KR102113108B1 - 키메라 주요 조직적합성 복합체 （ｍｈｃ） 제ｉｉ부류 분자들을 발현하는 유전자전이 마우스 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 사람화된 MHC II 단백질(사람화된 MHC IIα 및 β 폴리펩타이드들)을 발현하는 유전적으로 변형된 비-사람 동물, 및 또한 이들 단백질을 포함하는 배아, 세포, 및 조직을 제공한다. 또한, 상기 유전적으로 변형된 동물들을 제조하기 위한 작제물 및 이를 제조하는 방법들도 제공된다. 유전적으로 변형된 동물들을 사용하여 사람 면역계의 다양한 양상들을 연구하는 방법들이 제공된다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은, 2011년 10월 28일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/552,584호에 대한 우선권의 이익을 청구하고, 이의 전문은 본원에 인용에 의해 포함된다.
본 발명의 분야
본 발명은, 유전자 조작되어 사람화된 주요 조직적합성 복합체(MHC) 제II 부류 단백질을 발현하는 비-사람 동물, 예를 들면, 설치류(예를 들면, 마우스 또는 래트), 및 또한 이를 발현하는 배아, 조직, 및 세포에 관한 것이다. 본 발명은, 추가로, 사람화된 MHC II 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 비-사람 동물을 제조하는 방법들에 관한 것이다. 또한, 림프구들을 활성화시키고 T 세포들을 관여(engaging)하도록 하는 펩타이드들을 동정하고, 사람 백신들 및 다른 치료제들을 개발하기 위해 사람화된 MHC 제II 부류 단백질을 발현하는 비-사람 동물, 세포, 및 조직을 사용하는 방법들도 제공된다.
적응성 면역 반응(adaptive immune response)에서, 외부 항원들은 B 림프구들(예를 들면, 면역글로불린들) 및 T 림프구들(예를 들면, T 세포 수용체 또는 TCR) 상의 수용체 분자들에 의해 인식된다. 이들 외부 항원들은, 일반적으로, 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자들로서 언급되는, 전문화된 단백질들에 의해 펩타이드 단편들로서 세포의 표면 상에 제시된다. MHC 분자들은 약 4Mb에 걸친 유전자들의 연결된 클러스터(cluster)로 발견되는 다수의 유전자좌(locus)들에 의해 암호화된다. 마우스에서, MHC 유전자들은 17번 염색체 상에서 발견되며, 조직학적 이유로 조직적합성 2(H-2) 유전자들로서 언급된다. 사람에서, 당해 유전자들은 6번 염색체 상에서 발견되며, 사람 백혈구 항원(HLA) 유전자라고 칭한다. 마우스 및 사람에서 유전자좌는 다유전자성이고; 이들은, 사람 및 뮤린 게놈(genome)에서 유사한 조직화를 나타내는, 3개의 고도로 다형성인 부류들(제I, 제II 및 제III 부류)의 MHC 유전자들을 포함한다(참조: 각각 도 2 및 도 3).
MHC 유전자좌들은 게놈 내에서 최대의 다형성(polymorphism)을 나타내며; 일부 유전자들은 300 초과의 대립형질들(예를 들면, 사람 HLA-DRβ 및 사람 HLA-B)로 나타낸다. 모든 제I 및 제II 부류 MHC 유전자들은 펩타이드 단편들을 제시하지만, 각각의 유전자는, 다형성을 반영하는 상이한 결합 특성들을 갖는 단백질들 및 대립형질 변이체들을 발현한다. 임의의 제공된 개인도 면역 반응 과정에서 B 및 T 세포들에 대해 세포 표면 상에 제시될 수 있는 고유한 범위의 펩타이드 단편들을 갖는다.
사람 및 마우스는 둘 다 제II 부류 MHC 유전자들(참조: 도 2 및 도 3)을 갖는다. 사람에서, 전통적인 MHC II 유전자들은 HLA-DP, HLA-DQ, 및 HLA-DR로 명명되고, 한편, 마우스에서 이들은 H-2A 및 H-2E(흔히 I-A 및 I-E로 각각 약기됨)이다. MHC II 유전자좌 내의 유전자들에 의해 암호화된 추가의 단백질들인, 사람들에서의 HLA-DM 및 HLA-DO, 및 마우스들에서의 H-2M 및 H-2O는 세포 표면 상에서는 발견되지 않지만, 식균작용의 격실(endocytic compartment) 내에 체류하여 펩타이드들을 지닌 MHC II 분자들의 적절한 로딩(loading)을 보장한다. 제II 부류 분자들은 2개의 폴리펩타이드 쇄들: α 쇄 및 β 쇄로 이루어져 있다. α 쇄의 세포외 부분은 2개의 세포외 도메인들, α1 및 α2를 함유하며; β 쇄의 세포외 부분은 또한 2개의 세포외 도메인들, β1 및 β2를 함유한다(참조: 도 1). α 쇄 및 β 쇄들은 서로 비-공유적으로 연합되어 있다.
MHC 제II 부류 분자들은 염증 등의 과정 동안에 항원-제시 세포(antigen-presenting cell: APC), 예를 들면, B 세포, 대식세포, 수지상 세포, 내피 세포 상에서 발현된다. APC의 표면 상에 발현된 MHC 제II 분자들은 전형적으로 세포내 소포 내에서 CD4+ T 세포들에 대해 생성된 항원들을 나타낸다. CD4+ T 세포 관여(engagement)에 참여하기 위하여, 목적하는 항원과의 MHC 제II 부류 복합체는 충분히 안정하여 CD4+ T 세포를 관여시키기에 충분히 오래 생존하여야 한다. CD4+ T 헬퍼 세포(helper cell)가 APC의 표면 상에서 외부 펩타이드/MHC II 복합체에 의해 관여되는 경우, T 세포는 활성화되어 침입자(invader)에 대한 면역 반응을 보조하는 사이토카인을 방출한다.
모든 항원이 내성 메커니즘들로 인하여 T 세포 활성화를 유발하지는 않을 것이다. 그러나, 일부 질환(예를 들면, 암, 자가면역 질환)에서 자기-단백질(self-protein)로부터 유도된 펩타이드들은 면역계의 세포 구성성분의 표적이 되고, 이는, 이러한 펩타이드들을 제시하는 세포들의 파괴를 초래한다. 임상적으로 유의한 항원들(예를 들면, 다양한 유형들의 암과 관련된 항원들)을 인식하는데 있어서 유의한 진보가 존재하여 왔다. 그러나, 특히 임상적으로 유의한 항원들의 펩타이드들에 대해, 사람 T 세포에서 적합한 반응을 유발할 펩타이드들의 동정 및 선택을 개선시키기 위하여, 사람 면역계의 양상들을 모사하는 생체내(in vivo) 및 시험관내(in vitro) 시스템들에 대한 필요성이 남아 있다. 따라서, 사람 면역계의 구성성분들을 나타낼 수 있는 생물학적 시스템들(예를 들면, 유전적으로 변형된 비-사람 동물들 및 세포들)에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명의 요약
사람 MHC 제II 부류 단백질들 및 이의 키메라(chimera)와 관련되어 있고, CD4+ T 세포들에 결합하는 펩타이드들을 생성하거나 동정하기 위한 생물학적 시스템이 제공된다. 세포의 면역 반응에서 기능하는 사람화된 분자들을 발현하는 비-사람 세포들을 포함하는 비-사람 동물들이 제공된다. 또한, 사람화된 MHC II 단백질들을 암호화하는 사람화된 설치류 유전자좌들도 제공된다. 또한, 사람화된 MHC 분자들을 발현하는 사람화된 설치류 세포들도 제공된다. 사람화된 설치류 세포들을 포함하는 생체내 및 시험관내 시스템들이 제공되고, 여기서, 상기 설치류 세포들은 하나 이상의 사람화된 면역계 분자들을 발현한다.
본원에는 사람화된 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 이의 게놈 내에 포함하는 비-사람 동물, 예를 들면, 설치류(예를 들면, 마우스 또는 래트)가 제공되며, 여기서, 상기 사람화된 MHC II 복합체의 사람 부분은 사람 MHC II 복합체의 세포외 도메인, 예를 들면, 사람화된 MHC IIα 세포외 도메인 및 사람화된 MHC IIβ 세포외 도메인을 포함한다.
한 양상에서, 본원에는, 내인성 MHC IIα 유전자 유전자좌에 키메라 사람/비-사람 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비-사람 동물이 제공된다. 한 실시형태에서, 이러한 키메라 사람/비-사람 MHC IIα 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC IIα 세포외 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 비-사람 동물은 동물의 세포의 표면 상에서 기능성 MHC II 복합체를 발현한다. 한 실시형태에서, 동물 내의 사람 MHC IIα 세포외 도메인은 사람 MHC IIα1 및 α2 도메인들을 포함하고; 한 실시형태에서, 키메라 사람/비-사람 MHC IIα 폴리펩타이드의 비-사람 부분은 내인성 비-사람 MHC IIα 폴리펩타이드의 막관통(transmembrane) 및 세포질성 도메인들을 포함한다. 한 실시형태에서, 키메라 사람/비-사람 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비-사람 MHC IIα 프로모터 및 조절 요소들의 조절성 제어 하에서 발현된다. 한 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분은 HLA-DR, HLA-DQ, 및 HLA-DP로 이루어진 그룹으로부터 선택된 사람 HLA 제II 부류 단백질로부터 유도되고, 예를 들면, 당해 사람 부분은 HLA-DR4 단백질로부터 유도된다. 비-사람 동물은 설치류, 예를 들면, 마우스일 수 있다. 한 양상에서, 내인성 MHC IIα 유전자 유전자좌에 키메라 사람/비-사람 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비-사람 동물은, 내인성 MHC IIβ 유전자 유전자좌에 키메라 사람/비-사람 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 또한, 본원에서 내인성 MHC IIα 유전자 유전자좌에 키메라 사람/비-사람 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 비-사람 동물을 제조하는 방법도 제공된다. 이러한 방법은, 내인성 MHC IIα 유전자 유전자좌에 내인성 비-사람 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 키메라 사람/비-사람 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체함을 포함할 수 있다.
또한, 본원에서 내인성 MHC IIβ 유전자 유전자좌에 키메라 사람/비-사람 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비-사람 동물도 제공된다. 한 실시형태에서, 이러한 키메라 사람/비-사람 MHC IIβ 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC IIβ 세포외 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 비-사람 동물은 동물의 세포 표면 상에서 기능성 MHC II 복합체를 발현한다. 한 실시형태에서, 동물 내의 사람 MHC IIβ 세포외 도메인은 사람 MHC IIβ1 및 β2 도메인들을 포함하고; 한 실시형태에서, 키메라 사람/비-사람 MHC IIβ 폴리펩타이드의 비-사람 부분은 내인성 비-사람 MHC IIβ 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질성 도메인들을 포함한다. 한 실시형태에서, 키메라 사람/비-사람 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비-사람 MHC IIβ 프로모터 및 조절 요소들의 조절성 제어 하에 발현된다. 한 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분은 HLA-DR, HLA-DQ, 및 HLA-DP로 이루어진 그룹으로부터 선택된 사람 HLA 제II 부류 단백질로부터 유도되고, 예를 들면, 사람 부분은 HLA-DR4 단백질로부터 유도된다. 비-사람 동물은 설치류, 예를 들면, 마우스일 수 있다. 한 양상에서, 내인성 MHC IIβ 유전자 유전자좌에 키메라 사람/비-사람 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비-사람 동물은, 내인성 MHC IIα 유전자 유전자좌에 키메라 사람/비-사람 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 또한, 본원에서 내인성 MHC IIβ 유전자 유전자좌에 키메라 사람/비-사람 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 비-사람 동물을 제조하는 방법도 제공된다. 이러한 방법은 내인성 MHC IIβ 유전자 유전자좌에서 내인성 비-사람 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 키메라 사람/비-사람 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체함을 포함할 수 있다.
한 양상에서, 내인성 MHC II 유전자 유전자좌에 키메라 사람/비-사람 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 키메라 사람/비-사람 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비-사람 동물이 제공되고, 여기서, 상기 키메라 사람/비-사람 MHC IIα 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC IIα 세포외 도메인을 포함하고, 키메라 사람/비-사람 MHC IIβ 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC IIβ 세포외 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, 키메라 사람/비-사람 MHC IIα 및 β 폴리펩타이드들은 세포의 표면 상에 기능성 키메라 MHC II 복합체(예를 들면, 사람/비-사람 MHC II 복합체)를 형성한다. 한 실시형태에서, 사람 MHC IIα 세포외 도메인은 사람 MHC II의 사람 α1 및 α2 도메인들을 포함한다. 한 실시형태에서, 사람 MHC IIβ 세포외 도메인은 사람 MHC II의 사람 β1 및 β2 도메인들을 포함한다. 각종 양상들에서, 제1 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비-사람 MHC IIα 프로모터 및 조절성 성분들의 조절성 제어하에 발현된다. 각종 양상들에서, 제2 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비-사람 MHC IIβ 프로모터 및 조절성 성분들의 조절성 제어하에서 발현된다. 일부 실시형태들에서, 키메라 사람/비-사람 MHC IIα 폴리펩타이드의 비-사람 부분은 내인성 비-사람 MHC IIα 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질성 도메인들을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 키메라 사람/비-사람 MHC IIβ 폴리펩타이드의 비-사람 부분은 내인성 비-사람 MHC IIβ 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질성 도메인들을 포함한다.
각종 실시형태들에서, 비-사람 동물은 설치류이고, 키메라 사람/설치류 MHC IIα 및 β 폴리펩타이드들의 사람 부분은, HLA-DR, HLA-DQ, 및 HLA-DP로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HLA 제II 부류 단백질로부터 유도된 사람 서열들을 포함한다. 본 발명의 일부 실시형태들에서, 키메라 사람/설치류 MHC IIα 및 β 서열들의 사람 부분들은 사람 HLA-DR4 서열로부터 유도되므로; MHC IIα 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 HLA-DRα*01 유전자의 서열로부터 유도되고, MHC IIβ 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 HLA-DRβ1*04 유전자를 암호화하는 서열로부터 유도된다.
본 발명의 각종 실시형태들에서, 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열들은 동일한 염색체 상에 위치한다. 일부 양상들에서, 동물은 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열들을 함유하는 2개 카피들의 MHC II 유전자좌를 포함하고, 한편, 다른 양상들에서, 동물은 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열들을 함유하는 1개 카피의 MHC II 유전자좌를 포함한다. 따라서, 당해 동물은 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열들을 함유하는 MHC II 유전자좌에 대해 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있다.
일부 양상들에서, 키메라 MHC IIα 폴리펩타이드 및/또는 키메라 MHC IIβ 폴리펩타이드는 비-사람 리더 서열(non-human leader sequence)에 작동적으로 연결되어 있다.
한 양상에서, 유전자 조작된 비-사람 동물은 설치류이다. 한 실시형태에서, 설치류는 마우스 및 래트로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 따라서, 일부 실시형태들에서, 키메라 MHC IIα 및 β 유전자들의 비-사람 서열들은 마우스 MHC II 단백질, 예를 들면, 마우스 H-2E 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열들로부터 유도된다. 한 실시형태에서, 본 발명의 설치류(예를 들면, 마우스 또는 래트)는 설치류의 내인성 유전자좌들로부터 기능성 내인성 MHC II 폴리펩타이드들을 발현하지 않는다. 한 실시형태에서, 설치류가 마우스인 경우, 당해 마우스는 마우스의 내인성 유전자좌들로부터 기능성 내인성 H-2E 및 H-2A 폴리펩타이드들을 발현하지 않는다.
따라서, 일부 실시형태들에서, 내인성 마우스 MHC II 유전자좌에서 키메라 사람/마우스 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 키메라 사람/마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스가 제공되고, 여기서, 상기 키메라 MHC IIα 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 HLA-DR4 단백질의 α 폴리펩타이드로부터 유도된 세포외 도메인을 포함하고, 상기 키메라 사람/마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 HLA-DR4 단백질의 β 폴리펩타이드로부터 유도된 세포외 도메인을 포함하며, 여기서, 상기 키메라 MHC IIα 폴리펩타이드의 마우스 부분은 마우스 H-2E α 쇄의 막관통 및 세포질성 도메인들을 포함하고, 상기 키메라 MHC IIβ 폴리펩타이드의 마우스 부분은 마우스 H-2E β 쇄의 막관통 및 세포질성 도메인들을 포함하며, 여기서, 마우스는 기능성 키메라 HLA-DR4/H-2E MHC II 복합체를 발현한다. 일부 양상들에서, 키메라 MHC IIα 폴리펩타이드의 세포외 도메인은 사람 α1 및 α2 도메인들을 포함하고; 일부 양상들에서, 키메라 MHC IIβ 폴리펩타이드의 세포외 도메인은 사람 β1 및 β2 도메인들을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 제1 뉴클레오타이드 서열은 내인성 마우스 MHC IIα 프로모터 및 조절 요소들의 조절성 제어 하에 발현되고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 내인성 마우스 MHC IIβ 프로모터 및 조절 요소들의 조절성 제어 하에 발현된다. 각종 실시형태들에서, 마우스는 마우스의 내인성 유전자좌들로부터 기능성 내인성 MHC II 폴리펩타이드들, 예를 들면, H-2E 및 H-2A 폴리펩타이드들을 발현하지 않는다. 일부 양상들에서, 마우스는 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열들을 함유하는 2개 카피들의 MHC II 유전자좌를 포함하고, 한편, 다른 양상들에서, 마우스는 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열들을 함유하는 1개 카피의 MHC II 유전자좌를 포함한다.
본원에 기술된 바와 같은 유전자 조작된 비-사람 동물들(예를 들면, 설치류들, 예를 들면, 마우스들 또는 래트들)을 제조하는 방법들이 또한 제공된다. 각종 실시형태들에서, 본 발명의 비-사람 동물들(예를 들면, 설치류들, 예를 들면, 마우스들 또는 래트들)은, 내인성 MHC II 서열들을 키메라 사람/비-사람(예를 들면, 사람/마우스) MHC IIα 및 β 폴리펩타이드들을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열들로 대체하여 제조한다. 한 실시형태에서, 본 발명은, 내인성 마우스 MHC II 유전자좌에서 설치류 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 키메라 사람/설치류 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체함을 포함하는, 키메라 사람/설치류 MHC II 복합체를 발현시키기 위해 설치류(예를 들면, 마우스 또는 래트)의 MHC II 유전자좌를 변형시키는 방법을 제공한다. 당해 방법의 한 양상에서, 키메라 사람/설치류 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 사람 MHC IIα 쇄의 세포외 도메인 및 설치류 MHC IIα 쇄의 막관통 및 세포질성 도메인들을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 및 사람 MHC IIβ 쇄의 세포외 도메인 및 설치류 MHC IIβ 쇄의 막관통 및 세포질성 도메인들을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 양상들에서, 키메라 MHC II 복합체의 설치류 부분은 마우스 H-2E 단백질로부터 유도되고, 사람 부분은 사람 HLA-DR4 단백질로부터 유도된다. 일부 실시형태들에서, 본원에 기술된 내인성 MHC II 유전자좌들의 대체는 단일 ES 세포 내에서 이루어지며, 단일 ES 세포는 설치류(예를 들면, 마우스 또는 래트) 배아 내로 도입되어 유전적으로 변형된 설치류(예를 들면, 마우스 또는 래트)가 제조된다.
또한, 본원에서 세포들, 예를 들면, 본원에 기술된 비-사람 동물들(예를 들면, 설치류들, 예를 들면, 마우스들 또는 래트들)로부터 유도된, 분리된 항원-제시 세포들도 제공된다. 본원에 기술된 비-사람 동물들로부터 유도된 조직 및 배아도 제공된다.
본원에 기술된 실시형태들 및 양상들 중 어느 것도 내용에 달리 나타내거나 이로부터 명백하지 않는 한, 서로 함께 사용될 수 있다. 다른 실시형태들은 하기 상세한 설명의 고찰로부터 당해 분야의 숙련가에게 명백해질 것이다. 하기 상세한 설명은 본 발명을 청구하는 것으로 한정하지 않는, 본 발명의 각종 실시형태들의 예시적인 표시들을 포함한다. 첨부된 도면들은 당해 명세서의 일부를 구성하며, 설명과 함께, 실시형태들을 단지 나열하기 위해 제공되며 본 발명을 제한하지 않는다.
도 1은 4개의 도메인들: α1, α2, β1, 및 β2를 함유하는 항원 제시 세포(APC)의 표면 상에 발현된 MHC 제II 부류 분자의 개략도이다. 회색 원은 펩타이드-결합 간극(cleft)에 결합된 펩타이드를 나타낸다.
도 2는 제I, 제II 및 제III 부류 유전자들을 나타내는 사람 HLA의 상대적인 게놈 구조의 개략도(축척은 나타내지 않음)이다.
도 3은 제I, 제II 및 제III 부류 유전자들을 나타내는 마우스 MHC의 상대적인 게놈 구조의 개략도(축척은 나타내지 않음)이다.
도 4a 내지 도 4d는 사람화된 I-Eβ 및 I-Eα(즉, 각각 H-2Eβ/HLA-DRβ1*04 및 H-2Eα/HLA-DRα*01 키메라)를 포함하는 표적화 벡터(targeting vector)를 생성하기 위한 전략의 개략도(축척은 나타내지 않음)이다. 도 4c에서, 도 4b로부터의 최종 사람화된 MHC II 서열은 도 4a로부터의 최종 작제물의 PI-SceI 및 I-CeuI 제한 부위들 사이에서 연결되어 사람화된 MHC II 및 BALB/c로부터의 I-Eα의 엑손 1을 포함하는 작제물을 생성한다. Pg=슈도유전자(pseudogene); BHR=세균 동종 재조합; CM=클로람페니콜; spec=스펙티노마이신; hyg=하이그로마이신; neo=네오마이신; EP=전기천공(electroporation). 삼각형들은 엑손들을 나타내고, 채워진 삼각형들은 C57BL/6 마우스로부터의 마우스 엑손[BALB/c 마우스로부터의 I-Eα의 엑손 1을 나타내는, 우물정자표시된(hashed) 삼각형들은 제외됨]을 나타내고 개방된 삼각형들은 사람 엑손들을 나타낸다.
도 5는 MHC 제II 부류 I-E 및 I-A 유전자들의 개략도(축척은 나타내지 않음)를 나타내고, 하이그로마이신 카세트(hygromycin cassette)를 사용한 마우스 유전자좌의 녹아웃(knockout)에 이어서, 사람화된 I-Eβ 및 I-Eα(즉, 각각 H-2Eβ/HLA-DRβ1*04 및 H-2Eα/HLA-DRα*01 키메라)를 포함하는 벡터의 도입을 나타낸다. 개방된 삼각형들은 사람 엑손들을 나타내고; 채워진 삼각형들은 마우스 엑손들을 나타낸다. 유전형(genotyping)에 사용된 프로브(probe)들은 둘러싸여 있다.
도 6은 도 5의 네오마이신 카세트의 Cre-매개된 제거의 개략도(축척은 나타내지 않음)를 나타낸다. 개방 삼각형들은 사람 엑손들을 나타내고; 채워진 삼각형들은 마우스 엑손들을 나타낸다. 상부의 2개의 가닥(strand)들은 네오마이신 선택 카세트를 지닌 사람화된 MHC II 이형접합성 마우스 내의 MHC II 유전자좌들을 나타내고, 하부 2개의 가닥들은 제거된 네오마이신 카세트를 지닌 사람화된 MHC II 이형접합성 마우스 내의 MHC II 유전자좌들을 나타낸다.
도 7은 마우스 및 사람 제II 부류 유전자좌들의 개략적인 비교도(축척은 나타내지 않음)를 나타낸다. 제II 부류 유전자들은 박스들로 표시되며, 빈 박스들은 슈도유전자들을 나타낸다. 각종 핵산 단편들의 상대적인 크기들(kb)이 포함된다.
도 8은 좌측 패널(panel)에서, MHC IIα 쇄에 대한 사람화 전략의 개략도(축척은 나타내지 않음)이며; 특히, 당해 도는 MHC IIα 유전자의 엑손 2 및 엑손 3에 의해 암호화된, α1 및 α2 도메인들의 대체를 나타내고, 한편, 마우스 막관통 및 세포질성 테일 서열(tail sequence)들의 보유를 나타낸다. 사람화된 유전자좌에서, MHC IIα 리더 서열은 마우스 BALB/c 스트레인으로부터 유도된다. 우측 패널은 MHC IIβ 쇄의 사람화를 나타내며; 특히, 당해 도는 MHC IIβ 유전자의 엑손 2 및 엑손 3에 의해 암호화된 β1 및 β2 도메인들의 대체를 나타내고, 한편, 마우스 리더 및 마우스 막관통 및 세포질성 테일 서열들의 보유를 나타낸다. 상부 열은 모든 사람 서열들이고; 중간 열은 모든 마우스 서열들이며; 하부 열은, 사람 HLA-DR 유전자들로부터 유도된 엑손 2 및 엑손 3을 지닌 모든 사람화된 서열들이다.
도 9는 폴리(I:C)의 존재(1681HET + 폴리(I:C)) 또는 부재(1681HET) 하에 키메라 HLA-DR4[네오 카세트(neo cassette)가 제거됨]에 대해 이형접합성인 마우스, 및 야생형 마우스(WT 마우스)로부터의 B 세포들의 항-HLA-DR 항체를 사용한 FACS 분석을 나타낸다.
도 2는 제I, 제II 및 제III 부류 유전자들을 나타내는 사람 HLA의 상대적인 게놈 구조의 개략도(축척은 나타내지 않음)이다.
도 3은 제I, 제II 및 제III 부류 유전자들을 나타내는 마우스 MHC의 상대적인 게놈 구조의 개략도(축척은 나타내지 않음)이다.
도 4a 내지 도 4d는 사람화된 I-Eβ 및 I-Eα(즉, 각각 H-2Eβ/HLA-DRβ1*04 및 H-2Eα/HLA-DRα*01 키메라)를 포함하는 표적화 벡터(targeting vector)를 생성하기 위한 전략의 개략도(축척은 나타내지 않음)이다. 도 4c에서, 도 4b로부터의 최종 사람화된 MHC II 서열은 도 4a로부터의 최종 작제물의 PI-SceI 및 I-CeuI 제한 부위들 사이에서 연결되어 사람화된 MHC II 및 BALB/c로부터의 I-Eα의 엑손 1을 포함하는 작제물을 생성한다. Pg=슈도유전자(pseudogene); BHR=세균 동종 재조합; CM=클로람페니콜; spec=스펙티노마이신; hyg=하이그로마이신; neo=네오마이신; EP=전기천공(electroporation). 삼각형들은 엑손들을 나타내고, 채워진 삼각형들은 C57BL/6 마우스로부터의 마우스 엑손[BALB/c 마우스로부터의 I-Eα의 엑손 1을 나타내는, 우물정자표시된(hashed) 삼각형들은 제외됨]을 나타내고 개방된 삼각형들은 사람 엑손들을 나타낸다.
도 5는 MHC 제II 부류 I-E 및 I-A 유전자들의 개략도(축척은 나타내지 않음)를 나타내고, 하이그로마이신 카세트(hygromycin cassette)를 사용한 마우스 유전자좌의 녹아웃(knockout)에 이어서, 사람화된 I-Eβ 및 I-Eα(즉, 각각 H-2Eβ/HLA-DRβ1*04 및 H-2Eα/HLA-DRα*01 키메라)를 포함하는 벡터의 도입을 나타낸다. 개방된 삼각형들은 사람 엑손들을 나타내고; 채워진 삼각형들은 마우스 엑손들을 나타낸다. 유전형(genotyping)에 사용된 프로브(probe)들은 둘러싸여 있다.
도 6은 도 5의 네오마이신 카세트의 Cre-매개된 제거의 개략도(축척은 나타내지 않음)를 나타낸다. 개방 삼각형들은 사람 엑손들을 나타내고; 채워진 삼각형들은 마우스 엑손들을 나타낸다. 상부의 2개의 가닥(strand)들은 네오마이신 선택 카세트를 지닌 사람화된 MHC II 이형접합성 마우스 내의 MHC II 유전자좌들을 나타내고, 하부 2개의 가닥들은 제거된 네오마이신 카세트를 지닌 사람화된 MHC II 이형접합성 마우스 내의 MHC II 유전자좌들을 나타낸다.
도 7은 마우스 및 사람 제II 부류 유전자좌들의 개략적인 비교도(축척은 나타내지 않음)를 나타낸다. 제II 부류 유전자들은 박스들로 표시되며, 빈 박스들은 슈도유전자들을 나타낸다. 각종 핵산 단편들의 상대적인 크기들(kb)이 포함된다.
도 8은 좌측 패널(panel)에서, MHC IIα 쇄에 대한 사람화 전략의 개략도(축척은 나타내지 않음)이며; 특히, 당해 도는 MHC IIα 유전자의 엑손 2 및 엑손 3에 의해 암호화된, α1 및 α2 도메인들의 대체를 나타내고, 한편, 마우스 막관통 및 세포질성 테일 서열(tail sequence)들의 보유를 나타낸다. 사람화된 유전자좌에서, MHC IIα 리더 서열은 마우스 BALB/c 스트레인으로부터 유도된다. 우측 패널은 MHC IIβ 쇄의 사람화를 나타내며; 특히, 당해 도는 MHC IIβ 유전자의 엑손 2 및 엑손 3에 의해 암호화된 β1 및 β2 도메인들의 대체를 나타내고, 한편, 마우스 리더 및 마우스 막관통 및 세포질성 테일 서열들의 보유를 나타낸다. 상부 열은 모든 사람 서열들이고; 중간 열은 모든 마우스 서열들이며; 하부 열은, 사람 HLA-DR 유전자들로부터 유도된 엑손 2 및 엑손 3을 지닌 모든 사람화된 서열들이다.
도 9는 폴리(I:C)의 존재(1681HET + 폴리(I:C)) 또는 부재(1681HET) 하에 키메라 HLA-DR4[네오 카세트(neo cassette)가 제거됨]에 대해 이형접합성인 마우스, 및 야생형 마우스(WT 마우스)로부터의 B 세포들의 항-HLA-DR 항체를 사용한 FACS 분석을 나타낸다.
정의
본 발명은 사람 또는 사람화된 MHC II 폴리펩타이드를 발현하는 유전적으로 변형된 비-사람 동물들(예를 들면, 마우스, 래트, 토끼 등); 이를 포함하는 배아, 세포, 및 조직; 이들을 제조하는 방법들; 및 이들을 사용하는 방법들을 제공한다. 달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 용어들 및 어구들은, 당해 용어 및 어구가 사용된 내용으로부터 명확하게 묘사되거나 명확하게 드러나지 않는 한, 이들 용어들 및 어구들이 당해 분야에서 통용되어 왔던 의미들을 포함한다.
보존적 아미노산 치환을 기술하는데 사용되는 경우, 용어 "보존적"은 유사한 화학적 특성들(예를 들면, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄 R 그룹을 갖는 다른 아미노산 잔기에 의한 아미노산 잔기의 치환을 포함한다. 보존적 아미노산 치환들은 뉴클레오타이드 서열을 변형하여 보존적 치환을 암호화할 뉴클레오타이드 변화를 도입함으로써 달성할 수 있다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 목적한 기능성 특성들, 예를 들면, 목적한 펩타이드를 제시하는 MHC II의 능력을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 유사한 화학적 특성들을 갖는 측쇄들을 갖는 아미노산들의 그룹들의 예로는 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신과 같은 지방족 측쇄들; 세린 및 트레오닌과 같은 지방족-하이드록실 측쇄들; 아스파라긴 및 글루타민과 같은 아미드-함유 측쇄들; 페닐알라닌, 타이로신, 및 트립토판과 같은 방향족 측쇄들; 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘과 같은 염기성 측쇄들; 아스파르트산 및 글루탐산과 같은 산성 측쇄들; 및 시스테인 및 메티오닌과 같은 황-함유 측쇄들이 포함된다. 보존적 아미노산 치환 그룹들로는, 예를 들면, 발린/류신/이소류신, 페닐알라닌/타이로신, 라이신/아르기닌, 알라닌/발린, 글루타메이트/아스파르테이트, 및 아스파라긴/글루타민이 포함된다. 일부 실시형태들에서, 보존적 아미노산 치환은, 예를 들면, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발(alanine scanning mutagenesis)에서 사용된 바와 같은, 단백질 내의 임의의 천연의 잔기의 알라닌으로의 치환일 수 있다. 일부 실시형태들에서, 본원에 인용에 의해 포함된 문헌[참조: Gonnet et al. (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45]에 기재된 PAM250 로그-우도 매트릭스(log-likelihood matrix)에서 양성 값을 갖는 보존적 치환이 이루어진다. 일부 실시형태들에서, 당해 치환은 중간의 보존적 치환이며, 여기서 당해 치환은 PAM250 로그-우도 매트릭스에서 비음성 값을 갖는다.
따라서, 이의 게놈이 사람 또는 사람화된 MHC II 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 비-사람 동물이 본 발명에 포함되며, 여기서, 당해 폴리펩타이드는 본원에 기술된 아미노산 서열 내의 보존적 아미노산 치환들을 포함한다.
당해 분야의 숙련가는, 본원에 기술된 사람 또는 사람화된 MHC II 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 잔기들 외에, 유전적 코드의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여, 다른 핵산들은 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 이의 게놈 내에 보존적 아미노산 치환들을 지닌 MHC II 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 비-사람 동물 외에, 이의 게놈이 유전 코드의 축퇴성으로 인하여 본원에 기술된 것과 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비-사람 동물이 또한 제공된다.
서열과 함께 사용되는 경우 용어 "동일성(identity)"은 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열 동일성을 측정하는데 사용될 수 있는 당해 분야에 공지되어 있는 다수의 상이한 알고리즘들에 의해 측정된 것으로서의 동일성을 포함한다. 본원에 기술된 일부 실시형태들에서, 동일성은 10.0의 개방 갭 패널티(open gap penalty), 0.1의 연장 갭 패널티(extend gap penalty)를 이용하는 ClustalW v. 1.83(slow) 정렬을 사용하고, 곤넷 유사성 매트릭스(Gonnet similarity matrix)(MacVectorTM 10.0.2, MacVector Inc., 2008)를 사용하여 측정한다. 서열들의 동일성과 관련하여 비교할 서열들의 길이는 특정 서열들에 의존할 것이다. 각종 실시형태들에서, 동일성은 이의 N-말단으로부터 이의 C-말단까지 성숙한 단백질의 서열을 비교함으로써 측정한다. 각종 실시형태들에서, 키메라 사람/비-사람 서열을 사람 서열에 대해 비교하는 경우, 키메라 사람/비-사람 서열의 사람 부분(그러나 비-사람 부분 제외)는 사람 서열과 키메라 사람/비-사람 서열의 사람 부분 사이의 동일성의 수준을 확인할 목적을 위한 비교에 사용된다(예를 들면, 키메라 사람/마우스 단백질의 사람 엑토도메인(ectodomain)을 사람 단백질의 사람 엑토도메인과 비교함).
서열들, 예를 들면, 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열들의 참조시 용어들 "상동성" 또는 "상동의(상동성의)"는, 최적의 정렬 및 비교시, 적어도 약 75%의 뉴클레오타이드들 또는 아미노산들, 적어도 약 80%의 뉴클레오타이드들 또는 아미노산들, 적어도 약 90 내지 95%의 뉴클레오타이드들 또는 아미노산들, 예를 들면, 97% 초과의 뉴클레오타이드들 또는 아미노산들에서 동일한 2개의 서열을 의미한다. 당해 분야에서 숙련가는, 최적의 유전자 표적화를 위해, 표적화 작제물이 내인성 DNA 서열들에 대해 상동성인 아암(arm)(즉, "상동성 아암")을 함유함으로써; 상동성 재조합이 표적화 작제물과 표적화된 내인성 서열 사이에서 발생할 수 있음을 이해할 수 있다.
용어 "작동적으로 연결된"은, 이렇게 기술된 구성성분들이 이들을 이들의 의도된 방식으로 기능하도록 하는 관계에 있는 병렬(juxtaposition)을 말한다. 이와 같이, 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 조절 서열들[예를 들면, 프로모터, 인핸서, 사일런서(silencer) 서열 등]에 작동적으로 연결됨으로써 적절한 전사 조절을 보유할 수 있다. 또한, 본 발명의 키메라 또는 사람화된 단백질의 다양한 부분들은 작동적으로 연결되어 세포 내의 단백질의 적절한 폴딩(folding), 프로세싱, 표적화, 발현, 및 다른 기능성 특성들을 보유할 수 있다. 달리 언급하지 않는 한, 본 발명의 키메라 또는 사람화된 단백질의 각종 도메인들은 서로에 대해 작동적으로 연결되어 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어들 "MHC II 복합체", "MHC II 단백질" 등은 MHC IIα 폴리펩타이드와 MHC IIβ 폴리펩타이드 사이의 복합체를 포함한다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "MHC IIα 폴리펩타이드" 또는 "MHC IIβ 폴리펩타이드"(또는 기타)는 MHC Iα 폴리펩타이드 단독 또는 MHC IIβ 폴리펩타이드 단독 각각을 포함한다. 유사하게, 용어들 "HLA-DR4 복합체", "HLA-DR4 단백질", "H-2E 복합체", "H-2E 단백질" 등은 α 및 β 폴리펩타이드들 사이의 복합체를 말한다. 전형적으로, 용어들 "사람 MHC" 및 "HLA"는 상호교환적으로 사용된다.
유전자 대체(gene replacement)와 관련하여 용어 "대체(replacement)"는 외인성 유전 물질이 내인성 유전 유전자좌에 위치함으로써, 내인성 유전자 중 전부 또는 일부가 이종상동성(orthologous) 또는 상동성 핵산 서열로 대체됨을 말한다. 하기 실시예들에서 입증된 바와 같이, 내인성 MHC II 유전자좌의 핵산 서열은 사람 MHC IIα 및 β 폴리펩타이드들 중의 부위들을 암호화하는; 구체적으로 MHC IIα 및 β 폴리펩타이드들의 세포외 부분들을 암호화하는 서열들을 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 대체되었다.
예를 들면, 기능성 폴리펩타이드를 참조시, 본원에 사용된 것으로서, "기능성"은 천연의 단백질과 일반적으로 관련된 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 폴리펩타이드를 말한다. 예를 들면, 본 발명의 일부 실시형태들에서, 내인성 유전자좌에서의 대체(예를 들면, 내인성 비-사람 MHC II 유전자좌에서의 대체)는 기능성 내인성 폴리펩타이드를 발현하지 못하는 유전자좌를 생성한다.
유전적으로 변형된 MHC II 동물들
각종 양상에서, 본 발명은 일반적으로 이들의 게놈내에 사람 또는 사람화된 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 비-사람 동물들을 제공하며; 따라서, 당해 동물들은 사람 또는 사람화된 MHC II 복합체(예를 들면, MHC IIα 및 β 폴리펩타이드들)를 발현한다.
MHC 유전자들은 3개의 부류들로 분류된다: 제I 부류, 제II 부류, 및 제III 부류, 이들 모두는 사람 염색체 6번 또는 마우스 염색체 17번 상에 암호화되어 있다. 사람 및 마우스 MHC 부류들의 상대적인 조직화의 도식은 도 2 및 도 3에 각각 나타낸다. MHC 유전자들 중의 대부분은 다형성이며, 실제로 이들은 마우스 및 사람 게놈들의 대부분의 다형성 유전자들이다. MHC 다형성들은 진화적 이점을 제공하는데 있어서 중요한 것으로 추정되며; 서열 내의 변화들은 보다 우수한 항원 제시를 허용하는 펩타이드 결합에 있어서의 차이들을 생성할 수 있다. 한가지 예외는, 단형성(monomorphic)인, 사람 HLA-DRα 쇄 및 이의 마우스 동족체, Eα(즉, H-2Ea)이다.
MHC 제II 부류 복합체는 2개의 비-공유결합적으로 관련된 도메인들: α 쇄 및 β 쇄를 포함하며, 이들은 또한 본원에서 α 폴리펩타이드 및 β 폴리펩타이드(도 1)로 언급된다. 단백질은 혈장막에 걸쳐 있으므로; 이는 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포질성 도메인을 함유한다. α 쇄의 세포외 부분은 α1 및 α2 도메인들을 포함하며, β 쇄의 세포외 부분은 β1 및 β2 도메인들을 포함한다. α1 및 β1 도메인들은 세포 표면 상에 펩타이드-결합 간극을 형성한다. MHC II 복합체의 펩타이드-결합 간극의 3-차원 구조 확인으로 인하여, 결합된 항원의 길이에 있어서 이론적으로 상한선(upper limit)은 없으나, 전형적으로 MHC II에 의해 제시된 펩타이드들은, 길이 13 내지 17개의 아미노산들이다.
항원성 펩타이드들과 이의 상호작용 이외에, MHC II 분자의 펩타이드-결합 간극은 MHC II 복합체 형성 및 펩타이드 획득의 공정들 동안에 불변의 쇄(Ii)와 상호작용한다. α/ β MHC II 이합체들은 소포체 내에서 조립하여 Ii 쇄와 연합하며, 당해 쇄는 펩타이드 결합의 조절 및 MHC II의 식균작용 경로(endocytic pathway)의 표적화에 관여한다. 엔도솜(endosome)에서, Ii는 단백질분해를 겪으며, Ii의 작은 단편, 제II 부류-관련된 불변 쇄 펩타이드(CLIP)는 펩타이드-결합 간극에서 잔존한다. 엔도솜에서, HLA-DM(사람들내에서)의 제어 하에, CLIP는 항원성 펩타이드에 대해 교환된다.
MHC II는 α2와 β2 도메인들 사이의 연결부에서 소수성 틈새(crevice)에서 T 세포 공-수용체(co-receptor) CD4와 상호작용한다. Wang and Reinherz (2002) Structural Basis of T Cell Recognition of Peptides Bound to MHC Molecules, Molecular Immunology, 38:1039-49. CD4 및 T 세포 수용체가 펩타이드와 복합체화된 동일한 MHC II 분자에 결합하는 경우, 항원에 대한 T 세포의 민감성은 증가하며, 이는 활성화를 위해 100배 미만의 항원을 필요로 한다. 본원에 인용에 의해 포함된 문헌[Janeway's Immunobiology, 7th Ed., Murphy et al. eds., Garland Science, 2008]을 참조한다.
다수의 기능들이 MHC II의 막관통 및 세포질성 도메인들을 위해 제안되어 왔다. 세포질성 도메인의 경우에, 이는 세포내 신호전달, 혈장막에 대한 트래피킹(trafficking), 및 궁극적으로, 항원 제시를 위해 중요한 것으로 밝혀져 왔다. 예를 들어, T 세포 하이브리도마들은 세포질성 도메인에서 트렁케이트된(truncated) MHC IIβ 쇄들로 형질감염된 항원-제시 세포들(APCs)에 대해 불량하게 반응하며, B 세포 분화의 유도가 방해받음이 밝혀졌다[참조: 예를 들면, Smiley et al. (1996) Truncation of the class IIβ-chain cytoplasmic domain influences the level of Class II/invariant chain-derived peptide complexes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:241-44]. 제II 부류 분자들의 트렁케이션은 cAMP 생산을 손상시키는 것으로 여겨진다. MHC II의 세포질성 테일의 결실은 세포내 트래피킹에 영향을 미침으로써 식균작용 경로에서 우연히 발견된 관련 항원들로부터 복합체를 방지하는 것으로 추정되어 왔다. 스밀리(Smiley) 등(상기 참조)은, 세포질성 도메인에서 제II 부류 분자들의 트렁케이션이 CLIP/제II 부류 복합체들의 수들 감소시킴을 입증하였으며, 이것이 항원 제시를 효과적으로 조절하는 CLIP의 능력에 영향을 미치는 것으로 추정하였다.
MHC II 집적화(clustering)는 T 세포 수용체 (TCR) 개시(triggering)를 위해 중요하므로, 세포질성 도메인에서 트렁케이트된 MHC II 분자들이 세포골격을 결합하여 응집하는 것으로부터 방지된 경우, T 세포들에 대한 항원 제시가 영향받을 수 있다[참조: Ostrand-Rosenberg et al. (1991) Abrogation of Tumorigenicity by MHC Class II Antigen Expression Requires the Cytoplasmic Domain of the Class II Molecule, J. Immunol. 147:2419-22]. 실제로, 세포질성 도메인에서 트렁케이트된 HLA-DR은 올리고머화 후 세포골격과 연합하지 못하였음이 최근에 밝혀졌다[참조: El Fakhy et al. (2004) Delineation of the HLA-DR Region and the Residues Involved in the Association with the Cytoskeleton, J. Biol. Chem. 279:18472-80]. 중요하게도, 액틴 세포골격은 국재화된 신호 형질도입 활성의 부위이며, 이는 항원 제시를 수행할 수 있다. 세포골격과의 연합 외에도, 최근의 연구들은 또한, 모든 HLA-DR 분자들 중 20% 이하가 콜레스테롤 및 글리코스핑고리피드들에서 풍부한 마이크로도메인들인, APCs의 지질 뗏목(lipid raft)들에서 구성적으로 존재하며, 이러한 국재화는 항원 제시, 면역 시냅스 형성(immune synapse formation), 및 MHC II-매개된 신호전달에 중요함이 또한 밝혀졌다[참조: 예를 들면, Dolan et al. (2004) Invariant Chain and the MHC II Cytoplasmic Domains Regulate Localization of MHC Class II Molecules to Lipid Rafts in Tumor Cell-Based Vaccines, J. Immunol. 172:907-14]. 돌란(Dolan) 등은, MHC II의 세포질성 도메인의 트렁케이션이 MHC II의 지질 땟목들에 대한 구성적 국재화를 감소시킴을 제안하였다.
또한, MHC II, 특히 β 쇄의 세포질성 도메인은 식균작용 트래피킹, 내재화, 및 MHC II의 분해를 조절하는, 막-관련된 RING-CH I (MARCH I)인, 유비퀴틴 리가제에 의한 유비퀴틴화(ubiquitination)에 속한 류신 잔기를 함유하며; MARCH-매개된 유비퀴틴화는 수지 세포 성숙(dendritic cell maturation)시 중단되어 혈장 막에서 증가된 수준들의 MHC II를 생성함이 밝혀졌다[참조: Shin et al. (2006) Surface expression of MHC class II in dendritic cells is controlled by regulated ubiquitination, Nature 444:115-18; De Gassart et al. (2008) MHC class II stabilization at the surface of human dendritic cells is the result of maturation-dependent MARCH I down-regulation, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:3491-96].
MHC II의 α 및 β 쇄들의 막관통 도메인들은 서로 상호작용하며 이러한 상호작용은 제II 부류 MHC 복합체의 적절한 조립에 중요하다[참조: Cosson and βonifacino (1992) Role of Transmembrane Domain Interactions in the Assembly of Class II MHC Molecules, Nature 258:659-62]. 실제로, α 및 β 쇄들의 막관통 도메인들이 IL-2 수용체의 α 쇄들에 의해 대체된 MHC II 분자들은 ER내에 보유되어 세포 표면에서 드믈게 검출가능하였다. Id. 돌연변이유발 연구들을 통해, α 및 β 막관통 도메인들에서 보존된 Gly 잔기들은 세포 표면에서 MHC II 조립에 관여하는 것으로 밝혀졌다. Id. 따라서, 막관통 및 세포질성 도메인들 둘 다는 MHC II 복합체의 적절한 기능에 결정적이다.
각종 실시형태들에서, 본 발명은 이의 게놈내에 사람 또는 사람화된 MHC II 복합체, 예를 들면, 사람 또는 사람화된 MHC IIα및/또는 β 폴리펩타이드(들)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 비-사람 동물 (예를 들면, 마우스, 래트, 토끼 등)을 제공한다. 비-사람 동물은 이의 게놈내에 부분적으로 사람 및 부분적으로 비-사람인, 예를 들면, 키메라 사람/비-사람 MHC II 복합체를 발현하는 비-사람 동물(예를 들면, 키메라 사람/비-사람 MHC IIα 및 β 폴리펩타이드들을 발현하는 비-사람 동물)인 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 한 양상에서, 상기 비-사람 동물은 사람 또는 사람화된 MHC II 복합체, 예를 들면, 키메라 사람/비-사람 MHC II 복합체만을 발현하며, 내인성 MHC II 유전자좌로부터 내인성 비-사람 MHC II 복합체를 발현하지 않는다. 일부 실시형태들에서, 동물은 내인성 MHC II 유전자좌로부터 어떠한 내인성 비-사람 MHC II 복합체로 발현할 수 없으나, 단지 사람 또는 사람화된 MHC II 복합체만을 발현한다. 각종 실시형태들에서, 유전적으로 변형된 비-사람 동물(예를 들면, 마우스, 래트, 토끼, 등)은 이의 배선내에 사람 또는 사람화된 MHC II 복합체, 예를 들면, 사람 또는 사람화된 MHC IIα 및/또는 β 폴리펩타이드(들)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
한 양상에서, 키메라 사람/비-사람 MHC II 복합체가 제공된다. 한 실시형태에서, 상기 키메라 사람/비-사람 MHC II 복합체는 키메라 사람/비-사람 MHC IIα 폴리펩타이드 및 키메라 사람/비-사람 MHC IIβ 폴리펩타이드를 포함한다. 한 양상에서, 키메라 MHC IIα 폴리펩타이드의 사람 부분 및/또는 키메라 MHC IIβ 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC IIα 폴리펩타이드 및/또는 사람 MHC IIβ 폴리펩타이드의 펩타이드-결합 도메인 각각을 포함한다. 한 양상에서, 키메라 MHC IIα 및/또는 β 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC IIα 및/또는 β 폴리펩타이드의 세포외 도메인 각각을 포함한다. 한 실시형태에서, 키메라 MHC IIα 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC IIα 폴리펩타이드의 α1 도메인을 포함하고; 다른 실시형태에서, 키메라 MHC IIα 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC IIα 폴리펩타이드의 α1 및 α2 도메인들을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 키메라 MHC IIβ 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC IIβ 폴리펩타이드의 β1 도메인을 포함하고; 다른 실시형태에서, 키메라 MHC IIβ 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC IIβ 폴리펩타이드의 β1 및 β2 도메인들을 포함한다.
본원에 기술된 MHC IIα 및 β 폴리펩타이드들의 사람 부분은 HLA-DP, -DQ, 및 -DR 유전자좌들 중 어느 것에 의해 암호화될 수 있다. 일반적으로 사용된 HLA 항원들 및 대립형질들의 목록은 본원에 참고로 혼입된 문헌[참조: Shankarkumar et al. (2004) The Human Leukocyte Antigen(HLA) System, Int. J. Hum. Genet. 4(2):91-103]에 기술되어 있다. 샨카르쿠마(Shankarkumar) 등은 또한 당해 분야에서 사용된 HLA 명명법의 간략한 설명을 나타낸다. HLA 명명법 및 다양한 HLA 대립형질들에 관한 추가의 정보는 문헌[참조: Holdsworth et al. (2009) The HLA dictionary 2008: a summary of HLA-A, -B, -C, -DRB1/3/4/5, and DQB1 alleles and their association with serologically defined HLA-A, -B, -C, -DR, and -DQ antigens, Tissue Antigens 73:95-170, 및 Marsh et al.에 의한 최근 업데이트 (2010) Nomenclature for factors of the HLA system, 2010, Tissue Antigens 75:291-455, 이들 둘다는 본원에 인용에 의해 포함된다]에서 찾을 수 있다. 따라서, 사람 또는 사람화된 MHC II 폴리펩타이드는 본원에 기술된 어떠한 기능성 사람 HLA 분자들로부터 기원할 수 있다.
하나의 구체적인 양상에서, 본원에 기술된 사람화된 MHC II 복합체의 사람 부분들은 사람 HLA-DR, 예를 들면, HLA-DR4로부터 기원한다. 전형적으로, HLA-DR α 쇄들은 단형성인데, 예를 들면, HLA-DR 복합체의 α 쇄는 HLA-DRA 유전자(예를 들면, HLA-DRα*01 유전자)에 의해 암호화된다. 한편, HLA-DR β 쇄는 다형성이다. 따라서, HLA-DR4는 HLA-DRA 유전자에 의해 암호화된 α 쇄 및 HLA-DRB1 유전자(예를 들면, HLA-DRβ1*04 유전자)에 의해 암호화된 β 쇄를 포함한다. 본원에서 하기 기술된 바와 같이, HLA-DR4는 다수의 자가면역병들, 예를 들면, 류마티스 관절염, 제I형 당뇨병들, 다발경화증 등의 발병과 관련된 것으로 알려져 있다. 본 발명의 한 실시형태에서, HLA-DRA 대립형질은 HLA-DRα*01 대립형질, 예를 들면, HLA-DRα*01:01:01:01이다. 다른 실시형태에서, HLA-DRB 대립형질은 HLA-DRβ1*04, 예를 들면, HLA-DRβ1*04:01:01이다. 본 실시예들이 이들 특정 HLA 서열들을 기술하고 있다고 해도; 어떠한 적합한 HLA-DR 서열들, 예를 들면, 사람 집단에서 나타난 다형성 변이체들, 하나 이상의 보존적 또는 비-보존적 아미노산 변형들을 지닌 서열들, 유전 코드의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 본원에 기술된 서열들과는 상이한 핵산 서열들 등이 본원에 포함된다.
사람화된 MHC II 복합체의 사람 부분들은 일반적인 사람 질병들과 관련되는 것으로 공지된 HLA 대립형질들의 뉴클레오타이드 서열들에 의해 암호화될 수 있다. 이러한 HLA 대립형질들은 HLA-DRB1*0401, -DRB1*0301, -DQA1*0501, -DQB1*0201, -DRB1*1501, -DRB1*1502, -DQB1*0602, -DQA1*0102, -DQA1*0201, -DQB1*0202, -DQA1*0501, 및 이들의 조합들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. HLA 대립형질/질병 관련성들의 요약에 대해서는 참조로 본원에 혼입된, 문헌[참조: Bakker et al. (2006) A high-resolution HLA and SNP haplotype map for disease association studies in the extended human MHC, Nature Genetics 38:1166-72 및 보충 정보]를 참조한다.
한 양상에서, 키메라 사람/비-사람 MHC II 복합체의 비-사람 부분은 내인성 비-사람(예를 들면, 설치류, 예를 들면, 마우스, 래트 등) MHC II 복합체의 막관통 및/또는 세포질성 도메인들을 포함한다. 따라서, 키메라 사람/비-사람 MHC IIα 폴리펩타이드의 비-사람 부분은 내인성 비-사람 MHC IIα 폴리펩타이드의 막관통 및/또는 세포질성 도메인들을 포함할 수 있다. 키메라 사람/비-사람 MHC IIβ 폴리펩타이드의 비-사람 부분은 내인성 비-사람 MHC IIβ 폴리펩타이드의 막관통 및/또는 세포질성 도메인들을 포함할 수 있다. 한 양상에서, 동물은 마우스이고, 키메라 α 및 β 폴리펩타이드들의 비-사람 부분들은 마우스 H-2E 단백질로부터 기원한다. 따라서, 키메라 α 및 β 폴리펩타이드들의 비-사람 부분들은 마우스 H-2E 단백질로부터 기원한 막관통 및 세포질성 도메인들을 포함할 수 있다. 비록 특이적인 H-2E 서열들이 실시예들에서 고려되어 있다고 해도, 어떠한 적합한 서열들, 예를 들면, 다형성 변이체들, 보존적/비-보존적 아미노산 치환들 등이 본원에 포함된다.
본 발명의 다양한 양상들에서, 키메라 사람/비-사람 MHC II 복합체를 암호화하는 서열(들)은 내인성 비-사람 MHC II 유전자좌(예를 들면, 마우스 H-2A 및/또는 H-2E 유전자좌)에 위치한다. 한 실시형태에서, 이는 내인성 MHC II 유전자(들) 또는 이의 부위의, 사람 또는 사람화된 MHC II 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들), 예를 들면, 본원에 기술된 키메라 사람/비-사람 MHC II 단백질을 암호화하는 키메라 유전자로의 대체를 초래한다. MHC IIα 및 β 폴리펩타이드들을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열들은 염색체 상에서 서로 근접하게 위치하므로, 대체는 2개의 유전자들이 독립적으로 또는 함께 표적화하도록 설계될 수 있으며; 이들 가능성들 둘 다는 본원에 포함된다. 한 실시형태에서, 대체는 MHC IIα 및 β 폴리펩타이드들을 암호화하는 내인성 뉴클레오타이드 서열의, 키메라 사람/비-사람 MHC α 폴리펩타이드 및 키메라 사람/비-사람 MHC β 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로의 대체를 포함한다. 한 양상에서, 상기 대체는 하나 이상(예를 들면, 2개)의 내인성 MHC II 유전자들을 나타내는 뉴클레오타이드 서열들을 대체함을 포함한다. 따라서, 비-사람 동물은 내인성 MHC II 유전자좌에서 키메라 사람/비-사람 뉴클레오타이드 서열을 함유하여, 내인성 비-사람 유전자좌로부터 키메라 사람/비-사람 MHC II 단백질을 발현한다.
따라서, 내인성 MHC II 유전자 유전자좌에서 키메라 사람/비-사람 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 키메라 사람/비-사람 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비-사람 동물이 본원에 제공되며, 여기서 상기 키메라 사람/비-사람 MHC IIα 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC IIα 세포외 도메인을 포함하고 키메라 사람/비-사람 MHC IIβ 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC IIβ 세포외 도메인을 포함하며, 여기서 키메라 사람/비-사람 MHC IIα 및 MHC IIβ 폴리펩타이드들은 세포의 표면 상에 기능성 MHC II 복합체를 형성한다.
키메라 사람/비-사람 폴리펩타이드는 사람 또는 비-사람 리더(신호) 서열을 포함하도록 존재할 수 있다. 한 실시형태에서, 키메라 MHC IIα 폴리펩타이드는 내인성 MHC IIα 폴리펩타이드의 비-사람 리더 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 키메라 MHC IIβ 폴리펩타이드는 내인성 MHC IIβ 폴리펩타이드의 비-사람 리더 서열을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 키메라 MHC IIα 및/또는 MHC IIβ 폴리펩타이드는 다른 비-사람 동물, 예를 들면, 다른 설치류 또는 다른 마우스 스트레인으로부터의 MHC IIα 및/또는 MHC IIβ 폴리펩타이드의 비-사람 리더 서열 각각을 포함한다. 따라서, 키메라 MHC IIα 및/또는 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 비-사람 MHC IIα 및/또는 MHC IIβ 리더 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 각각 작동적으로 연결될 수 있다. 여전히 다른 실시형태에서, 키메라 MHC IIα 및/또는 MHC IIβ 폴리펩타이드는 사람 MHC IIα 및/또는 사람 MHC IIβ 폴리펩타이드의 사람 리더 서열 각각(예를 들면, 사람 HLA-DRA 및/또는 사람 HLA-DRβ1*04의 리더 서열 각각)을 포함한다.
키메라 사람/비-사람 MHC IIα 및/또는 MHC IIβ 폴리펩타이드는 이의 사람 부분내에 사람 MHC IIα 및/또는 사람 MHC IIβ 폴리펩타이드의 완전하거나 또는 실질적으로 완전한 세포외 도메인 각각을 포함할 수 있다. 따라서, 사람 부분은, 사람 MHC IIα 및/또는 사람 MHC IIβ 폴리펩타이드(예를 들면, 사람 HLA-DRA 및/또는 사람 HLA-DRβ1*04)의 세포외 도메인을 암호화하는, 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들면, 95% 이상의 아미노산들을 포함할 수 있다. 하나의 예에서, 사람 MHC IIα 및/또는 사람 MHC IIβ 폴리펩타이드의 실질적으로 완전한 세포외 도메인은 사람 리더 서열을 결여하고 있다. 다른 예에서, 키메라 사람/비-사람 MHC IIα 및/또는 키메라 사람/비-사람 MHC IIβ 폴리펩타이드는 사람 리더 서열을 포함한다.
더욱이, 키메라 MHC IIα 및/또는 MHC IIβ 폴리펩타이드는 내인성 비-사람 프로모터 및 조절 성분들, 예를 들면, 마우스 MHC IIα 및/또는 MHC IIβ 조절 성분들 각각의 제어 하에서 발현될 수 있다. 이러한 배열은 예를 들면, 비-사람 동물에서 면역 반응 동안에 비-사람 동물내에서 키메라 MHC II 폴리펩타이드들의 적절한 발현을 촉진할 것이다.
유전적으로 변형된 비-사람 동물은 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 소[예를 들면, 암소, 황소, 버팔로(buffalo)], 사슴, 양, 염소, 닭, 고양이, 개, 흰담비, 영장류[예를 들면, 마모셋(marmoset), 레서스 원숭이(rhesus monkey)]로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다. 적합한 유전적으로 변형가능한 ES 세포들이 용이하게 이용가능하지 않은 비-사람 동물의 경우, 다른 방법들을 사용하여 유전적 변형을 포함하는 비-사람 동물을 제조한다. 이러한 방법들은 예를 들면, 비-ES 세포 게놈(예를 들면, 섬유아세포 또는 유도된 다능성 세포)을 변형시키는 단계, 핵 이전(nuclear transfer)을 사용하여 변형된 게놈을 적합한 세포, 예를 들면, 난모세포로 이전시키는 단계, 및 변형된 세포(예를 들면, 변형된 난모세포)를 비-사람 동물 속에서 적합한 조건들하에 잉태시켜 배아를 형성시키는 단계를 포함한다.
한 양상에서, 비-사람 동물은 포유동물이다. 한 양상에서, 비-사람 동물은 예를 들면, 상과 디포도이데아(Dipodoidea) 또는 무로이데아(Muroidea)의 작은 포유동물이다. 한 실시형태에서, 유전적으로 변형된 동물은 설치류이다. 한 실시형태에서, 상기 설치류는 마우스, 래트, 및 햄스터 중에서 선택된다. 한 실시형태에서, 상기 설치류는 상과 무로이데아로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 유전적으로 변형된 동물은 칼로마이스키다에(Calomyscidae)(예를 들면, 마우스-유사 햄스터들), 크리케티다에(Cricetidae)(예를 들면, 햄스터, 뉴 월드 래트들 및 마우스들, 들쥐), 무리다에[실제 마우스들 및 래트들, 저빌들(gerbils), 고슴도치들, 크레스티드 래트들(crested rats)], 네소마이이다에(Nesomyidae)[클라이밍(climbing) 마우스들, 록 마우스들(rock mice), 위드-테일드 래트들(with-tailed rats), 말라가시 래트들(Malagasy rats) 및 마우스들], 플라타칸쏘마이이다에(Platacanthomyidae)[예를 들면, 가시겨울잠쥐(spiny dormice)], 및 스팔라키다에(Spalacidae)[예를 들면, 뒤쥐(mole rats), 밤부 래트들(bamboo rats), 및 조커들(zokors)] 중에서 선택된 과로부터 기원한다. 구체적인 실시형태에서, 유전적으로 변형된 설치류는 실제 마우스 또는 래트(무리다에 과), 저빌, 가시겨울잠쥐, 및 크레스티드 래트로 부터 선택된다. 한 실시형태에서, 유전적으로 변형된 마우스는 무리다에 과의 구성원으로부터 기원한다. 한 실시형태에서, 동물은 설치류이다. 구체적인 실시형태에서, 설치류는 마우스 및 래트로부터 선택된다. 한 실시형태에서, 비-사람 동물은 마우스이다.
구체적인 실시형태에서, 비-사람 동물은 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, 및 C57BL/Ola로부터 선택된 C57BL 스트레인의 마우스인 설치류이다. 다른 실시형태에서, 마우스는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (예를 들면, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2인 스트레인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 129 스트레인이다[참조: 예를 들면, Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, see also, Auerbach et al (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines]. 구체적인 실시형태에서, 유전적으로 변형된 마우스는 전술된 129 스트레인과 전술된 C57BL/6 스트레인의 잡종이다. 구체적인 실시형태에서, 마우스는 전술된 129 스트레인들의 잡종, 또는 전술된 BL/6 스트레인들의 잡종이다. 구체적인 실시형태에서, 상기 잡종의 129 스트레인는 129S6(129/SvEvTac) 스트레인이다. 다른 실시형태에서, 마우스는 BALB 스트레인, 예를 들면, BALB/c 스트레인이다. 여전히 다른 실시형태에서, 마우스는 BALB 스트레인와 다른 전술된 스트레인의 잡종이다.
한 실시형태에서, 비-사람 동물은 래트이다. 한 실시형태에서, 래트는 위스타 래트(Wistar rat), LEA 스트레인, 스프라그 다울리 스트레인(Sprague Dawley strain), 피셔 스트레인(Fischer strain), F344, F6, 및 다크 아고우티(Dark Agouti) 중에서 선택된다. 한 실시형태에서, 래트 스트레인은 위스타, LEA, 스프라그 다울리, 피셔, F344, F6, 및 다크 아고우티로 이루어진 그룹 중에서 선택된 2개 이상의 스트레인들의 잡종이다.
따라서, 한 실시형태에서, 본 발명은 이의 게놈내에 키메라 사람/마우스 MHC II 복합체, 예를 들면, 키메라 사람/마우스 MHC IIα 및 β 폴리펩타이드들을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 마우스에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 키메라 사람/마우스 MHC IIα 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC IIα 펩타이드 결합 또는 세포외 도메인을 포함하고 키메라 사람/마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC IIβ 펩타이드 결합 또는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 마우스는 내인성 마우스 유전자좌(예를 들면, H-2A 및/또는 H-2E 유전자좌)로부터의 내인성 마우스 α 및/또는 β 폴리펩타이드의 펩타이드 결합 또는 세포외 도메인을 발현하지 않는다. 일부 실시형태들에서, 마우스는 H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2, H-2Ea, 및 이의 조합을 포함하는 기능성 MHC 제II 부류를 암호화하는 유전자를 결여하고 있는 게놈을 포함한다. 사람 MHC IIα 폴리펩타이드의 펩타이드-결합 도메인은 α1 도메인을 포함할 수 있고 사람 MHC IIβ 폴리펩타이드의 펩타이드-결합 도메인은 β1 도메인을 포함할 수 있으므로; 키메라 MHC II 복합체의 펩타이드-결합 도메인은 사람 α1 및 β1 도메인들을 포함할 수 있다. 사람 MHC IIα 폴리펩타이드의 세포외 도메인은 α1 및 α2 도메인들을 포함할 수 있고 사람 MHC IIβ 폴리펩타이드의 세포외 도메인은 β1 및 β2 도메인들을 포함할 수 있으므로; 키메라 MHC II 복합체의 세포외 도메인은 사람 α1, α2, β1 및 β2 도메인들을 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, 키메라 MHC II 복합체의 마우스 부분은 마우스 MHC II, 예를 들면, 마우스 H-2E의 막관통 및 세포질성 도메인들(예를 들면, 마우스 H-2Eα 및 β 쇄들의 막관통 및 세포질성 도메인들)을 포함한다.
따라서, 한 실시형태에서, 유전적으로 변형된 마우스가 제공되며, 여기서 당해 마우스는 내인성 마우스 MHC II 유전자좌에서 키메라 사람/마우스 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 키메라 사람/마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 여기서 키메라 MHC IIα 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 HLA-DR4 단백질의 α 폴리펩타이드로부터 기원한 세포외 도메인을 포함하고 키메라 MHC IIβ 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 HLA-DR4 단백질의 β 폴리펩타이드로부터 기원한 세포외 도메인을 포함하며, 여기서, 키메라 MHC IIα 폴리펩타이드의 마우스 부분은 마우스 H-2Eα 쇄의 막관통 및 세포질성 도메인들을 포함하고 키메라 MHC IIβ 폴리펩타이드의 마우스 부분은 마우스 H-2Eβ 쇄의 막관통 및 세포질성 도메인들을 포함하며, 여기서 상기 마우스는 기능성인 키메라 HLA-DR4/H-2E MHC II 복합체를 발현한다. 한 실시형태에서 키메라 HLA-DR4/H-2E MHC II 복합체는 HLA-DR4 단백질(HLA-DRAα1, 및 α2 도메인들)로부터 기원한 세포외 도메인들(예를 들면, α1, 및 α2 도메인들) 및 마우스 H-2Eα 쇄로부터의 막관통 및 세포질성 도메인들을 포함하는 MHC IIα 쇄, 및 또한 HLA-DR4 (HLA-DRβ1*04 β1 및 β2 도메인들)로부터 기원한 세포외 도메인들(예를 들면, β1 및 β2 도메인들) 및 마우스 H-2Eβ 쇄로부터 기원한 막관통 및 세포질성 도메인들을 포함하는 MHC IIβ 쇄를 포함한다. 한 양상에서, 마우스는 이들의 내인성 마우스 유전자좌들로부터 기능성 내인성 H-2A 및 H-2E 폴리펩타이드들을 발현하지 않는다(예를 들면, 마우스는 H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2, 및 H-2Ea 폴리펩타이드들을 발현하지 않는다). 각종 실시형태들에서, 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열들의 발현은 각각의 내인성 마우스 프로모터들 및 조절 성분들의 제어 하에 있다. 본 발명의 각종 실시형태들에서, 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열들은 동일한 염색체 위에 위치한다. 일부 양상들에서, 마우스는 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열들을 함유하는 2개 카피들의 키메라 MHC II 유전자좌를 포함하는 반면, 다른 양상들에서, 마우스는 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열들을 함유하는 1개 카피의 MHC II 유전자좌를 포함한다. 따라서, 마우스는 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열들을 함유하는 키메라 MHC II 유전자좌에 대해 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있다. 각종 실시형태들에서, 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열들은 마우스의 배선내에 포함된다.
본원에 기술된 일부 실시형태들에서, 내인성 마우스 MHC II 유전자좌에서, 예를 들면, 내인성 마우스 H-2A 및 H-2E 유전자들의 대체를 통해 키메라 MHC II 유전자좌를 포함하는 마우스가 제공된다. 일부 양상들에서, 키메라 유전자좌는 사람 HLA-DRA의 세포외 도메인 및 마우스 H-2E α 쇄의 막관통 및 세포질성 도메인들, 및 또한 사람 HLA-DRβ1*04의 세포외 도메인 및 마우스 H-2E β 쇄의 막관통 및 세포질성 도메인들을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 키메라 유전자좌의 각종 도메인들은, 유전자좌가 기능성인 키메라 사람/마우스 MHC II 복합체를 발현하는 방식으로 연결된다.
각종 실시형태들에서, 본원에 기술된 바와 같은 키메라 MHC II 유전자좌로부터 기능성인 키메라 MHC II 단백질을 발현하는 비-사람 동물(예를 들면, 설치류, 예를 들면, 마우스 또는 래트)은 세포 표면 상에 키메라 단백질을 나타낸다. 한 실시형태에서, 비-사람 동물은 사람에서 관찰된 바와 동일한 세포 분포로 세포 표면 상에 키메라 MHC II 단백질을 발현한다. 한 양상에서, 세포는 키메라 MHC II 단백질의 세포외 부분(예를 들면, 사람 HLA-DR4 세포외 부분)에 결합된 펩타이드 단편(항원 단편)을 나타낸다.
각종 실시형태들에서, 키메라 MHC II 단백질, 예를 들면, HLA-DR4/H-2E 단백질을 나타내는 세포는 항원-제시 세포(APC), 예를 들면, 대식세포, 수지 세포, 또는 B 세포이다. 일부 실시형태들에서, 키메라 단백질이 나타낸 펩타이드 단편은 종양으로부터 기원한다. 다른 실시형태들에서, 키메라 MHC II 단백질이 나타낸 펩타이드 단편은 병원체, 예를 들면, 세균, 바이러스, 또는 기생충으로부터 기원한다.
본원에 기술된 키메라 MHC II 단백질은 동일한 세포 또는 제2의 세포의 표면 상에 다른 단백질들과 상호작용할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 키메라 MHC II 단백질은 내인성 비-사람 단백질들과 당해 세포의 표면위에 상호작용한다. 키메라 MHC II 단백질은 또한 사람 또는 사람화된 단백질들과 동일한 세포 또는 제2의 세포의 표면 상에서 상호작용할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 제2의 세포는 T 세포이고, 키메라 MHC II 단백질은 T 세포 수용체(TCR) 및 이의 공-수용체 CD4와 상호작용한다. 일부 실시형태들에서, T 세포는 내인성 마우스 T 세포이다. 다른 실시형태들에서, T 세포는 사람 T 세포이다. 일부 실시형태들에서, TCR은 사람 또는 사람화된 TCR이다. 추가의 실시형태들에서, CD4는 사람 또는 사람화된 CD4이다. 다른 실시형태에서, TCR 및 CD4 중 하나 또는 둘 다는 비-사람, 예를 들면, 마우스 또는 래트이다.
한 실시형태에서, 키메라 MHC II 유전자를 결여하고 있는 야생형 동물보다 더 높은 비율로 종양들을 진행시키지 않는, 본원에 기술된 바와 같은 유전적으로 변형된 비-사람 동물이 제공된다. 일부 실시형태들에서, 동물은 간 악성종양들, 예를 들면, 각종의 T 및 β 세포 림프종들, 백혈병들, 복합 림프종들(composite lymphomas)[예를 들면, 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma)]을 야생형 동물보다 더 높은 비율로 진행하지 않는다.
유전자 조작된 비-사람 동물 외에도, 비-사람 배아(예를 들면, 설치류, 예를 들면, 마우스 또는 래트 배아)가 또한 제공되며, 여기서 배아는 본원에 기술된 바와 같은 비-사람 동물(예를 들면, 설치류, 예를 들면, 마우스 또는 래트)로부터 기원한 공여체 ES 세포를 포함한다. 한 양상에서, 배아는 키메라 MHC II 유전자 및 숙주 배아 세포들을 포함하는 ES 공여체 세포를 포함한다.
또한 본원에 기술된 바와 같은 비-사람 동물(예를 들면, 설치류, 예를 들면, 마우스 또는 래트)로부터 기원하며, 키메라 MHC II 단백질(예를 들면, HLA-DR4/H-2E 단백질)을 발현하는 조직이 제공된다.
또한, 본원에 기술된 바와 같은 비-사람 동물로부터 분리된 비-사람 세포가 제공된다. 한 실시형태에서, 세포는 ES 세포이다. 한 실시형태에서, 세포는 항원-제시 세포, 예를 들면, 수지 세포(dendritic cell), 대식세포, B 세포이다. 한 실시형태에서, 세포는 면역 세포이다. 한 실시형태에서, 면역 세포는 림프구이다.
또한 본원에 기술된 바와 같은 비-사람 동물의 염색체 또는 이의 단편을 포함하는 비-사람 세포가 제공된다. 한 실시형태에서, 비-사람 세포는 본원에 기술된 바와 같은 비-사람 동물의 핵을 포함한다. 한 실시형태에서, 비-사람 세포는 핵 전이의 결과로서 염색체 또는 이의 단편을 포함한다.
한 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 키메라 MHC II 단백질(예를 들면, HLA-DR4/H-2E 단백질)을 암호화하는 유전자를 포함하는 비-사람 유도된 다능성 세포가 제공된다. 한 실시형태에서, 유도된 다능성 세포는 본원에 기술된 바와 같은 비-사람 동물로부터 기원한다.
한 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 비-사람 동물의 세포로부터 기원한 하이브리도마 또는 쿼드로마(quadroma)가 제공된다. 한 실시형태에서, 비-사람 동물은 마우스 또는 래트이다.
*한 양상에서, 결합된 펩타이드를 포함함으로써 키메라 사람/설치류 MHC II/펩타이드 복합체를 형성하는 키메라 사람/설치류 MHC II 표면 단백질을 지닌 제1 세포, 및 키메라 사람/설치류 MHC II/펩타이드 복합체에 결합하는 제2 세포를 포함하는 시험관내 제조가 제공된다. 한 실시형태에서, 제2 세포는 사람 또는 사람화된 T-세포 수용체를 포함하고, 한 실시형태에서 사람 또는 사람화된 CD4를 추가로 포함한다. 한 실시형태에서, 제2 세포는 사람 또는 사람화된 T-세포 수용체 및 사람 또는 사람화된 CD4 단백질을 포함하는 설치류(예를 들면, 마우스 또는 래트) 세포이다. 한 실시형태에서, 제2 세포는 사람 세포이다.
또한, 본원에 기술된 유전자 조작된 비-사람 동물(예를 들면, 유전자 조작된 설치류, 예를 들면, 마우스 또는 래트)을 제조하는 방법이 제공된다. 유전자 조작된 비-사람 동물을 제조하는 방법은, 이의 게놈이 키메라 MHC II 단백질(예를 들면, 키메라 MHC IIα 및 β 폴리펩타이드들)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 동물을 생성한다. 한 실시형태에서, 상기 방법은 유전자 조작된 마우스를 생성하며, 이의 게놈은 내인성 MHC II 유전자좌에서 키메라 사람/마우스 MHC II 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 여기서 키메라 MHC II 단백질의 사람 부분은 사람 HLA-DR4의 세포외 도메인을 포함하고 마우스 부분은 마우스 H-2E의 막관통 및 세포질성 도메인들을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 당해 방법은 VELOCIGENE® 기술을 사용하여 제조한 표적화 작제물을 이용하고, 당해 작제물을 ES 세포들내로 도입시킴을 이용하며, 표적화된 ES 세포 클론들을 실시예들에서 기술된 바와 같은 VELOCIMOUSE® 기술을 사용하여 마우스 배아내로 도입시킴을 이용한다. 한 실시형태에서, ES 세포들은 129 및 C57BL/6 마우스 스트레인들의 잡종이고; 한 실시형태에서, ES 세포들은 BALB/c 및 129 마우스 스트레인들의 잡종이다.
본원에 기술된 유전자 조작된 비-사람 동물들을 생성하는데 사용된 뉴클레오타이드 작제물이 또한 제공된다. 한 양상에서, 뉴클레오타이드 작제물은: 5' 및 3' 비-사람 동족체 아암들(arms), 사람 HLA-DR α 및 β 쇄 서열들을 포함하는 DNA 단편, 및 재조합 부위들에 의해 플랭킹(flanking)된 선택 카세트를 포함한다. 한 실시형태에서, 사람 HLA-DR α 및 β 쇄 서열들은 사람 HLA-DRα 및 β 쇄 유전자들의 인트론(intron)들 및 엑손들을 포함하는 게놈 서열들이다. 한 실시형태에서, 비-사람 동족체 아암들은 비-사람 MHC II 게놈 서열에 대해 상동성이다.
한 실시형태에서, 사람 HLA-DRα 쇄 서열은 α1 및 α2 도메인 암호화 서열을 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 이는 5'로부터 3'까지: α1 엑손(엑손 2), α1/α2 인트론(인트론 2), 및 α2 엑손(엑손 3)을 포함한다. 한 실시형태에서, 사람 HLA-DR β 쇄 서열은 β1 및 β2 도메인 암호화 서열을 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 이는 5'로부터 3'까지: β1 엑손(엑손 2), β1/β2 인트론(인트론 2), 및 β2 엑손(엑손 3)을 포함한다.
선택 카세트는, 목적한 작제물이 통합된 세포들(예를 들면, ES 세포들)의 선택을 용이하게 하는 표적화 작제물내로 삽입된 뉴클레오타이드 서열이다. 다수의 적합한 선택 카세트들이 당해 분야에 공지되어 있다. 일반적으로, 선택 카세트는 특정 항생제(예를 들면, Neo, Hyg, Pur, CM, SPEC 등)의 존재하에서 긍정적 선택이 가능하도록 한다. 또한, 선택 카세트는 재조합 부위들에 의해 플랭킹될 수 있으며, 상기 부위들은 리컴비나제 효소들을 사용한 처리시 선택 카세트가 결실되도록 한다. 일반적으로 사용된 재조합 부위들은 Cre 및 Flp 효소들 각각에 의해 인식된 loxP 및 Frt이나, 다른 것들도 당해 분야에 공지되어 있다. 선택 카세트는 암호화 영역 외부의 작제물내 어느 곳에도 위치할 수 있다. 한 실시형태에서, 선택 카세트는 β 쇄 인트론, 예를 들면, β2/막관통 도메인 인트론(인트론 3)내에 위치한다.
한 실시형태에서, 5' 및 3' 상동성 아암들은 내인성 비-사람 MHC II 유전자좌의 5' 및 3' 위치들에서 게놈 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 5' 상동성 아암은 H-2Ab1 유전자 상부의 유전자 서열을 포함하고, 3' 상동성 아암은 마우스 H-2Ea 유전자 하부의 게놈 서열을 포함한다. 당해 실시형태에서, 작제물은 마우스 H-2E 및 H-2A 유전자들 둘 다의 대체를 허용한다.
따라서, 한 양상에서, 5'로부터 3'까지: 마우스 H-2Ab1 유전자 상부의 마우스 게놈 서열을 함유하는 5' 상동성 아암, 키메라 사람/마우스 MHC IIβ 쇄를 암호화하는 서열을 포함하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 키메라 사람/마우스 MHC IIα 쇄를 암호화하는 서열을 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열, 및 마우스 H-2Ea 유전자 상부의 마우스 게놈 서열을 함유하는 3' 상동성 아암을 포함하는 뉴클레오타이드 작제물이 제공된다. 구체적인 실시형태에서, 키메라 사람/마우스 MHC IIβ 쇄를 암호화하는 서열을 포함하는 제1 뉴클레오타이드 서열은 사람 β1 엑손, β1/β2 인트론, β2 엑손, 사람 β2 엑손 서열과, 마우스 막관통 도메인 엑손의 서열 사이의 인트론성 영역내에 삽입된 재조합 부위들에 의해 플랭킹된 선택 카세트를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 키메라 사람/마우스 MHC IIα 쇄를 암호화하는 서열을 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열은 사람 α1 엑손, α1/α2 인트론, 및 사람 α2 엑손을 포함한다. 본 발명의 예시적인 작제물은 도 5에 묘사되어 있다(MAID 1680).
유전자 표적화의 완료시, ES 세포들 또는 유전적으로 변형된 비-사람 동물들을 스크리닝하여 목적한 외인성 뉴클레오타이드 서열의 성공적인 혼입 또는 외인성 폴리펩타이드의 발현을 확인한다. 다수의 기술들이 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있으며, 서던 블롯팅(Southern blotting), 긴(long) PCR, 정량적 PCT(예를 들면, TAQMAN®을 사용한 실시간 PCR), 형광성 반응계내 하이브리드화, 노던 블롯팅(Northern blotting), 유동 세포분석, 웨스턴 분석(Western analysis), 면역세포화학, 면역조직화학 등을 포함한다(그러나 이에 한정되지 않는다). 하나의 예에서, 목적한 유전적 변형을 지닌 비-사람 동물들(예를 들면, 마우스들)은 마우스 대립형질의 손실 및/또는 사람 대립형질의 획득을 문헌[참조: Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659]에 기술된 대립형질 검정의 변형을 사용하여 스크리닝함으로써 확인할 수 있다. 유전적으로 변형된 동물들에서 특이적인 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열을 확인하는 다른 검정들은 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있다.
당해 기재내용은 또한 비-사람 동물의 MHC II 유전자좌를 변형시켜 본원에 기술된 키메라 사람/비-사람 MHC II 복합체를 발현시키는 방법을 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명은 내인성 마우스 MHC II 유전자좌에서 마우스 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 키메라 사람/마우스 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체시킴을 포함하여, 마우스의 MHC II 유전자좌를 변형시켜 키메라 사람/마우스 MHC II 복합체를 발현시키는 방법을 제공한다. 구체적인 양상에서, 키메라 사람/마우스 MHC II 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 사람 MHC IIα 쇄(예를 들면, HLA-DR4α 쇄)의 세포외 도메인 및 마우스 MHC IIα 쇄(예를 들면, H-2Eα 쇄)의 막관통 및 세포질성 도메인들을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열들 및 사람 MHC IIβ 쇄(예를 들면, HLA-DR4β 쇄)의 세포외 도메인 및 마우스 MHC IIβ 쇄(예를 들면, H-2Eβ 쇄, 예를 들면, H-2Eb1 쇄)의 막관통 및 세포질성 도메인들을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 변형된 마우스 MHC II 유전자좌는 키메라 HLA-DR4/H-2E 단백질을 발현한다.
한 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 뉴클레오타이드 작제물로부터의 키메라 HLA-DR4/H-2E 단백질을 단일 세포내에서 발현시킴을 포함하여, 키메라 사람 HLA 제II 부류/비-사람 MHC 제II 부류 분자를 제조하는 방법이 제공된다. 한 실시형태에서, 상기 뉴클레오타이드 작제물은 바이러스 벡터이고; 구체적인 실시형태에서, 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)이다. 한 실시형태에서, 세포는 CHO, COS, 293, HeLa, 및 바이러스 핵산 서열을 발현하는 망막 세포(예를 들면, PERC.6TM 세포) 중에서 선택된다.
한 양상에서, 키메라 HLA-DR4/H-2E 단백질을 발현하는 세포가 제공된다. 한 실시형태에서, 상기 세포는 본원에 기술된 바와 같은 키메라 MHC 제II 부류 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 세포는 CHO, COS, 293, HeLa, 및 바이러스 핵산 서열을 발현하는 망막 세포(예를 들면, PERC.6TM 세포) 중에서 선택된다.
본원에 기술된 바와 같은 비-사람 동물에 의해 제조된 키메라 MHC 제II 부류 분자가 또한 제공되며, 여기서 키메라 MHC 제II 부류 분자는 사람 MHC II 단백질, 예를 들면, HLA-DR4 단백질로부터의 α1, α2, β1, 및 β2 도메인들, 및 비-사람 MHC II 단백질, 예를 들면, 마우스 H-2E 단백질로부터의 막관통 및 세포질성 도메인들을 포함한다. 본원에 기술된 HLA-DR4의 세포외 도메인을 포함하는 키메라 MHC II 복합체는 항-HLA-DR 항체들에 의해 검출될 수 있다. 따라서, 키메라 사람/비-사람 MHC II 폴리펩타이드를 나타내는 세포는 항-HLA-DR 항체를 사용하여 검출하고/하거나 선택할 수 있다.
비록 후속되는 실시예들이, 이의 게놈이 마우스 H-2A 및 H-2E 단백질들을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의, 키메라 사람/마우스 HLA-DR4/H-2E 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로의 대체를 포함하는 유전자 조작된 동물을 기술한다고 해도, 당해 분야의 숙련가는, 유사한 전략을 사용하여 다른 사람 MHC II 유전자들(HLA-DP 및 HLA-DQ)을 포함하는 키메라들을 도입시킬 수 있음을 이해할 수 있다. 따라서, 본 발명의 추가의 실시형태는, 이의 게놈이 키메라 HLA-DQ/H-2A 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 조작된 동물에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 키메라 HLA-DQ2.5/H-2A 단백질을 암호화한다. 다른 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 키메라 HLA-DQ8/H-2A 단백질을 암호화한다. 또한, 다수의 사람화된 MHC II 분자들(예를 들면, 키메라 HLA-DR/H-2E 및 HLA-DQ/H-2A)의 도입이 또한 고려된다.
유전적으로 변형된 동물들의 용도
각종 실시형태들에서, 본원에 기술된 유전적으로 변형된 비-사람 동물들은 사람 또는 사람화된 MHC II를 지닌 APCs를 세포 표면 상에서 제조하며, 그 결과, 복합체의 성분들 중 실질적으로 모두가 사람이거나 사람화되어 있기 때문에, 사람과 유사한 방식으로 T 세포들에 대한 에피토프(epitope)들로서 세포질성 단백질들로부터 기원한 펩타이드들을 나타낸다. 본 발명의 유전적으로 변형된 비-사람 동물들은 사람화된 동물에서 사람 면역계의 기능을 연구하기 위해; 면역 반응을 유발하는 항원들 및 항원 에피토프들(예를 들면, T 세포 에피토프들, 예를 들면, 유일한 사람 암 에피토프들)의 확인을 위해, 예를 들면, 백신 개발시 사용하기 위해; 백신 후보물들 및 다른 백신 전략들의 평가를 위해; 사람 자가면역성을 연구하기 위해; 사람 감염성 질병들을 연구하기 위해; 및 달리는 사람 MHC 발현을 기준으로 하여 보다 우수한 치료학적 전략들을 고안하기 위해 사용될 수 있다.
MHC II 복합체는 세포외 단백질들, 예를 들면, 세포외 세균, 이웃하는 세포들, 또는 B 세포 수용체들에 의해 결합되거나 B 세포내로 내재화된 폴리펩타이드들로부터 기원한 펩타이드들에 결합한다. 세포외 단백질들이 식균작용 경로로 도입되면, 이들은 펩타이드들로 분해되며, 펩타이드들은 결합되어 MHC II에 의해 나타난다. MHC II에 의해 나타난 펩타이드가 CD4+ T 세포들에 의해 인식되면, T 세포들이 활성화되고, 증식되어, 각종의 T 헬퍼 아형들(예를 들면, TH1, TH2)로 분화되고, 대식세포-매개된 병원체 사멸, B 세포 증식, 및 항체 생산의 활성화를 포함하는 다수의 현상들을 초래한다. 면역 반응에 있어서 MHC II 역활로 인하여, MHC II 펩타이드 제시(presentation)는 사람 병리학들용 치료의 개발시 중요하다. 그러나, 마우스 MHC II와 관련하여 항원들의 제시는, 사람 및 마우스 MHC 복합체들이 항원들을 상이하게 인식하므로, 예를 들면, 마우스 MHC II가 동일한 항원들을 인식하지 않을 수 있거나 사람 MHC II보다 상이한 에피토프들을 나타낼 수 있으므로, 사람 질병과 어느 정도만 관련되어 있다. 따라서, 사람 병리학들에 대한 가장 관련된 데이타는 사람 MHC II에 의한 항원 에피토프들의 제시를 연구함을 통해 수득된다.
따라서, 각종 실시형태들에서, 본 발명의 유전자 조작된 동물들이 다른 것들 중에서, 사람내 면역 반응을 개시하는 항원의 능력을 평가하고, 항원들의 다양성을 생성하여 사람 백신 개발에 사용될 수 있는 특이적인 항원을 확인하기 위해 유용하다.
한 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 유전적으로 변형된 비-사람 동물을 펩타이드 서열을 포함하는 분자에 노출시키는 단계, 비-사람 동물이 면역 반응을 시작하도록 하는 단계, 및 비-사람 동물내에서 본원에 기술된 사람화된 MHC II 복합체에 의해 나타난 펩타이드의 서열에 결합하는 세포를 검출하는 단계를 포함하여, 사람내에서 펩타이드 서열의 항원성을 측정하는 방법이 제공된다.
한 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 유전적으로 변형된 비-사람 동물을 펩타이드에 노출시키는 단계, 비-사람 동물이 면역 반응을 개시하도록 하는 단계, 및 비-사람 동물내에서 본원에 기술된 바와 같은 키메라 사람/비-사람 MHC 제II 부류 분자들에 의해 펩타이드의 서열에 결합하는 세포를 검출하는 단계를 포함하여, 펩타이드가 사람내에서 면역 반응을 유발할 것인지를 측정하는 방법이 제공된다. 한 실시형태에서, 노출 후 비-사람 동물은 펩타이드에 결합하는 MHC 제II 부류-제한된 CD4+ T 세포를 포함한다.
한 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 비-사람 동물을 추정된 T 세포 에피토프를 포함하는 항원에 노출시키는 단계, 비-사람 동물이 면역 반응을 개시하도록 하는 단계, 및 MHC 제II 부류-제한된 CD4+ T 세포에 의해 결합된 에피토프를 확인하는 단계를 포함하여, 사람 CD4+ T 세포 에피토프를 확인하는 방법이 제공된다.
한 양상에서, 추정된 항원을 본원에 기술된 바와 같은 마우스에 노출시키는 단계, 마우스가 면역 반응을 개시하도록 하는 단계, 사람 MHC II 분자(예를 들면, HLA-DR 분자)와 관련하여 항원에 대해 특이적인 CD4+ T 세포 반응을 검출하는 단계, 및 사람 MHC II-제한된 분자(예를 들면, 사람 HLA-DR 제한된 분자)에 의해 결합된 항원을 확인하는 단계를 포함하여, 사람에서 CD4+ T 세포 반응을 생성하는 항원을 확인하기 위한 방법이 제공된다..
한 실시형태에서, 상기 항원은 세균 단백질을 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 항원은 사람 종양 세포 항원을 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 항원은 사람에서 사용하기 위한 추정된 백신, 또는 다른 생물약제를 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 항원은 사람에서 항체들을 생성하는 사람 에피토프를 포함한다. 여전히 다른 실시형태에서, 항원은 효모 또는 진균 세포 항원을 포함한다. 여전히 다른 실시형태에서, 항원은 사람 기생충으로부터 기원한다.
한 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 마우스를 추정된 항원에 노출시키는 단계 및 마우스 내에서 항원-특이적인 HLA-DR-제한된(예를 들면, HLA-DR4-제한된) 면역 반응을 측정하는 단계를 포함하여, 추정된 항원이 사람 면역계에 대한 노출시 HLA-DR-제한된 면역 반응(예를 들면, HLA-DR4-제한된 반응)을 생성할 에피토프를 함유하는지를 측정하기 위한 방법이 제공된다. 다른 양상에서, 추정된 항원이 사람 면역계에 대한 노출시 HLA-DQ-제한된 반응을 생성할 에피토프를 함유하는지를 측정하는 방법이 제공된다.
또한, 본원에 기술된 마우스를 항원에 노출시키는 단계, 마우스가 면역 반응을 개시하도록 하는 단계(여기서, 면역 반응은 항원 생산을 포함한다), 및 사람 MHC II 복합체와 관련하여 나타난 항원을 인식하는 항체를 분리하는 단계를 포함하여, 사람 MHC II 복합체와 관련하여 나타난 항원, 예를 들면, 세균, 기생충 등으로부터 기원한 항원에 대해 항체들을 생성시키는 방법이 제공된다. 한 실시형태에서, 펩타이드-MHC II에 대한 항체들을 생성하기 위하여, MHC II 사람화된 마우스는 펩타이드-MHC II 면역원으로 면역화시킨다.
한 양상에서, 본원에 기술된 사람화된 MHC II 복합체를 포함하는 마우스를 항원에 노출시키는 단계, 마우스가 면역 반응을 생성하도록 하는 단계, 및 마우스로부터 MHC II-제한된 항원에 결합하는 T 세포 수용체의 가변 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 분리하는 단계를 포함하여, MHC II와 관련하여 나타난 항원(예를 들면, 사람 종양 항원, 백신 등)을 인식하는 T 세포 수용체 가변성 도메인을 확인하는 방법이 제공된다. 한 실시형태에서, 상기 항원은 사람화된 MHC II(예를 들면, 사람 HLA II 엑토도메인/마우스 MHC II 막관통 및/또는 세포질성 도메인)과 관련하여 나타난다.
T 세포와, MHC II(예를 들면, 사람 HLA II 엑토도메인/마우스 MHC II 막관통 및/또는 세포질성 도메인)와 관련하여 펩타이드를 나타내는 APC 사이의 상호작용의 결과는 당해 분야에 공지된 다수의 기술들, 예를 들면, T 세포 증식 검정들, 사이토카인 방출 검정들 등으로 측정할 수 있다.
병원체들 또는 신생물들로부터의 항원들 및 이들의 T 세포 에피토프들을 확인하기 위한 능력 외에도, 본 발명의 유전적으로 변형된 동물들을 사용하여 사람 자가면역병과 관련된 자가항원들을 확인하고, 또한 사람 자가면역병 진행을 연구할 수 있다. HLA 유전자좌들내의 다형성들이 사람 자가면역병에 대한 소인(predisposition)에 역활을 한다는 것은 공지되어 있다. 실제로, 류마티스 관절염, 제I형 당뇨병들, 하쉬모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 다발경화증, 중증 근육무력증, 그레이브스병(Graves's disease), 전신 홍반 루푸스, 소아지방변증(celiac disease), 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염, 및 다른 자가면역 질환들의 발달과 상호 관련되는 HLA-DR 및 HLA-DQ 유전자좌들에서 특이적인 다형성들이 확인되어 왔다. 예를 들면, 문헌[참조: Wong and Wen (2004) What can the HLA transgenic mouse tell us about autoimmune diabetes?, Diabetologia 47:1476-87; Taneja and David (1998) HLA Transgenic Mice as Humanized Mouse Models of Disease and Immunity, J. Clin. Invest. 101:921-26; Bakker et al. (2006), supra; 및 International MHC and Autoimmunity Genetics Network (2009) Mapping of multiple susceptibility variants within the MHC region for 7 immune-mediated diseases, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:18680-85]을 참조한다.
따라서, 본원에 기술된 사람화된 MHC II 복합체 동물들을 제조하는 방법들을 사용하여 사람 자가면역병들과 관련된 것으로 고려되는 MHC II 분자들을 도입시키고, 사람 자가면역병의 진행을 연구할 수 있다. 또한, 본원에 기술된 비-사람 동물들을 사용하여 사람 자가면역병의 동물 모델들을 개발할 수 있다. 본원에 기술된 사람화된 MHC II 단백질들을 수반하는 본 발명에 따른 마우스들을 사용하여 잠재적인 자가항원들을 확인하고, 질병 진행에 관여된 에피토프들을 맵핑(mapping)하며, 자가면역병 조절을 위한 전략들을 설계할 수 있다.
또한, 본원에 기술된 유전적으로 변형된 동물들을 사람 알레르기 반응의 연구에 사용할 수 있다. 알레르기 반응들은 MHC II 대립형질들과 관련된 것으로 여겨지므로, 본원에 기술된 유전적으로 변형된 동물들을 사용하여 알레르겐(allergen) 특이적인 T 세포 반응의 HLA 제한을 측정하고 알레르기 반응을 방지하기 위한 전략들을 개발할 수 있다.
실시예
본 발명은 하기 비제한적 실시예들에 의해 추가로 설명할 것이다. 이들 실시예들은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제시되지만 어떠한 방식으로도 이의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 이들 실시예들은 당해 분야의 통상의 숙련가들에게 잘 공지될 수 있는 통상의 방법들의 상세한 설명(분자 클로닝 기술들 등)을 포함하지 않는다. 달리 나타내지 않는 한, 부(part)는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨로 나타내고, 압력은 대기압 또는 대기압 근처이다.
실시예 1. 내인성 MHC 제II 부류 H-2A 및 H-2E 유전자좌의 결실
VELOCIGENE® 유전자 조작 기술(참조: 예를 들면, 미국 특허 제6,586,251호 및 Valenzuela et al., 상기 참조)을 사용하여 내인성 MHC 제II 부류 H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2, 및 H-2Ea 유전자들의 결실을 도입시키기 위한 표적화 벡터를 제조하였다. 세균 인공 염색체(BAC) RP23-458i22[제조원: 인비트로겐(Invitrogen)] DNA를 변형시켜 내인성 MHC 제II 부류 유전자들 H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2, 및 H-2Ea를 결실시켰다.
요약하면, 상부 및 하부 상동성 아암들을 마우스 BAC DNA의 PCR에 의해 H-2Ab1 유전자의 5' 및 H-2Ea 유전자의 3' 위치로부터 각각 유도하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 이들의 상동성 아암들을 사용하여 MHC 제II 부류 유전자좌의 유전자들 H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2, 및 H-2Ea를 포함하는 약 79kb의 RP23-458i22가 결실된 카세트를 세균 동종 재조합(BHR)에 의해 제조하였다. 당해 영역을 lox66 및 lox71 부위에 의해 플랭킹된 하이그로마이신 카세트로 대체하였다. 최종의 표적화 벡터는 5'로부터 3'까지, 내인성 MHC 제II 부류 유전자좌의 H-2Ab1 유전자에 대해 마우스 게놈 서열 5'을 포함하는 34kb의 상동성 아암, 5' lox66 부위, 하이그로마이신 카세트, 3' lox71 부위, 및 내인성 MHC 제II 부류 유전자좌의 H-2Ea 유전자에 대해 마우스 게놈 서열 3'을 포함하는 63kb의 상동성 아암을 포함하였다(MAID 5111, 도 5 참조).
BAC DNA 표적화 벡터(상기에 기술함)를 사용하여 마우스 ES 세포들을 전기천공(electroporate)시켜 내인성 MHC 제II 부류 유전자좌의 결실을 포함하는 변형된 ES 세포들을 생성하였다. 결실된 내인성 MHC 제II 부류 유전자좌를 함유하는 양성 ES 세포들을 정량적 PCR 검정에 의해 TAQMANTM 프로브들을 사용하여 확인하였다[참조: Lie and Petropoulos (1998) Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48]. 결실된 유전자좌의 상부 영역을 PCR에 의해 프라이머들 5111U F(CAGAACGCCAGGCTGTAAC; 서열번호 1) 및 5111U R(GGAGAGCAGGGTCAGTCAAC; 서열번호 2) 및 프로브 5111U P(CACCGCCACTCACAGCTCCTTACA; 서열번호 3)를 사용하여 확인하였고, 반면, 결실된 유전자좌의 하부 영역은 프라이머들 5111D F(GTGGGCACCATCTTCATCATTC; 서열번호 4) 및 5111D R(CTTCCTTTCCAGGGTGTGACTC; 서열번호 5) 및 프로브 5111D P(AGGCCTGCGATCAGGTGGCACCT; 서열번호 6)을 사용하여 확인하였다. 표적화 벡터 유래의 하이그로마이신 카세트의 존재는 프라이머들 HYGF(TGCGGCCGATCTTAGCC; 서열번호 7) 및 HYGR(TTGACCGATTCCTTGCGG; 서열번호 8) 및 프로브 HYGP(ACGAGCGGGTTCGGCCCATTC; 서열번호 9)를 사용하여 확인하였다. 상부 결실점에 걸친 뉴클레오타이드 서열(서열번호 10)은 결실점에 존재하는 카세트 서열에 인접하게 연결된 결실점 상부의 내인성 마우스 서열(하기 괄호안에 함유됨)을 나타내는, 다음 서열을 포함하였다: (TTTGTAAACA AAGTCTACCC AGAGACAGAT GACAGACTTC AGCTCCAATG CTGATTGGTT CCTCACTTGG GACCAACCCT) CTCGAGTACC GTTCGTATAA TGTATGCTAT ACGAAGTTAT ATGCATCCGG GTAGGGGAGG. 하부 결실점에 걸친 뉴클레오타이드 서열(서열번호 11)은 결실점 하부의 내인성 마우스 서열과 인접한 카세트 서열(하기 괄호 안에 함유됨)을 나타내는, 하기 서열을 포함하였다: CCTCGACCTG CAGCCCTAGG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAC GGTAGAGCTC (CACAGGCATT TGGGTGGGCA GGGATGGACG GTGACTGGGA CAATCGGGAT GGAAGAGCAT AGAATGGGAG TTAGGGAAGA). 이어서, 양성 ES 세포 클론들을 사용하여 VELOCIMOUSE® 방법(하기 기술됨)을 사용하여 암컷 마우스들을 이식시켜 내인성 MHC 제II 부류 유전자좌의 결실을 함유하는 새끼들(litter of pups)를 생성하였다.
상기에 기술된 표적화된 ES 세포들을 공여체 ES 세포들로서 사용하여 8개-세포 단계의 마우스 배아 내에 VELOCIMOUSE® 방법(참조: 예를 들면, 미국 특허 제7,294,754호 및 Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25(1):91-99]에 의해 도입시켰다. 내인성 MHC 제II 부류 유전자좌 내에 H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2, 및 H-2Ea 유전자들의 결실을 지닌 마우스들을, 하이그로마이신 카세트의 존재를 검출하여 내인성 MHC 제II 부류 서열들의 부재를 확인한 대립형질 검정(참조: Valenzuela et al., 상기 참조)의 변형을 사용한 유전자형(genotyping)으로 확인하였다.
내인성 MHC 제II 부류 유전자좌 내에 H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2, 및 H-2Ea 유전자들의 결실을 지닌 마우스들을 Cre 결실자(deletor) 마우스 스트레인(참조: 예를 들면, 국제 특허 출원 공보 제WO 2009/114400호)에 대해 교배하여, 예를 들면, ES 세포 단계에서 또는 배아에서 제거되지 않은 표적화 벡터에 의해 도입된 임의의 loxed 하이그로마이신 카세트도 제거할 수 있다. 임의로, 하이그로마이신 카세트는 마우스 내에 유지된다.
실시예 2. 사람화된 H-2Eb1 및 H-2Ea 유전자들을 포함하는 거대 표적화 벡터(LTVEC)의 생성
사람화된 MHC II 서열들을 도입시키기 위한 표적화 벡터를 도 4에 나타낸 바와 같이 설계하였다. VELOCIGENE® 유전자 조작 기술을 이용하여, 세균 인공 염색체(BAC) RP23-458i22 DNA를 다양한 단계들에서 변형시켜: (1) BALB/c H-2Ea 유전자로부터 기능성 I-E α 엑손 1을 포함하는 벡터를 생성하고(도 4a); (2) 마우스 I-E β 유전자의 엑손 2 및 엑손 3의 사람 DRβ1*04의 엑손들로의 대체 및 마우스 I-Eα의 엑손 2 및 엑손 3의 사람 DRα1*01의 엑손들로의 대체를 포함하는 벡터를 생성하며(도 4b); (3) 나머지 마우스 I-Eβ 엑손들 중에서 사람 DRβ1*04의 엑손 2 및 엑손 3, 및 BALB/c 마우스로부터의 기능성 I-Eα 엑손 1을 포함하는 나머지 마우스 I-Eα 엑손들 중에서 사람 DRα1*01의 엑손 2 및 엑손 3을 수반하는 벡터를 생성하고[단계 (1)(도 4c)]; (4) (3)에서 생성된 벡터 내에서 잠재 스플라이스 부위(cryptic splice site)를 제거(도 4d)한다.
구체적으로, C57Bl/6 마우스들 내에서, I-Eα 유전자는 비-기능성 엑손 1의 존재로 인하여 유사유전자(pseudogene)이므로, 우선, BALB/c H-2Ea 유전자로부터 기능성 I-Eα 엑손 1을 포함하는 벡터를 생성하였다(도 4a). RP23-458i22 BAC를 세균 동종 재조합에 의해 변형시켜(1.BHR) 클로람페니콜 내성 유전자를 스펙트로마이신의 내성 유전자로 대체하였다. 수득된 벡터를 BHR로 추가로 변형시켜 전체 I-A 및 I-E 암호화 영역을 재조합 부위들에 의해 플랭킹된 네오마이신 카세트로 대체하였다(2.BHR). BALB/c I-Eα 리더를 암호화하는 엑손(엑손 1) 및 PI-SceI 및 I-CeuI 제한 부위들에 의해 플랭킹된 클로람페니콜 유전자를 포함하는 작제물을 사용한 다른 라운드의 BHR(3. BHR)로 기능성 BALB/c H-2Ea 엑손 1을 포함하는 벡터를 생성시켰다.
독립적으로, 마우스 I-Eβ 유전자의 엑손 2 및 엑손 3의 사람 DRβ1*04의 엑손들로의 대체 및 마우스 I-Eα의 엑손 2 및 엑손 3의 사람 DRα1*01의 엑손들로의 대체를 포함하는 벡터를 생성시키기 위하여, RP23-458i22 BAC를 몇몇의 동종 재조합 단계들, 4. BHR 내지 8. BHR을 통해 변형시켰다(도 4b). 수득되는 핵산 서열을 PI-SceI/I-CeuI 제한 부위에 의해 플랭킹하여 상기에 언급한 BALB/c I-Eα 엑손 1을 수반하는 작제물 내로 연결되도록 하였다(도 4c).
도 4c에 나타낸 최종 작제물의 서열은 BALB/c 인트론의 3' 말단에서 잠재적 스플라이스 부위를 함유하였다. 몇몇의 BHR 단계들(11. BHR 내지 12. BHR)에 이은 결실 단계를 수행하여 최종의 표적화 벡터(MAID 1680)를 수득하고 이를 사용하여 ES 세포들 내로 전기천공하였다(도 4d).
상세하게는, 최종 표적화 벡터(MAID 1680)는, 5'으로부터 3'까지, 내인성 MHC 제II 부류 유전자좌의 H-2Ab1 유전자의 바로 상부에서 종결하는 약 26kb의 마우스 게놈 서열; 사람화된 MHC IIβ 쇄 유전자(사람화된 H-2Eb1 유전자) 및 사람화된 MHC IIα 쇄 유전자(사람화된 H-2Ea 유전자)를 함유하는 약 59kb의 삽입물 및 플록스트(floxed) 네오마이신 카세트로 이루어진 5' 마우스 상동성 아암; 및 내인성 MHC 제II 부류 유전자좌의 H-2Ea 유전자의 바로 하부에서 시작하는 약 57kb의 마우스 게놈 서열로 이루어진 3' 마우스 상동성 아암으로 구성되었다. 5' 아암과 삽입물 사이의 연결부에 걸친 뉴클레오타이드 서열(서열번호 12)은 하기를 포함하였으며: (TGCTGATTGG TTCCTCACTT GGGACCAACC C) TAAGCTTTA TCTATGTCGG GTGCGGAGAA AGAGGTAATG AAATGGCACA AGGAGATCAC ACACCCAAAC CAAACTCGCC, 여기서, 이탤릭체의 서열은 고유한 PI-SceI 부위이고, 5' 상동성 아암 내의 마우스 게놈 서열은 괄호 안에 나타낸다. 삽입물과 3' 아암 사이의 연결부에 걸친 뉴클레오타이드 서열(서열번호 13)은 하기를 포함하였으며: CACATCAGTG AGGCTAGAAT AAATTAAAAT CGCTAATATG AAAATGGGG (ATTTGTACCT CTGAGTGTGA AGGCTGGGAA GACTGCTTTC AAGGGAC), 여기서, 3' 상동성 아암 내의 마우스 게놈 서열은 괄호 안에 나타낸다.
약 59kb의 삽입물 내에서, H-2Eb1 유전자를 다음과 같이 변형시켰다: 인트론 1, 엑손 2, 인트론 2, 엑손 3의 마지막 153bp, 및 인트론 3의 첫번째 122bp를 포함하는, H-2Eb1의 5136bp 영역을, 인트론 1, 엑손 2, 인트론 2, 엑손 3의 마지막 148bp, 및 인트론 3의 첫번째 132bp를 포함하는 사람 HLA-DRB1*04의 3111bp 상동성 영역으로 대체하였다. 인트론 3의 사람과 마우스 서열들 사이의 연결부에서, 5' lox2372 부위, UbC 프로모터, 네오마이신 내성 유전자, 및 3' lox2372 부위로 이루어진 카세트를 삽입하였다. 수득되는 유전자는 마우스 H-2Eb1 리더, DRβ1*04로부터의 사람 β1 및 β2 도메인들, 및 마우스 막관통 도메인 및 세포질성 테일로 구성된 키메라 HLA-DRB1*04/H-2Eb1 단백질을 암호화하였다. 인트론 1 내의 마우스/사람 연결부에 걸친 뉴클레오타이드 서열(서열번호 14)은 하기를 포함하였으며: (TCCATCACTT CACTGGGTAG CACAGCTGTA ACTGTCCAGC CTG) GGTACCGAGC TCGGATCCAC TAGTAACGGC CGCCAGTGTG CTGGAATTC GCCCTTGATC GAGCTCCCTG GGCTGCAGGT GGTGGGCGTT GCGGGTGGGG CCGGTTAA, 여기서, 이탤릭체 서열은 클로닝 단계들 동안 도입된 다수의 클로닝 부위이고, 마우스 인트론 1 서열들은 괄호 안에 나타낸다. 사람 인트론 3과 네오마이신 카세트 사이의 연결부에 걸친 뉴클레오타이드 서열(서열번호 15)은 하기를 포함하였으며: (ATCTCCATCA GAAGGGCACC GGT) ATAACTT CGTATAAGGT ATCCTATACG AAGTTATATG CATGGCCTCC GCGCCGGGTT, 여기서, 5' lox2372 부위는 이탤릭체이고, 사람 인트론 3 서열은 괄호 안에 나타낸다. 네오마이신 카세트와 마우스 인트론 3 사이의 연결부에 걸친 뉴클레오타이드 서열(서열번호 16)은 하기를 포함하였으며: ATAACTTCGT ATAAGGTATC CTATACGAAG TTATCTCGAG (TGGCTTACAG GTAGGTGCGT GAAGCTTCTA CAAGCACAGT TGCCCCCTGG), 여기서, 3' lox2372 부위는 이탤릭체이고, 마우스 인트론 3 서열은 괄호 안에 나타낸다.
또한, 약 59kb의 삽입물 내에서, H-2Ea 유전자가 다음과 같이 변형되었다: 인트론 1, 엑손 2, 인트론 2, 엑손 3의 마지막 101bp, 및 인트론 3의 첫번째 66bp를 포함하는, H-2Ea의 1185bp 영역을 인트론 1, 엑손 2, 인트론 2, 엑손 3의 마지막 104bp, 및 인트론 3의 첫번째 66bp를 포함하는, 사람 HLA-DRA1*01의 1189bp의 상동성 영역으로 대체하였다. 상기에 기술한 바와 같이, H-2Ea의 C57BL/6 대립형질의 엑손 1은 유전자를 비기능성이 되도록 하는 결실을 함유하기 때문에, H-2Ea 엑손 1 및 인트론 1의 나머지는, 기능성인, H-2Ea의 BALB/c 대립형질로부터의 등가의 2616bp 영역으로 대체하였다. 수득된 유전자는 BALB/c로부터의 마우스 H-2Ea 리더, DRA1*01로부터의 사람 α1 및 α2 도메인들, 및 마우스 막관통 도메인 및 세포질성 테일로 구성된 키메라 H-2Ea/HLA-DRA1*01 단백질을 암호화하였다. 인트론 1 내의 마우스/사람 연결부에 걸친 뉴클레오타이드 서열(서열번호 17)은 하기를 포함하였고: (CTGTTTCTTC CCTAACTCCC ATTCTATGCT CTTCCATCCC GA) CCGCGGCCCA ATCTCTCTCC ACTACTTCCT GCCTACATGT ATGTAGGT, 여기서, 이탤릭체 서열은 클로닝 단계들 동안에 도입된 제한 효소 부위이고, BALB/c 인트론 1 서열들은 괄호 안에 나타낸다. 인트론 3 내의 사람/마우스 연결부에 걸친 뉴클레오타이드 서열(서열번호 18)은 하기를 포함하였고: CAAGGTTTCC TCCTATGATG CTTGTGTGAA ACTCGGGGCC GGCC (AGCATTTAAC AGTACAGGGA TGGGAGCACA GCTCAC), 여기서, 이탤릭체 서열은 클로닝 단계들 동안에 도입된 제한 효소 부위이고, 마우스 인트론 3 서열들은 괄호 안에 나타낸다. 엑손 1의 C57BL/6-BALB/c 연결부 5'에 걸친 뉴클레오타이드 서열(서열번호 19)은 하기를 포함하였고: (GAAAGCAGTC TTCCCAGCCT TCACACTCAG AGGTACAAAT) CCCCATTTTC ATATTAGCGA TTTTAATTTA TTCTAGCCTC, 여기서, C57BL/6-특이적인 서열들은 괄호 안에 나타낸다. 엑손 1의 BALB/c-C57BL/6 연결부 3'에 걸친 뉴클레오타이드 서열(서열번호 20)은 하기를 포함하였고: TCTTCCCTAA CTCCCATTCT ATGCTCTTCC ATCCCGA CCG CGG (CCCAATC TCTCTCCACT ACTTCCTGCC TACATGTATG), 여기서, SacII 제한 부위는 이탤릭체이고, C57BL/6 서열들은 괄호 안에 나타낸다.
실시예 3. 사람화된 MHC II 마우스들의 생성
실시예 2의 벡터를 사용하여 사람화된 MHC II 마우스들을 생성하기 위한 전략의 단순화된 도해들을 도 5 및 도 8에 나타낸다.
구체적으로, MAID1680 BAC DNA(상기에 기술한 바와 같음)를 사용하여 MAID5111 ES 세포들을 전기천공시켜 내인성 마우스 I-A 및 I-E 유전자좌들의 키메라 사람 DR4/마우스 I-E 유전자좌를 포함하는 게놈 단편으로의 대체를 포함하는 변형된 ES 세포들을 생성하였다. 키메라 사람 DR4/마우스 I-E 유전자좌를 포함하는 게놈 단편으로 대체된 결실된 내인성 I-A 및 I-E 유전자좌들을 함유하는 양성 ES 세포들을 정량적 PCR 검정에 의해 TAQMANTM 프로브들(참조: Lie and Petropoulos, 상기 참조)을 사용하여 확인하였다. 사람 DRα 서열들의 삽입은 PCR에 의해 프라이머들 hDRA1F(CTGGCGGCTTGAAGAATTTGG; 서열번호 21), hDRA1R (CATGATTTCCAGGTTGGCTTTGTC; 서열번호 22), 및 프로브 hDRA1P (CGATTTGCCAGCTTTGAGGCTCAAGG; 서열번호 23)를 사용하여 확인하였다. 사람 DRβ 서열들의 삽입은 PCR에 의해 프라이머들 hDRB1F(AGGCTTGGGTGCTCCACTTG; 서열번호 24), hDRB1R(GACCCTGGTGATGCTGGAAAC; 서열번호 25), 및 프로브 hDRB1P(CAGGTGTAAACCTCTCCACTCCGAGGA; 서열번호 26)를 사용하여 확인하였다. 표적화 벡터로부터 하이그로마이신 카세트의 손실은 프라이머들 HYGF(TGCGGCCGATCTTAGCC; 서열번호 7) 및 HYGR(TTGACCGATTCCTTGCGG; 서열번호 8) 및 프로브 HYGP (ACGAGCGGGTTCGGCCCATTC; 서열번호 9)로 확인하였다.
이어서, 양성 ES 세포 클론들을 사용하여 암컷 마우스들을 VELOCIMOUSE® 방법(상기 참조)을 사용하여 이식함으로써 내인성 I-A 및 I-E 유전자좌들이 키메라 사람 DR4/마우스 I-E 유전자좌로 대체됨을 포함하는 새끼들을 생성하였다. 상기에 기술된 표적화된 ES 세포들을 공여체 ES 세포들로서 사용하여 8개-세포 단계 마우스 배아 내로 VELOCIMOUSE® 방법에 의해 도입시켰다. 키메라 사람 DR4/마우스 I-E 유전자좌를 지닌 마우스들을 키메라 사람 DR4/마우스 I-E 유전자좌의 존재를 검출한 대립형질 검정(참조: Valenzuela et al., 상기 참조)의 변형을 사용하는 유전자형으로 확인하였다.
키메라 사람 DR4/마우스 I-E 유전자좌를 지닌 마우스들을 Cre 결실자 마우스 스트레인(참조: 예를 들면, 국제 특허 출원 공보 제WO 2009/114400호)에 대해 교배하여, 예를 들면, ES 세포 단계 또는 배아 내에서 제거되지 않은 표적화 벡터에 의해 도입된 임의의 loxed 네오마이신 카세트도 제거할 수 있다(참조: 도 6).
실시예 4. 유전적으로 변형된 마우스들에서의 키메라 HLA-DR4의 발현
WT 또는 이형접합성 사람화된 HLA-DR4 마우스들("1681 HET")로부터의 비장에 콜라게나제 D[제조원: 로슈 바이오사이언스(Roche Bioscience)]를 관류시키고 적혈구들을 ACK 분해 완충액으로 분해하였다. 비장세포들을 2일 동안 25㎍/mL의 폴리(I:C)와 함께 배양하여 MHC-II 유전자들의 발현을 자극하였다. 사람 HLA-DR4의 세포 표면 발현을 FACS에 의해 플루오로크롬-접합된 항-CD3(17A2), 항-CD19(1D3), 항-CD11c(N418), 항-F480(BM8), 항-I-A/I-E(M15) 및 항-HLADR(L243)을 사용하여 분석하였다. BD-LSRII를 사용하여 유동 세포분석을 수행하였다. 사람 HLA-DR4의 발현은 CD19+ B 세포들의 표면 상에서 명확하게 검출가능하였으며 톨-유사 수용체 작용제(toll-like receptor agonist)인 폴리(I:C)에 의한 자극시 유의적으로 상향조절되었다(참조: 도 9).
등가 범위
당해 분야의 숙련가들은, 본원에 기술된 본 발명의 구체적인 실시형태들의 많은 등가 범위를 인식하거나, 단지 통상의 실험을 사용하여, 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가 범위는 하기 특허청구범위에 포함되는 것으로 의도된다.
본 출원 전체에서 인용된 모든 비-특허 문헌들, 특허 출원들 및 특허들의 전체 내용들은, 이들의 전문이 본원에 인용에 의해 포함되어 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.
<120> TRANSGENIC MICE EXPRESSING CHIMERIC MAJOR HISTOCOMPATIBILITY COMPLEX (MHC) CLASS II MOLECULES
<130> 1210A-WO
<150> US 61/552,584
<151> 2011-10-28
<160> 26
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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gtgggcacca tcttcatcat tc 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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cttcctttcc agggtgtgac tc 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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aggcctgcga tcaggtggca cct 23
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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acgagcgggt tcggcccatt c 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 10
tttgtaaaca aagtctaccc agagacagat gacagacttc agctccaatg ctgattggtt 60
cctcacttgg gaccaaccct ctcgagtacc gttcgtataa tgtatgctat acgaagttat 120
atgcatccgg gtaggggagg 140
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<211> 140
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 11
cctcgacctg cagccctagg ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaac ggtagagctc 60
cacaggcatt tgggtgggca gggatggacg gtgactggga caatcgggat ggaagagcat 120
agaatgggag ttagggaaga 140
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 12
tgctgattgg ttcctcactt gggaccaacc ctaagcttta tctatgtcgg gtgcggagaa 60
agaggtaatg aaatggcaca aggagatcac acacccaaac caaactcgcc 110
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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cacatcagtg aggctagaat aaattaaaat cgctaatatg aaaatgggga tttgtacctc 60
tgagtgtgaa ggctgggaag actgctttca agggac 96
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<211> 150
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 14
tccatcactt cactgggtag cacagctgta actgtccagc ctgggtaccg agctcggatc 60
cactagtaac ggccgccagt gtgctggaat tcgcccttga tcgagctccc tgggctgcag 120
gtggtgggcg ttgcgggtgg ggccggttaa 150
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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atctccatca gaagggcacc ggtataactt cgtataaggt atcctatacg aagttatatg 60
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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ataacttcgt ataaggtatc ctatacgaag ttatctcgag tggcttacag gtaggtgcgt 60
gaagcttcta caagcacagt tgccccctgg 90
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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ctgtttcttc cctaactccc attctatgct cttccatccc gaccgcggcc caatctctct 60
ccactacttc ctgcctacat gtatgtaggt 90
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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caaggtttcc tcctatgatg cttgtgtgaa actcggggcc ggccagcatt taacagtaca 60
gggatgggag cacagctcac 80
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<212> DNA
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gaaagcagtc ttcccagcct tcacactcag aggtacaaat ccccattttc atattagcga 60
ttttaattta ttctagcctc 80
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<220>
<223> Synthetic
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acttcctgcc tacatgtatg 80
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<211> 21
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<220>
<223> Synthetic
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ctggcggctt gaagaatttg g 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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catgatttcc aggttggctt tgtc 24
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cgatttgcca gctttgaggc tcaagg 26
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aggcttgggt gctccacttg 20
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gaccctggtg atgctggaaa c 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 26
caggtgtaaa cctctccact ccgagga 27
Claims (41)
- 내인성 주요 조직적합성 복합체 II(MHC II)α 유전자 유전자좌(locus)에 키메라 사람/설치류 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 분자를 포함하고/하거나 내인성 MHC IIβ 유전자 유전자좌에 키메라 사람/설치류 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 분자를 포함하는, 분리된 설치류 세포로서,
상기 키메라 사람/설치류 MHC IIα 폴리펩타이드의 사람 부분이 사람 MHC IIα1 및 α2 도메인들을 포함하고/하거나 상기 키메라 사람/설치류 MHC IIβ 폴리펩타이드의 사람 부분이 사람 MHC IIβ1 및 β2 도메인들을 포함하는, 분리된 설치류 세포. - 제1항에 있어서, 상기 키메라 사람/설치류 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 분자가 내인성 설치류 MHC IIα 프로모터 및 조절 요소들의 조절성 제어 하에서 발현되고/되거나 상기 키메라 사람/설치류 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 분자가 내인성 설치류 MHC IIβ 프로모터 및 조절 요소들의 조절성 제어 하에서 발현되는, 분리된 설치류 세포.
- 제1항에 있어서, 상기 키메라 사람/설치류 MHC IIα 폴리펩타이드의 설치류 부분이 내인성 설치류 MHC IIα 폴리펩타이드의 막관통(transmembrane) 및 세포질성 도메인들을 포함하고/하거나 상기 키메라 사람/설치류 MHC IIβ 폴리펩타이드의 설치류 부분이 내인성 설치류 MHC IIβ 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질성 도메인들을 포함하는, 분리된 설치류 세포.
- 제1항에 있어서, 상기 키메라 사람/설치류 MHC IIα 폴리펩타이드의 사람 부분이 HLA-DRα 쇄 유전자, HLA-DQα 쇄 유전자 및 HLA-DPα 쇄 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 HLA 제II 부류 α 쇄 유전자에 의해 암호화되고/되거나 상기 키메라 사람/설치류 MHC IIβ 폴리펩타이드의 사람 부분이 HLA-DRβ 쇄 유전자, HLA-DQβ 쇄 유전자 및 HLA-DPβ 쇄 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 사람 HLA 제II 부류 유전자에 의해 암호화되는, 분리된 설치류 세포.
- 제4항에 있어서, 상기 키메라 사람/설치류 MHC IIα 폴리펩타이드의 사람 부분이 사람 HLA-DR4α 쇄 유전자에 의해 암호화되고/되거나 상기 키메라 사람/설치류 MHC IIβ 폴리펩타이드의 사람 부분이 사람 HLA-DR4β 쇄 유전자에 의해 암호화되는, 분리된 설치류 세포.
- 제1항에 있어서, 상기 세포가 상기 세포의 표면 상에 상기 세포의 내인성 설치류 MHC II 유전자좌들로부터의 기능성 내인성 MHC II 폴리펩타이드들을 발현하지 않는, 분리된 설치류 세포.
- 제1항에 있어서, 상기 세포가 상기 세포의 표면 상에서 기능성 사람/설치류 MHC II 복합체를 발현하는 항원 제시 세포인, 분리된 설치류 세포.
- 제7항에 있어서, 상기 항원 제시 세포가 수지상 세포, 대식세포, 또는 B-세포인, 분리된 설치류 세포.
- 제1항에 있어서, 상기 세포가 배아 줄기 세포인, 분리된 설치류 세포.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류가 래트 또는 마우스인, 분리된 설치류 세포.
- 제1항에 있어서, 상기 설치류가 마우스인, 분리된 설치류 세포.
- 제11항에 있어서, 상기 키메라 사람/설치류 MHC IIα 폴리펩타이드의 설치류 부분이 마우스 H-2Eα 쇄 유전자에 의해 암호화되고/되거나 상기 키메라 사람/설치류 MHC IIβ 폴리펩타이드의 설치류 부분이 마우스 H-2Eβ 쇄 유전자에 의해 암호화되는, 분리된 설치류 세포.
- 사람 CD4+ T 세포 에피토프를 확인(identifying)하는 방법으로서, 상기 방법이
설치류를 CD4+ T 세포 에피토프를 포함하는 항원에 노출시키는 단계,
상기 설치류가 면역 반응을 개시하도록 하는 단계,
상기 설치류로부터 상기 에피토프에 결합하는 MHC 제II 부류-제한된 CD4+ T 세포를 분리하는 단계, 및
상기 MHC 제II 부류-제한된 CD4+ T 세포에 의해 결합된 에피토프를 확인하는 단계를 포함하고,
여기서, 상기 설치류가 내인성 주요 조직적합성 복합체 II(MHC II)α 유전자 유전자좌에 키메라 사람/설치류 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 분자를 포함하고/하거나 내인성 MHC IIβ 유전자 유전자좌에 키메라 사람/설치류 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 분자를 포함하고,
상기 키메라 사람/설치류 MHC IIα 폴리펩타이드의 사람 부분이 사람 MHC II α1 및 α2 도메인들을 포함하고/하거나 상기 키메라 사람/설치류 MHC IIβ 폴리펩타이드의 사람 부분이 사람 MHC II β1 및 β2 도메인들을 포함하는, 사람 CD4+ T 세포 에피토프를 확인하는 방법. - 제13항에 있어서, 상기 키메라 사람/설치류 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 분자가 내인성 설치류 MHC IIα 프로모터 및 조절 요소들의 조절성 제어 하에서 발현되고/되거나 상기 키메라 사람/설치류 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 분자가 내인성 설치류 MHC IIβ 프로모터 및 조절 요소들의 조절성 제어 하에서 발현되는, 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 키메라 사람/설치류 MHC IIα 폴리펩타이드의 설치류 부분이 내인성 설치류 MHC IIα 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질성 도메인들을 포함하고/하거나 상기 키메라 사람/설치류 MHC IIβ 폴리펩타이드의 설치류 부분이 내인성 설치류 MHC IIβ 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질성 도메인들을 포함하는, 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 키메라 사람/설치류 MHC IIα 폴리펩타이드의 사람 부분이 HLA-DRα 쇄 유전자, HLA-DQα 쇄 유전자 및 HLA-DPα 쇄 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 HLA 제II 부류 α 쇄 유전자에 의해 암호화되고/되거나 상기 키메라 사람/설치류 MHC IIβ 폴리펩타이드의 사람 부분이 HLA-DRβ 쇄 유전자, HLA-DQβ 쇄 유전자 및 HLA-DPβ 쇄 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 사람 HLA 제II 부류 유전자에 의해 암호화되는, 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 키메라 사람/설치류 MHC IIα 폴리펩타이드의 사람 부분이 사람 HLA-DR4α 쇄 유전자에 의해 암호화되고/되거나 상기 키메라 사람/설치류 MHC IIβ 폴리펩타이드의 사람 부분이 사람 HLA-DR4β 쇄 유전자에 의해 암호화되는, 방법.
- 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류가 래트 또는 마우스인, 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 설치류가 마우스이고,
상기 키메라 사람/설치류 MHC IIα 폴리펩타이드의 설치류 부분이 마우스 H-2Eα 쇄 유전자에 의해 암호화되고/되거나 상기 키메라 사람/설치류 MHC IIβ 폴리펩타이드의 설치류 부분이 마우스 H-2Eβ 쇄 유전자에 의해 암호화되는, 방법. - 키메라 사람/설치류 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산으로서, 상기 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분이 사람 MHC IIα 폴리펩타이드의 α1 및 α2 도메인들을 포함하고, 상기 키메라 폴리펩타이드의 설치류 부분이 마우스 MHC IIα 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질성 도메인들을 포함하고, 여기서 상기 사람 MHC IIα 폴리펩타이드가 HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP로부터 선택되는 전통적(classical) 사람 MHC 제II 부류 분자의 α 폴리펩타이드이고, 상기 마우스 MHC IIα 폴리펩타이드가 전통적 마우스 MHC 제II 부류 H-2A 또는 H-2E 분자의 α 폴리펩타이드인, 핵산.
- 제20항에 있어서, 상기 키메라 사람/설치류 MHC IIα 폴리펩타이드를 암호화하는 서열에 작동적으로 연결된 설치류 조절 요소들을 추가로 포함하는, 핵산.
- 제20항에 있어서, 상기 마우스 MHC IIα 폴리펩타이드가 전통적 마우스 MHC 제II 부류 H-2E 분자의 α 폴리펩타이드인, 핵산.
- 키메라 사람/설치류 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산으로서, 상기 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분이 사람 MHC IIβ 폴리펩타이드의 β1 및 β2 도메인들을 포함하고, 상기 키메라 폴리펩타이드의 설치류 부분이 마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질성 도메인들을 포함하고, 여기서 상기 사람 MHC IIβ 폴리펩타이드가 HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP로부터 선택되는 전통적 사람 MHC 제II 부류 분자의 β 폴리펩타이드이고, 상기 마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드가 전통적 마우스 MHC 제II 부류 H-2A 또는 H-2E 분자의 β 폴리펩타이드인, 핵산.
- 제23항에 있어서, 상기 키메라 사람/설치류 MHC IIβ 폴리펩타이드를 암호화하는 서열에 작동적으로 연결된 설치류 조절 요소들을 추가로 포함하는, 핵산.
- 제23항에 있어서, 상기 마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드가 전통적 마우스 MHC 제II 부류 H-2E 분자의 β 폴리펩타이드인, 핵산.
- 키메라 사람/설치류 MHC IIα 폴리펩타이드로서, 상기 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분이 사람 MHC IIα 폴리펩타이드의 α1 및 α2 도메인들을 포함하고, 상기 키메라 폴리펩타이드의 설치류 부분이 마우스 MHC IIα 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질성 도메인들을 포함하고, 여기서 상기 사람 MHC IIα 폴리펩타이드가 HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP로부터 선택되는 전통적 사람 MHC 제II 부류 분자의 α 폴리펩타이드이고, 상기 마우스 MHC IIα 폴리펩타이드가 전통적 마우스 MHC 제II 부류 H-2A 또는 H-2E 분자의 α 폴리펩타이드인, 키메라 사람/설치류 MHC IIα 폴리펩타이드.
- 제26항에 있어서, 상기 마우스 MHC IIα 폴리펩타이드가 전통적 마우스 MHC 제II 부류 H-2E 분자의 α 폴리펩타이드인, 키메라 사람/설치류 MHC IIα 폴리펩타이드.
- 키메라 사람/설치류 MHC IIβ 폴리펩타이드로서, 상기 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분이 사람 MHC IIβ 폴리펩타이드의 β1 및 β2 도메인들을 포함하고, 상기 키메라 폴리펩타이드의 설치류 부분이 마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질성 도메인들을 포함하고, 여기서 상기 사람 MHC IIβ 폴리펩타이드가 HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP로부터 선택되는 전통적 사람 MHC 제II 부류 분자의 β 폴리펩타이드이고, 상기 마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드가 전통적 마우스 MHC 제II 부류 H-2A 또는 H-2E 분자의 β 폴리펩타이드인, 키메라 사람/설치류 MHC IIβ 폴리펩타이드.
- 제28항에 있어서, 상기 마우스 MHC IIβ 폴리펩타이드가 전통적 마우스 MHC 제II 부류 H-2E 분자의 β 폴리펩타이드인, 키메라 사람/설치류 MHC IIβ 폴리펩타이드.
- 키메라 사람/설치류 MHC II 단백질 복합체로서,
(i) 키메라 사람/설치류 MHC IIα 폴리펩타이드로서, 상기 키메라 MHC IIα 폴리펩타이드의 사람 부분이 사람 MHC IIα 폴리펩타이드의 α1 및 α2 도메인들을 포함하고, 상기 키메라 MHC IIα 폴리펩타이드의 설치류 부분이 설치류 MHC IIα 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질성 도메인들을 포함하는, 키메라 사람/설치류 MHC IIα 폴리펩타이드; 및
(ii) 키메라 사람/설치류 MHC IIβ 폴리펩타이드로서, 상기 키메라 MHC IIβ 폴리펩타이드의 사람 부분이 사람 MHC IIβ 폴리펩타이드의 β1 및 β2 도메인들을 포함하고, 상기 키메라 MHC IIβ 폴리펩타이드의 설치류 부분이 설치류 MHC IIβ 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질성 도메인들을 포함하는, 키메라 사람/설치류 MHC IIβ 폴리펩타이드
를 포함하는, 키메라 사람/설치류 MHC II 단백질 복합체. - 제30항에 있어서, 상기 설치류가 래트 또는 마우스인, 키메라 사람/설치류 MHC II 단백질 복합체.
- 제31항에 있어서, 상기 설치류가 마우스인, 키메라 사람/설치류 MHC II 단백질 복합체.
- 제32항에 있어서, 상기 사람 MHC IIα 폴리펩타이드가 HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP의 MHC IIα 폴리펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 상기 사람 MHC IIβ 폴리펩타이드가 HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP의 MHC IIβ 폴리펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 상기 마우스 MHC IIα 및 β 폴리펩타이드들이 각각 H-2E의 α 및 β 폴리펩타이드들인, 키메라 사람/설치류 MHC II 단백질 복합체.
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