
ン-5'-モノホスフェートに変換される。これらは、RNA
およびDNAいずれの合成も阻害し、その結果、細胞死を
引き起こす。このことは、Mullinら、1992年、Proc. Na
tl. Aca d. Sci. USA 89:33-37に、「細菌のシトシンデ
アミナーゼ遺伝子の哺乳動物細胞への転移は5-フルオロ
シトシンに対する致死感受性を付与する：負の選抜シス
テム」として報告されている。
胞環境下に通常では存在しない試薬に対して、該細胞の
致死感受性を付与する、一般には酵素である、タンパク
質を発現させる遺伝子を該細胞内に含有すること、を伴
なう。例えば、細菌のシトシンデアミナーゼ(CyD)は無
毒の薬剤5-フルオロシトシンを5-フルオロウラシルに変
換し、これは次いで細胞内で、5-フルオロウリジン-5'-
トリホスフェートおよび5-フルオロ-2'ーデオキシウリジ
ン-5'-モノホスフェートに変換される。これらは、RNA
およびDNAいずれの合成も阻害し、その結果、細胞死を
引き起こす。このことは、Mullinら、1992年、Proc. Na
tl. Aca d. Sci. USA 89:33-37に、「細菌のシトシンデ
アミナーゼ遺伝子の哺乳動物細胞への転移は5-フルオロ
シトシンに対する致死感受性を付与する：負の選抜シス
テム」として報告されている。
【０１１２】従って、ドナー内皮細胞のゲノムに細菌の
CyD遺伝子を挿入することにより、宿主組織に、5-フル
オロシトシンを単に投与するだけで、任意の所望される
時に、細胞死が、果たされ得る。細菌のCyD遺伝子の配
列は公知であり、従って、ドナー内皮細胞内への上記遺
伝子の組み込みは、上記CD59遺伝子を挿入するのに使用
されたのと同様の手法で、予め形成され得る。
CyD遺伝子を挿入することにより、宿主組織に、5-フル
オロシトシンを単に投与するだけで、任意の所望される
時に、細胞死が、果たされ得る。細菌のCyD遺伝子の配
列は公知であり、従って、ドナー内皮細胞内への上記遺
伝子の組み込みは、上記CD59遺伝子を挿入するのに使用
されたのと同様の手法で、予め形成され得る。
【０１１３】現在知られているか、または、続いて同定
される、その他の遺伝子であって、選択された物質に対
して致死感受性を付与する遺伝子もまた、本目的のため
に、使用され得る。
される、その他の遺伝子であって、選択された物質に対
して致死感受性を付与する遺伝子もまた、本目的のため
に、使用され得る。
【０１１４】Ｖ．臨床的適用 以上で論じたように、上記操作された細胞は、細胞置換
または薬剤投与に使用し得る。
または薬剤投与に使用し得る。
【０１１５】冠動脈疾患の療法 例えば、冠動脈疾患は、心臓への酸素および養分の送達
を減少させる、血管内側の遮断により発生する。冠動脈
遮断に対する現行の療法は、血管形成術上のバルーンを
用いて遮断された血管を内側から機械的に広げること、
もしくは、バイパスで置き換えるかまたは上記遮断の周
囲に新たな通路を形成するために、合成の移植片、また
は伏在静脈の断片、のような代用管を使用すること、の
いずれかである。
を減少させる、血管内側の遮断により発生する。冠動脈
遮断に対する現行の療法は、血管形成術上のバルーンを
用いて遮断された血管を内側から機械的に広げること、
もしくは、バイパスで置き換えるかまたは上記遮断の周
囲に新たな通路を形成するために、合成の移植片、また
は伏在静脈の断片、のような代用管を使用すること、の
いずれかである。
【０１１６】冠動脈の血管形成術は、脚の血管から冠動
脈までの、カテーテルの挿入、および、アテローム性動
脈硬化の斑を広げるための、上記カテーテルの先端での
バルーンの膨張を包含する。このバルーン膨張は残念な
がら、血管の内層から内皮細胞を剥離するという、望ま
れていない副作用を有する。
脈までの、カテーテルの挿入、および、アテローム性動
脈硬化の斑を広げるための、上記カテーテルの先端での
バルーンの膨張を包含する。このバルーン膨張は残念な
がら、血管の内層から内皮細胞を剥離するという、望ま
れていない副作用を有する。
【０１１７】臨床上の実施に関しては、血管形成術後の
処置した管の再閉塞、いわゆる再狭窄は、それが上記処
置が実施されたうちの30〜50％に６カ月以内に生じ、そ
して実際の被検体の罹病率およびヘルスケアのための支
出に関連することから、重要な医学上の問題である。上
記再狭窄の根本原因は、内皮細胞によって供給される抗
血栓性の表層の欠如に基づく急性の血栓の形成、ならび
に血行性細胞による、抑制されていない平滑筋細胞の刺
激に基づく、およびさらに、上記防御内皮細胞層の欠如
に基づく、新生内膜の形成、にある。
処置した管の再閉塞、いわゆる再狭窄は、それが上記処
置が実施されたうちの30〜50％に６カ月以内に生じ、そ
して実際の被検体の罹病率およびヘルスケアのための支
出に関連することから、重要な医学上の問題である。上
記再狭窄の根本原因は、内皮細胞によって供給される抗
血栓性の表層の欠如に基づく急性の血栓の形成、ならび
に血行性細胞による、抑制されていない平滑筋細胞の刺
激に基づく、およびさらに、上記防御内皮細胞層の欠如
に基づく、新生内膜の形成、にある。
【０１１８】心筋の残余を供給する、遮断された血管周
囲の血流を迂回させるため、代わりのバイパスを使用す
る、冠動脈のバイパス移植片外科手術は、冠動脈内の血
流の遮断物の除去を伴わない。伏在静脈の一部が上記バ
イパスを形成するのに使用される場合、内層の内皮細胞
は通常、管壁からはぎ取られ、そして血管壁の平滑筋細
胞が損傷する。
囲の血流を迂回させるため、代わりのバイパスを使用す
る、冠動脈のバイパス移植片外科手術は、冠動脈内の血
流の遮断物の除去を伴わない。伏在静脈の一部が上記バ
イパスを形成するのに使用される場合、内層の内皮細胞
は通常、管壁からはぎ取られ、そして血管壁の平滑筋細
胞が損傷する。
【０１１９】内皮層の欠如は、血液凝固阻止表面の欠
如、重要な平滑筋細胞調節力の欠如および血小板、単球
およびリンパ球から平滑筋細胞を保護する防御管壁の被
覆の欠如、を包含する、種々の重大な内皮の性質の欠如
を引き起こす。上記血管のこの治療上の損傷に続く応答
は、二つの部分からなる：１)管腔を完全に修復するた
めの、損傷部の端からの内皮細胞の生理学的かつ有益な
移動、そして２)上記新生内膜の形成および関与後の閉
塞を引き起こす、血管壁の内部から管腔への平滑筋細胞
の病態生理学的な移動、である。
如、重要な平滑筋細胞調節力の欠如および血小板、単球
およびリンパ球から平滑筋細胞を保護する防御管壁の被
覆の欠如、を包含する、種々の重大な内皮の性質の欠如
を引き起こす。上記血管のこの治療上の損傷に続く応答
は、二つの部分からなる：１)管腔を完全に修復するた
めの、損傷部の端からの内皮細胞の生理学的かつ有益な
移動、そして２)上記新生内膜の形成および関与後の閉
塞を引き起こす、血管壁の内部から管腔への平滑筋細胞
の病態生理学的な移動、である。
【０１２０】末梢の動脈および冠動脈バイパス移植片の
閉塞は、頻繁かつ重大な臨床的所見である。伏在静脈の
冠動脈バイパス移植片の３分の２は、深刻に病んでいる
か、またはバイパス外科手術後６から７年後までに完全
に閉塞するかのいずれかである。末梢の動脈のバイパス
移植片は、一般的に２から５年以内に、閉塞を起こす。
閉塞は、頻繁かつ重大な臨床的所見である。伏在静脈の
冠動脈バイパス移植片の３分の２は、深刻に病んでいる
か、またはバイパス外科手術後６から７年後までに完全
に閉塞するかのいずれかである。末梢の動脈のバイパス
移植片は、一般的に２から５年以内に、閉塞を起こす。
【０１２１】合成移植片もまた、高率の閉塞が表れる。
初めのうちは、このようなタイプの移植片は内皮生成が
されない。このことにより、血栓に基づく早期閉塞が実
際に発生する。時が経つにつれ、上記移植片は、近位お
よび遠位の吻合部からの内皮細胞、または多孔性の合成
移植片を通って管腔表面上に、内殖する毛状内皮細胞か
らの移動により、部分的に再内皮生成する。しかしなが
ら、内皮細胞移動のプロセスは通常は遅く、動脈内皮細
胞による上記移植片の全被覆は、可能ではない。さら
に、内殖する毛状内皮細胞は、血餅形成を阻害する能力
は、動脈の内皮細胞よりも低い。自己由来の内皮細胞と
ともに周辺の移植片を再移植させる試みは、移植期の移
植片の不完全な被覆が移植片閉塞を招く結果となるこ
と、そして移植手法の臨床的利点の欠如を立証してい
る。
初めのうちは、このようなタイプの移植片は内皮生成が
されない。このことにより、血栓に基づく早期閉塞が実
際に発生する。時が経つにつれ、上記移植片は、近位お
よび遠位の吻合部からの内皮細胞、または多孔性の合成
移植片を通って管腔表面上に、内殖する毛状内皮細胞か
らの移動により、部分的に再内皮生成する。しかしなが
ら、内皮細胞移動のプロセスは通常は遅く、動脈内皮細
胞による上記移植片の全被覆は、可能ではない。さら
に、内殖する毛状内皮細胞は、血餅形成を阻害する能力
は、動脈の内皮細胞よりも低い。自己由来の内皮細胞と
ともに周辺の移植片を再移植させる試みは、移植期の移
植片の不完全な被覆が移植片閉塞を招く結果となるこ
と、そして移植手法の臨床的利点の欠如を立証してい
る。
【０１２２】本明細書に記載の遺伝学的に操作された細
胞は、再血管新生上のこれらの臨床的問題に取り組むた
めの重要な機構を提供する。これらの細胞は、被検体の
免疫系による重大な拒絶を受けないで、露出した管また
は移植片が再内皮生成するのに使用され得る。さらに、
上記細胞は、外科手術の操作前に多数に増殖し得るの
で、露出した管またはむき出しの移植片の広範囲の被覆
のための、充分な供給量が入手できる。これに関連し
て、さらに内皮細胞に関した遺伝子工学技術が、同時係
属出願第07/820,011号、1992年１月６日提出、名称「増
強された移動およびプラスミノーゲン活性化因子活性を
示す遺伝学的に操作された内皮細胞」(この中の教示は
本文中に組み入れられてる)に従い、ドナー内皮細胞の
移動の比率が増大するよう、そしてより急速に再内皮生
成が達成されるように、実施され得る。
胞は、再血管新生上のこれらの臨床的問題に取り組むた
めの重要な機構を提供する。これらの細胞は、被検体の
免疫系による重大な拒絶を受けないで、露出した管また
は移植片が再内皮生成するのに使用され得る。さらに、
上記細胞は、外科手術の操作前に多数に増殖し得るの
で、露出した管またはむき出しの移植片の広範囲の被覆
のための、充分な供給量が入手できる。これに関連し
て、さらに内皮細胞に関した遺伝子工学技術が、同時係
属出願第07/820,011号、1992年１月６日提出、名称「増
強された移動およびプラスミノーゲン活性化因子活性を
示す遺伝学的に操作された内皮細胞」(この中の教示は
本文中に組み入れられてる)に従い、ドナー内皮細胞の
移動の比率が増大するよう、そしてより急速に再内皮生
成が達成されるように、実施され得る。
【０１２３】被検体の冠動脈内に万能ドナー内皮細胞を
移植する、典型的操作は、以下の通りである： １．血管形成術、アテレクトミー(atherectomy)、レー
ザー療法、または機械的な他の型の再血管新生術によ
る、冠(または周辺の)動脈疾患の重篤度、位置および影
響度を決定するために、被検体へ診断的にカテーテルの
挿入を実施すること。
移植する、典型的操作は、以下の通りである： １．血管形成術、アテレクトミー(atherectomy)、レー
ザー療法、または機械的な他の型の再血管新生術によ
る、冠(または周辺の)動脈疾患の重篤度、位置および影
響度を決定するために、被検体へ診断的にカテーテルの
挿入を実施すること。
【０１２４】２．工程(１)により、治療学上の血管形成
術が適切であると測定されたときには、通常のバルーン
血管形成術操作を実施すること。
術が適切であると測定されたときには、通常のバルーン
血管形成術操作を実施すること。
【０１２５】３．液体窒素保存から、本明細書中に記載
の遺伝学的に操作された内皮細胞を取り出し、３７℃で
上記細胞を解凍し、そして滅菌した緩衝培地中へ懸濁す
ることにより、血管形成術操作のための装置にそれらを
供する準備を行なうこと。
の遺伝学的に操作された内皮細胞を取り出し、３７℃で
上記細胞を解凍し、そして滅菌した緩衝培地中へ懸濁す
ることにより、血管形成術操作のための装置にそれらを
供する準備を行なうこと。
【０１２６】４．一般的なワイヤー交換方法を用い、バ
ルーン血管形成カテーテルを除き、二つのバルーン間に
置かれた脱出ポートを有する二つのバルーンカテーテル
を上記カテーテルと置き換えること。
ルーン血管形成カテーテルを除き、二つのバルーン間に
置かれた脱出ポートを有する二つのバルーンカテーテル
を上記カテーテルと置き換えること。
【０１２７】５．上記露出した動脈セグメント、すなわ
ち、血管形成操作により内皮層が除去された動脈の部分
を跨ぐ上記二つのバルーンカテーテルを用いて、上記二
つのバルーンカテーテル先端を血管形成術を施された冠
動脈内に配置すること。
ち、血管形成操作により内皮層が除去された動脈の部分
を跨ぐ上記二つのバルーンカテーテルを用いて、上記二
つのバルーンカテーテル先端を血管形成術を施された冠
動脈内に配置すること。
【０１２８】６．標準的な環流技術で、遠位の冠動脈循
環を支持する間の上記二つのバルーンを緩やかに膨張さ
せること。
環を支持する間の上記二つのバルーンを緩やかに膨張さ
せること。
【０１２９】７．上記遺伝学的に操作された細胞を、上
記二つのバルーンカテーテルの体外末端へ導入するこ
と、そして、血管の露出した部分に接種するため、上記
二つのバルーン間の血管の隔離された領域へ、例えば、
溶液10ミリリットルあたり２〜10×106細胞数濃度で、
上記細胞を注入すること。
記二つのバルーンカテーテルの体外末端へ導入するこ
と、そして、血管の露出した部分に接種するため、上記
二つのバルーン間の血管の隔離された領域へ、例えば、
溶液10ミリリットルあたり２〜10×106細胞数濃度で、
上記細胞を注入すること。
【０１３０】８．およそ20から30分後に、上記二つのバ
ルーンカテーテルを収縮させて、正常なアンテグレード
(antegrade)冠動脈環流を復帰させること。
ルーンカテーテルを収縮させて、正常なアンテグレード
(antegrade)冠動脈環流を復帰させること。
【０１３１】９．上記二つのバルーンカテーテルを除去
し、そして標準的なカテーテル挿入後処理を行なうこ
と。
し、そして標準的なカテーテル挿入後処理を行なうこ
と。
【０１３２】同様に、合成または自己由来の、血管移植
片またはステントは、遺伝学的に操作された内皮細胞で
被覆され得、そして以下の操作により被検体に移植され
得る： １．自己由来、合成、または他の移植材料を用いて、血
管バイパス外科手術による冠(または周辺の)動脈疾患の
重篤度、位置および影響度を決定するために、被検体へ
診断学的カテーテル挿入を実施すること。
片またはステントは、遺伝学的に操作された内皮細胞で
被覆され得、そして以下の操作により被検体に移植され
得る： １．自己由来、合成、または他の移植材料を用いて、血
管バイパス外科手術による冠(または周辺の)動脈疾患の
重篤度、位置および影響度を決定するために、被検体へ
診断学的カテーテル挿入を実施すること。
【０１３３】２．合成の移植片またはステント、例えば
DACRONまたはステンレススチール製の、移植片またはス
テントの場合には、上記移植片またはステントを、pH9.
4炭酸緩衝液中25mg/ml以上の飽和量の、Ｉ型コラーゲン
およびフィブロネクチンにより被覆すること；あるいは
自己由来の移植片の場合には、従来の外科的技術を使用
し、伏在静脈または他の管を採取すること。
DACRONまたはステンレススチール製の、移植片またはス
テントの場合には、上記移植片またはステントを、pH9.
4炭酸緩衝液中25mg/ml以上の飽和量の、Ｉ型コラーゲン
およびフィブロネクチンにより被覆すること；あるいは
自己由来の移植片の場合には、従来の外科的技術を使用
し、伏在静脈または他の管を採取すること。
【０１３４】３．上記合成または伏在静脈の移植片の近
位末端にカニューレを挿入し、そして遠位末端を結紮す
ること。
位末端にカニューレを挿入し、そして遠位末端を結紮す
ること。
【０１３５】４．液体窒素保存から、上記遺伝学的に操
作された内皮細胞を取り出し、３７℃でそれらを解凍
し、そして滅菌した緩衝培地中へ懸濁することによる、
移植片移植に供するためにそれらを準備すること。
作された内皮細胞を取り出し、３７℃でそれらを解凍
し、そして滅菌した緩衝培地中へ懸濁することによる、
移植片移植に供するためにそれらを準備すること。
【０１３６】５．例えば、溶液10ミリリットルあたり２
〜10×106細胞数濃度で、上記操作された細胞を、近位
のカニューレ挿入口から上記移植片管腔内へ注入するこ
と、およびおよそ60分間、上記移植片を回転させて、上
記万能ドナー細胞により上記移植片の表面を被覆させる
こと。
〜10×106細胞数濃度で、上記操作された細胞を、近位
のカニューレ挿入口から上記移植片管腔内へ注入するこ
と、およびおよそ60分間、上記移植片を回転させて、上
記万能ドナー細胞により上記移植片の表面を被覆させる
こと。
【０１３７】６．一般的な繊細な外科技術を使用し、上
記接種された移植片を、冠動脈または周囲の動脈へ移植
すること。
記接種された移植片を、冠動脈または周囲の動脈へ移植
すること。
【０１３８】細胞置換のためのそれらの使用に加えて、
遺伝学的に操作されたこの内皮細胞は、細胞移植部位へ
の局部的または全身のいずれについても、治療薬剤の投
与のための優れた機構を提供する。これらの細胞はさら
に、管または移植片壁の再狭窄を阻害するように、PDGF
またはFGFの、アンタゴニスト、血栓溶解剤、またはト
ロンビンアンタゴニストも分泌し得る。万能ドナー内皮
細胞を介する全身系の薬剤送達は、容量に比べて相対的
に広い表面積を有することを包含する幾多の利点を示す
遺伝学的に操作された微細血管の(毛細血管の)内皮細胞
の使用により、特に、以下に記載されるような、上記細
胞が毛細血管網へ接種される時、および拡散の妨げが何
もない治療学的なタンパク質産物の直接分泌時に、さら
に効果的に完成され得る。本方法により投与され得る薬
剤タイプの例には、血液凝固因子群、凝固溶解因子群、
ホルモン類、成長因子群、サイトカイン類、酵素類、お
よびコレステロール結合または除去タンパク質が包含さ
れる。いずれの場合も、移植の前に、適切な遺伝子また
は遺伝子の組合せが、上記ドナー内皮細胞のゲノム内
に、挿入される。
遺伝学的に操作されたこの内皮細胞は、細胞移植部位へ
の局部的または全身のいずれについても、治療薬剤の投
与のための優れた機構を提供する。これらの細胞はさら
に、管または移植片壁の再狭窄を阻害するように、PDGF
またはFGFの、アンタゴニスト、血栓溶解剤、またはト
ロンビンアンタゴニストも分泌し得る。万能ドナー内皮
細胞を介する全身系の薬剤送達は、容量に比べて相対的
に広い表面積を有することを包含する幾多の利点を示す
遺伝学的に操作された微細血管の(毛細血管の)内皮細胞
の使用により、特に、以下に記載されるような、上記細
胞が毛細血管網へ接種される時、および拡散の妨げが何
もない治療学的なタンパク質産物の直接分泌時に、さら
に効果的に完成され得る。本方法により投与され得る薬
剤タイプの例には、血液凝固因子群、凝固溶解因子群、
ホルモン類、成長因子群、サイトカイン類、酵素類、お
よびコレステロール結合または除去タンパク質が包含さ
れる。いずれの場合も、移植の前に、適切な遺伝子また
は遺伝子の組合せが、上記ドナー内皮細胞のゲノム内
に、挿入される。
【０１３９】例えば、ブタ起源の、このタイプの細胞の
単離の典型的操作は以下の通りである： １．無菌的に雄のブタからまず取り出した副睾丸脂肪褥
および/または腎臓からブタ微細血管内皮細胞(PMEC)を
単離する。これを行うために、上記器官または組織を、
140mM NaCl、10mM HEPES、10mM KCl、0.1mM CaCl2、0.2
mM MgCl2、11g/l NaHCO3、5.0g/l グルコース、100U/ml
ペニシリン、および100U/ml ストレプトマイシンを含有
する滅菌HEPES緩衝液(pH7.4)中に入れる。腎臓について
は、腎周囲の脂肪を切除し、そして腎臓を上記の滅菌HE
PES緩衝液に入れる。
単離の典型的操作は以下の通りである： １．無菌的に雄のブタからまず取り出した副睾丸脂肪褥
および/または腎臓からブタ微細血管内皮細胞(PMEC)を
単離する。これを行うために、上記器官または組織を、
140mM NaCl、10mM HEPES、10mM KCl、0.1mM CaCl2、0.2
mM MgCl2、11g/l NaHCO3、5.0g/l グルコース、100U/ml
ペニシリン、および100U/ml ストレプトマイシンを含有
する滅菌HEPES緩衝液(pH7.4)中に入れる。腎臓について
は、腎周囲の脂肪を切除し、そして腎臓を上記の滅菌HE
PES緩衝液に入れる。
【０１４０】２．大きくて目に見える血管は、副睾丸脂
肪から切除し、そしてその脂肪は、滅菌HEPES緩衝液に
入れる。上記脂肪組織は、少量の滅菌HEPES緩衝液を含
有する50mlの滅菌のFalcon製「ブルーマックス」チュー
ブに入れ、そしてその脂肪を、３から５分間、はさみで
細かく切り刻む。
肪から切除し、そしてその脂肪は、滅菌HEPES緩衝液に
入れる。上記脂肪組織は、少量の滅菌HEPES緩衝液を含
有する50mlの滅菌のFalcon製「ブルーマックス」チュー
ブに入れ、そしてその脂肪を、３から５分間、はさみで
細かく切り刻む。
【０１４１】３．細かく切り刻まれた組織は、５mg/ml
のコラゲナーゼおよび５mg/mlのウシ血清アルブミン(BS
A)を含有する滅菌HEPES緩衝液を、同量ずつ含有する複
数の50ml三角フラスコに入れる。上記フラスコを、20分
間、撹拌しながら37℃でインキュベートする。その後、
各フラスコから、20分毎に少量の部分標本(0.1ml)を取
り出し、次いで、毛細血管床のチューブ状の断片の出現
を確かめる。上記インキュベーションは、細かく切り刻
まれた組織の大部分がチューブ状の断片および単独の細
胞を含むようになるまで続ける。
のコラゲナーゼおよび５mg/mlのウシ血清アルブミン(BS
A)を含有する滅菌HEPES緩衝液を、同量ずつ含有する複
数の50ml三角フラスコに入れる。上記フラスコを、20分
間、撹拌しながら37℃でインキュベートする。その後、
各フラスコから、20分毎に少量の部分標本(0.1ml)を取
り出し、次いで、毛細血管床のチューブ状の断片の出現
を確かめる。上記インキュベーションは、細かく切り刻
まれた組織の大部分がチューブ状の断片および単独の細
胞を含むようになるまで続ける。
【０１４２】４．上記細胞懸濁液は、15mlコニカルチュ
ーブ中で７分間、200×gで遠心分離する。そして最上部
白色脂肪層は、吸引除去し、そしてペレットは、10％BS
Aを含有するHEPES緩衝液に再溶解し、次いで再遠心分
離、再溶解をさらに２回行なう。
ーブ中で７分間、200×gで遠心分離する。そして最上部
白色脂肪層は、吸引除去し、そしてペレットは、10％BS
Aを含有するHEPES緩衝液に再溶解し、次いで再遠心分
離、再溶解をさらに２回行なう。
【０１４３】５．最終のペレットは、45％パーコールに
再溶解し、SS34固定アングルローター中で４℃、20分
間、15,000×gで遠心分離する。上記PMECの塊は、最上
部の最も含脂肪細胞を含有する層の真下であり、より大
きな管断片を含有する半透明層の上の、乳状のオフホワ
イト色層に存在する。上記微細血管の塊および遊離の内
皮細胞は、滅菌ピペットで収集し、次いでHEPES-BSA中
で、３分間、200×gの遠心分離によりペレットにする。
上記塊は、培地(20％熱失活FBS、ペニシリン、ストレプ
トマイシン、５mM HEPES、５mM ピルビン酸塩、および
５mMグルタミンを含有する、199E培地と、10％FBSを含
有する同様の培地とを１：１で混合し、密集した内皮細
胞培養物のインキュベートにより48時間調製した培地)
に再懸濁する。
再溶解し、SS34固定アングルローター中で４℃、20分
間、15,000×gで遠心分離する。上記PMECの塊は、最上
部の最も含脂肪細胞を含有する層の真下であり、より大
きな管断片を含有する半透明層の上の、乳状のオフホワ
イト色層に存在する。上記微細血管の塊および遊離の内
皮細胞は、滅菌ピペットで収集し、次いでHEPES-BSA中
で、３分間、200×gの遠心分離によりペレットにする。
上記塊は、培地(20％熱失活FBS、ペニシリン、ストレプ
トマイシン、５mM HEPES、５mM ピルビン酸塩、および
５mMグルタミンを含有する、199E培地と、10％FBSを含
有する同様の培地とを１：１で混合し、密集した内皮細
胞培養物のインキュベートにより48時間調製した培地)
に再懸濁する。
【０１４４】６．次いで上記細胞を、1.5％ゼラチンを
含むPBSで一晩被覆した組織培養フラスコに接種する。
含むPBSで一晩被覆した組織培養フラスコに接種する。
【０１４５】７．次いで上記PMEC培養物を、37℃で５％
CO2、95％に過湿された空気でインキュベートする。上
記PMECは、定期的に、プレートから細胞を取り除くた
め、および細胞凝集を分離させるために0.02％トリプシ
ン、EDTAを含むCa2+、Mg2+フリーのPBSを使用して、集
密継代する。
CO2、95％に過湿された空気でインキュベートする。上
記PMECは、定期的に、プレートから細胞を取り除くた
め、および細胞凝集を分離させるために0.02％トリプシ
ン、EDTAを含むCa2+、Mg2+フリーのPBSを使用して、集
密継代する。
【０１４６】８．トランスフェクション/感染に供する
細胞を、１から４の分割比で、1.5％ゼラチンを含むリ
ン酸塩緩衝化生理食塩水で一晩被覆した75mlCorning製
組織培養フラスコ上にプレーティングする。一晩培養
後、上記細胞を、CD59について、上に記載したように、
トランスフェクション/感染させる。
細胞を、１から４の分割比で、1.5％ゼラチンを含むリ
ン酸塩緩衝化生理食塩水で一晩被覆した75mlCorning製
組織培養フラスコ上にプレーティングする。一晩培養
後、上記細胞を、CD59について、上に記載したように、
トランスフェクション/感染させる。
【０１４７】９．上記遺伝学的に操作された内皮細胞
は、必要になるまで液体窒素中で凍結および保存でき
る。
は、必要になるまで液体窒素中で凍結および保存でき
る。
【０１４８】10．上記遺伝学的に操作された細胞を細胞
ネットワークに接種するため、その操作された細胞を、
まず、中和した酸溶解Ｉ型コラーゲン(子ウシ真皮から
単離された)の５mg/ml溶液に、４℃で、コラーゲン溶液
１mlあたり3.0×106の濃度に分散させる。この混合物を
24ウェル集合ディッシュに各ウェル0.75mlずつプレーテ
ィングし、そして37℃、5％CO2、95％に過湿された空気
条件のインキュベーター内に入れる。上記コラーゲンの
ゲル化に続いて、培地をそのゲルに導入する。上記細胞
を次いで上記のように培養し、上記細胞に毎日、再給餌
する。３日後、上記ゲルをディッシュから、滅菌テフロ
ンTM細胞スクレーパーを使用してかきとり、そしてBell
coTM４リットル浮遊培養管に１週間移しておき、そして
必要になるまで液体窒素中で凍結および保存する。
ネットワークに接種するため、その操作された細胞を、
まず、中和した酸溶解Ｉ型コラーゲン(子ウシ真皮から
単離された)の５mg/ml溶液に、４℃で、コラーゲン溶液
１mlあたり3.0×106の濃度に分散させる。この混合物を
24ウェル集合ディッシュに各ウェル0.75mlずつプレーテ
ィングし、そして37℃、5％CO2、95％に過湿された空気
条件のインキュベーター内に入れる。上記コラーゲンの
ゲル化に続いて、培地をそのゲルに導入する。上記細胞
を次いで上記のように培養し、上記細胞に毎日、再給餌
する。３日後、上記ゲルをディッシュから、滅菌テフロ
ンTM細胞スクレーパーを使用してかきとり、そしてBell
coTM４リットル浮遊培養管に１週間移しておき、そして
必要になるまで液体窒素中で凍結および保存する。
【０１４９】それらの、宿主免疫系に対する多重レベル
の防御により、上記操作された内皮細胞は、通常の非自
己由来細胞移植に関連する移植片拒絶を防ぎ、したがっ
て、例えば上記で説明したタイプの自己破壊により宿主
から除去されるまでの、実質的な期間に、それらにコー
ドされる治療学的な薬剤の投与に使用され得る。
の防御により、上記操作された内皮細胞は、通常の非自
己由来細胞移植に関連する移植片拒絶を防ぎ、したがっ
て、例えば上記で説明したタイプの自己破壊により宿主
から除去されるまでの、実質的な期間に、それらにコー
ドされる治療学的な薬剤の投与に使用され得る。
【０１５０】本発明を、以下のこれで限定するものでは
ない実施例により、さらに詳細に説明する。
ない実施例により、さらに詳細に説明する。
【０１５１】
（実施例１）ヒト補体阻害タンパク質、特にヒトCD59ま
たは機能的に同等のポリペプチド、の哺乳動物細胞での
発現方法。
たは機能的に同等のポリペプチド、の哺乳動物細胞での
発現方法。
【０１５２】特にCD59を引用して記載するが、これらの
方法は、等しく、CD55およびCD46に適用可能である。
方法は、等しく、CD55およびCD46に適用可能である。
【０１５３】材料：ヒト補体タンパク質C5b6、C7、C8お
よびC9を精製し、WiedmerおよびSims、J. Biol.Chem. 2
60、8014-8019(1985)に記載の方法に従って、機能的活
性を解析した。補体タンパク質C8(C*D)ならびにヒト補
体タンパク質C8およびC9のヒト血清の欠失は、Sims,P.
J.、Biochemistry 23,3248-3260(1984)、およびCheng,
K.ら、J.Immunol . 135,459-464(1985)、に従って調製お
よびアッセイした。メトトレキセートは、Lederle Labo
ratories(Carolina、Puerto Rico)から購入した。BCECF
/AMは、Molecular Probes(Eugene、OR)から購入した。N
-グリカナーゼは、Genzyme(Cambridge、MA)から購入し
た。他の全ての化学物質は、試薬または分析グレードで
ある。
よびC9を精製し、WiedmerおよびSims、J. Biol.Chem. 2
60、8014-8019(1985)に記載の方法に従って、機能的活
性を解析した。補体タンパク質C8(C*D)ならびにヒト補
体タンパク質C8およびC9のヒト血清の欠失は、Sims,P.
J.、Biochemistry 23,3248-3260(1984)、およびCheng,
K.ら、J.Immunol . 135,459-464(1985)、に従って調製お
よびアッセイした。メトトレキセートは、Lederle Labo
ratories(Carolina、Puerto Rico)から購入した。BCECF
/AMは、Molecular Probes(Eugene、OR)から購入した。N
-グリカナーゼは、Genzyme(Cambridge、MA)から購入し
た。他の全ての化学物質は、試薬または分析グレードで
ある。
【０１５４】溶液：ハンクスの平衡塩類溶液(HBSS)は、
Whittaker M.A. Bioproducts(Walkersville、MD)から購
入し、そして１％(w/v)の脂肪酸フリーウシ血清アルブ
ミン(Sigma製)溶液を作成した。
Whittaker M.A. Bioproducts(Walkersville、MD)から購
入し、そして１％(w/v)の脂肪酸フリーウシ血清アルブ
ミン(Sigma製)溶液を作成した。
【０１５５】抗体：CD59に対するモノクローナル抗体を
Dr.Motowo Tomita(昭和大学、東京)から入手した。ヒト
赤血球CD59に対する単一特異性ウサギ抗体のFabフラグ
メントは、Sims, P.J.、Rollins, S.A.、およびWiedme
r, T.(1989)が記載したように調製した。CHO膜に反応す
るウサギ血清は、培養CHO細胞由来の細胞膜を繰り返し
注入することにより調製し、そしてそのIgG画分(抗CHO)
は、プロテインＡ−セファロース(Sigma製)を使用した
アフィニティー精製により調製した。ウサギ抗ヒト赤血
球は、Cappel(Cochranville、PA)から購入した。
Dr.Motowo Tomita(昭和大学、東京)から入手した。ヒト
赤血球CD59に対する単一特異性ウサギ抗体のFabフラグ
メントは、Sims, P.J.、Rollins, S.A.、およびWiedme
r, T.(1989)が記載したように調製した。CHO膜に反応す
るウサギ血清は、培養CHO細胞由来の細胞膜を繰り返し
注入することにより調製し、そしてそのIgG画分(抗CHO)
は、プロテインＡ−セファロース(Sigma製)を使用した
アフィニティー精製により調製した。ウサギ抗ヒト赤血
球は、Cappel(Cochranville、PA)から購入した。
【０１５６】C5b-9を阻害する赤血球膜タンパク質(CD5
9)：C5b-9を介する活性および溶解を阻害する、18kDaの
ヒト赤血球タンパク質、CD59、をSugitaら(1988)が記載
した方法の変法により単離した。Mono-QTMのFPLC(ファ
ルマシア製)によりさらなる精製を行った。阻害活性を
有するCD59ポリペプチドはインヒビター特異的抗体の使
用により、さらにアフィニティー精製し得る。αーP18の
様な、C5b-9インヒビターポリペプチドに結合する抗体
は、当業者に周知の技術により、クロマトグラフマトリ
ックス材料に固定化し、上記18kDaのタンパク質を含有
する材料をそのクロマトグラフマトリックスに通し、非
結合物質は洗浄により除去し、そして結合した物質は、
高塩濃度溶液またはそれに類似の手法で取り出す。C5b-
9を介する凝血促進反応を阻害する能力を有するポリペ
プチドは、組み換え手法により生産される。CD59をコー
ドする核酸配列またはその活性フラグメントは、ヒトcD
NAライブラリー、または好ましくは、本明細書中に記載
のクローンから単離される。例えば、ヒトDNAが単離さ
れ、制限酵素で切断されて、適切なサイズであり、既知
の市販の発現ベクター(例えばPromega製ラムダgt11ベク
ター系)へ結合するための適切な付着末端が付与され
る。あるいは、上記単離されたDNAを剪断し、そして適
切なリンカーを得られたフラグメントに結合し、次いで
選択した発現ベクターに挿入する。
9)：C5b-9を介する活性および溶解を阻害する、18kDaの
ヒト赤血球タンパク質、CD59、をSugitaら(1988)が記載
した方法の変法により単離した。Mono-QTMのFPLC(ファ
ルマシア製)によりさらなる精製を行った。阻害活性を
有するCD59ポリペプチドはインヒビター特異的抗体の使
用により、さらにアフィニティー精製し得る。αーP18の
様な、C5b-9インヒビターポリペプチドに結合する抗体
は、当業者に周知の技術により、クロマトグラフマトリ
ックス材料に固定化し、上記18kDaのタンパク質を含有
する材料をそのクロマトグラフマトリックスに通し、非
結合物質は洗浄により除去し、そして結合した物質は、
高塩濃度溶液またはそれに類似の手法で取り出す。C5b-
9を介する凝血促進反応を阻害する能力を有するポリペ
プチドは、組み換え手法により生産される。CD59をコー
ドする核酸配列またはその活性フラグメントは、ヒトcD
NAライブラリー、または好ましくは、本明細書中に記載
のクローンから単離される。例えば、ヒトDNAが単離さ
れ、制限酵素で切断されて、適切なサイズであり、既知
の市販の発現ベクター(例えばPromega製ラムダgt11ベク
ター系)へ結合するための適切な付着末端が付与され
る。あるいは、上記単離されたDNAを剪断し、そして適
切なリンカーを得られたフラグメントに結合し、次いで
選択した発現ベクターに挿入する。
【０１５７】ヒトDNAを含有するベクターを次に、適切
な細菌株、通常は、発現ベクターキットに含まれる大腸
菌の菌株に導入し、DNA遺伝子バンクまたはライブラリ
ーを形成させる。上記ベクターを含有する上記ライブラ
リーの細菌を適切な培地にプレートして培養することに
よって、挿入されたヒトDNAフラグメントの発現が起こ
る。このコロニー群を、αーP18の様な特異抗体を使用し
て、C5b-9阻害タンパク質をコードするDNAの存在および
C5b-9阻害タンパク質の発現をスクリーニングする。陽
性のコロニーを単離し、そして組み換え操作で生産され
た阻害タンパク質の大規模な発現に使用する。
な細菌株、通常は、発現ベクターキットに含まれる大腸
菌の菌株に導入し、DNA遺伝子バンクまたはライブラリ
ーを形成させる。上記ベクターを含有する上記ライブラ
リーの細菌を適切な培地にプレートして培養することに
よって、挿入されたヒトDNAフラグメントの発現が起こ
る。このコロニー群を、αーP18の様な特異抗体を使用し
て、C5b-9阻害タンパク質をコードするDNAの存在および
C5b-9阻害タンパク質の発現をスクリーニングする。陽
性のコロニーを単離し、そして組み換え操作で生産され
た阻害タンパク質の大規模な発現に使用する。
【０１５８】この様式で、完全な型の阻害タンパク質お
よびその改変ポリペプチド、機能的フラグメント、およ
び誘導体が、組み換え操作で作成される。三次構造を有
し、そしてC5b-9を阻害する能力を有する機能的ポリペ
プチドが、上記で説明した方法または当業者に通常知ら
れる他の方法で生産され得る。これらの単離され精製さ
れたポリペプチドは、さらに、薬学的に容認し得る担体
と混合され得、長期の細胞保存あるいは免疫異常症また
は病気の処置に使用する組成物が形成される。
よびその改変ポリペプチド、機能的フラグメント、およ
び誘導体が、組み換え操作で作成される。三次構造を有
し、そしてC5b-9を阻害する能力を有する機能的ポリペ
プチドが、上記で説明した方法または当業者に通常知ら
れる他の方法で生産され得る。これらの単離され精製さ
れたポリペプチドは、さらに、薬学的に容認し得る担体
と混合され得、長期の細胞保存あるいは免疫異常症また
は病気の処置に使用する組成物が形成される。
【０１５９】以下の方法は、CD59またはそのフラグメン
トのC5b-9阻害活性の検出および定量に有用である。
トのC5b-9阻害活性の検出および定量に有用である。
【０１６０】タンパク質の蛍光標識 化または放射線標
識：フローサイトメトリーのために、すべての抗体をフ
ルオレセインイソチオシアネート(FITC)と結合させた。
ネズミIgGに対する、アフィニティー精製したヤギ抗体
のIgG画分(Sigma製)をFITC抗マウスIgGで標識した。色
素：タンパク質比の範囲は３から６である。全ての場合
において、組み込まれなかった標識物(126ＩまたはFIT
C)は、ゲル濾過、次いで完全な透析により除く。
識：フローサイトメトリーのために、すべての抗体をフ
ルオレセインイソチオシアネート(FITC)と結合させた。
ネズミIgGに対する、アフィニティー精製したヤギ抗体
のIgG画分(Sigma製)をFITC抗マウスIgGで標識した。色
素：タンパク質比の範囲は３から６である。全ての場合
において、組み込まれなかった標識物(126ＩまたはFIT
C)は、ゲル濾過、次いで完全な透析により除く。
【０１６１】モノクローナル抗体1F1は、IODOGENTM(Pie
rce Chemical Co.製)により、6221cpm/ngの比活性まで
に放射線標識した。
rce Chemical Co.製)により、6221cpm/ngの比活性まで
に放射線標識した。
【０１６２】タンパク質濃度：未標識のタンパク質濃度
は、以下の吸光係数(Ｅ1% 280)より想定して定めた：ネ
ズミIgG(15)、C8(15.1)およびC9(9.6)。各FITC標識タン
パク質の濃度は、色素結合アッセイ(BioRad製)により、
各々の未標識タンパク質をスタンダードとして、測定し
た。FITC濃度は、分子吸光(492nm)を68,000と想定して
決めた。
は、以下の吸光係数(Ｅ1% 280)より想定して定めた：ネ
ズミIgG(15)、C8(15.1)およびC9(9.6)。各FITC標識タン
パク質の濃度は、色素結合アッセイ(BioRad製)により、
各々の未標識タンパク質をスタンダードとして、測定し
た。FITC濃度は、分子吸光(492nm)を68,000と想定して
決めた。
【０１６３】ウェスタンブロッティ ング 精製したヒト赤血球CD59(１μg)およびCD59が導入され
たCHO細胞由来の抗原を、非還元条件下で、２％SDS中で
変性(３分、100℃)し、Laemmli, U.K.、Nature227,680-
685(1970)、の緩衝液系を使用して、15％均質ゲル中で
電気泳動した。ニトロセルロースに転写後、１％ウシ血
清アルブミンを含むTBS(150mM NaCl、50mM Tris、pH7.
4)を用いて、モノクローナル抗CD59抗体(10μg/ml)また
はウサギ抗CD59抗体(10μg/ml)と、23℃で一晩のインキ
ュベーションを行なうことにより、イムノブロッティン
グを実施した。ブロットを、アルカリフォスファターゼ
を結合させた、適切な抗ウサギまたは抗マウスIgG(Sigm
a製)の１:1000希釈液を用いて、生じさせた。
たCHO細胞由来の抗原を、非還元条件下で、２％SDS中で
変性(３分、100℃)し、Laemmli, U.K.、Nature227,680-
685(1970)、の緩衝液系を使用して、15％均質ゲル中で
電気泳動した。ニトロセルロースに転写後、１％ウシ血
清アルブミンを含むTBS(150mM NaCl、50mM Tris、pH7.
4)を用いて、モノクローナル抗CD59抗体(10μg/ml)また
はウサギ抗CD59抗体(10μg/ml)と、23℃で一晩のインキ
ュベーションを行なうことにより、イムノブロッティン
グを実施した。ブロットを、アルカリフォスファターゼ
を結合させた、適切な抗ウサギまたは抗マウスIgG(Sigm
a製)の１:1000希釈液を用いて、生じさせた。
【０１６４】CHO細胞での、C D59cDNAのトランスフ ェク
ションおよび発現 Philbrick,A.E.ら、Eur. J. Immunol. 20, 87-92(199
0)、に記載された、上記CD59をコードするEcoRIフラグ
メントを、Slanetz,W.M.,およびBothwell,A.L.M、E ur.
J. Immun ol. 21, 179-183(1991)、に報告されたμFRSV
発現ベクターのEcoRI部位にサブクローニングした。
ションおよび発現 Philbrick,A.E.ら、Eur. J. Immunol. 20, 87-92(199
0)、に記載された、上記CD59をコードするEcoRIフラグ
メントを、Slanetz,W.M.,およびBothwell,A.L.M、E ur.
J. Immun ol. 21, 179-183(1991)、に報告されたμFRSV
発現ベクターのEcoRI部位にサブクローニングした。
【０１６５】この挿入物によりコードされる、上記タン
パク質のアミノ酸配列は以下の通りである：
パク質のアミノ酸配列は以下の通りである：
【０１６６】
【表９】
【０１６７】上記CD59タンパク質をコードするcDNA塩基
配列は、以下の通りである：
配列は、以下の通りである：
【０１６８】
【表１０】
【０１６９】上記FRSV.CD59ベクターをSalI(20μg)で開
環し、そしてエレクトロポレーション(２kV、25マイク
ロファラッド)により、107個のCHO細胞に導入した。上
記細胞を、10mg/mlアデノシン、チミジン、およびデオ
キシアデノシンを含有するイーグルの最小培地(GIBCO
製)にプレートし、１日〜２日間維持した。その後、上
記培地を、デオキシヌクレオシドを欠き、代わりに0.09
μg/mlのメトトレキセートおよび10％の透析済みウシ胎
児血清(GIBCO製)を含有するイーグルの最小培地と交換
した。２週間から３週間後、個々のクローンを単離し、
増殖させ、そして、メトトレキセートのレベルを上げて
選抜した。
環し、そしてエレクトロポレーション(２kV、25マイク
ロファラッド)により、107個のCHO細胞に導入した。上
記細胞を、10mg/mlアデノシン、チミジン、およびデオ
キシアデノシンを含有するイーグルの最小培地(GIBCO
製)にプレートし、１日〜２日間維持した。その後、上
記培地を、デオキシヌクレオシドを欠き、代わりに0.09
μg/mlのメトトレキセートおよび10％の透析済みウシ胎
児血清(GIBCO製)を含有するイーグルの最小培地と交換
した。２週間から３週間後、個々のクローンを単離し、
増殖させ、そして、メトトレキセートのレベルを上げて
選抜した。
【０１７０】得られたトランスフェクタントを、サブク
ローニングし、そしてメトトレキセートを追加した培地
での成長により選抜し、次いで図１に示すように、メト
トレキセートの増加濃度範囲を１mg/mlまで上げていく
連続培養によって、増幅した。
ローニングし、そしてメトトレキセートを追加した培地
での成長により選抜し、次いで図１に示すように、メト
トレキセートの増加濃度範囲を１mg/mlまで上げていく
連続培養によって、増幅した。
【０１７１】トランスフェクトされたCHO細胞で発現し
たCD59およびヒト赤血球のイムノブロッティングを実施
した。イムノブロットをモノクローナル抗体1F1(10μg/
ml)およびウサギ抗CD59抗体(10μg/ml)により生じさせ
た。上記トランスフェクトされたCHO細胞由来のタンパ
ク質は、天然のタンパク質よりも大きい分子量を有して
いた。
たCD59およびヒト赤血球のイムノブロッティングを実施
した。イムノブロットをモノクローナル抗体1F1(10μg/
ml)およびウサギ抗CD59抗体(10μg/ml)により生じさせ
た。上記トランスフェクトされたCHO細胞由来のタンパ
ク質は、天然のタンパク質よりも大きい分子量を有して
いた。
【０１７２】この抗原に対する放射線標識したモノクロ
ーナル抗体の特異結合に基づいて、細胞表面のCD59を０
(トランスフェクトされていないCHO細胞コントロール)
からおよそ4.2×106分子/細胞まで(それらのCD59トラン
スフェクタントは、１mg/mlのメトトレキセートで維持
されている)に増加させた。
ーナル抗体の特異結合に基づいて、細胞表面のCD59を０
(トランスフェクトされていないCHO細胞コントロール)
からおよそ4.2×106分子/細胞まで(それらのCD59トラン
スフェクタントは、１mg/mlのメトトレキセートで維持
されている)に増加させた。
【０１７３】細胞表面CD59抗原の定量 125 Ｉ標識した1F1の特異結合をCD59でトランスフェクト
されたCHO細胞により発現するCD59抗原のレベルの定量
に利用した。上記CHO細胞(CD59トランスフェクタントお
よびコントロール)は、48ウェル組織培養プレートに集
密して培養し、HBSSで洗浄し、次いで１％パラホルムア
ルデヒドで固定した(10分、23℃)。固定液を除去するた
めの洗浄後、上記細胞を、飽和濃度での抗体、10μg/ml
の125Ｉ標識1F1と、30分間、23℃でインキュベートし
た。次いで、上記細胞を、氷冷HBSSで６回洗浄し、そし
て細胞に結合する抗体を４％ドデシル硫酸ナトリウム(S
DS)で溶出した。放射活性は、光子計数で計測し、そし
て20倍過剰の未標識抗体の存在下での計測で、非特異結
合について補正を行なった。CD59トランスフェクタント
のデータは、トランスフェクトされていないCHO細胞コ
ントロールに比較して表面抗原の増大を示した。
されたCHO細胞により発現するCD59抗原のレベルの定量
に利用した。上記CHO細胞(CD59トランスフェクタントお
よびコントロール)は、48ウェル組織培養プレートに集
密して培養し、HBSSで洗浄し、次いで１％パラホルムア
ルデヒドで固定した(10分、23℃)。固定液を除去するた
めの洗浄後、上記細胞を、飽和濃度での抗体、10μg/ml
の125Ｉ標識1F1と、30分間、23℃でインキュベートし
た。次いで、上記細胞を、氷冷HBSSで６回洗浄し、そし
て細胞に結合する抗体を４％ドデシル硫酸ナトリウム(S
DS)で溶出した。放射活性は、光子計数で計測し、そし
て20倍過剰の未標識抗体の存在下での計測で、非特異結
合について補正を行なった。CD59トランスフェクタント
のデータは、トランスフェクトされていないCHO細胞コ
ントロールに比較して表面抗原の増大を示した。
【０１７４】真核生物発現ベクターpFRSV中のヒトCD59c
DNAのサブクローニング、およびエレクトロポレーショ
ンによるCHO細胞のトランスフェクションは、通常はCD5
9およびHRFを発現しない細胞中で、CD59が発現し得、そ
して補体を介する細胞溶解に対する防御を与えることを
示す。pFRSVは、メトトレキセート濃度に依存する方法
で、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子座に隣接した上記
DNAを、漸増的に増幅させるため選択されたが、他のベ
クターもまた、pFRSV-SRαのように使用し得る。
DNAのサブクローニング、およびエレクトロポレーショ
ンによるCHO細胞のトランスフェクションは、通常はCD5
9およびHRFを発現しない細胞中で、CD59が発現し得、そ
して補体を介する細胞溶解に対する防御を与えることを
示す。pFRSVは、メトトレキセート濃度に依存する方法
で、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子座に隣接した上記
DNAを、漸増的に増幅させるため選択されたが、他のベ
クターもまた、pFRSV-SRαのように使用し得る。
【０１７５】上記ベクターpFRSVは、メトトレキセート
を含有する培地での選抜による遺伝子増幅後の発現増大
に効果的に使用されている。上記プラスミドベクターpF
RSV-SRαは、導入したcDNAの発現を駆動する、より強い
プロモーターを有する。pcDL-SRα296(Takebeら、Mo le
c. Cell Biol. 8:466-472(1988))のSalI-EcoRIフラグメ
ント(800bp)を、SlanetzおよびBothwell、(1991)に記載
のpFRSVのHindIII-EcoRI部位に挿入した。このプラスミ
ドは、上記pFRSVベクターよりも、CD59および他の挿入
されたcDNAの発現の基礎レベルがより高い。
を含有する培地での選抜による遺伝子増幅後の発現増大
に効果的に使用されている。上記プラスミドベクターpF
RSV-SRαは、導入したcDNAの発現を駆動する、より強い
プロモーターを有する。pcDL-SRα296(Takebeら、Mo le
c. Cell Biol. 8:466-472(1988))のSalI-EcoRIフラグメ
ント(800bp)を、SlanetzおよびBothwell、(1991)に記載
のpFRSVのHindIII-EcoRI部位に挿入した。このプラスミ
ドは、上記pFRSVベクターよりも、CD59および他の挿入
されたcDNAの発現の基礎レベルがより高い。
【０１７６】哺乳動物細胞における発現は、特に内皮細
胞では、レトロウイルスベクターを利用する感染によっ
て、達成され得る。この方法は、細胞内にDNAを導入す
る手段という点で、エレクトロポレーションよりも、さ
らに穏やかで効果的である。選抜のための異なる薬剤抵
抗性マーカー類を有するレトロウイルスは、内皮細胞で
の発現のために多重なcDNAを導入する手段を提供する。
この目的のために現在開発下にあるレトロウイルスは、
選抜マーカーとして、ネオマイシン(neo)、ハイグロマ
イシン(hygrogycin)およびヒスチジノールの使用を包含
する。これらの抵抗性遺伝子の全てがBamHIフラグメン
トに利用でき、そして、あるベクターの抵抗性を変える
ために、容易にレトロウイルスベクターに挿入され得
る。DHFR遺伝子もまた、レトロウイルスベクターに利用
できる。上記SRαプロモーターまたはレトロウイルスLT
R(長末端反復)プロモーターにより駆動されてCD59を発
現するレトロウイルスも利用され得る。
胞では、レトロウイルスベクターを利用する感染によっ
て、達成され得る。この方法は、細胞内にDNAを導入す
る手段という点で、エレクトロポレーションよりも、さ
らに穏やかで効果的である。選抜のための異なる薬剤抵
抗性マーカー類を有するレトロウイルスは、内皮細胞で
の発現のために多重なcDNAを導入する手段を提供する。
この目的のために現在開発下にあるレトロウイルスは、
選抜マーカーとして、ネオマイシン(neo)、ハイグロマ
イシン(hygrogycin)およびヒスチジノールの使用を包含
する。これらの抵抗性遺伝子の全てがBamHIフラグメン
トに利用でき、そして、あるベクターの抵抗性を変える
ために、容易にレトロウイルスベクターに挿入され得
る。DHFR遺伝子もまた、レトロウイルスベクターに利用
できる。上記SRαプロモーターまたはレトロウイルスLT
R(長末端反復)プロモーターにより駆動されてCD59を発
現するレトロウイルスも利用され得る。
【０１７７】異なる薬剤抵抗性マーカー類を有するレト
ロウイルスの使用は、CD59と、DAF(CD55)またはMCP(CD4
6)のいずれかとの共発現を容易にし得る。内皮細胞活性
の減少化に、CD59との共発現は、CD59単独よりも、より
効果的である。上記レトロウイルスベクターにとって薬
剤抵抗性を有するということは、望ましいことではある
が、本質的なことではない。レトロウイルスは、単独の
ウイルスからCD59、およびCD55またはCD46の両方を発現
するように発達され得る。３種の補体調節タンパク質CD
59、CD55およびCD46をすべて発現するために異なる薬剤
マーカー類を有するベクターの利用もまた可能である。
ロウイルスの使用は、CD59と、DAF(CD55)またはMCP(CD4
6)のいずれかとの共発現を容易にし得る。内皮細胞活性
の減少化に、CD59との共発現は、CD59単独よりも、より
効果的である。上記レトロウイルスベクターにとって薬
剤抵抗性を有するということは、望ましいことではある
が、本質的なことではない。レトロウイルスは、単独の
ウイルスからCD59、およびCD55またはCD46の両方を発現
するように発達され得る。３種の補体調節タンパク質CD
59、CD55およびCD46をすべて発現するために異なる薬剤
マーカー類を有するベクターの利用もまた可能である。
【０１７８】組み換えCD59、天然のCD59および脱糖鎖 C D
59の分子量比較 CD59でトランスフェクトされたCHO細胞(１mg/mlメトト
レキセート存在下の培養により増幅された、CD59の発
現)由来の膜タンパク質を２％トリトンX100、20mM Tri
s、10mM EDTA、50mM ベンザミジン、200mM N-エチルマ
レイミド、１mM フェニルメチルスルホニルフルオリ
ド、pH7.4で抽出した。11,000×g、５分の遠心分離によ
り、不溶物質を除去した後、この洗浄剤抽出物を10倍に
希釈し、そして、アフィ−ゲル10(Bio-Rad製)に固定化
された抗体を使用するイムノアフィニティークロマトグ
ラフィーにより、CD59抗原を精製した。抗原は、１M グ
リシン、0.2％ トリトンX-100、10mM EDTA、50mM ベン
ズアミジン、200mM N-エチルマレイミド、１mM フェニ
ルメチルスルホニルフルオリド、pH3.0で溶出し；200mM
リン酸ナトリウム、10mM EDTA、50mM ベンズアミジ
ン、200mM N-エチルマレイミド、１mM フェニルメチル
スルホニルフルオリド、pH8.6で透析し；そして200μg/
mlに濃縮した。還元条件(0.5％ SDS、100mM β-メルカ
プトエタノール；100℃、３分)下での変性後、イムノア
フィニティー精製したCD59を、30ユニット/mlのN-グリ
カナーゼと、10mM 1、10-フェナントロリンの存在下で、
インキュベート(37℃、24時間)し、そして、８〜25％ S
DS-PAGE(PHASTシステム、Pharmacia LKB Biotechnology
Inc.)後に、銀染色法により、解析した。
59の分子量比較 CD59でトランスフェクトされたCHO細胞(１mg/mlメトト
レキセート存在下の培養により増幅された、CD59の発
現)由来の膜タンパク質を２％トリトンX100、20mM Tri
s、10mM EDTA、50mM ベンザミジン、200mM N-エチルマ
レイミド、１mM フェニルメチルスルホニルフルオリ
ド、pH7.4で抽出した。11,000×g、５分の遠心分離によ
り、不溶物質を除去した後、この洗浄剤抽出物を10倍に
希釈し、そして、アフィ−ゲル10(Bio-Rad製)に固定化
された抗体を使用するイムノアフィニティークロマトグ
ラフィーにより、CD59抗原を精製した。抗原は、１M グ
リシン、0.2％ トリトンX-100、10mM EDTA、50mM ベン
ズアミジン、200mM N-エチルマレイミド、１mM フェニ
ルメチルスルホニルフルオリド、pH3.0で溶出し；200mM
リン酸ナトリウム、10mM EDTA、50mM ベンズアミジ
ン、200mM N-エチルマレイミド、１mM フェニルメチル
スルホニルフルオリド、pH8.6で透析し；そして200μg/
mlに濃縮した。還元条件(0.5％ SDS、100mM β-メルカ
プトエタノール；100℃、３分)下での変性後、イムノア
フィニティー精製したCD59を、30ユニット/mlのN-グリ
カナーゼと、10mM 1、10-フェナントロリンの存在下で、
インキュベート(37℃、24時間)し、そして、８〜25％ S
DS-PAGE(PHASTシステム、Pharmacia LKB Biotechnology
Inc.)後に、銀染色法により、解析した。
【０１７９】図２に示すように、これらの細胞の表面で
発現する組み換えCD59は、糖脂質アンカーを介する膜へ
の結合と両立する、ホスファチジルイノシトール特異的
ホスフォリパーゼＣ消化による除去が可能であった。1.
0mg/mlメトトレキセート下で維持された、集密した単層
のCD59でトランスフェクトされたCHO細胞を、T-25組織
培養フラスコからVersene/EDTA(Whittaker M.A. Biopro
ducts)を用いて遊離した。洗浄およびHBSS中に２×106
細胞/mlに懸濁した後、これら細胞を1.0ユニット/mlホ
スファチジルイノシトール特異的ホスフォリパーゼＣ(I
CN Biochemicals、Indianapolis、IN)に、または、コン
トロールとして酵素を希釈した緩衝液にさらした。37
℃、１時間のインキュベーション後、各細胞懸濁液25μ
lを25μlのモノクローナル抗体1F1(HBSS中の最終濃度が
10μg 1F1/ml)を含有するチューブに添加した。４℃で3
0分間インキュベーションした後、FITC抗マウスIgGを10
μl添加し(最終濃度が87μg IgG/ml)、そして細胞をさ
らに23℃、15分間インキュベートした。細胞表面のCD59
を、モノクローナル抗体1F1の特異的結合により定量
し、対数増加にセットしたFL1蛍光チャンネル(520nm)で
のFACSCAN(Becton、Dickinson & Co.)フローサイトメー
ターにより測定した。
発現する組み換えCD59は、糖脂質アンカーを介する膜へ
の結合と両立する、ホスファチジルイノシトール特異的
ホスフォリパーゼＣ消化による除去が可能であった。1.
0mg/mlメトトレキセート下で維持された、集密した単層
のCD59でトランスフェクトされたCHO細胞を、T-25組織
培養フラスコからVersene/EDTA(Whittaker M.A. Biopro
ducts)を用いて遊離した。洗浄およびHBSS中に２×106
細胞/mlに懸濁した後、これら細胞を1.0ユニット/mlホ
スファチジルイノシトール特異的ホスフォリパーゼＣ(I
CN Biochemicals、Indianapolis、IN)に、または、コン
トロールとして酵素を希釈した緩衝液にさらした。37
℃、１時間のインキュベーション後、各細胞懸濁液25μ
lを25μlのモノクローナル抗体1F1(HBSS中の最終濃度が
10μg 1F1/ml)を含有するチューブに添加した。４℃で3
0分間インキュベーションした後、FITC抗マウスIgGを10
μl添加し(最終濃度が87μg IgG/ml)、そして細胞をさ
らに23℃、15分間インキュベートした。細胞表面のCD59
を、モノクローナル抗体1F1の特異的結合により定量
し、対数増加にセットしたFL1蛍光チャンネル(520nm)で
のFACSCAN(Becton、Dickinson & Co.)フローサイトメー
ターにより測定した。
【０１８０】ウェスタンブロッティングにより、トラン
スフェクトされたCHO細胞で発現したCD59は、ヒト赤血
球に存在するCD59(見かけの分子質量が18〜21kDa)より
もSDS-PAGE上の移動の明確な遅延を示した(見かけの分
子質量が21〜24kDa)。アスパラギンに結合した炭水化物
を除去するためのN-グリカナーゼによる消化後、CHOト
ランスフェクタントから単離した組み換えCD59、およ
び、ヒト赤血球から単離したCD59は、SDS-PAGEにより、
見かけの分子質量12〜14kDaに共に移動した。
スフェクトされたCHO細胞で発現したCD59は、ヒト赤血
球に存在するCD59(見かけの分子質量が18〜21kDa)より
もSDS-PAGE上の移動の明確な遅延を示した(見かけの分
子質量が21〜24kDa)。アスパラギンに結合した炭水化物
を除去するためのN-グリカナーゼによる消化後、CHOト
ランスフェクタントから単離した組み換えCD59、およ
び、ヒト赤血球から単離したCD59は、SDS-PAGEにより、
見かけの分子質量12〜14kDaに共に移動した。
【０１８１】ヒトC5b-9の小孔形成活性に対する、CD59
でトランスフェクトされたCHO細胞の防御 トランスフェクトされたCHO細胞内で発現する組み換えC
D59の機能的活性を、細胞内蛍光色素指示薬BCECF/AMを
使用する補体を介する色素放出のアッセイにより、評価
した。図１に示すように、メトトレキセートの種々の濃
度での生長による遺伝子発現を漸増的に増幅する能力を
利用して、CD59抗原レベルとC5b-9阻害活性との相互関
係を評価した。
でトランスフェクトされたCHO細胞の防御 トランスフェクトされたCHO細胞内で発現する組み換えC
D59の機能的活性を、細胞内蛍光色素指示薬BCECF/AMを
使用する補体を介する色素放出のアッセイにより、評価
した。図１に示すように、メトトレキセートの種々の濃
度での生長による遺伝子発現を漸増的に増幅する能力を
利用して、CD59抗原レベルとC5b-9阻害活性との相互関
係を評価した。
【０１８２】各メトトレキセート濃度での安定した発現
が達成された後、BCECF/AM色素放出アッセイを使用し
て、上記CD59でトランスフェクトされた細胞のヒト血清
補体に対する感受性を試験した。BCECF/AM(15μM)との
インキュベーションそして洗浄後、集密した単層を５mg
/mlのウサギ抗CHOIgG、および細胞膜上にC5b-67を沈積
させるために25％ C8Dとインキュベートした。その後、
10mM EDTAを含有するヒト血清を、C8およびC9の供給源
として添加した。上清への色素の放出は、37℃で15分経
過した後に、調和させたコントロールで得られる非特異
的放出による補正と合わせて(C8Dとのインキュベーショ
ンでは省略したが)、測定した。
が達成された後、BCECF/AM色素放出アッセイを使用し
て、上記CD59でトランスフェクトされた細胞のヒト血清
補体に対する感受性を試験した。BCECF/AM(15μM)との
インキュベーションそして洗浄後、集密した単層を５mg
/mlのウサギ抗CHOIgG、および細胞膜上にC5b-67を沈積
させるために25％ C8Dとインキュベートした。その後、
10mM EDTAを含有するヒト血清を、C8およびC9の供給源
として添加した。上清への色素の放出は、37℃で15分経
過した後に、調和させたコントロールで得られる非特異
的放出による補正と合わせて(C8Dとのインキュベーショ
ンでは省略したが)、測定した。
【０１８３】図３に示すように、CD59の発現の高い増幅
により、ヒト血清補体の免疫活性化により誘導される色
素の放出に対するトランスフェクトされたCHO細胞の感
受性の目立った低下が生じた。200μg/mlメトトレキセ
ート存在下で生育させた細胞(１細胞あたりおよそ1.2×
106分子のCD59ほどの細胞表面発現の増幅を示す)では、
たとえより高濃度の血清(75％)を供試しても、全く補体
を介する色素放出が認められなかった。
により、ヒト血清補体の免疫活性化により誘導される色
素の放出に対するトランスフェクトされたCHO細胞の感
受性の目立った低下が生じた。200μg/mlメトトレキセ
ート存在下で生育させた細胞(１細胞あたりおよそ1.2×
106分子のCD59ほどの細胞表面発現の増幅を示す)では、
たとえより高濃度の血清(75％)を供試しても、全く補体
を介する色素放出が認められなかった。
【０１８４】補体阻害活性を立証するために、トランス
フェクトされたCHO細胞のCD59の発現を50μg/mlのメト
トレキセート存在下で生育させることにより増幅させ：
上記細胞をBCECF/AMとのインキュベーションにより色素
で充填し；そして図３に示すように、C5b-67を沈積させ
た。洗浄後、上記細胞を、CD59に対して０mg/mlまたは
0.5mg/mlの機能的に阻害する抗体(Fabフラグメント)と
インキュベートした(４℃、30分)。結合していない抗体
は除去し、C8(１μg/ml)および多様な量のC9を添加し、
そして37℃で15分経過した後に、色素の放出を測定し
た。
フェクトされたCHO細胞のCD59の発現を50μg/mlのメト
トレキセート存在下で生育させることにより増幅させ：
上記細胞をBCECF/AMとのインキュベーションにより色素
で充填し；そして図３に示すように、C5b-67を沈積させ
た。洗浄後、上記細胞を、CD59に対して０mg/mlまたは
0.5mg/mlの機能的に阻害する抗体(Fabフラグメント)と
インキュベートした(４℃、30分)。結合していない抗体
は除去し、C8(１μg/ml)および多様な量のC9を添加し、
そして37℃で15分経過した後に、色素の放出を測定し
た。
【０１８５】CD59発現CHO細胞で認められた補体を介す
る膜損傷に対する抵抗性は、補体小孔についてのC9依存
的活性を反映し、そしてこの阻害は、CD59抗原に対して
向けられる機能的な遮断抗体のFabフラグメントと細胞
との前インキュベーションにより、消失した。CD59トラ
ンスフェクタントに認められるヒト血清補体に対する防
御が、細胞表面でのCD59発現に関係し、メトトレキセー
トとの長期の培養により誘導され得る、これら細胞内で
の他の変化には基づいていないことを、これらのデータ
は明確に示している。
る膜損傷に対する抵抗性は、補体小孔についてのC9依存
的活性を反映し、そしてこの阻害は、CD59抗原に対して
向けられる機能的な遮断抗体のFabフラグメントと細胞
との前インキュベーションにより、消失した。CD59トラ
ンスフェクタントに認められるヒト血清補体に対する防
御が、細胞表面でのCD59発現に関係し、メトトレキセー
トとの長期の培養により誘導され得る、これら細胞内で
の他の変化には基づいていないことを、これらのデータ
は明確に示している。
【０１８６】CD59でトランスフェクトされたCHO細胞に
より発現された補体阻害機能のヒト選択性 ヒト赤血球、および、ヒト赤血球由来の精製CD59抗原で
再構築された膜で認められる、溶解に対する種選択的抵
抗性に類似の様式で、CD59でトランスフェクトされたCH
O細胞は、ヒトC5b-9タンパク質の影響から選択的に防御
される。これらの研究では、C5b-9複合体中のC8およびC
9成分の供給源として、EDTAを含有するヒトまたはモル
モット血清とのインキュベーションの前に、抗CHO IgG
およびヒトC8Dを、CHO細胞の原形質膜上にヒトC5b-67複
合体を沈積させるため使用した。
より発現された補体阻害機能のヒト選択性 ヒト赤血球、および、ヒト赤血球由来の精製CD59抗原で
再構築された膜で認められる、溶解に対する種選択的抵
抗性に類似の様式で、CD59でトランスフェクトされたCH
O細胞は、ヒトC5b-9タンパク質の影響から選択的に防御
される。これらの研究では、C5b-9複合体中のC8およびC
9成分の供給源として、EDTAを含有するヒトまたはモル
モット血清とのインキュベーションの前に、抗CHO IgG
およびヒトC8Dを、CHO細胞の原形質膜上にヒトC5b-67複
合体を沈積させるため使用した。
【０１８７】トランスフェクトされたCHO細胞によるCD5
9の発現を、種々のメトトレキセート濃度での生育によ
り増幅させ、上記集密した単層をBCECF/AMで充填し、そ
してヒトC5b-67を上記のように沈積した。洗浄後、10mM
EDTAの存在下での、10％(v/v)ヒト血清(黒塗り記号)ま
たは10％(v/v)モルモット血清(白抜き記号)とのインキ
ュベーション(15分、37℃)により、上記C5b67細胞に、C
5b-9を課した。
9の発現を、種々のメトトレキセート濃度での生育によ
り増幅させ、上記集密した単層をBCECF/AMで充填し、そ
してヒトC5b-67を上記のように沈積した。洗浄後、10mM
EDTAの存在下での、10％(v/v)ヒト血清(黒塗り記号)ま
たは10％(v/v)モルモット血清(白抜き記号)とのインキ
ュベーション(15分、37℃)により、上記C5b67細胞に、C
5b-9を課した。
【０１８８】トランスフェクトされたCHO細胞により発
現されたCD59は、これらの細胞をヒトC5b-9による小孔
形成から防御したが、この複合体のC8およびC9成分をモ
ルモットタンパク質に置換した場合は防御しなかった。
現されたCD59は、これらの細胞をヒトC5b-9による小孔
形成から防御したが、この複合体のC8およびC9成分をモ
ルモットタンパク質に置換した場合は防御しなかった。
【０１８９】ヒトC5b-67を、抗ヒト赤血球抗血清(1.5％
(v/v)、10mM EDTAを含有する)および60％(v/v)ヒトC8枯
渇血清(HBSSで希釈)との連続的なインキュベーションに
よりK562細胞に沈積した。BCECF/AMで充填後、細胞を、
CD59に対して機能的な０mg/mlまたは1mg/mlの遮断抗
体、とインキュベートした(４℃、30分)。結合していな
い抗体の除去後、10mM EDTAを含有する、ヒト(円)また
はモルモット(三角)血清とのインキュベーションによ
り、上記細胞に、C5b-9を課した。ヒト(モルモットでは
起こらない)C8およびC9のC5b-9への組み込みにより発生
する小孔形成活性を制限するこのような能力はまた、ヒ
トK562細胞の表面に本質的に発現するCD59からも認めら
れ、そしてこれらの研究に使用したCD59のcDNAは、元
来、この細胞からの細胞系から得られた。
(v/v)、10mM EDTAを含有する)および60％(v/v)ヒトC8枯
渇血清(HBSSで希釈)との連続的なインキュベーションに
よりK562細胞に沈積した。BCECF/AMで充填後、細胞を、
CD59に対して機能的な０mg/mlまたは1mg/mlの遮断抗
体、とインキュベートした(４℃、30分)。結合していな
い抗体の除去後、10mM EDTAを含有する、ヒト(円)また
はモルモット(三角)血清とのインキュベーションによ
り、上記細胞に、C5b-9を課した。ヒト(モルモットでは
起こらない)C8およびC9のC5b-9への組み込みにより発生
する小孔形成活性を制限するこのような能力はまた、ヒ
トK562細胞の表面に本質的に発現するCD59からも認めら
れ、そしてこれらの研究に使用したCD59のcDNAは、元
来、この細胞からの細胞系から得られた。
【０１９０】CD59、および、C5b-9複合体に対する他の
インヒビターの効果的な強さは、原形質膜の単位面積当
りに生じるC5b-9複合体の数に依存する。したがって、C
5b-9の細胞溶解および細胞刺激活性に関するCD59の阻害
効果は、C5b-9複合体の集まりに対して要求される活性
化補体成分の投入量の増大によって、克服され得る。CD
59の防御効果は、CD46および/またはCD55と共にCD59を
提供することで増強され得る。本処方では、CD59は、各
タンパク質の遺伝子を含有するベクターのトランスフェ
クションまたは感染により、CD46および/またはCD55と
共に発現される。これらの遺伝子の共同発現は、細胞表
面に生じる得るC5b-9の量の制限(補体酵素によるC5から
C5bへの転換に対するCD46および/またはCD55の阻害効果
を通じて)、および、CD46および/またはCD55の作用によ
り阻害されない、プラズミンおよび他の酵素によるC5か
らC5bへの転換を通じて形成された残余のC5b-9の細胞溶
解および細胞刺激の影響からの防御に寄与する。
インヒビターの効果的な強さは、原形質膜の単位面積当
りに生じるC5b-9複合体の数に依存する。したがって、C
5b-9の細胞溶解および細胞刺激活性に関するCD59の阻害
効果は、C5b-9複合体の集まりに対して要求される活性
化補体成分の投入量の増大によって、克服され得る。CD
59の防御効果は、CD46および/またはCD55と共にCD59を
提供することで増強され得る。本処方では、CD59は、各
タンパク質の遺伝子を含有するベクターのトランスフェ
クションまたは感染により、CD46および/またはCD55と
共に発現される。これらの遺伝子の共同発現は、細胞表
面に生じる得るC5b-9の量の制限(補体酵素によるC5から
C5bへの転換に対するCD46および/またはCD55の阻害効果
を通じて)、および、CD46および/またはCD55の作用によ
り阻害されない、プラズミンおよび他の酵素によるC5か
らC5bへの転換を通じて形成された残余のC5b-9の細胞溶
解および細胞刺激の影響からの防御に寄与する。
【０１９１】（実施例２）ブタ内皮細胞でのヒトCD59の
発現は、ヒト補体による超急性拒絶反応からそれらを防
御する。
発現は、ヒト補体による超急性拒絶反応からそれらを防
御する。
【０１９２】本実施例は、ヒトCD59タンパク質をコード
する全鎖長cDNAが、安定してブタ大動脈内皮細胞(PAEC)
のゲノム内に組み込まれ細胞表面上で発現する場合、イ
ンビトロでの、ヒト補体を介する細胞溶解によりアッセ
イされるような補体を介する攻撃から、これらの細胞を
防御することを立証する。
する全鎖長cDNAが、安定してブタ大動脈内皮細胞(PAEC)
のゲノム内に組み込まれ細胞表面上で発現する場合、イ
ンビトロでの、ヒト補体を介する細胞溶解によりアッセ
イされるような補体を介する攻撃から、これらの細胞を
防御することを立証する。
【０１９３】PAECの培養物を10％ウシ胎児血清(FBS)、
５mM Hepes、２mM L-グルタミン、および各１％のペニ
シリン、およびストレプトマイシン(P/S)を含有するDME
Mで培養した。レトロウイルスの感染前に、上記細胞を5
0％集密まで成長させた。副次的に集密したPAECを両種
性ヘルパーフリーのレトロウイルスベクターpRNSRalpha
CD59+を使用して感染させた。このレトロウイルスの構
成を図４に示す。コントロールとして、PAECを、薬剤選
抜マーカー遺伝子ネオマイシンを含有するコントロール
レトロウイルスベクターで感染させたまたは感染させな
かった。両種性レトロウイルスのストックを、総容量３
mlのT-25組織培養フラスコ内で成長させ、副次的に集密
した細胞に添加した。ポリブレンを上記フラスコに添加
し、そして培養物を37℃で２から５時間インキュベート
した。ついで上記細胞培養培地を除去し、単層を５mlの
培地で２回リンスし、次いで５mlの培地を、37℃、８％
CO2でインキュベートした細胞に添加した。
５mM Hepes、２mM L-グルタミン、および各１％のペニ
シリン、およびストレプトマイシン(P/S)を含有するDME
Mで培養した。レトロウイルスの感染前に、上記細胞を5
0％集密まで成長させた。副次的に集密したPAECを両種
性ヘルパーフリーのレトロウイルスベクターpRNSRalpha
CD59+を使用して感染させた。このレトロウイルスの構
成を図４に示す。コントロールとして、PAECを、薬剤選
抜マーカー遺伝子ネオマイシンを含有するコントロール
レトロウイルスベクターで感染させたまたは感染させな
かった。両種性レトロウイルスのストックを、総容量３
mlのT-25組織培養フラスコ内で成長させ、副次的に集密
した細胞に添加した。ポリブレンを上記フラスコに添加
し、そして培養物を37℃で２から５時間インキュベート
した。ついで上記細胞培養培地を除去し、単層を５mlの
培地で２回リンスし、次いで５mlの培地を、37℃、８％
CO2でインキュベートした細胞に添加した。
【０１９４】24から48時間のインキュベーション期間の
後、上記レトロウイルス構築物の安定した組み込みを選
択するために、上記細胞をG418(400μg/ml)にさらし
た。ネオマイシン抵抗性コロニーのフローサイトメトリ
ー手法(FACS解析)によりヒトCD59の細胞表面発現をアッ
セイした。ブタ内皮細胞でのヒトCD59の細胞表面発現を
評価するため、集密したネオマイシン抵抗性細胞クロー
ンをT-75組織培養フラスコで集密するまで成長させ、そ
して37℃で10分のVersene-EDTA中のインキュベーション
によるFACS解析に供すために、細胞を遊離させた。回収
した細胞を遠心分離によりペレットにし、次いでリン酸
緩衝食塩水(PBS)、0.2％アジ化ナトリウム、および、２
％FBSを含有する染色緩衝液２mlに再懸濁した。細胞を
次いで、血球計算器で計測し、遠心分離によりペレット
にし、染色緩衝液で２回リンスし、次いで、ヒトCD59に
対する一次抗体と10μg/mlのウサギ抗CD59ポリクローナ
ル抗体、または、１μg/mlのマウス抗CD59モノクローナ
ル1F1(Dr.Motowa Tomita、昭和大学、日本から入手し
た)のいずれかとを、23℃で30分間インキュベートし
た。次いで上記細胞をさらに染色緩衝液で２回リンス
し、そして染色緩衝液で１:50に希釈した、FITC結合の
ヤギの抗ウサギIgGまたは抗マウスIgGと、23℃で30分間
インキュベートした。上記細胞を、染色緩衝液で２回、
PBSで１回リンスし、次いで１％パラホルムアルデヒド
を含有するPBSに再懸濁し、そしてFACSにより解析し
た。細胞クローン１、２および９についてはみられるが
ネオマイシン抵抗性遺伝子のみを含有するコントロール
で感染させたコントロールPAECにはみられない、明確な
(X軸の蛍光強度により測定されるように)ヒトCD59の細
胞表面発現が、図５に示されている。
後、上記レトロウイルス構築物の安定した組み込みを選
択するために、上記細胞をG418(400μg/ml)にさらし
た。ネオマイシン抵抗性コロニーのフローサイトメトリ
ー手法(FACS解析)によりヒトCD59の細胞表面発現をアッ
セイした。ブタ内皮細胞でのヒトCD59の細胞表面発現を
評価するため、集密したネオマイシン抵抗性細胞クロー
ンをT-75組織培養フラスコで集密するまで成長させ、そ
して37℃で10分のVersene-EDTA中のインキュベーション
によるFACS解析に供すために、細胞を遊離させた。回収
した細胞を遠心分離によりペレットにし、次いでリン酸
緩衝食塩水(PBS)、0.2％アジ化ナトリウム、および、２
％FBSを含有する染色緩衝液２mlに再懸濁した。細胞を
次いで、血球計算器で計測し、遠心分離によりペレット
にし、染色緩衝液で２回リンスし、次いで、ヒトCD59に
対する一次抗体と10μg/mlのウサギ抗CD59ポリクローナ
ル抗体、または、１μg/mlのマウス抗CD59モノクローナ
ル1F1(Dr.Motowa Tomita、昭和大学、日本から入手し
た)のいずれかとを、23℃で30分間インキュベートし
た。次いで上記細胞をさらに染色緩衝液で２回リンス
し、そして染色緩衝液で１:50に希釈した、FITC結合の
ヤギの抗ウサギIgGまたは抗マウスIgGと、23℃で30分間
インキュベートした。上記細胞を、染色緩衝液で２回、
PBSで１回リンスし、次いで１％パラホルムアルデヒド
を含有するPBSに再懸濁し、そしてFACSにより解析し
た。細胞クローン１、２および９についてはみられるが
ネオマイシン抵抗性遺伝子のみを含有するコントロール
で感染させたコントロールPAECにはみられない、明確な
(X軸の蛍光強度により測定されるように)ヒトCD59の細
胞表面発現が、図５に示されている。
【０１９５】上記の生物学的性質に関しては、CD59で感
染させたPAECと、非感染PAECまたはコントロールベクタ
ーで感染させたPAECとは、区別されなかった。例えば、
非感染細胞と同様の増殖率が維持され、単層の過剰生育
または懸濁液中の増殖はせずに、そして接触が阻止され
る。加えて、CD59で感染させたブタ内皮細胞は、図６に
示す走査型電子顕微鏡写真で証明されるように、合成Go
rtexTM移植片に付着する能力を有していた。合成Gortex
TMシート２平方センチメートルを蒸気滅菌し、滅菌35mm
細菌学的ペトリディッシュ内に入れ、そして、１平方セ
ンチメートルのウェルを有する滅菌ステンレススチール
のフェンスをかぶせた。CD59で感染させたPAECを、上述
の培養培地0.5ml容量中１×105細胞の密度で、上記フェ
ンスのウェルの中心に移植し、そして37℃、５％CO2で
インキュベートした。２日後、上記培養物に培地を再補
給し、さらに２日後、培地を吸引除去し、そして培養物
をPBSで洗浄し、次いで、緩衝化した２％グルタルアル
デヒドおよび４％パラホルムアルデヒドで１時間固定し
た。次いで、上記フェンスを取り除き、そして上記Gort
exTMを走査型電子顕微鏡のための処理をした。図６は、
PAECが発現した細胞表面のヒトCD59が、正常内皮細胞と
同様に、合成GortexTM移植片にもよく付着することを示
している。
染させたPAECと、非感染PAECまたはコントロールベクタ
ーで感染させたPAECとは、区別されなかった。例えば、
非感染細胞と同様の増殖率が維持され、単層の過剰生育
または懸濁液中の増殖はせずに、そして接触が阻止され
る。加えて、CD59で感染させたブタ内皮細胞は、図６に
示す走査型電子顕微鏡写真で証明されるように、合成Go
rtexTM移植片に付着する能力を有していた。合成Gortex
TMシート２平方センチメートルを蒸気滅菌し、滅菌35mm
細菌学的ペトリディッシュ内に入れ、そして、１平方セ
ンチメートルのウェルを有する滅菌ステンレススチール
のフェンスをかぶせた。CD59で感染させたPAECを、上述
の培養培地0.5ml容量中１×105細胞の密度で、上記フェ
ンスのウェルの中心に移植し、そして37℃、５％CO2で
インキュベートした。２日後、上記培養物に培地を再補
給し、さらに２日後、培地を吸引除去し、そして培養物
をPBSで洗浄し、次いで、緩衝化した２％グルタルアル
デヒドおよび４％パラホルムアルデヒドで１時間固定し
た。次いで、上記フェンスを取り除き、そして上記Gort
exTMを走査型電子顕微鏡のための処理をした。図６は、
PAECが発現した細胞表面のヒトCD59が、正常内皮細胞と
同様に、合成GortexTM移植片にもよく付着することを示
している。
【０１９６】上記の生物学的活性に関しては、CD59で感
染させたPAECの、ヒト血清中の補体による細胞融解に対
する感受性をアッセイした。これを行うため、CD59で感
染させたPAEC、ベクター単独で感染させたコントロール
PAEC、および非感染PAECを、10%FBS、２mMグルタミンお
よびＰ/Ｓを含有するDMEM中に１ウェルあたり1.25×105
細胞の密度で、48ウェル組織培養プレートにプレーティ
ングした。上記培地を除去し、上記細胞をFBSを含有し
ない培地で、３回洗浄した。次に、DMEMで種々の濃度に
希釈したヒト血清を培養物に添加し、37℃で２時間イン
キュベートした。培養物中に残存する生存細胞の百分率
は、0.1％トリパンブルーでの細胞染色により算定し
た。図７は、非感染またはコントロール(ベクター単独
に感染させた)PAECの80％以上はヒト血清により死滅し
たのにひきかえ、CD59で感染させたPAECは10％以下しか
死滅しなかったことを示している。これらの結果は、ブ
タ内皮細胞の表面でのヒトCD59の発現が、抗体およびヒ
ト血清の細胞溶解活性からこれらの細胞を防御するのを
示し、インビボでのこれら細胞が補体を介する超急性拒
絶反応から防御され得ることを示している。
染させたPAECの、ヒト血清中の補体による細胞融解に対
する感受性をアッセイした。これを行うため、CD59で感
染させたPAEC、ベクター単独で感染させたコントロール
PAEC、および非感染PAECを、10%FBS、２mMグルタミンお
よびＰ/Ｓを含有するDMEM中に１ウェルあたり1.25×105
細胞の密度で、48ウェル組織培養プレートにプレーティ
ングした。上記培地を除去し、上記細胞をFBSを含有し
ない培地で、３回洗浄した。次に、DMEMで種々の濃度に
希釈したヒト血清を培養物に添加し、37℃で２時間イン
キュベートした。培養物中に残存する生存細胞の百分率
は、0.1％トリパンブルーでの細胞染色により算定し
た。図７は、非感染またはコントロール(ベクター単独
に感染させた)PAECの80％以上はヒト血清により死滅し
たのにひきかえ、CD59で感染させたPAECは10％以下しか
死滅しなかったことを示している。これらの結果は、ブ
タ内皮細胞の表面でのヒトCD59の発現が、抗体およびヒ
ト血清の細胞溶解活性からこれらの細胞を防御するのを
示し、インビボでのこれら細胞が補体を介する超急性拒
絶反応から防御され得ることを示している。
【０１９７】（実施例３）相同的組み換え遺伝子ターゲ
ティングによるインバリアント鎖遺伝子の破壊本実施例
は、マウス胚幹細胞中で、インバリアント鎖遺伝子が、
変異し、または機能を有さない形のインバリアント鎖遺
伝子と、ゲノム内において、特異的および安定的に、置
換することにより、破壊され得ること；ならびに本来の
インバリアント鎖遺伝子の、機能を有さない変異体との
置換が、変異した遺伝子および本来のインバリアント鎖
遺伝子間の相同的組み換え現象を利用する、遺伝子ター
ゲティング技術により、供試細胞中で達成され得ること
を示している。図８Ｂに、マウスインバリアント鎖遺伝
子の一部の制限酵素地図を示す。制限酵素DraIIIによる
マウスゲノムDNAの切断を行ない、このDNAをマウスイン
バリアント鎖遺伝子特異的な放射標識したプローブを用
いたサザンブロッティングにより調べると、およそ8.7k
bのインバリアント鎖遺伝子フラグメントが生じるはず
である。上記結果が得られ、そしてそれを図９に示す
(親の細胞で同定したのと同じレーン)。
ティングによるインバリアント鎖遺伝子の破壊本実施例
は、マウス胚幹細胞中で、インバリアント鎖遺伝子が、
変異し、または機能を有さない形のインバリアント鎖遺
伝子と、ゲノム内において、特異的および安定的に、置
換することにより、破壊され得ること；ならびに本来の
インバリアント鎖遺伝子の、機能を有さない変異体との
置換が、変異した遺伝子および本来のインバリアント鎖
遺伝子間の相同的組み換え現象を利用する、遺伝子ター
ゲティング技術により、供試細胞中で達成され得ること
を示している。図８Ｂに、マウスインバリアント鎖遺伝
子の一部の制限酵素地図を示す。制限酵素DraIIIによる
マウスゲノムDNAの切断を行ない、このDNAをマウスイン
バリアント鎖遺伝子特異的な放射標識したプローブを用
いたサザンブロッティングにより調べると、およそ8.7k
bのインバリアント鎖遺伝子フラグメントが生じるはず
である。上記結果が得られ、そしてそれを図９に示す
(親の細胞で同定したのと同じレーン)。
【０１９８】相同的組み換えによりマウスインバリアン
ト鎖遺伝子を破壊するため、ヌクレオチド661位および1
064位の間に、インバリアント鎖遺伝子の配列をネオマ
イシン遺伝子と交換するように、遺伝子ターゲティング
ベクターを構築した。遺伝子操作は、翻訳開始コドンAT
Gを含有するエキソン１の大部分、ならびに、Zhuおよび
Jones、1989「ネズミのインバリアント(Ii)遺伝子の完
全な配列」、Nucleic Acids Res. 17:447-448、が報告
しているインバリアント鎖遺伝子のTATAボックスおよび
CAATボックス(正確で効率のよい転写に要求される調節
エレメントとして機能する)の脱離をもたらす。
ト鎖遺伝子を破壊するため、ヌクレオチド661位および1
064位の間に、インバリアント鎖遺伝子の配列をネオマ
イシン遺伝子と交換するように、遺伝子ターゲティング
ベクターを構築した。遺伝子操作は、翻訳開始コドンAT
Gを含有するエキソン１の大部分、ならびに、Zhuおよび
Jones、1989「ネズミのインバリアント(Ii)遺伝子の完
全な配列」、Nucleic Acids Res. 17:447-448、が報告
しているインバリアント鎖遺伝子のTATAボックスおよび
CAATボックス(正確で効率のよい転写に要求される調節
エレメントとして機能する)の脱離をもたらす。
【０１９９】上記破壊ストラテジーの一般的実施例とし
て、図８Ａに本遺伝子ターゲティングベクターを示す。
上記インバリアント鎖遺伝子中の本領域の削除により、
転写および翻訳を包含する本遺伝子の全ての発現が排除
される。従って、クラスIIMHC遺伝子産物の発現が破壊
され得る。
て、図８Ａに本遺伝子ターゲティングベクターを示す。
上記インバリアント鎖遺伝子中の本領域の削除により、
転写および翻訳を包含する本遺伝子の全ての発現が排除
される。従って、クラスIIMHC遺伝子産物の発現が破壊
され得る。
【０２００】天然のインバリアント鎖遺伝子の、変異し
たインバリアント鎖遺伝子への置換は、マウス胚幹細胞
で立証された。胚幹細胞(ES細胞)は、15％FBSおよび0.1
mM 2-メルカプトエタノールを含むDMEM(高グルコース)
を含有するES生長培地で、定期的に一日おきに継代し
た。上記ES細胞を原発性胚繊維芽細胞の集密層上で維持
した。上記ES細胞を、遺伝子ターゲティングベクターで
のトランスフェクションの二日前に、上記細胞を培地中
で増殖させた。これら細胞をトランスフェクトするため
に、250μFおよび0.32kVにセットしたBioRad製エレクト
ロポレーションにより、DNA25μgに相当する上記インバ
リアントターゲティングベクターを、１×107個のES細
胞に導入した。次いで、上記ES細胞を10×100mmのNunc
TM組織培養プレート上に移植し、G418(170μg/ml)に対
するネオマイシン抵抗性により、および/または、上記
ターゲティングベクターに単純ヘルペスウイルスチミジ
ンキナーゼ遺伝子が含有される場合のいくつかの実験で
はガングシクロヴィル(gangcyclovir)により、染色体組
み込みが行われた安定なトランスフェクタントを選抜し
た。
たインバリアント鎖遺伝子への置換は、マウス胚幹細胞
で立証された。胚幹細胞(ES細胞)は、15％FBSおよび0.1
mM 2-メルカプトエタノールを含むDMEM(高グルコース)
を含有するES生長培地で、定期的に一日おきに継代し
た。上記ES細胞を原発性胚繊維芽細胞の集密層上で維持
した。上記ES細胞を、遺伝子ターゲティングベクターで
のトランスフェクションの二日前に、上記細胞を培地中
で増殖させた。これら細胞をトランスフェクトするため
に、250μFおよび0.32kVにセットしたBioRad製エレクト
ロポレーションにより、DNA25μgに相当する上記インバ
リアントターゲティングベクターを、１×107個のES細
胞に導入した。次いで、上記ES細胞を10×100mmのNunc
TM組織培養プレート上に移植し、G418(170μg/ml)に対
するネオマイシン抵抗性により、および/または、上記
ターゲティングベクターに単純ヘルペスウイルスチミジ
ンキナーゼ遺伝子が含有される場合のいくつかの実験で
はガングシクロヴィル(gangcyclovir)により、染色体組
み込みが行われた安定なトランスフェクタントを選抜し
た。
【０２０１】選抜培地で14日経過後、独立のネオマオシ
ン抵抗性コロニーを選抜し、集密した胚線維芽細胞の栄
養層上で増殖させた。55の安定なトランスフェクタント
からDNAを単離し、そして制限酵素、EcoRIかDraIIIかい
ずれかで一晩分解した。切断されたDNAは、電気泳動に
より分割し、GeneScreen+TMナイロン膜にブロットし、
次いでマウスインバリアント鎖遺伝子に特異的な放射標
識DNAプローブでハイブリダイズした。図９に示す、二
つの独立したクローン、11.10.93および11.10.128の、
ハイブリダイズしたバンドのパターンは、相同的に組み
換えられ、そして置換した内在性のインバリアント鎖遺
伝子を有する上記インバリアント鎖遺伝子の変異形(ネ
オマイシン遺伝子配列の挿入によりエキソン１は破壊さ
れている)と一致した。観測された制限酵素の切断パタ
ーンを図８Ｃに模式的に示す。組み換えの頻度は55クロ
ーン中２つと決定された。これらのデータは、従って、
本ターゲティングベクターが細胞内の本来のインバリア
ント鎖遺伝子を破壊し得ることを示している。
ン抵抗性コロニーを選抜し、集密した胚線維芽細胞の栄
養層上で増殖させた。55の安定なトランスフェクタント
からDNAを単離し、そして制限酵素、EcoRIかDraIIIかい
ずれかで一晩分解した。切断されたDNAは、電気泳動に
より分割し、GeneScreen+TMナイロン膜にブロットし、
次いでマウスインバリアント鎖遺伝子に特異的な放射標
識DNAプローブでハイブリダイズした。図９に示す、二
つの独立したクローン、11.10.93および11.10.128の、
ハイブリダイズしたバンドのパターンは、相同的に組み
換えられ、そして置換した内在性のインバリアント鎖遺
伝子を有する上記インバリアント鎖遺伝子の変異形(ネ
オマイシン遺伝子配列の挿入によりエキソン１は破壊さ
れている)と一致した。観測された制限酵素の切断パタ
ーンを図８Ｃに模式的に示す。組み換えの頻度は55クロ
ーン中２つと決定された。これらのデータは、従って、
本ターゲティングベクターが細胞内の本来のインバリア
ント鎖遺伝子を破壊し得ることを示している。
【０２０２】図１は、ヒトCD59 cDNAを含有するプラス
ミドでトランスフェクトされたCHO細胞中でのCD59抗原
の誘導のグラフで、メトトレキセート(μg/ml)に対する
125I-1F1結合(CD59分子/細胞 x 10-6)を示す。チャイニ
ーズハムスターの卵巣細胞を、pFRSVベクターおよびヒ
トCD59のcDNAを含有するプラスミドで、トランスフェク
トした。サブクローニングおよび選別の後、メトトレキ
セートを含有する培地中に上記細胞を保持し、表面の抗
原を、モノクローナル抗体125I-1F1(10μg/ml)のCD59に
対する特異的結合により測定した。すべてのデータを、
メトトレキセートの非存在下で増殖されたコントロール
(トランスフェクトされていない)CHO細胞(原株)につい
て測定された非特異的結合により補正した。データは、
異なる日にされた３つの測定の平均±標準誤差を表す。
ミドでトランスフェクトされたCHO細胞中でのCD59抗原
の誘導のグラフで、メトトレキセート(μg/ml)に対する
125I-1F1結合(CD59分子/細胞 x 10-6)を示す。チャイニ
ーズハムスターの卵巣細胞を、pFRSVベクターおよびヒ
トCD59のcDNAを含有するプラスミドで、トランスフェク
トした。サブクローニングおよび選別の後、メトトレキ
セートを含有する培地中に上記細胞を保持し、表面の抗
原を、モノクローナル抗体125I-1F1(10μg/ml)のCD59に
対する特異的結合により測定した。すべてのデータを、
メトトレキセートの非存在下で増殖されたコントロール
(トランスフェクトされていない)CHO細胞(原株)につい
て測定された非特異的結合により補正した。データは、
異なる日にされた３つの測定の平均±標準誤差を表す。
【０２０３】図２は、ホスファチジルイノシトールに特
異的なホスホリパーゼＣ(PIPLC)による細胞表面のCD59
の除去のグラフで、平均蛍光強度に対する細胞数をプロ
ットしている。１mg/mlのメトトレキセート中での増殖
で増幅され、CD59でトランスフェクトされたCHO細胞
を、HBSS中に2 × 106/mlに懸濁し、そして0(....)また
は1(---)ユニット/mlのホスファチジルイノシトールに
特異的なホスホリパーゼＣと共に、37℃で1時間インキ
ュベートした。そして、細胞表面のCD59は、モノクロー
ナル抗体1F1(10μg/ml) を使用するフローサイトメトリ
ーにより測定され、そしてそれはFITC抗マウスIgG(67μ
g/ml)により検出された。ヒストグラムは、細胞当りの
平均蛍光強度を対数スケールで表す。1F1の非存在下で
測定されたバックグラウンドの細胞蛍光強度も示す(--
-)。
異的なホスホリパーゼＣ(PIPLC)による細胞表面のCD59
の除去のグラフで、平均蛍光強度に対する細胞数をプロ
ットしている。１mg/mlのメトトレキセート中での増殖
で増幅され、CD59でトランスフェクトされたCHO細胞
を、HBSS中に2 × 106/mlに懸濁し、そして0(....)また
は1(---)ユニット/mlのホスファチジルイノシトールに
特異的なホスホリパーゼＣと共に、37℃で1時間インキ
ュベートした。そして、細胞表面のCD59は、モノクロー
ナル抗体1F1(10μg/ml) を使用するフローサイトメトリ
ーにより測定され、そしてそれはFITC抗マウスIgG(67μ
g/ml)により検出された。ヒストグラムは、細胞当りの
平均蛍光強度を対数スケールで表す。1F1の非存在下で
測定されたバックグラウンドの細胞蛍光強度も示す(--
-)。
【０２０４】図３は、ヒト血清補体から、CD59でトラン
スフェクトされたCHO細胞の防御を示すグラフで、ヒト
血清(%)に対する色素の放出率(%)を示す。CD59でトラン
スフェクトされたCHO細胞は、メトトレキセート含有培
地中での成長により、種々の量のCD59抗体；発現したCD
59分子/細胞×10-5：0.0(黒丸)、1.9(白丸)、2.8(黒ひ
し形)、6.8(白三角形)、7.2(黒四角形)、13.0(白四角
形)、および31.3(黒ひし形)の発現を誘引した。
スフェクトされたCHO細胞の防御を示すグラフで、ヒト
血清(%)に対する色素の放出率(%)を示す。CD59でトラン
スフェクトされたCHO細胞は、メトトレキセート含有培
地中での成長により、種々の量のCD59抗体；発現したCD
59分子/細胞×10-5：0.0(黒丸)、1.9(白丸)、2.8(黒ひ
し形)、6.8(白三角形)、7.2(黒四角形)、13.0(白四角
形)、および31.3(黒ひし形)の発現を誘引した。
【０２０５】図４は、実施例２で使用されるレトロウイ
スベクターの構造を示す。このベクターは、欠損モロニ
ーネズミ白血病ウイルス(Moloney murine leukemia vir
us)から構築された。SV40プロモーターは切除され、SRa
lphaプロモーターで置換された。CD59のコーディング配
列を含有する500bpのcDNAフラグメントが、XhoI中にク
ローニングされ、そして制限分析により確認された。結
果生成したプラスミドは、pRNSRαCD59と命名された。
外生レトロウイルス(ecotropic retrovirus)は、Psi-2
細胞をポリブレンと共にトランスフェクトする工程、お
よび毒性アミノグリコシドG418中で選別する工程により
生産された。両種性ウイルス(amphotropic virus)の株
は、外生ウイルスを両種性パッケージング細胞系(ampho
tropicpackaging cell line)Psi-AMに感染する工程によ
り調製され、ポリブレンの存在下で内皮細胞培養物に直
接添加され、トランスフェクタントが400μg/mlのG418
と共に選別された。
スベクターの構造を示す。このベクターは、欠損モロニ
ーネズミ白血病ウイルス(Moloney murine leukemia vir
us)から構築された。SV40プロモーターは切除され、SRa
lphaプロモーターで置換された。CD59のコーディング配
列を含有する500bpのcDNAフラグメントが、XhoI中にク
ローニングされ、そして制限分析により確認された。結
果生成したプラスミドは、pRNSRαCD59と命名された。
外生レトロウイルス(ecotropic retrovirus)は、Psi-2
細胞をポリブレンと共にトランスフェクトする工程、お
よび毒性アミノグリコシドG418中で選別する工程により
生産された。両種性ウイルス(amphotropic virus)の株
は、外生ウイルスを両種性パッケージング細胞系(ampho
tropicpackaging cell line)Psi-AMに感染する工程によ
り調製され、ポリブレンの存在下で内皮細胞培養物に直
接添加され、トランスフェクタントが400μg/mlのG418
と共に選別された。
【０２０６】図５は、抗CD59抗体で検出され、そしてフ
ローサイトメトリー分析で分析されるブタの大動脈内皮
細胞(PAEC)上のヒトCD59の細胞表面発現のグラフであ
る。実線は、コントロールネオマイシン抵抗性遺伝子だ
けを保持する図４に示されるレトロウイルスに感染され
たPAECの蛍光強度を表す。破線、小点線、および大点線
は、それぞれ、CD59-発現PAEC細胞クローン２、９、お
よび１の蛍光強度を表す。
ローサイトメトリー分析で分析されるブタの大動脈内皮
細胞(PAEC)上のヒトCD59の細胞表面発現のグラフであ
る。実線は、コントロールネオマイシン抵抗性遺伝子だ
けを保持する図４に示されるレトロウイルスに感染され
たPAECの蛍光強度を表す。破線、小点線、および大点線
は、それぞれ、CD59-発現PAEC細胞クローン２、９、お
よび１の蛍光強度を表す。
【０２０７】図６は、合成GortexTM移植片に付着するCD
59-発現PAECの走査電子顕微鏡写真を示す。図６ａはコ
ントロールGortexTMで、図６ｂ、ｃ、およびｄは、その
上にインプラントされたCD59発現細胞を伴うGortexTMで
ある。
59-発現PAECの走査電子顕微鏡写真を示す。図６ａはコ
ントロールGortexTMで、図６ｂ、ｃ、およびｄは、その
上にインプラントされたCD59発現細胞を伴うGortexTMで
ある。
【０２０８】図７は、ヒト補体による溶解からのヒトCD
59発現PAECの防御を示す棒グラフである。黒塗り棒(sol
id bar)は、ヒトCD59を発現するPAECの細胞溶解の百分
率を表す。点彩棒(stippled bar)は、コントロールの
(感染されていない)PAECの細胞溶解の百分率を表すが、
斜線棒(cross-hatched bar)は、コントロールのネオマ
イシン抵抗性遺伝子のみを発現したPAECの細胞溶解の百
分率を表す。
59発現PAECの防御を示す棒グラフである。黒塗り棒(sol
id bar)は、ヒトCD59を発現するPAECの細胞溶解の百分
率を表す。点彩棒(stippled bar)は、コントロールの
(感染されていない)PAECの細胞溶解の百分率を表すが、
斜線棒(cross-hatched bar)は、コントロールのネオマ
イシン抵抗性遺伝子のみを発現したPAECの細胞溶解の百
分率を表す。
【０２０９】図８ａは、pBS(Bluescript)中にクローン
化されたマウスのインバリアント鎖遺伝子(invariant c
hain gene)に対する、遺伝子ターゲティングベクターの
制限酵素切断マップを示す。ターゲティングベクターは
ネオマイシン遺伝子(neo)を含有する。図８ｂは、内生
マウスインバリアント鎖遺伝子の部分的制限酵素切断マ
ップを示し、そして図８ｃは、相同的組換えにより達成
される分割されたインバリアント鎖遺伝子の制限酵素切
断マップを示す。矢印は、すべての３つのパネル中での
転写の方向を示す。図９に示されるサザンブロィテイン
グに使用される放射性標識のされたインバリアント遺伝
子プローブに対する認識領域は、図８ｃの下に黒塗り棒
で示されている。
化されたマウスのインバリアント鎖遺伝子(invariant c
hain gene)に対する、遺伝子ターゲティングベクターの
制限酵素切断マップを示す。ターゲティングベクターは
ネオマイシン遺伝子(neo)を含有する。図８ｂは、内生
マウスインバリアント鎖遺伝子の部分的制限酵素切断マ
ップを示し、そして図８ｃは、相同的組換えにより達成
される分割されたインバリアント鎖遺伝子の制限酵素切
断マップを示す。矢印は、すべての３つのパネル中での
転写の方向を示す。図９に示されるサザンブロィテイン
グに使用される放射性標識のされたインバリアント遺伝
子プローブに対する認識領域は、図８ｃの下に黒塗り棒
で示されている。
【０２１０】図９は、内生インバリアント鎖遺伝子が相
同的組換えにより分割され、その遺伝子の突然変異型と
置換された、２つの独立したネオマイシン抵抗性マウス
胚幹細胞クローンに対する制限酵素切断パターンを示す
サザンブロットである。この２つのクローンは、11.10.
93および11.10.128と名づけられる。サイズマーカーは
左側に示されている。親細胞のDraIII制限パターンは右
端のレーンに示され、改変されたインバリアント鎖遺伝
子を保持する２つのクローンの制限パターンと明らかに
異なる。
同的組換えにより分割され、その遺伝子の突然変異型と
置換された、２つの独立したネオマイシン抵抗性マウス
胚幹細胞クローンに対する制限酵素切断パターンを示す
サザンブロットである。この２つのクローンは、11.10.
93および11.10.128と名づけられる。サイズマーカーは
左側に示されている。親細胞のDraIII制限パターンは右
端のレーンに示され、改変されたインバリアント鎖遺伝
子を保持する２つのクローンの制限パターンと明らかに
異なる。
【０２１１】本明細書中の開示から、本発明の範囲およ
び意図からはずれない種々の改変は、当業者には明らか
である。上記の請求の範囲は、本明細書中に記載の特定
の実施態様、および、そのような改変物、変形物、およ
び同等物についてもカバーするすることを意図する。
び意図からはずれない種々の改変は、当業者には明らか
である。上記の請求の範囲は、本明細書中に記載の特定
の実施態様、および、そのような改変物、変形物、およ
び同等物についてもカバーするすることを意図する。
【０２１２】
【発明の効果】本発明によって、遺伝学的に操作された
内皮細胞、特に、非自己の宿主中へ導入されたときに、
補体による溶解を阻害し、異質の細胞を排除する宿主の
免疫機構を回避するように改変された内皮細胞が提供さ
れる。
内皮細胞、特に、非自己の宿主中へ導入されたときに、
補体による溶解を阻害し、異質の細胞を排除する宿主の
免疫機構を回避するように改変された内皮細胞が提供さ
れる。
【０２１３】
【０２１４】
【配列番号：１】 配列の長さ：2124 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源 生物名：ホモサピエンス 直接の起源 ライブラリー名：GenBank HUMCD46Q クローン名：HUMCD46 cDNA 配列 GAATTCGGGG ATAACAGCGT CTTCCGCGCC GCGCATGGAG CCTCCCGGCC GCCGCGAGTG 60 TCCCTTTCCT TCCTGGCGCT TTCCTGGGTT GCTTCTGGCG GCCATGGTGT TGCTGCTGTA 120 CTCCTTCTCC GATGCCTGTG AGGAGCCACC AACATTTGAA GCTATGGAGC TCATTGGTAA 180 ACCAAAACCC TACTATGAGA TTGGTGAACG AGTAGATTAT AAGTGTAAAA AAGGATACTT 240 CTATATACCT CCTCTTGCCA CCCATACTAT TTGTGATCGG AATCATACAT GGCTACCTGT 300 CTCAGATGAC GCCTGTTATA GAGAAACATG TCCATATATA CGGGATCCTT TAAATGGCCA 360 AGCAGTCCCT GCAAATGGGA CTTACGAGTT TGGTTATCAG ATGCACTTTA TTTGTAATGA 420 GGGTTATTAC TTAATTGGTG AAGAAATTCT ATATTGTGAA CTTAAAGGAT CAGTAGCAAT 480 TTGGAGCGGT AAGCCCCCAA TATGTGAAAA GGTTTTGTGT ACACCACCTC CAAAAATAAA 540 AAATGGAAAA CACACCTTTA GTGAAGTAGA AGTATTTGAG TATCTTGATG CAGTAACTTA 600 TAGTTGTGAT CCTGCACCTG GACCAGATCC ATTTTCACTT ATTGGAGAGA GCACGATTTA 660 TTGTGGTGAC AATTCAGTGT GGAGTCGTGC TGCTCCAGAG TGTAAAGTGG TCAAATGTCG 720 ATTTCCAGTA GTCGAAAATG GAAAACAGAT ATCAGGATTT GGAAAAAAAT TTTACTACAA 780 AGCAACAGTT ATGTTTGAAT GCGATAAGGG TTTTTACCTC GATGGCAGCG ACACAATTGT 840 CTGTGACAGT AACAGTACTT GGGATCCCCC AGTTCCAAAG TGTCTTAAAG TGTCGACTTC 900 TTCCACTACA AAATCTCCAG CGTCCAGTGC CTCAGGTCCT AGGCCTACTT ACAAGCCTCC 960 AGTCTCAAAT TATCCAGGAT ATCCTAAACC TGAGGAAGGA ATACTTGACA GTTTGGATGT 1020 TTGGGTCATT GCTGTGATTG TTATTGCCAT AGTTGTTGGA GTTGCAGTAA TTTGTGTTGT 1080 CCCGTACAGA TATCTTCAAA GGAGGAAGAA GAAAGGCACA TACCTAACTG ATGAGACCCA 1140 CAGAGAAGTA AAATTTACTT CTCTCTGAGA AGGAGAGATG AGAGAAAGGT TTGCTTTTAT 1200 CATTAAAAGG AAAGCAGATG GTGGAGCTGA ATATGCCACT TACCAGACTA AATCAACCAC 1260 TCCAGCAGAG CAGAGAGGCT GAATAGATTC CACAACCTGG TTTGCCAGTT CATCTTTTGA 1320 CTCTATTAAA ATCTTCAATA GTTGTTATTC TGTAGTTTCA CTCTCATGAG TGCAACTGTG 1380 GCTTAGCTAA TATTGCAATG TGGCTTGAAT GTAGGTAGCA TCCTTTGATG CTTCTTTGAA 1440 ACTTGTATGA ATTTGGGTAT GAACAGATTG CCTGCTTTCC CTTAAATAAC ACTTAGATTT 1500 ATTGGACCAG TCAGCACAGC ATGCCTGGTT GTATTAAAGC AGGGATATGC TGTATTTTAT 1560 AAAATTGGCA AAATTAGAGA AATATAGTTC ACAATGAAAT TATATTTTCT TTGTAAAGAA 1620 AGTGGCTTGA AATCTTTTTT GTTCAAAGAT TAATGCCAAC TCTTAAGATT ATTCTTTCAC 1680 CAACTATAGA ATGTATTTTA TATATCGTTC ATTGTAAAAA GCCCTTAAAA ATATGTGTAT 1740 ACTACTTTGG CTCTTGTGCA TAAAAACAAG AACACTGAAA ATTGGGAATA TGCACAAACT 1800 TGGCTTCTTT AACCAAGAAT ATTATTGGAA AATTCTCTAA AAGTAAAGGG TAAATTCTCT 1860 ATTTTTTGTA ATGTGTTCGG TGATTTCAGA AAGCTAGAAA GTGTATGTGT GGCATTTGTT 1920 TTCACTTTTT AAAACATCCC TAACTGATCG AATATATCAG TAATTTCAGA ATCAGATGCA 1980 TCCTTTCATA AGAAGTGAGA GGACTCTGAC AGCCATAACA GGAGTGCCAC TTCATGGTGC 2040 GAAGTGAACA CTGTAGTCTT GTTGTTTTCC CAAAGAGAAC TCCGTATGTT CTCTTAGGTT 2100 GAGTAACCCA CTCTGCCCGA ATTC 2124
【０２１５】
【配列番号：２】 配列の長さ：2847 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源 生物名：ホモサピエンス 直接の起源 ライブラリー名：GenBank HUMDAF; HUMDAFC1 クローン名：ヒト DAF cDNA 配列の特徴 特徴を表す記号：misc feature 存在位置：1..819 他の情報：／注＝“HUMDAFC1 (Exon 1のプロモーターお
よび5'末端、ゲノム配列)” 配列 TTCTCTCTAC AGTCAGTCTG GAGTAATCCC AAAGTGGTGT CTTTCGTAAA TAAGGAGAAC 60 CCGGGTGAAG AAAATGACTC CCACCCGAAC AAGGCATGAA CAATGTTCAC TCCCTACTGT 120 GTTATTCAAC CTGTTTCCCC AGGTCTCTGT TTTCACATTA GAGAGTGTTC TAGGAGATGA 180 CGCCCTTCCT CCTTAGTTAT TTCCCCACCC TCGTGCTGGC CTTTGACAGA CCTCCCAGTA 240 GAGGGCCCAA GACGCGGGTA GAGCACCGCG TCTCAGCGCC TGAGTCTCAG CCCCCGAACT 300 CCACCGCACC TCGAGGTCCC CTTGGCACGA CTCAAGCGCG GGGATGCTCC GCTTAGACGA 360 ACTCACGTGC GGGCAGCAAG GCCTGCGATA CTTGAGCACC CCTCCCCCTC TCCCGTTTAC 420 ACCCCGTTTG TGTTTACGTA GCGAGGAGAT ATTTAGGTTT CTAGAAGGCA GGTCATCGCA 480 GGCCCCACCC AGCAGTGGAG AGAGTGAGTC CAGAGGGTGT TGCCAGGAGC TCCTCCTCCT 540 TCCCCTCCCC ACTCTCCCCG AGTCTAGGGC CCCGGGGTAT GACGCCGGAG CCCTCTGACC 600 GCACCTCTGA CCACAACAAA CCCCTACTCC ACCCGTCTTG TTTGTCCCAC CCTTGGTGAC 660 GCAGAGCCCC AGCCCAGACC CCGCCCAAAG CACTCATTTA ACTGGTATTG CGGAGCCACG 720 AGGCTTCTGA CTTACTGCAA CTCGCTCCGG CCGCTGGGCG TAGCTGCGAC TCGGCGGAGT 780 CCCGGCGGCG CGTCCTTGTT CTAACCCGGC GCGCCATGAC CGTCGCGCGG CCGAGCGTGC 840 CCGCGGCGCT GCCCCTCCTC GGGGAGCTGC CCCGGCTGCT GCTGCTGGTG CTGTTGTGCC 900 TGCCGGCCGT GTGGGGTGAC TGTGGCCTTC CCCCAGATGT ACCTAATGCC CAGCCAGCTT 960 TGGAAGGCCG TACAAGTTTT CCCGAGGATA CTGTAATAAC GTACAAATGT GAAGAAAGCT 1020 TTGTGAAAAT TCCTGGCGAG AAGGACTCAG TGACCTGCCT TAAGGGCATG CAATGGTCAG 1080 ATATTGAAGA GTTCTGCAAT CGTAGCTGCG AGGTGCCAAC AAGGCTAAAT TCTGCATCCC 1140 TCAAACAGCC TTATATCACT CAGAATTATT TTCCAGTCGG TACTGTTGTG GAATATGAGT 1200 GCCGTCCAGG TTACAGAAGA GAACCTTCTC TATCACCAAA ACTAACTTGC CTTCAGAATT 1260 TAAAATGGTC CACAGCAGTC GAATTTTGTA AAAAGAAATC ATGCCCTAAT CCGGGAGAAA 1320 TACGAAATGG TCAGATTGAT GTACCAGGTG GCATATTATT TGGTGCAACC ATCTCCTTCT 1380 CATGTAACAC AGGGTACAAA TTATTTGGCT CGACTTCTAG TTTTTGTCTT ATTTCAGGCA 1440 GCTCTGTCCA GTGGAGTGAC CCGTTGCCAG AGTGCAGAGA AATTTATTGT CCAGCACCAC 1500 CACAAATTGA CAATGGAATA ATTCAAGGGG AACGTGACCA TTATGGATAT AGACAGTCTG 1560 TAACGTATGC ATGTAATAAA GGATTCACCA TGATTGGAGA GCACTCTATT TATTGTACTG 1620 TGAATAATGA TGAAGGAGAG TGGAGTGGCC CACCACCTGA ATGCAGAGGA AAATCTCTAA 1680 CTTCCAAGGT CCCACCAACA GTTCAGAAAC CTACCACAGT AAATGTTCCA ACTACAGAAG 1740 TCTCACCAAC TTCTCAGAAA ACCACCACAA AAACCACCAC ACCAAATGCT CAAGCAACAC 1800 GGAGTACACC TGTTTCCAGG ACAACCAAGC ATTTTCATGA AACAACCCCA AATAAAGGAA 1860 GTGGAACCAC TTCAGGTACT ACCCGTCTTC TATCTGGGCA CACGTGTTTC ACGTTGACAG 1920 GTTTGCTTGG GACGCTAGTA ACCATGGGCT TGCTGACTTA GCCAAAGAAG AGTTAAGAAG 1980 AAAATACACA CAAGTATACA GACTGTTCCT AGTTTCTTAG ACTTATCTGC ATATTGGATA 2040 AAATAAATGC AATTGTGCTC TTCATTTAGG ATGCTTTCAT TGTCTTTAAG ATGTGTTAGG 2100 AATGTCAACA GAGCAAGGAG AAAAAAGGCA GTCCTGGAAT CACATTCTTA GCACACCTGC 2160 GCCTCTTGAA AATAGAACAA CTTGCAGAAT TGAGAGTGAT TCCTTTCCTA AAAGTGTAAG 2220 AAAGCATAGA GATTTGTTCG TATTAAGAAT GGGATCACGA GGAAAAGAGA AGGAAAGTGA 2280 TTTTTTTCCA CAAGATCTGA AATGATATTT CCACTTATAA AGGAAATAAA AAATGAAAAA 2340 CATTATTTGG ATATCAAAAG CAAATAAAAA CCCAATTCAG TCTCTTCTAA GCAAAATTGC 2400 TAAAGAGAGA TGACCACATT ATAAAGTAAT CTTTGGCTAA GGCATTTTCA TCTTTCCTTC 2460 GGTTGGCAAA ATATTTTAAA GGTAAAACAT GCTGGTGAAC CAGGGTGTTG ATGGTGATAA 2520 GGGAGGAATA TAGAATGAAA GACTGAATCT TCCTTTGTTG CACAAATAGA GTTTGGAAAA 2580 AGCCTGTGAA AGGTGTCTTC TTTGACTTAA TGTCTTTAAA AGTATCCAGA GATACTACAA 2640 TATTAACATA AGAAAAGATT ATATATTATT TCTGAATCGA GATGTCCATA GTCAAATTTG 2700 TAAATCTTAT TCTTTTGTAA TATTTATTTA TATTTATTTA TGACAGTGAA CATTCTGATT 2760 TTACATGTAA AACAAGAAAA GTTGAAGAAG ATATGTGAAG AAAAATGTAT TTTTCCTAAA 2820 TAGAAATAAA TGATCCCATT TTTTGGT 2847
よび5'末端、ゲノム配列)” 配列 TTCTCTCTAC AGTCAGTCTG GAGTAATCCC AAAGTGGTGT CTTTCGTAAA TAAGGAGAAC 60 CCGGGTGAAG AAAATGACTC CCACCCGAAC AAGGCATGAA CAATGTTCAC TCCCTACTGT 120 GTTATTCAAC CTGTTTCCCC AGGTCTCTGT TTTCACATTA GAGAGTGTTC TAGGAGATGA 180 CGCCCTTCCT CCTTAGTTAT TTCCCCACCC TCGTGCTGGC CTTTGACAGA CCTCCCAGTA 240 GAGGGCCCAA GACGCGGGTA GAGCACCGCG TCTCAGCGCC TGAGTCTCAG CCCCCGAACT 300 CCACCGCACC TCGAGGTCCC CTTGGCACGA CTCAAGCGCG GGGATGCTCC GCTTAGACGA 360 ACTCACGTGC GGGCAGCAAG GCCTGCGATA CTTGAGCACC CCTCCCCCTC TCCCGTTTAC 420 ACCCCGTTTG TGTTTACGTA GCGAGGAGAT ATTTAGGTTT CTAGAAGGCA GGTCATCGCA 480 GGCCCCACCC AGCAGTGGAG AGAGTGAGTC CAGAGGGTGT TGCCAGGAGC TCCTCCTCCT 540 TCCCCTCCCC ACTCTCCCCG AGTCTAGGGC CCCGGGGTAT GACGCCGGAG CCCTCTGACC 600 GCACCTCTGA CCACAACAAA CCCCTACTCC ACCCGTCTTG TTTGTCCCAC CCTTGGTGAC 660 GCAGAGCCCC AGCCCAGACC CCGCCCAAAG CACTCATTTA ACTGGTATTG CGGAGCCACG 720 AGGCTTCTGA CTTACTGCAA CTCGCTCCGG CCGCTGGGCG TAGCTGCGAC TCGGCGGAGT 780 CCCGGCGGCG CGTCCTTGTT CTAACCCGGC GCGCCATGAC CGTCGCGCGG CCGAGCGTGC 840 CCGCGGCGCT GCCCCTCCTC GGGGAGCTGC CCCGGCTGCT GCTGCTGGTG CTGTTGTGCC 900 TGCCGGCCGT GTGGGGTGAC TGTGGCCTTC CCCCAGATGT ACCTAATGCC CAGCCAGCTT 960 TGGAAGGCCG TACAAGTTTT CCCGAGGATA CTGTAATAAC GTACAAATGT GAAGAAAGCT 1020 TTGTGAAAAT TCCTGGCGAG AAGGACTCAG TGACCTGCCT TAAGGGCATG CAATGGTCAG 1080 ATATTGAAGA GTTCTGCAAT CGTAGCTGCG AGGTGCCAAC AAGGCTAAAT TCTGCATCCC 1140 TCAAACAGCC TTATATCACT CAGAATTATT TTCCAGTCGG TACTGTTGTG GAATATGAGT 1200 GCCGTCCAGG TTACAGAAGA GAACCTTCTC TATCACCAAA ACTAACTTGC CTTCAGAATT 1260 TAAAATGGTC CACAGCAGTC GAATTTTGTA AAAAGAAATC ATGCCCTAAT CCGGGAGAAA 1320 TACGAAATGG TCAGATTGAT GTACCAGGTG GCATATTATT TGGTGCAACC ATCTCCTTCT 1380 CATGTAACAC AGGGTACAAA TTATTTGGCT CGACTTCTAG TTTTTGTCTT ATTTCAGGCA 1440 GCTCTGTCCA GTGGAGTGAC CCGTTGCCAG AGTGCAGAGA AATTTATTGT CCAGCACCAC 1500 CACAAATTGA CAATGGAATA ATTCAAGGGG AACGTGACCA TTATGGATAT AGACAGTCTG 1560 TAACGTATGC ATGTAATAAA GGATTCACCA TGATTGGAGA GCACTCTATT TATTGTACTG 1620 TGAATAATGA TGAAGGAGAG TGGAGTGGCC CACCACCTGA ATGCAGAGGA AAATCTCTAA 1680 CTTCCAAGGT CCCACCAACA GTTCAGAAAC CTACCACAGT AAATGTTCCA ACTACAGAAG 1740 TCTCACCAAC TTCTCAGAAA ACCACCACAA AAACCACCAC ACCAAATGCT CAAGCAACAC 1800 GGAGTACACC TGTTTCCAGG ACAACCAAGC ATTTTCATGA AACAACCCCA AATAAAGGAA 1860 GTGGAACCAC TTCAGGTACT ACCCGTCTTC TATCTGGGCA CACGTGTTTC ACGTTGACAG 1920 GTTTGCTTGG GACGCTAGTA ACCATGGGCT TGCTGACTTA GCCAAAGAAG AGTTAAGAAG 1980 AAAATACACA CAAGTATACA GACTGTTCCT AGTTTCTTAG ACTTATCTGC ATATTGGATA 2040 AAATAAATGC AATTGTGCTC TTCATTTAGG ATGCTTTCAT TGTCTTTAAG ATGTGTTAGG 2100 AATGTCAACA GAGCAAGGAG AAAAAAGGCA GTCCTGGAAT CACATTCTTA GCACACCTGC 2160 GCCTCTTGAA AATAGAACAA CTTGCAGAAT TGAGAGTGAT TCCTTTCCTA AAAGTGTAAG 2220 AAAGCATAGA GATTTGTTCG TATTAAGAAT GGGATCACGA GGAAAAGAGA AGGAAAGTGA 2280 TTTTTTTCCA CAAGATCTGA AATGATATTT CCACTTATAA AGGAAATAAA AAATGAAAAA 2340 CATTATTTGG ATATCAAAAG CAAATAAAAA CCCAATTCAG TCTCTTCTAA GCAAAATTGC 2400 TAAAGAGAGA TGACCACATT ATAAAGTAAT CTTTGGCTAA GGCATTTTCA TCTTTCCTTC 2460 GGTTGGCAAA ATATTTTAAA GGTAAAACAT GCTGGTGAAC CAGGGTGTTG ATGGTGATAA 2520 GGGAGGAATA TAGAATGAAA GACTGAATCT TCCTTTGTTG CACAAATAGA GTTTGGAAAA 2580 AGCCTGTGAA AGGTGTCTTC TTTGACTTAA TGTCTTTAAA AGTATCCAGA GATACTACAA 2640 TATTAACATA AGAAAAGATT ATATATTATT TCTGAATCGA GATGTCCATA GTCAAATTTG 2700 TAAATCTTAT TCTTTTGTAA TATTTATTTA TATTTATTTA TGACAGTGAA CATTCTGATT 2760 TTACATGTAA AACAAGAAAA GTTGAAGAAG ATATGTGAAG AAAAATGTAT TTTTCCTAAA 2820 TAGAAATAAA TGATCCCATT TTTTGGT 2847
【０２１６】
【配列番号：３】 配列の長さ：103 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO フラグメント型：Ｎ末端 起源 生物名：ホモサピエンス 直接の起源 クローン名：CD59 配列 Leu Gln Cys Tyr Asn Cys Pro Asn Pro Thr Ala Asp Cys Lys Thr Ala 1 5 10 15 Val Asn Cys Ser Ser Asp Phe Asp Ala Cys Leu Ile Thr Lys Ala Gly 20 25 30 Leu Gln Val Tyr Asn Lys Cys Trp Lys Phe Glu His Cys Asn Phe Asn 30 40 45 Asp Val Thr Thr Arg Leu Arg Glu Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Cys Cys 50 55 60 Lys Lys Asp Leu Cys Asn Phe Asn Glu Gln Leu Glu Asn Gly Gly Thr 65 70 75 80 Ser Leu Ser Glu Lys Thr Val Leu Leu Leu Val Thr Pro Phe Leu Ala 85 90 95 Ala Ala Trp Ser Leu His Pro 100
【０２１７】
【配列番号：４】 配列の長さ：315 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源 生物名：ホモサピエンス 直接の起源 クローン名：CD59 配列 CTGCAGTGCT ACAACTGTCC TAACCCAACT GCTGACTGCA AAACAGCCGT CAATTGTTCA 60 TCTGATTTTG ATGCGTGTCT CATTACCAAA GCTGGGTTAC AAGTGTATAA CAAGTGTTGG 120 AAGTTTGAGC ATTGCAATTT CAACGACGTC ACAACCCGCT TGAGGGAAAA TGAGCTAACG 180 TACTACTGCT GCAAGAAGGA CCTGTGTAAC TTTAACGAAC AGCTTGAAAA TGGTGGGACA 240 TCCTTATCAG AGAAAACAGT TCTTCTGCTG GTGACTCCAT TTCTGGCAGC AGCCTGGAGC 300 CTTCATCCCT AAGTC 315
【図１】ヒトCD59 cDNAを含有するプラスミドでトラン
スフェクトされたCHO細胞中でのCD59抗原の誘導のグラ
フである。
スフェクトされたCHO細胞中でのCD59抗原の誘導のグラ
フである。
【図２】ホスファチジルイノシトールに特異的なホスホ
リパーゼＣ(PIPLC)による細胞表面のCD59の除去のグラ
フである。
リパーゼＣ(PIPLC)による細胞表面のCD59の除去のグラ
フである。
【図３】ヒト血清補体から、CD59でトランスフェクトさ
れたCHO細胞の防御を示すグラフである。
れたCHO細胞の防御を示すグラフである。
【図４】実施例２で使用されるレトロウイスベクターの
概略図である。
概略図である。
【図５】ブタの大動脈内皮細胞(PAEC)上のヒトCD59の細
胞表面発現のグラフである。
胞表面発現のグラフである。
【図６ａ】合成GortexTM移植片に付着するCD59-発現PAE
Cの走査電子顕微鏡写真である。
Cの走査電子顕微鏡写真である。
【図６ｂ】合成GortexTM移植片に付着するCD59-発現PAE
Cの走査電子顕微鏡写真である。
Cの走査電子顕微鏡写真である。
【図６ｃ】合成GortexTM移植片に付着するCD59-発現PAE
Cの走査電子顕微鏡写真である。
Cの走査電子顕微鏡写真である。
【図６ｄ】合成GortexTM移植片に付着するCD59-発現PAE
Cの走査電子顕微鏡写真である。
Cの走査電子顕微鏡写真である。
【図７】ヒト補体による溶解からのヒトCD59発現PAECの
防御を示す棒グラフである。
防御を示す棒グラフである。
【図８ａ】pBS中にクローン化されたマウスのインバリ
アント鎖遺伝子に対する、遺伝子ターゲティングベクタ
ーの制限酵素切断地図である。
アント鎖遺伝子に対する、遺伝子ターゲティングベクタ
ーの制限酵素切断地図である。
【図８ｂ】内生マウスインバリアント鎖遺伝子の部分的
制限酵素切断地図である。
制限酵素切断地図である。
【図８ｃ】相同的組換えにより達成される分割されたイ
ンバリアント鎖遺伝子の制限酵素切断地図である。
ンバリアント鎖遺伝子の制限酵素切断地図である。
【図９】２つの独立したネオマイシン抵抗性マウス胚幹
細胞クローンに対する制限酵素切断パターンを示すサザ
ンブロットのＸ線写真である。
細胞クローンに対する制限酵素切断パターンを示すサザ
ンブロットのＸ線写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 594003676 825 Ｎ．Ｅ． 13ｔｈ Ｓｔｒｅｅｔ, Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｃｉｔｙ，Ｏｋｌａｈ ｏｍａ 73104，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔ ｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 ピーター ジェイ．サイムズ アメリカ合衆国 オクラホマ 73106 オ クラホマ シティ，エヌ． ダブリュー. シックスティーンス ストリート 800 (72)発明者 アルフレッド エル． エム． ボスウェ ル アメリカ合衆国 コネティカット 06437 ギルフォード，ジェインウェイ ドライ ブ 188 (72)発明者 アイリーン エイ． エリオット アメリカ合衆国 コネティカット 06511 ニュー ヘブン，ヨーク ストリート 129 (72)発明者 リチャード エイ． フラベル アメリカ合衆国 コネティカット 06419 キリングワース，レザボワー ロード 182 (72)発明者 ジョーゼフ マドリ アメリカ合衆国 コネティカット 06417 ノース ブランフォード，ウェスト ポ ンド ロード エクステンション 277 (72)発明者 スコット ロリンズ アメリカ合衆国 コネティカット 06468 モンロー，ナットメグ サークル 12 (72)発明者 レオナード ベル アメリカ合衆国 コネティカット 06525 ウッドブリッジ，タンブル ブルック ロード 59 (72)発明者 スティーブン スキント アメリカ合衆国 ニューヨーク 10533 アービントン，バーチ レイン 281
Claims (1)
- 【請求項１】 ヒトまたは動物への移植用の遺伝学的に
操作された哺乳動物細胞であって、 細胞あたり103より多いかまたは等しいCD59分子、ある
いは、原形質膜表面の１μm2あたり１分子より多いかま
たは等しいCD59抗原をその表面上に有する、細胞。
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