ES2872799T3

ES2872799T3 - Animales no humanos que tienen un gen 3 de activación linfocitaria humanizado

Info

Publication number: ES2872799T3
Application number: ES16810152T
Authority: ES
Inventors: Alexander O Mujica; Elena Burova; Andrew J Murphy
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2015-11-20
Filing date: 2016-11-18
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2036-11-18
Also published as: US20210360908A1; KR20180083381A; RU2018117944A; RS61866B1; EP3376857A1; WO2017087780A1; BR112018010158A2; RU2745403C2; CN108366548A; AU2016358101B2; ZA201802717B; SG11201803409UA; CA3003786C; PT3376857T; KR102454546B1; US20190320632A1; IL258841A; US10306874B2; HRP20210824T1; DK3376857T3

Abstract

Un roedor cuyo genoma comprende un gen Lag-3 humanizado en un locus Lag-3 endógeno, en donde dicho roedor expresa un polipéptido Lag-3 humanizado de dicho gen Lag-3 humanizado, cuyo polipéptido Lag-3 humanizado comprende: una porción extracelular que contiene los dos primeros dominios N-terminales similares a inmunoglobulina (Ig) de un polipéptido LAG-3 humano y los dos últimos dominios similares a Ig de un polipéptido Lag-3 endógeno; el dominio transmembrana del polipéptido Lag-3 endógeno; y el dominio intracelular del polipéptido Lag-3 endógeno; y en donde dicho roedor es un ratón o una rata.

Description

DESCRIPCIÓN

Animales no humanos que tienen un gen 3 de activación linfocitaria humanizado

Referencia cruzada a las solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. 62/258,181, presentada el 20 de noviembre de 2015, y la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. 62/370,430, presentada el 3 de agosto de 2016.

Listado de secuencias

El Listado de Secuencias en el archivo de texto ASCII, denominado 34031_10212US01_SequenceListing.txt de 49 KB, creado el 18 de octubre de 2016, y presentado a la Oficina de Patentes y Marcas de los Estados Unidos a través de EFS-Web.

Antecedentes

El cáncer sigue siendo un enorme desafío en la industria de la salud en todo el mundo, en parte, porque las células cancerosas poseen la capacidad de evadir el sistema inmunitario del huésped. Se ha entendido que tal capacidad es el resultado de la inhibición y/o regulación negativa de la inmunidad antitumoral. Aun así, falta el desarrollo de sistemas in vivo útiles para determinar de manera óptima el potencial terapéutico de nuevos agentes terapéuticos y/o regímenes terapéuticos contra el cáncer que están diseñados para activar y/o promover la inmunidad antitumoral y determinar los mecanismos de cómo las células cancerosas proporcionan señales inhibidoras a las células inmunitarias, en particular, faltan células T. Tales sistemas proporcionan una fuente para los ensayos de evaluación de la eficacia terapéutica de agentes candidatos que promueven un ambiente antitumoral in vivo.

Resumen de la descripción

La presente invención abarca el reconocimiento de que es conveniente modificar genéticamente roedores para permitir sistemas mejorados para identificar y desarrollar nuevos agentes terapéuticos y/o regímenes terapéuticos que pueden usarse para el tratamiento del cáncer. La presente invención también abarca el reconocimiento de que es conveniente modificar genéticamente roedores para permitir sistemas in vivo mejorados para identificar y desarrollar nuevos agentes terapéuticos que pueden usarse para tratar enfermedades, trastornos o afecciones autoinmunitarias (o inflamatorias o infecciosas). La presente invención abarca además el reconocimiento de que es conveniente modificar genéticamente roedores para permitir sistemas in vivo mejorados para identificar y desarrollar nuevos agentes terapéuticos que promuevan la inmunidad antitumoral. Además, la presente invención también abarca el reconocimiento de que los roedores que tienen el gen 3 de activación linfocitaria humanizado (Lag-3) y/o que de cualquier otra manera expresan, contienen o producen el polipéptido Lag-3 humano o humanizado son convenientes, por ejemplo, para el uso en identificar y desarrollar agentes terapéuticos contra el cáncer que regulen positivamente la inmunidad antitumoral. En algunas modalidades, los roedores de la presente invención proporcionan sistemas in vivo mejorados para la identificación y el desarrollo de terapias combinadas que incluyen dirigirse a Lag-3 y/o Muerte celular programada 1 (PD-1).

La presente invención proporciona un roedor cuyo genoma comprende un gen Lag-3 humanizado en un locus Lag-3 endógeno, en donde dicho roedor expresa un polipéptido Lag-3 humanizado de dicho gen Lag-3, cuyo polipéptido Lag-3 humanizado comprende: una porción extracelular que contiene los dos primeros dominios N-terminales similares a inmunoglobulina (Ig) de un polipéptido LAG-3 humano y los dos últimos dominios similares a Ig de un polipéptido Lag-3 endógeno; el dominio transmembrana del polipéptido Lag-3 endógeno; y el dominio intracelular del polipéptido Lag-3 endógeno; y en donde dicho roedor es un ratón o una rata. La presente invención proporciona además un roedor cuyo genoma comprende un gen Lag-3 humanizado en un locus Lag-3 endógeno, en donde dicho roedor expresa un polipéptido Lag-3 humanizado a partir de dicho gen Lag-3 humanizado, cuyo polipéptido Lag-3 humanizado comprende los dos primeros dominios N-terminales similares a Ig de un polipéptido lAG-3 humano; en donde el gen Lag-3 humanizado comprende los exones 1, 5, 6, 7 y 8 de Lag-3 exógeno, y en donde dicho roedor es un ratón o una rata. Por lo tanto, los roedores proporcionados tienen un genoma que comprende un gen Lag-3 modificado genéticamente, el Lag-3 modificado genéticamente incluye material genético de dos especies diferentes (un ser humano y el roedor). Tal gen Lag-3 modificado genéticamente incluye material genético que codifica uno o más dominios similares a inmunoglobulina (similares a Ig) de un polipéptido LAG-3 humano. En algunas modalidades, el material genético codifica los dominios similares a Ig de un polipéptido LAG-3 humano que son responsables de la unión al ligando (por ejemplo, unión al MHC de clase II). Por tanto, un gen Lag-3 modificado genéticamente de un roedor como se describe en la presente descripción codifica un polipéptido Lag-3 que contiene porciones humanas y endógenas, en donde las porciones humanas y endógenas están unidas entre sí y forman un polipéptido Lag-3 funcional. El gen Lag-3 de un roedor modificado genéticamente como se describe en la presente descripción codifica un polipéptido Lag-3 que contiene los dos primeros dominios similares a Ig (D1 y D2), en su totalidad o en parte, de un polipéptido LAG-3 humano. Generalmente hablando, los dos primeros dominios similares a Ig (D1 y D2) están contenidos dentro de los 260 aminoácidos N-terminales de un polipéptido LAG-3 humano; y en algunas modalidades, dentro de los residuos de aminoácidos 21-260, 23-260 o 29-260 de un polipéptido LAG-3 humano. Véanse, además, las Figuras 1-2, por ejemplo.

El roedor proporcionado expresa un polipéptido Lag-3, cuyo polipéptido Lag-3 comprende una porción humana y una porción endógena.

En algunas modalidades, en el roedor proporcionado, cuyo genoma comprende un gen (o locus) Lag-3 humanizado que comprende una porción endógena y una porción humana, las porciones endógena y humana están unidas operativamente a un promotor de Lag-3 no humano.

Una porción endógena de un polipéptido Lag-3 comprende una porción intracelular de un polipéptido Lag-3 endógeno. La porción endógena de un polipéptido Lag-3 comprende el dominio intracelular de un polipéptido Lag-3 endógeno. Una porción endógena de un polipéptido Lag-3 comprende además, una porción transmembrana de un polipéptido Lag-3 endógeno. La porción endógena de un polipéptido Lag-3 comprende el dominio transmembrana de un polipéptido Lag-3 endógeno. En algunas modalidades, la porción endógena de un polipéptido Lag-3 comprende además una porción extracelular de un polipéptido Lag-3 endógeno, por ejemplo, una porción C-terminal del dominio extracelular de un polipéptido Lag-3 endógeno que no incluye los dos primeros dominios similares a Ig, pero incluye los dos últimos dominios similares a Ig (D3 y D4). En algunas modalidades, la porción endógena de un polipéptido Lag-3 comprende los aminoácidos del péptido señal de un polipéptido Lag-3 endógeno. Por ejemplo, la porción endógena de un polipéptido Lag-3 comprende sustancialmente el péptido señal de un polipéptido Lag-3 endógeno.

En algunas modalidades, una porción endógena del polipéptido Lag-3 tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 98 % idéntica a una secuencia de aminoácidos correspondiente que aparece en un polipéptido Lag-3 de roedor con SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4. En algunas modalidades, una porción endógena de un polipéptido Lag-3 tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica o idéntica a una secuencia de aminoácidos correspondiente que aparece en un polipéptido Lag-3 de roedor de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.

En algunas modalidades, una porción endógena de un gen Lag-3 humanizado comprende los exones 1, 5, 6, 7 y 8 de Lag-3 endógeno no humano. En algunas modalidades, los exones 1, 5, 6, 7 y 8 de un gen Lag-3 endógeno no humano son al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 98 % idénticos a los exones correspondientes 1, 5, 6, 7 y 8 que aparecen en una secuencia de ARNm de Lag-3 de roedor de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3. En algunas modalidades, los exones 1, 5, 6, 7 y 8 de un gen Lag-3 endógeno no humano son sustancialmente idénticos o idénticos a los exones 1, 5, 6, 7 y 8 correspondientes que aparecen en una secuencia de ARNm de Lag-3 de roedor de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3.

En algunas modalidades, una porción humana (o secuencia humana) de un polipéptido Lag-3 humanizado comprende uno o más de los dominios similares a Ig de un polipéptido LAG-3 humano que son responsables de la unión al ligando (por ejemplo, unión al MHC de clase II). La porción humana de un polipéptido Lag-3 humanizado comprende los dos primeros dominios similares a Ig (D1 y D2), en su totalidad o en parte, de un polipéptido LAG-3 humano. En algunas modalidades, dentro de los residuos de aminoácidos 21-260, 23-260 o 29-260 de un polipéptido LAG-3 humano. En algunas modalidades, la porción humana de un polipéptido Lag-3 humanizado comprende los aminoácidos 29-260 (o 23-260 o 21-260) de un polipéptido LAG-3 humano. En algunas modalidades, una porción humana (o secuencia humana) de un polipéptido Lag-3 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % idéntica a una secuencia de aminoácidos correspondiente que aparece en un polipéptido LAG-3 humano de SEQ ID NO: 6. En algunas modalidades, una porción humana (o secuencia humana) de un polipéptido Lag-3 comprende una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica o idéntica a una secuencia de aminoácidos correspondiente que aparece en un polipéptido LAG-3 humano de SEQ ID NO: 6.

En algunas modalidades, una porción humana (o secuencia humana) de un gen Lag-3 humanizado codifica al menos los aminoácidos 29-260 (o 23-260 o 21-260) de un polipéptido LAG-3 humano. En algunas modalidades, una porción humana (o secuencia humana) de un gen Lag-3 humanizado comprende los exones 2-4 (o los exones 2, 3 y 4) de un gen LAG-3 humano.

En algunas modalidades, los exones 2-4 de un gen LAG-3 humano son al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 98 % idénticos a los exones 2-4 correspondientes que aparecen en una secuencia de ARNm de LAG-3 humana de SEQ ID NO: 5. En algunas modalidades, los exones 2-4 de un gen LAG-3 humano son sustancialmente idénticos o idénticos a los exones 2-4 correspondientes que aparecen en una secuencia de ARNm de LAG-3 humano de SEQ ID NO: 5. En algunas modalidades, una porción humana de un gen Lag-3 humanizado comprende una secuencia que se optimiza con codones para su expresión en un animal no humano como se describe en la presente descripción.

En algunas modalidades, un polipéptido Lag-3 que comprende una porción humana y una porción endógena se codifica mediante una secuencia de ácido nucleico colocada en un locus (o gen) Lag-3 endógeno como se describe en la presente descripción.

En algunas modalidades, una porción endógena del polipéptido Lag-3 está codificada por los exones 1, 5, 6, 7 y 8 de Lag-3.

En algunas modalidades, un gen Lag-3 humanizado incluye el exón 1 de Lag-3 endógeno no humano, los exones 2-4 de Lag-3 humano, y los exones 5-8 de Lag-3 no humano, en donde los exones no humanos y humanos se unen operativamente entre sí y a un promotor de Lag-3 endógeno no humano. En algunas modalidades, tal gen Lag-3 humanizado se coloca en un locus de Lag-3 endógeno.

En algunas modalidades, un gen Lag-3 humanizado codifica un polipéptido Lag-3 humanizado que incluye un péptido señal que es sustancialmente idéntico al péptido señal de un polipéptido Lag-3 endógeno no humano; un dominio extracelular que incluye una porción humana y una porción no humana en donde la porción humana comprende los dos primeros dominios similares a Ig (por ejemplo, una secuencia que comprende los aminoácidos 26-290) de un polipéptido LAG-3 humano y la porción no humana comprende los dos últimos dominios similares a Ig de un polipéptido endógeno no humano Lag-3; y los dominios transmembrana e intracelular de un polipéptido Lag-3 endógeno no humano.

La presente invención también proporciona un polipéptido Lag-3 humanizado producido por un roedor de la invención. En algunas modalidades, se proporciona un polipéptido Lag-3 producido o expresado por un roedor como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades, un polipéptido Lag-3 producido o expresado por un animal no humano como se describe en la presente descripción se traduce en una célula del roedor con un péptido señal no humano, en su totalidad o en parte (por ejemplo, un péptido señal quimérico). En algunas modalidades, un polipéptido Lag-3 producido o expresado por un roedor como se describe en la presente descripción comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % idéntica a una secuencia de aminoácidos que aparece en un polipéptido Lag-3 humanizado de SEQ ID NO: 8. En algunas modalidades, un polipéptido Lag-3 producido o expresado por un roedor como se describe en la presente descripción comprende una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica o idéntica a una secuencia de aminoácidos que aparece en un polipéptido Lag-3 humanizado de SEQ ID NO: 8.

La presente invención proporciona una célula o tejido aislado del roedor de la invención. En algunas modalidades, se proporciona una célula o tejido de un aislada de un roedor, cuyo genoma comprende un gen Lag-3 (o locus) como se describe en la presente descripción y que es una célula de rata o ratón o un tejido de rata o ratón. En algunas modalidades, una célula es un linfocito. En algunas modalidades, una célula se selecciona de una célula B, una célula dendrítica, un macrófago, un monocito y una célula T. En algunas modalidades, un tejido se selecciona de adiposo, vejiga, cerebro, mama, médula ósea, ojo, corazón, intestino, riñón, hígado, pulmón, ganglio linfático, músculo, páncreas, plasma, suero, piel, bazo, estómago, timo, testículo, ovario y una de sus combinaciones.

En algunas modalidades, se proporciona una célula inmortalizada fabricada, generada o producida a partir de una célula aislada de un roedor como se describe en la presente descripción.

La presente invención también proporciona una célula madre embrionaria de roedor (ES) cuyo genoma comprende un gen Lag-3 humanizado en un locus Lag-3 que codifica un polipéptido Lag-3 humanizado, cuyo polipéptido Lag-3 humanizado comprende: una porción extracelular que contiene los dos primeros dominios N-terminales similares a Ig de un polipéptido LAG-3 humano y los dos últimos dominios similares a Ig de un polipéptido Lag-3 endógeno; el dominio transmembrana del polipéptido Lag-3 endógeno; y el dominio intracelular del polipéptido Lag-3 endógeno de roedor; en donde el gen Lag-3 humanizado está unido operativamente a un promotor de Lag-3 de roedor, y en donde dicha célula ES de roedor es una célula ES de ratón o rata. La presente invención también proporciona una célula madre embrionaria de roedor (ES) cuyo genoma comprende un gen Lag-3 humanizado en un locus Lag-3 endógeno que codifica un polipéptido Lag-3 humanizado, cuyo polipéptido Lag-3 humanizado comprende: los dos primeros dominios N-terminales similares a Ig de un polipéptido LAG-3 humano; en donde el gen Lag-3 comprende los exones I, 5, 6, 7 y 8 de Lag-3 endógeno; en donde el gen Lag-3 está unido operativamente a un promotor de Lag-3 de roedor; y en donde dicha célula ES de roedor es una célula ES de ratón o rata. En ciertas modalidades, una célula madre embrionaria de roedor es una célula madre embrionaria de ratón y es de una cepa 129, una cepa C57BL o una mezcla de estas. En ciertas modalidades, una célula madre embrionaria de roedor es una célula madre embrionaria de ratón y es una mezcla de las cepas 129 y C57BL. En algunas modalidades, se proporciona una célula ES no humana como se describe en la presente descripción que comprende cualquiera de la Se Q ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: I I , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15.

En algunas modalidades, se proporciona el uso de una célula madre embrionaria de roedor como se describe en la presente descripción para producir un roedor. En ciertas modalidades, una célula madre embrionaria de roedor es una célula madre embrionaria de ratón y se usa para producir un ratón que comprende un gen (o locus) Lag-3 humanizado como se describe en la presente descripción. En algunas ciertas modalidades, una célula madre embrionaria de roedor es una célula madre embrionaria de rata y se usa para producir una rata que comprende un gen (o locus) Lag-3 humanizado como se describe en la presente descripción.

En la presente invención también se proporciona un embrión de roedor generado a partir de una célula ES de la presente invención. En algunas modalidades, se proporciona un embrión de roedor que comprende, se produce a partir de, se obtiene a partir de, o se generado a partir de una célula madre embrionaria de roedor como se describe en la presente descripción. En algunas ciertas modalidades, un embrión de roedor es un embrión de ratón; en algunas modalidades, un embrión de rata.

En algunas modalidades, se proporciona el uso de un embrión de roedor descrito en la presente descripción para producir un animal roedor. En algunas ciertas modalidades, un embrión de roedor es un embrión de ratón y se usa para producir un ratón que comprende un gen (o locus) Lag-3 humanizado como se describe en la presente descripción. En algunas ciertas modalidades, un embrión de roedor es un embrión de rata y se usa para producir una rata que comprende un gen (o locus) Lag-3 humanizado como se describe en la presente descripción.

En algunas modalidades, se proporciona un kit, que comprende una célula o tejido aislada de roedor como se describe en la presente descripción, una célula inmortalizada como se describe en la presente descripción, una célula madre embrionaria de roedor como se describe en la presente descripción, un embrión de roedor como se describe en la presente descripción, o un roedor como se describe en la presente descripción.

En algunas modalidades, se proporciona un kit como se describe en la presente descripción, para su uso en la fabricación y/o desarrollo de un fármaco (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígenos del mismo) para la terapia o el diagnóstico.

En algunas modalidades, se proporciona un kit como se describe en la presente descripción, para su uso en la fabricación y/o desarrollo de un fármaco (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo) para el tratamiento, prevención o mejora de una enfermedad, trastorno o afección.

También se describen en la presente descripción un transgén, constructo de ácido nucleico, constructo de ADN o vector de transformación. En algunos casos, un transgén, constructo de ácido nucleico, constructo de ADN o vector de transformación comprende un gen (o locus) Lag-3, en su totalidad o en parte, como se describe en la presente descripción. En algunos casos determinados, un transgén, constructo de ácido nucleico, constructo de ADN o vector de transformación comprende un fragmento de ADN que incluye un gen (o locus) Lag-3, en su totalidad o en parte, como se describe en la presente descripción. En ciertas modalidades, un transgén, constructo de ácido nucleico, constructo de ADN, o vector de transformación comprende un gen (o locus) Lag-3 que comprende cualquiera de la SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15. En algunos casos determinados, un transgén, constructo de ácido nucleico, constructo de ADN o vector de transformación comprende además uno o más marcadores de selección. En algunos casos determinados, un transgén, constructo de ácido nucleico, constructo de ADN o vector de transformación que comprende además uno o más sitios de recombinación específicos del sitio (por ejemplo, loxP, Frt, o una de sus combinaciones). En algunos casos determinados, un transgén, constructo de ácido nucleico, constructo de ADN, o vector de transformación se representa en la Figura 3.

En algunas modalidades, se proporciona el uso de un transgén, constructo de ácido nucleico, constructo de ADN o vector de transformación como se describe en la presente descripción para producir una célula madre embrionaria de roedor, célula de roedor, embrión de roedor y/o roedor.

También se proporciona un método para producir un roedor que comprende: modificar el genoma de un roedor de manera que comprenda un gen Lag-3 humanizado en un locus Lag-3 endógeno cuyo gen humanizado está unido operativamente a un promotor de Lag-3 de un roedor, para de esta manera producir dicho roedor, en donde dicho roedor expresa un polipéptido Lag-3 humanizado de dicho gen Lag-3, cuyo polipéptido Lag-3 humanizado comprende: una porción extracelular que contiene los dos primeros dominios N-terminales similares a Ig de un polipéptido LAG-3 humano y los dos últimos dominios similares a Ig de un polipéptido Lag-3 endógeno; el dominio transmembrana del polipéptido Lag-3 endógeno; y el dominio intracelular del polipéptido Lag-3 endógeno; y en donde dicho roedor es un ratón o una rata. Se proporciona además un método para producir un roedor que comprende:

modificar el genoma de un roedor de manera que comprenda un gen Lag-3 humanizado en un locus Lag-3 endógeno cuyo gen humanizado está unido operativamente a un promotor de Lag-3 de roedor, de esta manera que dicho roedor, en donde dicho roedor expresa un polipéptido Lag-3 humanizado a partir de dicho gen Lag-3 humanizado, que el polipéptido Lag-3 humanizado comprende: los dos primeros dominios N-terminales similares a Ig de un polipéptido LAG-3; y

en donde el gen Lag-3 humanizado comprende los exones 1, 5, 6, 7 y 8 de Lag-3;

y en donde dicho roedor es un ratón o una rata.

En algunas modalidades de un método para producir un roedor que expresa un polipéptido Lag-3 a partir de un gen Lag-3 endógeno, el método comprende además una etapa de colocar un fragmento genómico en un gen Pdcdl endógeno de la célula madre embrionaria no humana de (a), dicho fragmento genómico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PD-1 humano en su totalidad o en parte. En algunas modalidades de un método para producir un animal roedor que expresa un polipéptido Lag-3 a partir de un gen Lag-3, un fragmento genómico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PD-1 humano en su totalidad o en parte se coloca en un Pdcdl del gen de la célula madre embrionaria no humana de (a) antes de, simultáneamente con, o después de la colocación del fragmento genómico que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido Lag-3 humano en su totalidad o en parte en el gen Lag-3. El roedor puede criarse con un segundo roedor, dicho segundo roedor que tiene un genoma que comprende un gen Pdcdl que codifica un polipéptido PD-1 que comprende una porción humana y una porción endógena.

En algunas modalidades, una secuencia de nucleótidos comprende los exones 2-4 de Lag-3 humano. En algunas modalidades, una secuencia de nucleótidos codifica al menos los aminoácidos 29-260 (o 23-260 o 21-260) de un polipéptido LAG-3 humano. En algunas modalidades, una secuencia de nucleótidos comprende uno o más marcadores de selección. En algunas modalidades, una secuencia de nucleótidos comprende uno o más sitios de recombinación sitio específica.

En algunas modalidades, se proporciona un método para producir un roedor cuyo genoma comprende un gen Lag-3 que codifica un polipéptido Lag-3 que tiene una porción humana y una porción endógena, el método comprende modificar el genoma de un roedor para que comprenda un gen Lag-3 que codifica un polipéptido Lag-3 que tiene una porción humana y una porción endógena, cuyas porciones están unidas operativamente a un promotor de Lag-3 no humano, lo que produce de esta manera dicho roedor.

En algunas modalidades de un método para producir un roedor cuyo genoma comprende un gen Lag-3 que codifica un polipéptido Lag-3 que tiene una porción humana y una porción endógena, un gen Lag-3 se modifica para incluir los exones 2-4 (o los exones 2, 3 y 4) de un gen LAG-3 humano. En algunas modalidades de un método para producir un roedor cuyo genoma comprende un gen Lag-3 que codifica un polipéptido Lag-3 que tiene una porción humana y una porción endógena, un gen Lag-3 se modifica para codificar al menos los aminoácidos 29-260 (o 23-260 o 21-260) de un polipéptido LAG-3 humano.

En algunas modalidades de un método para producir un roedor cuyo genoma comprende un gen Lag-3 que codifica un polipéptido Lag-3 que tiene una porción humana y una porción endógena, el método comprende además modificar el genoma del roedor de manera que comprenda un gen Pdcdl que codifica un polipéptido PD-1 que comprende una porción humana y una porción endógena. En algunas modalidades de un método para producir un roedor cuyo genoma comprende un gen Lag-3 que codifica un polipéptido Lag-3 que tiene una porción humana y una porción endógena, modificar el genoma del roedor de modo que comprenda un gen Pdcdl que codifica un polipéptido PD-1 que comprende una porción humana y se realiza una porción endógena antes de, simultáneamente con, o después de modificar el genoma del roedor de modo que comprenda un gen Lag-3 que codifica un polipéptido Lag-3 que tiene una porción humana y una porción endógena. El roedor cuyo genoma comprende un gen Lag-3 que codifica un polipéptido Lag-3 que tiene una porción humana y una porción endógena puede criarse con un segundo animal no humano, dicho segundo roedor que tiene un genoma que comprende un gen Pdcdl que codifica un polipéptido PD-1 que comprende una porción humana y una porción endógena.

En algunas modalidades, se proporciona un roedor que puede obtenerse por (hecho de, obtenido de, o generado de) cualquiera de los métodos como se describe en la presente descripción.

En algunas modalidades, se proporciona un método para evaluar la eficacia antitumoral de un fármaco dirigido al LAG-3 humano, el método que comprende las etapas de administrar el fármaco a un roedor como se describe en la presente descripción, y realizar un ensayo para determinar una o más propiedades antitumorales del fármaco dirigido al LAG-3 humano. En particular, también se proporciona un método para evaluar la eficacia antitumoral o las propiedades farmacocinéticas de un fármaco dirigido al LAG-3 humano, el método que comprende las etapas de:

administrar el fármaco a un roedor de la invención; y

realizar un ensayo para determinar una o más propiedades antitumorales del fármaco dirigido al LAG-3 humano, en donde opcionalmente:

(a) el fármaco dirigido al LAG-3 humano es un anticuerpo anti-Lag-3; y/o

(b) el fármaco dirigido al LAG-3 humano se administra al roedor por vía intravenosa, intraperitoneal o subcutánea.

En algunas modalidades, se proporciona un método para evaluar las propiedades farmacocinéticas de un fármaco dirigido al LAG-3 humano, el método que comprende las etapas de administrar el fármaco a un roedor como se describe en la presente descripción, y realizar un ensayo para determinar una o más propiedades farmacocinéticas del fármaco dirigido a LAG-3 humano.

En algunas modalidades, un fármaco dirigido al LAG-3 humano es un antagonista de Lag-3. En algunas modalidades, un fármaco dirigido al LAG-3 humano es un agonista de Lag-3. En algunas modalidades, un fármaco dirigido al LAG 3 humano es un anticuerpo anti-Lag-3.

En algunas modalidades, un fármaco dirigido al LAG-3 humano se administra a un roedor como se describe en la presente descripción por vía intravenosa, intraperitoneal o subcutánea.

En algunas modalidades, el roedor proporcionado es uno cuyo genoma comprende un gen Lag-3 que incluye una porción endógena que comprende una porción endógena de los exones 1, 5, 6, 7 y 8 de Lag-3; y una porción humana que comprende los exones 2-4 (o los exones 2, 3 y 4) de un gen LAG-3 humano; en donde las porciones endógenas y humanas se unen operativamente a un promotor de Lag-3, y en donde el animal no humano expresa un polipéptido Lag-3 que comprende los aminoácidos 29-260 (o 23-260 o 21-260) de un polipéptido LAG-3 humano.

En algunas modalidades, se proporciona un modelo de tumor de roedor, cuyo roedor que expresa un polipéptido Lag-3 y/o PD-1 como se describe en la presente descripción.

En algunas modalidades, se proporciona un modelo de tumor de roedor, cuyo roedor tiene un genoma que comprende un gen Lag-3 y/o Pdcd1 como se describe en la presente descripción.

En algunas modalidades, se proporciona un modelo de tumor de roedor, que se obtiene al (a) proporcionar un roedor cuyo genoma comprende un gen Lag-3 y/o Pdcd1 como se describe en la presente descripción; y (b) implantar una o más células tumorales en el roedor de (a); proporcionar de esta manera dicho modelo de tumor de roedor.

En algunas modalidades, se proporciona un roedor o célula como se describe en la presente descripción, para su uso en la fabricación y/o desarrollo de un fármaco para terapia o diagnóstico.

En algunas modalidades, se proporciona un roedor o célula como se describe en la presente descripción, para su uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento, prevención o mejora de una enfermedad, trastorno o afección. En algunas modalidades, se proporciona el uso de un roedor o célula como se describe en la presente descripción en la fabricación y/o desarrollo de un fármaco o vacuna para el uso en medicina, tal como el uso como medicamento. En algunas modalidades, se proporciona el uso de un roedor o célula como se describe en la presente descripción en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección.

En algunas modalidades, se proporciona el uso de un roedor o célula como se describe en la presente descripción en la fabricación y/o desarrollo de un anticuerpo que se une a una molécula de punto de control inmunitario.

En algunas modalidades, una enfermedad, trastorno o afección como se describe en la presente descripción es cáncer 0 una neoplasia. En algunas modalidades, una enfermedad, trastorno o afección como se describe en la presente descripción es una enfermedad, trastorno o afección autoinmunitaria (o inflamatoria). En algunas modalidades, una enfermedad, trastorno o afección como se describe en la presente descripción es una enfermedad, trastorno o afección infecciosa.

En varias modalidades, un promotor de Lag-3 no humano es o comprende un promotor de Lag-3 no humano endógeno. En varias modalidades, una porción humana (o secuencia humana, o secuencia de nucleótidos) del gen Lag-3 o Pdcdl como se describe en la presente descripción es o comprende una secuencia que está optimizada para codones para la expresión en un roedor (o célula o tejido de roedor) como se describe en la presente descripción.

En varias modalidades, un roedor (o célula o tejido de roedor, o célula madre embrionaria de roedor, o embrión de roedor) como se describe en la presente descripción expresa además un polipéptido PD-1 humanizado, cuyo polipéptido PD-1 humanizado comprende una porción humana y una porción endógena. En algunas modalidades, una porción humana de un polipéptido PD-1 comprende sustancialmente el dominio extracelular de un polipéptido PD-1 humano; y en modalidades específicas, una porción humana comprende los aminoácidos 21-170, 26-169, 27-169, 27 145 o 35-145 de un polipéptido PD-1 humano. En algunas modalidades, una porción endógena de un polipéptido PD-1 comprende una porción intracelular y/o una porción transmembrana de un polipéptido PD-1 endógeno; en algunas modalidades, una porción endógena de un polipéptido PD-1 comprende el dominio intracelular de un polipéptido PD-1 endógeno, y en ciertas modalidades, una porción endógena de un polipéptido PD-1 comprende además sustancialmente el dominio transmembrana de un polipéptido PD-1 endógeno.

En varias modalidades, el genoma de un roedor (o célula o tejido de roedor, o célula madre embrionaria de roedor, o embrión de roedor) como se describe en la presente descripción comprende además un gen Pdcdl que comprende una porción endógena y una porción humana, en donde las porciones endógenas y humanas se unen operativamente a un promotor de Pdcdl no humano. En algunas modalidades, una porción endógena de un gen Pdcdl comprende los exones 1,4 y 5 de Pdcdl endógeno. En algunas modalidades, una porción endógena de un gen Pdcdl comprende además el exón 3 Pdcd1 endógeno en su totalidad o en parte, por ejemplo, una porción 3' del exón 3 endógeno que codifica aminoácidos que son parte del dominio transmembrana de un polipéptido PD-1 endógeno. En algunas modalidades, una porción humana de un gen Pdcdl codifica los aminoácidos 35-145, 27-145, 27-169, 26-169 o 21 170 de un polipéptido PD-1 humano. En algunas modalidades, una porción humana de un gen Pdcdl comprende el exón 2 de un gen PDCD1 humano; en ciertas modalidades, comprende además un exón 3 de PDCD1 humano en su totalidad o en parte, por ejemplo, una porción 5' del exón 3 humano que codifica aminoácidos que son parte del dominio extracelular de un polipéptido PD-1 humano. En modalidades específicas, un gen Pdcdl humanizado en un roedor comprende el exón 1 de un gen Pdcdl endógeno del roedor, el exón 2 y una parte del exón 3 (por ejemplo, una porción 5' del exón 3 que codifica los aminoácidos que son parte del dominio extracelular) de un gen Pdcdl humano, seguido de una parte del exón 3 (por ejemplo, una porción 3' del exón 3 que codifica los aminoácidos que son parte del dominio transmembrana) y los exones 4-5 de un gen Pdcdl no humano endógeno.

En varias modalidades, un promotor de Pdcdl no humano es o comprende un promotor de Pdcdl no humano endógeno.

En varias modalidades, una porción humana de un gen Lag-3 que codifica una secuencia de aminoácidos de los dominios 1 (D1) y 2 (D2) similares a inmunoglobulina (similares a Ig) de un polipéptido LAG-3 humano, o codifica una secuencia de aminoácidos de un polipéptido LAG-3 humano que es responsable de unirse al MHC II.

En varias modalidades, una porción humana de un polipéptido Lag-3 comprende una secuencia de aminoácidos de los dominios 1 (D1) y 2 (D2) similares a inmunoglobulinas (similares a Ig) de un polipéptido LAG-3 humano, o comprende una secuencia de aminoácidos de un polipéptido LAG-3 humano que es responsable de unirse al MHC II.

Un animal no humano como se describe en la presente descripción es un roedor que es un ratón o rata; en algunas modalidades, un ratón; en algunas modalidades, una rata. En algunas modalidades, un ratón como se describe en la presente descripción se selecciona del grupo que consiste en una cepa 129, una cepa BALB/C, una cepa C57BL/6 y una cepa mixta 129xC57BL/6; en algunas ciertas modalidades, una cepa C57BL/6.

Como se usa en esta solicitud, los términos “alrededor de” y “aproximadamente” se usan como equivalentes. Cualquier número usado en esta solicitud con o sin alrededor de/aproximadamente pretende abarcar cualquiera de las fluctuaciones normales apreciadas por un experto en la técnica en cuestión.

Breve descripción de los dibujos

Los Dibujos incluidos en la presente descripción, compuestos por las siguientes Figuras, son solamente con propósitos de ilustración y no de limitación.

La Figura 1 muestra un diagrama, no a escala, de la organización genómica de un gen 3 de activación linfocitaria no humano (por ejemplo, de ratón) y humano (Lag-3).Los exones se numeran arriba o abajo de cada exón. Las regiones no traducidas (cajas abiertas) también se indican para cada gen. Los dominios similares a inmunoglobulina se indican, no a escala, mediante cajas estiradas y la abreviación simbólica "Ig" por encima de los exones codificantes.

La Figura 2 muestra una alineación de secuencias de aminoácidos representativas de LAG-3 humano (hLAG3) (SEQ ID NO: 6), Lag-3 de ratón (mLag3) (SEQ ID NO: 4) y Lag-3 humanizado (HumLAG3) (SEQ ID NO: 8). Los asteriscos indican los dominios similares a inmunoglobulina (similares a Ig) y el texto subrayado indica aminoácidos codificados por los exones de LAG-3 humanos insertados (es decir, exones 2, 3 y 4). Los dominios similares a Ig 1 (D1) y 2 (D2) se separan por un único amino indicado por la barra inclinada hacia adelante más abajo de la secuencia.

La Figura 3 muestra un diagrama, no a escala, de un método ilustrativo para la humanización de un gen 3 de activación linfocitaria no humano (Lag-3). Las ubicaciones de las uniones de nucleótidos seleccionadas se marcan con una línea más abajo de cada unión y cada una está indicada por la SEQ ID NO

La Figura 4 muestra un diagrama, no a escala, de la organización genómica de un gen 3 de activación linfocitaria humano y de ratón (Lag-3) que indica las ubicaciones aproximadas de las sondas empleadas en un ensayo descrito en el Ejemplo 1.

La Figura 5 muestra los histogramas representativos de esplenocitos activados C57BL/6 de tipo silvestre (tipo silvestre), Lag-3 homocigoto humanizado (HumLAG-3), PD-1 homocigoto humanizado (HumPD-1), y ratones homocigotos Lag-3xPD-1 doblemente humanizados (HumPD-1xLAG-3) teñidos con anticuerpos para LAG-3 humano, PD-1 humano, Lag-3 de ratón y PD-1 de ratón o teñidos con el anticuerpo de control de isotipo respectivo. La tinción positiva se indica mediante curvas rellenas, mientras que la tinción con anticuerpos de control de isotipo se indica mediante curvas sin relleno. Todos los perfiles de tinción representan células dentro de la activación de CD4+. La intensidad media de fluorescencia (MFI) con tinción de anticuerpos en las células T CD4+ está indicada para cada histograma (hilera superior: expresión LAG-3 humana; 2nd hilera: expresión Lag-3 de ratón; 3ra hilera: expresión de PD-1 humano; hilera inferior: expresión de PD-1 de ratón). El genotipo de los ratones se indica en la parte superior de cada columna. Para ratones PD-1 humanizados, véase la solicitud de patente de los Estados Unidos con Número de Serie 14/744,592, presentada el 19 de junio de 2015, y la solicitud de patente Internacional núm. PCT/US15/036649, presentada el 19 de junio de 2015.

La Figura 6 muestra el volumen tumoral promedio representativo (mm3+SEM) durante 35 días en varios grupos de tratamiento de ratones con Lag-3/PD-1 doblemente humanizados (control, círculo: anticuerpo de control de isotipo humano no específico para LAG-3 o ratón o PD-1 humano; anti-LAG3, diamante: anticuerpo LAG-3 humano; anti-PD1, hexágono: anticuerpo PD-1 humano;). Las flechas indican los días de tratamiento con el anticuerpo.

La Figura 7 muestra los volúmenes tumorales promedio (mm3+SEM) en varios grupos de tratamiento de ratones con Lag-3/PD-1 doblemente humanizados en múltiples puntos temporales después de la implantación del tumor en un experimento para evaluar la eficacia del anticuerpo anti-LAG3 solo y en combinación con el anticuerpo PD-1 humano contra los tumores MC38 establecidos (control, círculo: anticuerpo de control de isotipo humano no específico para ratón o LAG-3 humano o ratón o PD-1 humano; anti-LAG3, diamante: anticuerpo LAG-3 humano; anti-PDl, hexágono: anticuerpo PD-1 humano; anti-LAG3 anti-PD-1, triángulo: combinación de anticuerpo LAG-3 humano y anticuerpo PD-1 humano). Los días de tratamiento se indican con flechas.

La Figura 8 muestra las secuencias ilustrativas de roedor (por ejemplo, rata y ratón), humano y el gen 3 de activación linfocitaria humanizado (Lag-3), así como también un fragmento de ADN sintético ilustrativo para la humanización de un gen Lag-3 no humano. Para las secuencias de ARNm, la fuente en negrita indica la secuencia codificante y los exones consecutivos, cuando se indique, están separados por texto subrayado alternativo; para las secuencias de ARNm humanizadas, las secuencias humanas están contenidas entre paréntesis. Para las secuencias de aminoácidos, las secuencias transmembrana se indican mediante una fuente subrayada; para las secuencias de aminoácidos humanizadas, las secuencias humanas se indican en negrita y se contienen entre paréntesis.

Las Figuras 9A-9D muestran secuencias de unión en cierto locus Lag-3 humanizado ilustrativo. La Figura 9A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 12) a través del punto de inserción aguas arriba, que indica la secuencia endógena de ratón (contenida dentro del paréntesis más abajo) contigua con la secuencia genómica de LAG-3 humano en el punto de inserción. La Figura 9B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 13) a lo largo del extremo 5' del casete de autodeleción de neomicina, que indica la secuencia genómica de LAG-3 humano contigua a la secuencia del casete (contenida entre paréntesis más abajo con un SalI-XhoI compatible finalizada en cursiva y una secuencia loxP en negrita) aguas abajo del punto de inserción. La Figura 9C muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 14) a través del punto de inserción aguas abajo en el extremo 3' del casete de autodeleción de neomicina, que indica la secuencia del casete (contenida dentro de los paréntesis más abajo con un sitio loxP en negrita, un sitio de reconocimiento I-CeuI subrayado y un sitio de reconocimiento NheI en cursiva) contiguo con la secuencia genómica de Lag-3 de ratón. La Figura 9D muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 15) a través del punto de inserción aguas arriba después de la deleción del casete de neomicina (77 pb restantes en el intrón 4), que indica la secuencia genómica humana y de ratón yuxtapuesta con la secuencia de casete restante de loxP (contenida dentro de los paréntesis más abajo con un extremo compatible con SalI-XhoI en cursiva, un sitio loxP en negrita, un sitio de restricción I-CeuI subrayado y un sitio de restricción NheI en cursiva).

Definiciones

Esta invención no se limita a los métodos y condiciones experimentales particulares descritos en la presente descripción, ya que tales métodos y condiciones pueden variar. Además, debe entenderse que la terminología usada en la presente descripción es solamente para el propósito de describir modalidades particulares, y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invención se define en las reivindicaciones.

A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos y frases usados en la presente descripción incluyen los significados que se atribuyen a los términos y frases en la técnica, a menos que se indique claramente lo contrario o resulte claramente evidente por el contexto en el cual se usa el término o frase. Aunque cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente descripción puede usarse en la práctica o prueba de la presente invención, a continuación, se describirán métodos y materiales particulares.

Aproximadamente: como se aplica en la presente descripción a uno o más valores de interés, incluye un valor que es similar a un valor de referencia indicado. En determinadas modalidades, el término “aproximadamente’’ o “alrededor de" o incluye un intervalo de valores que caen dentro de 25 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o menos en cualquier dirección (mayor o menor) del valor de referencia indicado a menos que se indique de cualquier otra manera o resulte evidente de cualquier otra manera por el contexto (excepto cuando tal número exceda el 100 % de un valor posible).

Biológicamente activo: como se usa en la presente descripción, incluye una característica de cualquier agente que tiene actividad en un sistema biológico, in vitro o in vivo (por ejemplo, en un organismo). Por ejemplo, un agente que, cuando está presente en un organismo, tiene un efecto biológico dentro de ese organismo, se considera biológicamente activo. En modalidades particulares, cuando una proteína o polipéptido es biológicamente activo, una porción de esa proteína o polipéptido que comparte al menos una actividad biológica de la proteína o polipéptido se denomina típicamente una porción “biológicamente activa".

Comparable : como se usa en la presente descripción, incluye a dos o más agentes, entidades, situaciones, conjuntos de condiciones, etc., que pueden no ser idénticos entre sí pero que son suficientemente similares para permitir la comparación entre ellos de manera que puedan obtenerse conclusiones razonablemente en base a las diferencias o las similitudes observadas. Los expertos en la técnica comprenderán, en contexto, el grado de identidad necesario en cualquier circunstancia determinada para dos o más de tales agentes, entidades, situaciones, conjuntos de condiciones, etc., para considerarse comparables.

Conservativo: como se usa en la presente descripción para describir una sustitución de aminoácido conservadora, incluye la sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo de aminoácido que tiene un grupo R de cadena lateral con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácido conservadora no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de interés de una proteína, por ejemplo, la capacidad de un receptor de unirse a un ligando. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen: cadenas laterales alifáticas tales como glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; cadenas laterales hidroxialifáticas tales como serina y treonina; cadenas laterales que contienen amida tales como asparagina y glutamina; cadenas laterales aromáticas tales como fenilalanina, tirosina, y triptófano; cadenas laterales básicas tales como lisina, arginina, e histidina; cadenas laterales ácidas tales como ácido aspártico y ácido glutámico; y, cadenas laterales que contienen azufre tales como cisteína y metionina. Los grupos de sustituciones conservadoras de aminoácidos incluyen, por ejemplo, valina/leucina/isoleucina, fenilalanina/tirosina, lisina/arginina, alanina/valina, glutamato/aspartato, y asparagina/glutamina. En algunas modalidades, una sustitución de aminoácido conservadora puede ser una sustitución de cualquier residuo nativo en una proteína con alanina, como se usa en, por ejemplo, la mutagénesis por barrido de alanina. En algunas modalidades, se produce una sustitución conservadora que tiene un valor positivo en la matriz de posibilidad logarítmica PAM250 descrita en Gonnet y otros (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45. En algunas modalidades, una sustitución es una sustitución moderadamente conservadora en donde la sustitución tiene un valor no negativo en la matriz de posibilidad logarítmica PAM250.

Control: como se usa en la presente descripción, incluye el significado que se entiende en la técnica de un “control’ que es un estándar contra el cual se comparan los resultados. Típicamente, los controles se usan para aumentar la integridad en los experimentos mediante el aislamiento de variables para llegar a una conclusión sobre tales variables. En algunas modalidades, un control es una reacción o un ensayo que se realiza de manera simultánea con una reacción o un ensayo de prueba para proporcionar un comparador. Como se usa en la presente descripción, un “control’ puede incluir un “control animal'. Un “control animal" puede tener una modificación como se describe en la presente descripción, una modificación que es diferente a como se describe en la presente descripción, o puede no tener modificaciones (es decir, es un animal de tipo silvestre). En un experimento, se aplica la "prueba" (es decir, la variable que se analiza). En el segundo experimento, el "control," (es decir, la variable que se analiza) no se aplica. En algunas modalidades, un control es un control histórico (es decir, de una prueba o un ensayo realizados previamente, o una cantidad o resultado que se conoce previamente). En algunas modalidades, un control es o comprende un registro impreso o guardado de cualquier otra manera. Un control puede ser un control positivo o un control negativo.

Interrupción : como se usa en la presente descripción, incluye el resultado de un evento de recombinación homóloga con una molécula de ADN (por ejemplo, con una secuencia homóloga endógena tal como un gen o locus génico). En algunas modalidades, una interrupción puede lograr o representar una inserción, una deleción, una sustitución, un reemplazo, una mutación con cambio de sentido, o un desplazamiento del marco de una o unas secuencias de ADN, o cualquiera de sus combinaciones. Las inserciones pueden incluir la inserción de genes completos o fragmentos de genes, por ejemplo, exones, que pueden ser de un origen distinto al de la secuencia endógena (por ejemplo, una secuencia heteróloga). En algunas modalidades, una interrupción puede aumentar la expresión y/o actividad de un gen o producto génico (por ejemplo, de una proteína codificada por un gen). En algunas modalidades, una interrupción puede disminuir la expresión y/o actividad de un gen o producto génico. En algunas modalidades, una interrupción puede alterar la secuencia de un gen o un producto génico codificado (por ejemplo, una proteína codificada). En algunas modalidades, una interrupción puede truncar o fragmentar un gen o un producto génico codificado (por ejemplo, una proteína codificada). En algunas modalidades, una interrupción puede extender un gen o un producto génico codificado; en algunas de tales modalidades, una interrupción puede lograr el ensamblaje de una proteína de fusión. En algunas modalidades, una interrupción puede afectar el nivel, pero no la actividad de un gen o producto génico. En algunas modalidades, una interrupción puede afectar la actividad, pero no el nivel de un gen o producto génico. En algunas modalidades, una interrupción puede no tener un efecto significativo sobre el nivel de un gen o producto génico. En algunas modalidades, una interrupción puede no tener un efecto significativo sobre la actividad de un gen o producto génico. En algunas modalidades, una interrupción puede no tener un efecto significativo sobre el nivel o la actividad de un gen o producto génico.

Determinar, medir, evaluar, valorar, ensayar y analizar: se usan indistintamente en la presente descripción para referirse a cualquier forma de medición, e incluyen determinar si un elemento está presente o no. Estos términos incluyen determinaciones cuantitativas y/o cualitativas. El ensayo puede ser relativo o absoluto. “Ensayo para determinar la presencia de" puede ser determinar la cantidad de algo presente y/o determinar si está presente o ausente.

Locus endógeno o gen endógeno: como se usa en la presente descripción, incluye un locus genético que se encuentra en un organismo parental o de referencia antes de la introducción de una alteración, interrupción, deleción, inserción, modificación, reemplazo o sustitución como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades, el locus endógeno tiene una secuencia que se encuentra en la naturaleza. En algunas modalidades, el locus endógeno es un locus de tipo silvestre. En algunas modalidades, el organismo de referencia es un organismo de tipo silvestre. En algunas modalidades, el organismo de referencia es un organismo modificado genéticamente. En algunas modalidades, el organismo de referencia es un organismo criado en un laboratorio (ya sea de tipo silvestre o modificado genéticamente).

Promotor endógeno: como se usa en la presente descripción incluye un promotor que se asocia naturalmente, por ejemplo, en un organismo de tipo silvestre, con un gen endógeno.

Modificado genéticamente: como se usa en la presente descripción, en general, incluye el aspecto de haber sido manipulado por la mano del hombre. Por ejemplo, en algunas modalidades, un polinucleótido puede considerarse "modificado genéticamente" cuando dos o más secuencias que no están unidas entre sí en ese orden en la naturaleza son manipuladas por la mano del hombre para unirse directamente entre sí en el polinucleótido modificado genéticamente. En algunas modalidades particulares tales, un polinucleótido modificado genéticamente puede comprender una secuencia reguladora que se encuentra en la naturaleza en asociación operativa con una primera secuencia codificante pero no en asociación operativa con una segunda secuencia codificante, se une por la mano del hombre de manera que se asocia operativamente con la segunda secuencia codificante. Alternativamente o adicionalmente, en algunas modalidades, las primera y segunda secuencias de ácido nucleico que cada uno codifica para elementos o dominios polipéptidos que en la naturaleza no están unidos entre sí pueden estar unidos entre sí en un único polinucleótido modificado genéticamente. De manera comparable, en algunas modalidades, una célula u organismo puede considerarse "modificado genéticamente" si se ha manipulado de manera que su información genética se altere (por ejemplo, se ha introducido nuevo material genético no presente previamente, o se ha alterado o eliminado material genético previamente presente). Como es la práctica común y se entiende por los expertos en la técnica, la progenie de un polinucleótido o célula modificados genéticamente se denomina típicamente todavía como "modificado genéticamente" aunque la manipulación real se realizó en una entidad anterior. Además, como apreciarán los expertos en la técnica, hay una variedad de metodologías disponibles a través de las cuales se puede lograr la ‘‘modificación genética" como se describe en la presente descripción. Por ejemplo, en algunas modalidades, la ‘‘modificación genética" puede implicar la selección o el diseño (por ejemplo, de secuencias de ácidos nucleicos, secuencias de polipéptidos, células, tejidos y/u organismos) mediante el uso de sistemas informáticos programados para realizar análisis o comparaciones, o de cualquier otra manera para analizar, recomendar y/o seleccionar secuencias, alteraciones, etc.). Alternativamente o adicionalmente, en algunas modalidades, la “modificación genética puede implicar el uso de metodologías de síntesis química in vitro y/o tecnologías de ácido nucleico recombinante tales como, por ejemplo, la amplificación de ácido nucleico (por ejemplo, a través de la reacción en cadena de la polimerasa) hibridación, mutación, transformación, transfección, etc., y/o cualquiera de una variedad de metodologías de acoplamiento controladas. Como apreciarán los expertos en la técnica, una variedad de tales técnicas establecidas (por ejemplo, para el ADN recombinante, la síntesis de oligonucleótidos, y el cultivo y transformación de tejidos (por ejemplo, electroporación, lipofección, etc.)) se conocen bien en la técnica y se describen en varias referencias generales y más específicas que se citan y/o se discuten a lo largo de la presente descripción. Véase, por ejemplo, Sambrook y otros, Molecular Cloning: Un Manual de laboratorio (2da ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).

Gen: como se usa en la presente descripción, incluye una secuencia de ADN en un cromosoma que codifica para un producto (por ejemplo, un producto de ARN y/o un producto de polipéptido). En algunas modalidades, un gen incluye una secuencia codificante (es decir, una secuencia que codifica un producto particular). En algunas modalidades, un gen incluye una secuencia no codificante. En algunas modalidades particulares, un gen puede incluir tanto la secuencia codificante (por ejemplo, exónica) como la no codificante (por ejemplo, intrónica). En algunas modalidades, un gen puede incluir una o más secuencias reguladoras (por ejemplo, promotores, potenciadores, etc.) y/o secuencias intrón que, por ejemplo, pueden controlar o afectar uno o más aspectos de la expresión génica (por ejemplo, expresión específica de tipo celular, expresión inducible, etc.). Para fines de claridad, observamos que, como se usa en la presente solicitud, el término "gen" generalmente incluye una porción de un ácido nucleico que codifica un polipéptido; el término puede abarcar opcionalmente secuencias reguladoras, como se aclarará del contexto a los expertos en la técnica. Esta definición no pretende excluir la aplicación del término "gen" a unidades de expresión no codificantes de proteínas sino más bien aclarar que, en la mayoría de los casos, el término como se usa en este documento incluye un ácido nucleico codificante de polipéptidos.

Heterólogo : como se usa en la presente descripción, incluye un agente o entidad de una fuente diferente. Por ejemplo, cuando se usa en referencia a un polipéptido, gen, o producto génico presente en una célula u organismo particular, el término aclara que el polipéptido, gen, o producto génico en cuestión: 1) se modificó genéticamente por la acción del hombre; 2) se introdujo en la célula u organismo (o un precursor de este) por la acción del hombre (por ejemplo, por medio de ingeniería genética); y/o 3) no se produce o no está presente naturalmente en la célula u organismo en cuestión (por ejemplo, el tipo de célula o el tipo de organismo en cuestión).

Célula huésped : como se usa en la presente descripción, incluye una célula en la cual se ha introducido un ácido nucleico o una proteína heterólogos (por ejemplo, exógenos). Después de leer esta descripción los expertos entenderán que tales términos no se refieren solamente a la célula particular en cuestión, sino que se usan, además, para referirse a la progenie de dicha célula. Debido a que pueden producirse determinadas modificaciones en las generaciones posteriores ya sea debido a una mutación o a influencias del ambiente, tal progenie puede no ser, de hecho, idéntica a la célula parental, pero todavía se incluye dentro del alcance del término "célula huésped' como se usa en la presente descripción. En algunas modalidades, una célula huésped es, o comprende, una célula procariota o eucariota. En general, una célula huésped es cualquier célula que sea adecuada para recibir y/o producir un ácido nucleico o una proteína heteróloga, independientemente del reino de la vida al que pertenece la célula. Las células ilustrativas incluyen las de organismos procariotas y eucariotas (unicelulares o pluricelulares), células bacterianas (por ejemplo, cepas de E. coli, Bacillus spp, Streptomyces spp, etc.), células de micobacterias, células fúngicas, células de levaduras (por ejemplo, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, etc.), células vegetales, células de insectos (por ejemplo, SF-9, SF-21, células de insectos infectadas con baculovirus, Trichoplusia ni, etc.), células de animales no humanos, células humanas, o fusiones de células tales como, por ejemplo, hibridomas o cuadromas. En algunas modalidades, la célula es una célula humana, de mono, simio, hámster, rata o ratón. En algunas modalidades, la célula es eucariota y se selecciona de las siguientes células: CHO (por ejemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por ejemplo, COS-7), célula de retina, Vero, CV1, renal (por ejemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (por ejemplo, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidérmica), CV-1, U937, 3T3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, MMT 060562, célula de Sertoli, célula BRL 3A, célula HT1080, célula de mieloma, célula tumoral, y una línea celular derivada de una célula mencionada anteriormente. En algunas modalidades, la célula comprende uno o más genes virales, por ejemplo, una célula de retina que expresa un gen viral (por ejemplo, una célula PER.C6™). En algunas modalidades, una célula huésped es o comprende una célula aislada. En algunas modalidades, una célula huésped es parte de un tejido. En algunas modalidades, una célula huésped es parte de un organismo.

Humanizado: se usa en la presente descripción de acuerdo con su significado entendido en la técnica para incluir a ácidos nucleicos o proteínas cuyas estructuras (es decir, secuencias de nucleótidos o aminoácidos) incluyen porciones que corresponden sustancialmente o idénticamente a las estructuras de un gen o proteína particular que se encuentran en la naturaleza en un animal no humano, e incluyen, además, porciones que se diferencian de la encontrada en el gen o proteína no humanos particulares en cuestión y en lugar de eso corresponden de manera más cercana a estructuras comparables que se encuentran en un gen o proteína humanos correspondientes. En algunas modalidades, un gen “humanizado” es uno que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual a la de un polipéptido humano (por ejemplo, una proteína humana o porción de esta - por ejemplo, una porción característica de esta). Para proporcionar un ejemplo, en el caso de un receptor de membrana, un gen “humanizado” puede codificar un polipéptido que tiene una porción extracelular, en su totalidad o en parte, que tiene una secuencia de aminoácidos igual a la de una porción extracelular humana y la secuencia restante igual a la de un polipéptido no humano (por ejemplo, de ratón). En algunas modalidades, un gen humanizado comprende al menos una porción de una secuencia de ADN de un gen humano. En algunas modalidades, un gen humanizado comprende una secuencia de ADN completa de un gen humano. En algunas modalidades, una proteína humanizada comprende una secuencia que tiene una porción que aparece en una proteína humana. En algunas modalidades, una proteína humanizada comprende una secuencia completa de una proteína humana y se expresa a partir de un locus endógeno de un animal no humano que corresponde al homólogo o al ortólogo del gen humano.

Identidad: como se usa en la presente descripción en relación con una comparación de secuencias, incluye la identidad determinada mediante una serie de algoritmos diferentes conocidos en la técnica que pueden usarse para medir la identidad de secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos. En algunas modalidades, las identidades como se describe en la presente descripción, se determinan mediante el uso de un alineamiento ClustalW v. 1.83 (lento) que emplea una penalización por apertura de interrupción de 10,0, una penalización por extensión de interrupción de 0,1, y el uso de una matriz de similitud de Gonnet (MACVECTOR™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008).

In vitro: como se usa en la presente descripción incluye eventos que ocurren en un entorno artificial, por ejemplo, en un tubo de ensayo o recipiente de reacción, en cultivo celular, etc., en lugar de dentro de un organismo multicelular.

In vivo: como se usa en la presente descripción incluye eventos que ocurren dentro de un organismo multicelular, tal como un animal humano y no humano. En el contexto de los sistemas basados en células, el término puede usarse para incluir eventos que ocurren dentro de una célula viva (en oposición a, por ejemplo, los sistemas in vitro).

A islado: como se usa en la presente descripción, incluye una sustancia y/o entidad que (1) se ha separado de al menos algunos de los componentes con los que se asociaba cuando se produjo inicialmente (ya sea en la naturaleza y/o en un entorno experimental) y/o (2) se ha diseñado, producido, preparado y/o fabricado por acción del hombre. Las sustancias y/o entidades aisladas pueden separarse de alrededor de 10 %, alrededor de 20 %, alrededor de 30 %, alrededor de 40 %, alrededor de 50 %, alrededor de 60 %, alrededor de 70 %, alrededor de 80 %, alrededor de 90 %, alrededor de 91 %, alrededor de 92 %, alrededor de 93 %, alrededor de 94 %, alrededor de 95 %, alrededor de 96 %, alrededor de 97 %, alrededor de 98 %, alrededor de 99 % o más de alrededor de 99 % de los otros componentes con los que se asociaron inicialmente. En algunas modalidades, los agentes aislados son alrededor de 80 %, alrededor de 85 %, alrededor de 90 %, alrededor de 91 %, alrededor de 92 %, alrededor de 93 %, alrededor de 94 %, alrededor de 95 %, alrededor de 96 %, alrededor de 97 %, alrededor de 98 %, alrededor de 99 % o más de alrededor de 99 % puros. Como se usa en la presente descripción, una sustancia es “pura” si está sustancialmente libre de otros componentes. En algunas modalidades, como entenderán los expertos en la técnica, una sustancia aún puede considerarse “aislada” o incluso “pura”, después de combinarse con otros componentes determinados tales como, por ejemplo, uno o más portadores o excipientes (por ejemplo, tampón, solvente, agua, etc.); en tales modalidades, el por ciento de aislamiento o pureza de la sustancia se calcula sin incluir tales portadores o excipientes. Para proporcionar un ejemplo, en algunas modalidades, un polímero biológico tal como un polipéptido o un polinucleótido que se produce en la naturaleza se considera “aislado” cuando: a) en virtud de su origen o fuente de obtención no se asocia con algunos o todos los componentes que lo acompañan en su estado nativo en la naturaleza; b) está sustancialmente libre de otros polipéptidos o ácidos nucleicos de la misma especie que la especie que lo produce en la naturaleza; o c) se expresa por, o se encuentra de cualquier otra manera en asociación con componentes de una célula u otro sistema de expresión que no es de la especie que lo produce en la naturaleza. Por lo tanto, por ejemplo, en algunas modalidades, un polipéptido que se sintetiza químicamente o se sintetiza en un sistema celular diferente del que lo produce en la naturaleza se considera un polipéptido "aislado". Alternativamente o adicionalmente, en algunas modalidades, un polipéptido que se ha sometido a una o más técnicas de purificación puede considerarse un polipéptido “aislado” en la medida que se ha separado de otros componentes: a) con los que se asocia en la naturaleza; y/o b) con los que se asociaba cuando se produjo inicialmente.

"Locus" o "Loci": como se usa en la presente descripción, incluye una(s) ubicación(ones) específica(s) de un gen (o secuencia significativa), secuencia de ADN, secuencia codificante de polipéptidos, o posición en un cromosoma del genoma de un organismo. Por ejemplo, un “locus Lag-3” puede incluir la ubicación específica de un gen Lag-3, secuencia de ADN Lag-3, secuencia de codificación Lag-3 o posición Lag-3 en un cromosoma del genoma de un organismo que se ha identificado en cuanto a dónde reside tal secuencia. Un “locus Lag-3” puede comprender un elemento regulador de un gen Lag-3, que incluye, pero no se limita a, un potenciador, un promotor, UTR 5' y/o 3', o una de sus combinaciones. Los expertos en la técnica apreciarán que los cromosomas pueden, en algunas modalidades, contener cientos o incluso miles de genes y demostrar la colocalización física de loci genéticos similares al comparar entre diferentes especies. Tales loci genéticos pueden describirse como que tienen sintenia compartida.

Animal no humano: El animal no humano modificado genéticamente de la invención es un roedor que es un ratón o rata. En algunas modalidades, un animal no humano como se describe en la presente descripción es un ratón.

En algunas modalidades, un animal no humano como se describe en la presente descripción, es un roedor que es un ratón de una cepa C57BL seleccionada de C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr y C57BL/Ola. En algunas ciertas modalidades, un ratón como se describe en la presente descripción es de una cepa 129 seleccionada del grupo que consiste en una cepa que es 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (por ejemplo, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (véase, por ejemplo, Festing y otros, 1999, Mammalian Genome 10:836; Auerbach, W. y otros, 2000, Biotechniques 29(5):1024-1028, 1030, 1032). En algunas ciertas modalidades, un ratón modificado genéticamente como se describe en la presente descripción es una mezcla de una cepa 129 mencionada anteriormente y una cepa C57BL/6 mencionada anteriormente. En ciertas modalidades, un ratón como se describe en la presente descripción, es una mezcla de las cepas 129 mencionadas anteriormente, o una mezcla de las cepas BL/6 mencionadas anteriormente. En ciertas modalidades, una cepa 129 de la mezcla como se describe en la presente descripción es una cepa 129S6 (129/SvEvTac). En algunas modalidades, un ratón como se describe en la presente descripción es una cepa BALB, por ejemplo, la cepa BALB/c. En algunas modalidades, un ratón como se describe en la presente descripción es una mezcla de una cepa BALB y otra cepa mencionada anteriormente.

En algunas modalidades, un animal no humano como se describe en la presente descripción es una rata. En ciertas modalidades, una rata como se describe en la presente descripción, se selecciona de una rata Wistar, una cepa LEA, una cepa Sprague Dawley, una cepa Fischer, L344, L6 y Dark Agouti. En ciertas modalidades, una cepa de rata como se describe en la presente descripción, es una mezcla de dos o más cepas seleccionadas del grupo que consiste en Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 y Dark Agouti.

Ácido nucleico: como se usa en la presente descripción, en su sentido más amplio, incluye cualquier compuesto y/o sustancia que es una cadena oligonucleotídica o que puede incorporarse a esta. En algunas modalidades, un “ácido nucleico” es un compuesto y/o sustancia que es una cadena oligonucleotídica o que puede incorporarse a esta por medio de un enlace fosfodiéster. Como resultará evidente por el contexto, en algunas modalidades, “ácido nucleico” incluye residuos de ácidos nucleicos individuales (por ejemplo, nucleótidos y/o nucleósidos); en algunas modalidades, “ácido nucleico” incluye una cadena oligonucleotídica que comprende residuos de ácidos nucleicos individuales. En algunas modalidades, un “ácido nucleico” es o comprende ARN; en algunas modalidades, un “ácido nucleico” es o comprende ADN. En algunas modalidades, un “ácido nucleico” es, comprende, o consiste en uno o más residuos de ácidos nucleicos naturales. En algunas modalidades, un “ácido nucleico” es, comprende, o consiste en uno o más análogos de ácidos nucleicos. En algunas modalidades, un análogo de ácido nucleico se diferencia de un “ácido nucleico" en que no utiliza una cadena principal con enlaces fosfodiéster. Por ejemplo, en algunas modalidades, un ‘‘ácido nucleico" es, comprende, o consiste en uno o más ‘‘ácidos nucleicos peptídicos", que se conocen en la técnica y tienen enlaces peptídicos en lugar de enlaces fosfodiéster en la cadena principal, y se consideran dentro del alcance descrito de la presente invención. Alternativamente o adicionalmente, en algunas modalidades, un ‘‘ácido nucleico" tiene uno o más enlaces fosforotioato y/o 5'-N-fosforamidita en lugar de enlaces fosfodiéster. En algunas modalidades, un ‘‘ácido nucleico" es, comprende, o consiste en uno o más nucleósidos naturales (por ejemplo, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina y desoxicitidina). En algunas modalidades, un ‘‘ácido nucleico" es, comprende, o consiste en uno o más análogos de nucleósidos (por ejemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolopirimidina, 3-metiladenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinilcitidina, C-5 propiniluridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propiniluridina, C5-propinilcitidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-deazaadenosina, 7-deazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina, 2-tiocitidina, bases metiladas, bases intercaladas y sus combinaciones). En algunas modalidades, un ‘‘ácido nucleico" comprende uno o más azúcares modificados (por ejemplo, 2'-fluororribosa, ribosa, 2'-desoxirribosa, arabinosa y hexosa) en comparación con los que se encuentran en los ácidos nucleicos naturales. En algunas modalidades, un ‘‘ácido nucleico" tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico funcional tal como un ARN o una proteína. En algunas modalidades, un ‘‘ácido nucleico" incluye uno o más intrones. En algunas modalidades, un ‘‘ácido nucleico" se prepara mediante uno o más de aislamiento a partir de una fuente natural, síntesis enzimática por polimerización basada en una plantilla complementaria (in vivo o in vitro), reproducción en una célula o sistema recombinante, y síntesis química. En algunas modalidades, un ‘‘ácido nucleico" es de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 o más residuos de largo. En algunas modalidades, un ‘‘ácido nucleico" es monocatenario; en algunas modalidades, un ‘‘ácido nucleico" es bicatenario. En algunas modalidades, un ‘‘ácido nucleico" tiene una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un elemento que codifica, o es el complemento de una secuencia que codifica, un polipéptido. En algunas modalidades, un ‘‘ácido nucleico" tiene actividad enzimática.

Unida operativamente: como se usa en la presente descripción, incluye una yuxtaposición en donde los componentes descritos se encuentran en una relación que les permite funcionar en su manera prevista. Una secuencia control "unida operativamente" a una secuencia codificante está ligada de manera que la expresión de la secuencia codificante se logra en condiciones compatibles con las secuencias control. Las secuencias "unidas operativamente" incluyen tanto las secuencias control de la expresión contiguas al gen de interés como las secuencias control de la expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés. El término "secuencia control de la expresión", como se usa en la presente descripción, incluye secuencias de polinucleótidos, que son necesarias para efectuar la expresión y el procesamiento de las secuencias codificantes a las que se ligan. Las ‘‘secuencias control de la expresión" incluyen: secuencias adecuadas de iniciación, de terminación, promotoras y potenciadoras de la transcripción; señales eficientes de procesamiento del ARN tales como señales de corte y empalme y de poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARNm citoplasmático; secuencias que aumentan la eficiencia de la traducción (es decir, la secuencia consenso Kozak); secuencias que aumentan la estabilidad de las proteínas; y cuando convenga, secuencias que aumentan la secreción de proteínas. La naturaleza de tales secuencias control difiere en dependencia del organismo huésped. Por ejemplo, en procariotas, tales secuencias control generalmente incluyen el promotor, el sitio de unión al ribosoma, y las secuencias de terminación de la transcripción, mientras que, en eucariotas, típicamente, tales secuencias control incluyen los promotores y las secuencias de terminación de la transcripción. El término ‘‘secuencias control’ está destinado a incluir los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y puede incluir, además, los componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de parejas de fusión.

Paciente o sujeto: como se usa en la presente descripción, incluye cualquier organismo al que se administra o puede administrarse una composición proporcionada, por ejemplo, con propósitos experimentales, de diagnóstico, profilácticos, estéticos y/o terapéuticos. Los pacientes típicos incluyen animales (por ejemplo, mamíferos tales como ratones, ratas, conejos, primates no humanos, y/o seres humanos). En algunas modalidades, un paciente es un animal no humano. En algunas modalidades, un paciente (por ejemplo, un paciente animal no humano) puede tener una modificación como se describe en la presente descripción, una modificación que es diferente a como se describe en la presente descripción o puede no tener modificaciones (es decir, un paciente animal no humano de tipo silvestre). En algunas modalidades, un animal no humano padece de uno o más trastornos o afecciones, o es susceptible a estos. En algunas modalidades, un animal no humano muestra uno o más síntomas de un trastorno o afección. En algunas modalidades, un animal no humano se ha diagnosticado con uno o más trastornos o afecciones.

Polipéptido: como se usa en la presente descripción, incluye cualquier cadena polimérica de aminoácidos. En algunas modalidades, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que se produce en la naturaleza. En algunas modalidades, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que no se produce en la naturaleza. En algunas modalidades, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que contiene porciones que se producen en la naturaleza separadas entre sí (es decir, de dos o más organismos diferentes, por ejemplo, porciones humanas y no humanas). En algunas modalidades, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que está modificada genéticamente dado que se diseña y/o produce mediante la acción del hombre.

Recombinante : como se usa en la presente descripción, se destina a incluir polipéptidos (por ejemplo, polipéptidos Lag-3 como se describe en la presente descripción) que se diseñan, se modifican genéticamente, se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por medios recombinantes, tales como polipéptidos que se expresan mediante el uso de un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped, polipéptidos aislados a partir de una biblioteca combinatoria, de polipéptidos humanos recombinantes (Hoogenboom H. R., 1997, TIB Tech. 15:62-70; Azzazy H., y Highsmith W. E., 2002, Clin. Biochem. 35:425-445; Gavilondo J. V., y Larrick J. W., 2002, BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H., y Chames P., 2000, Immunology Today 21:371-378), anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (véanse, por ejemplo, Taylor, L. D. y otros, 1992, Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann S-A., y Green L. L., 2002, Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Little M. y otros, 2000, Immunology Today 21:364-370; Murphy, A.J. y otros, 2014, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111(14):5153-5158) o polipéptidos que se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por cualquier otro medio que involucre el corte y empalme entre elementos de secuencia seleccionados entre sí. En algunas modalidades, uno o más de tales elementos de secuencia seleccionados se encuentran en la naturaleza. En algunas modalidades, uno o más de tales elementos de secuencia seleccionados se diseñan in silico. En algunas modalidades, uno o más de tales elementos de secuencia seleccionados son el resultado de la mutagénesis (por ejemplo, in vivo o in vitro) de un elemento de secuencia conocido, por ejemplo, de una fuente natural o sintética. Por ejemplo, en algunas modalidades, un polipéptido recombinante comprende secuencias que se encuentran en el genoma de un organismo fuente de interés (por ejemplo, humano, ratón, etc.). En algunas modalidades, un polipéptido recombinante tiene una secuencia de aminoácidos que es el resultado de la mutagénesis (por ejemplo, in vitro o in vivo, por ejemplo, en un animal no humano), de manera que las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos recombinantes son secuencias que, si bien se originan de secuencias de polipéptidos y se relacionan con estas, pueden no existir naturalmente dentro del genoma de un animal no humano in vivo.

Reemplazo: como se usa en la presente descripción, incluye un proceso a través del cual una secuencia de ácido nucleico “reemplazada" (por ejemplo, un gen) que se encuentra en un locus huésped (por ejemplo, en un genoma) se elimina de ese locus, y un ácido nucleico diferente, de “reemplazo" se coloca en su lugar. En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico reemplazada y las secuencias de ácidos nucleicos de reemplazo son comparables entre sí dado que, por ejemplo, son homólogas entre sí y/o contienen elementos correspondientes (por ejemplo, elementos que codifican proteínas, elementos reguladores, etc.). En algunas modalidades, una secuencia de ácido nucleico reemplazada incluye uno o más de un promotor, un potenciador, un sitio donante de corte y empalme, un sitio receptor de corte y empalme, un intrón, un exón, una región no traducida (UTR); en algunas modalidades, una secuencia de ácido nucleico de reemplazo incluye una o más secuencias codificantes. En algunas modalidades, una secuencia de ácido nucleico de reemplazo es un homólogo de la secuencia de ácido nucleico reemplazada. En algunas modalidades, una secuencia de ácido nucleico de reemplazo es un ortólogo de la secuencia reemplazada. En algunas modalidades, una secuencia de ácido nucleico de reemplazo es, o comprende, una secuencia de ácido nucleico humana. En algunas modalidades, que incluyen cuando la secuencia de ácido nucleico de reemplazo es, o comprende, una secuencia de ácido nucleico humana, la secuencia de ácido nucleico reemplazada es, o comprende, una secuencia de roedor (por ejemplo, una secuencia de ratón o de rata). La secuencia de ácido nucleico así colocada puede incluir una o más secuencias reguladoras que son parte de la secuencia de ácido nucleico fuente usada para obtener la secuencia así colocada (por ejemplo, promotores, potenciadores, regiones 5' o 3' no traducidas, etc.). Por ejemplo, en varias modalidades, el reemplazo es una sustitución de una secuencia endógena con una secuencia heteróloga que da como resultado la producción de un producto génico a partir de la secuencia de ácido nucleico así colocada (que comprende la secuencia heteróloga), pero no la expresión de la secuencia endógena; el reemplazo es de una secuencia genómica endógena con una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una función similar a la del polipéptido codificado por la secuencia endógena (por ejemplo, la secuencia genómica endógena codifica un polipéptido Lag-3, y el fragmento de ADN codifica uno o más polipéptidos Lag-3 humanos, en su totalidad o en parte). En varias modalidades, un gen endógeno o un fragmento de este se reemplaza con un gen humano correspondiente o un fragmento de este. Un gen humano correspondiente o un fragmento de este es un gen humano o un fragmento que es un ortólogo de, o es sustancialmente similar o igual en estructura y/o función, al gen endógeno o fragmento de este que se reemplaza.

Referencia: como se usa en la presente descripción, describe un estándar o agente, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor control contra el cual se compara un agente, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de interés. En algunas modalidades, un agente, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de referencia se somete a prueba y/o se determina sustancialmente de manera simultánea con la prueba o determinación del agente, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de interés. En algunas modalidades, un agente, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de referencia es una referencia histórica, materializada opcionalmente en un medio tangible. En algunas modalidades, una referencia puede referirse a un control. Como se usa en la presente descripción, una “referencia" puede referirse a un “animal de referencia". Un “animal de referencia" puede tener una modificación como se describe en la presente descripción, una modificación que es diferente a como se describe en la presente descripción o puede no tener modificaciones (es decir, un animal de tipo silvestre). Típicamente, como entenderán los expertos en la técnica, un agente, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de referencia se determina o caracteriza en condiciones comparables a las utilizadas para determinar o caracterizar el agente, animal (por ejemplo, un mamífero), cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de interés.

Sustancialmente: como se usa en la presente descripción, incluye la condición cualitativa de exhibir una medida o grado total o casi total de una característica o propiedad de interés. Un experto en las técnicas biológicas comprenderá que los fenómenos biológicos y químicos raramente, o nunca, llegan a completarse y/o se completan o logran o evitan un resultado absoluto. Por lo tanto, el término “sustancialmente" se usa en la presente descripción para capturar la carencia potencial de totalidad inherente en muchos fenómenos biológicos y químicos. El término también se usa en la presente descripción cuando se refiere a una secuencia, molécula de ácido nucleico, o proteína, o un dominio de proteína, en comparación con una secuencia, molécula o dominio de referencia. Por ejemplo, en referencia a un polipéptido Lag-3 humanizado que comprende sustancialmente el péptido señal de un polipéptido Lag-3 no humano, la frase "sustancialmente el péptido señal de un polipéptido Lag-3 no humano" incluye un péptido que es sustancialmente idéntico al péptido señal de un polipéptido Lag-3 no humano, el péptido, en algunas modalidades, es al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 95 %, 99 % o 100 % idéntico en secuencia con el péptido señal de un polipéptido Lag-3 no humano; y en algunas modalidades, se diferencia del péptido señal de un polipéptido Lag-3 no humano en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácidos, preferentemente solo en el extremo N- o C-terminal del péptido señal, por ejemplo, al carecer del(de los) aminoácido(s) o tener aminoácido(s) adicional(es) en el extremo N- o C-terminal del péptido señal. Como otro ejemplo, en referencia a un polipéptido PD-1 humanizado que comprende sustancialmente el dominio extracelular de una proteína PD-1 humana, la frase “sustancialmente el dominio extracelular de una proteína PD-1 humana" incluye un polipéptido que es sustancialmente idéntico al dominio extracelular de una proteína PD-1 humana, el polipéptido, en algunas modalidades, es al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 95 %, 99 % o 100 % idéntico en secuencia con el dominio extracelular de una proteína PD-1 humana; y en algunas modalidades, se diferencia del dominio extracelular de una proteína PD-1 humana en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácidos, preferentemente solo en el extremo N- o C-terminal, por ejemplo, al carecer de aminoácidos o tener aminoácidos adicionales en el extremo N- o C-terminal.

Homología sustancial: como se usa en la presente descripción, incluye una comparación entre secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos. Como apreciarán los expertos en la técnica, generalmente dos secuencias se consideran “sustancialmente homologas" si contienen residuos homólogos en posiciones correspondientes. Los residuos homólogos pueden ser residuos idénticos. Alternativamente, los residuos homólogos pueden ser residuos no idénticos con características estructurales y/o funcionales adecuadamente similares. Por ejemplo, como bien conocen los expertos en la técnica, determinados aminoácidos se clasifican típicamente como aminoácidos “hidrófobos" o “hidrófilos", y/o que tienen cadenas laterales “polares" o “apolares". La sustitución de un aminoácido por otro del mismo tipo puede considerarse frecuentemente una sustitución “homologa". Las clasificaciones de aminoácidos típicos se resumen más abajo:

Alanina Ala A Apolar Neutro 1,8

Arginina Arg R Polar Positivo -4,5

Asparagina Asn N Polar Neutro -3,5

Ácido aspártico Asp D Polar Negativo -3,5

Cisteína Cys C Apolar Neutro 2,5

Ácido glutámico Glu E Polar Negativo -3,5

Glutamina Gln Q Polar Neutro -3,5

Glicina Gly G Apolar Neutro -0,4

Histidina His H Polar Positivo -3,2

Isoleucina Ile I Apolar Neutro 4,5

Leucina Leu L Apolar Neutro 3,8

Lisina Lys K Polar Positivo -3,9

Metionina Met M Apolar Neutro 1,9

Fenilalanina Phe F Apolar Neutro 2,8

Prolina Pro P Apolar Neutro -1,6

Serina Ser S Polar Neutro -0,8

Treonina Thr T Polar Neutro -0,7

Triptófano Trp W Apolar Neutro -0,9

Tirosina Tyr Y Polar Neutro -1,3

Valina Val V Apolar Neutro 4,2

(continuación)

Aminoácidos Ambiguos 3-Letras 1-Letra

Asparagina o ácido aspártico Asx B

Glutamina o ácido glutámico Glx Z

Leucina o Isoleucina Xle J

Aminoácido no especificado

desconocido ^{o Xaa X}

Como se conoce bien en esta técnica, las secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos pueden compararse mediante el uso de cualquiera de una variedad de algoritmos, que incluyen los disponibles en programas informáticos comerciales tales como BLASTN para secuencias de nucleótidos y BLASTP, gapped BLAST y PSI-BLAST para secuencias de aminoácidos. Tales programas ilustrativos se describen en Altschul y otros, 1990, Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul y otros, 1996, Methods Enzymol. 266:160-80; Altschul y otros, 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Baxevanis y otros, 1998 Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley; y Misener y otros (eds.) (1999) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press. Además de identificar las secuencias homólogas, los programas mencionados anteriormente típicamente proporcionan una indicación del grado de homología. En algunas modalidades, dos secuencias se consideran sustancialmente homólogas si al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de sus residuos correspondientes son homólogos en un segmento de residuos en cuestión. En algunas modalidades, el segmento en cuestión es una secuencia completa. En algunas modalidades, el segmento en cuestión es de al menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o más residuos. En algunas modalidades, el segmento en cuestión incluye residuos contiguos a lo largo de una secuencia completa. En algunas modalidades, el segmento en cuestión incluye residuos discontinuos a lo largo de una secuencia completa. En algunas modalidades, el segmento en cuestión es de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más residuos.

Identidad sustancial : como se usa en la presente descripción, incluye una comparación entre secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos. Como apreciarán los expertos en la técnica, generalmente dos secuencias se consideran “sustancialmente idénticas" si contienen residuos idénticos en posiciones correspondientes. Como se conoce bien en esta técnica, las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos pueden compararse mediante el uso de cualquiera de una variedad de algoritmos, que incluyen los disponibles en programas informáticos comerciales tales como BLASTN para las secuencias de nucleótidos y BLASTP, gapped BLASt , y PSI-BLAST para las secuencias de aminoácidos. Tales programas ilustrativos se describen en Altschul y otros, 1990, Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul y otros, 1996, Methods Enzymol. 266:160-80; Altschul y otros, 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Baxevanis y otros, 1998, Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley; y Misener y otros, (eds.) (1999) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press. Además de identificar secuencias idénticas, los programas mencionados anteriormente típicamente proporcionan una indicación del grado de identidad. En algunas modalidades, dos secuencias se consideran sustancialmente idénticas si al menos el 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de sus residuos correspondientes son idénticos en un segmento de residuos en cuestión. En algunas modalidades, el segmento en cuestión es una secuencia completa. En algunas modalidades, el segmento en cuestión es de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más residuos.

Vector de transformación o constructo de transformación , como se usa en la presente descripción, incluye una molécula de polinucleótido que comprende una región de transformación. Una región de transformación comprende una secuencia que es idéntica o sustancialmente idéntica a una secuencia en una célula, tejido o animal diana y proporciona la integración del constructo de transformación en una posición dentro del genoma de la célula, tejido o animal por medio de la recombinación homóloga. Se incluyen, además, las regiones de transformación que se dirigen hacia el objetivo con el uso de sitios de reconocimiento de recombinasas sitio específicas (por ejemplo, sitios loxP y/o Frt). En algunas modalidades, un constructo de transformación comprende, además, una secuencia de ácido nucleico o gen de interés particular, un marcador de selección, secuencias control y/o reguladoras, y otras secuencias de ácidos nucleicos que permiten la recombinación mediada por la adición exógena de proteínas que ayudan o facilitan la recombinación que involucra a tales secuencias. En algunas modalidades, un constructo de transformación comprende, además, un gen de interés en su totalidad o en parte, en donde el gen de interés es un gen heterólogo que codifica una proteína, en su totalidad o en parte, que tiene una función similar a la de una proteína codificada por una secuencia endógena. En algunas modalidades, un constructo de transformación comprende, además, un gen humanizado de interés, en su totalidad o en parte, en donde el gen humanizado de interés codifica una proteína, en su totalidad o en parte, que tiene una función similar a la de una proteína codificada por la secuencia endógena. En algunas modalidades, un constructo de transformación comprende, además, un gen de interés modificado genéticamente, en su totalidad o en parte, en donde el gen de interés modificado genéticamente codifica una proteína, en su totalidad o en parte, que tiene una función similar a la de una proteína codificada por la secuencia endógena.

Variante: como se usa en la presente descripción, incluye una entidad que muestra una identidad estructural significativa con una entidad de referencia, pero se diferencia estructuralmente de la entidad de referencia en la presencia o nivel de una o más porciones químicas en comparación con la entidad de referencia. En muchas modalidades, una “variante’’ se diferencia, además, funcionalmente de su entidad de referencia. En general, el hecho de que una entidad particular se considere adecuadamente como una “variante’’ de una entidad de referencia se basa en su grado de identidad estructural con la entidad de referencia. Como apreciarán los expertos en la técnica, cualquier entidad de referencia biológica o química tiene determinados elementos estructurales característicos. Una “variante’’, por definición, es una entidad química definida que comparte uno o más de tales elementos estructurales característicos. Para proporcionar algunos ejemplos, una molécula pequeña puede tener un elemento estructural central característico (por ejemplo, un macrociclo central) y/o una o más porciones colgantes características de manera que una variante de la molécula pequeña es una que comparte el elemento estructural central y las porciones colgantes características pero se diferencia en otras porciones colgantes y/o en los tipos de enlaces presentes (simples vs. dobles, E vs. Z, etc.) dentro del núcleo central, un polipéptido puede tener un elemento de secuencia característico que comprende una pluralidad de aminoácidos que tienen posiciones designadas relacionadas entre sí en el espacio lineal o tridimensional y/o que contribuyen a una función biológica particular, un ácido nucleico puede tener un elemento de secuencia característico que comprende una pluralidad de residuos de nucleótidos que tienen posiciones designadas con respecto a otras en el espacio lineal o tridimensional. Por ejemplo, una “variante de polipéptido’’ puede diferenciarse de un polipéptido de referencia como resultado de una o más diferencias en la secuencia de aminoácidos y/o una o más diferencias en las porciones químicas (por ejemplo, carbohidratos, lípidos, etc.) unidas covalentemente a la cadena principal del polipéptido. En algunas modalidades, una “variante de polipéptido’’ muestra una identidad de secuencia general con un polipéptido de referencia que es al menos de 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % o 99 %. Alternativamente o adicionalmente, en algunas modalidades, una “variante de polipéptido’’ no comparte al menos un elemento de secuencia característico con un polipéptido de referencia. En algunas modalidades, el polipéptido de referencia tiene una o más actividades biológicas. En algunas modalidades, una “variante de polipéptido" comparte una o más de las actividades biológicas del polipéptido de referencia. En algunas modalidades, una “variante de polipéptido’’ carece de una o más de las actividades biológicas del polipéptido de referencia. En algunas modalidades, una “variante de polipéptido’’ muestra un nivel reducido de una o más actividades biológicas en comparación con el polipéptido de referencia. En muchas modalidades, un polipéptido de interés se considera una “variante” de un polipéptido parental o de referencia si el polipéptido de interés tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la del parental excepto por un pequeño número de alteraciones de la secuencia en posiciones particulares. Típicamente, menos de 20 %, l5 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % de los residuos en la variante están sustituidos en comparación con la parental. En algunas modalidades, una “variante’’ tiene 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos sustituidos en comparación con una parental. Frecuentemente, una “variante’’ tiene un número muy pequeño (por ejemplo, menos de 5, 4, 3, 2 o 1) de residuos funcionales sustituidos (es decir, residuos que participan en una actividad biológica particular). Además, típicamente, una “variante’’ no tiene más de 5, 4, 3, 2 o 1 adiciones o deleciones, y frecuentemente no tiene adiciones o deleciones, en comparación con la parental. Además, las adiciones o eliminaciones suelen típicamente ser menores que alrededor de 25, alrededor de 20, alrededor de 19, alrededor de 18, alrededor de 17, alrededor de 16, alrededor de 15, alrededor de 14, alrededor de 13, alrededor de 10, alrededor de 9, alrededor de 8, alrededor de 7, alrededor de 6, y comúnmente son menores que alrededor de 5, alrededor de 4, alrededor de 3 o alrededor de 2 residuos. En algunas modalidades, el polipéptido parental o de referencia es uno que se encuentra en la naturaleza. Como entenderán los expertos en la técnica, una pluralidad de variantes de un polipéptido de interés particular puede encontrarse comúnmente en la naturaleza, particularmente cuando el polipéptido de interés es un agente polipéptido infeccioso.

Vector, como se usa en la presente descripción, incluye una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se asocia. En algunas modalidades, los vectores son capaces de replicarse de manera extracromosómica y/o expresar los ácidos nucleicos a los que se encuentran unidos en una célula huésped tal como una célula eucariota y/o procariota. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes unidos operativamente se denominan en la presente descripción “vectores de expresión’’.

Tipo silvestre: como se usa en la presente descripción, tiene su significado entendido en la técnica de incluir una entidad que tiene una estructura y/o actividad como la que se encuentra en la naturaleza en un estado o contexto “normal’’ (a diferencia de mutante, enfermo, alterado, etc.). Los expertos en la técnica apreciarán que los genes y polipéptidos de tipo silvestre existen frecuentemente en múltiples formas diferentes (por ejemplo, alelos).

Descripción detallada de determinadas modalidades

La presente invención proporciona, entre otras cosas, roedores mejorados y/o modificados genéticamente que tienen material genético humanizado que codifica un polipéptido del gen 3 de activación linfocitaria (Lag-3) para determinar la eficacia terapéutica de moduladores de Lag-3 (por ejemplo, anticuerpos anti-Lag-3) para el tratamiento del cáncer, y ensayos en respuestas de células T y transducción de señales. Se contempla que tales no roedores proporcionan una mejora en la determinación de la eficacia terapéutica de los moduladores de Lag-3 y su potencial para el bloqueo de Lag-3. Por lo tanto, la presente invención es particularmente útil para el desarrollo de terapias anti-Lag-3 para el tratamiento de varios cánceres y enfermedades, trastornos o afecciones autoinmunitarias. En particular, la presente invención abarca la humanización de un gen de Lag-3 de roedor (murino) que da como resultado la expresión de un polipéptido Lag-3 humanizado en la superficie de células del roedor. Tales polipéptidos Lag-3 humanizados tienen la capacidad de proporcionar una fuente de células humanas Lag-3+ para determinar la eficacia de los agentes terapéuticos anti-Lag-3 para promover las respuestas inmunitarias antitumorales. En algunas modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción demuestran respuestas inmunitarias aumentadas mediante el bloqueo de la señalización de Lag-3 a través del polipéptido Lag-3 humanizado expresado en la superficie de las células del roedor. En algunas modalidades, los polipéptidos Lag-3 humanizados comprenden una secuencia correspondiente a una porción extracelular de un polipéptido LAG-3 humano, por ejemplo, una porción extracelular que contiene los dos primeros dominios similares a Ig de un polipéptido LAG-3 humano. En algunas modalidades, los polipéptidos Lag-3 humanizados comprenden una secuencia correspondiente a los residuos de aminoácidos 29-260 (o 23-260, o 21-260) de un polipéptido LAG-3 humano. En algunas modalidades, los polipéptidos Lag-3 humanizados comprenden una secuencia correspondiente al dominio transmembrana y/o cola intracelular de un polipéptido Lag-3 de roedor. En algunas modalidades, un polipéptido Lag-3 humanizado comprende una porción extracelular que contiene los dos primeros dominios similares a Ig de un polipéptido LAG-3 humano, en donde las porciones restantes del polipéptido Lag-3 humanizado se componen de aminoácidos de un polipéptido Lag-3 no humano (por ejemplo, de roedor tal como murino). En algunas modalidades, un polipéptido Lag-3 humanizado incluye un péptido señal sustancialmente idéntico al péptido señal de un polipéptido Lag-3 endógeno de roedor, un dominio extracelular que incluye una porción humana y una porción de roedor en donde la porción humana comprende los dos primeros dominios similares a Ig de un polipéptido LAG-3 humano y la porción de roedor comprende los dos últimos dominios similares a Ig de un polipéptido Lag-3 endógeno no humano; y los dominios transmembrana e intracelular de un polipéptido Lag-3 endógeno no humano. En algunas modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción comprenden un gen Lag-3 humanizado que contiene material genético del animal roedor y una especie heteróloga (por ejemplo, un ser humano). En algunas modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción comprenden un gen Lag-3 humanizado, en donde el gen Lag-3 humanizado comprende los exones 2 a 4 de un gen LAG-3 humano. En ciertas modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción comprenden un gen Lag-3 humanizado, en donde el gen Lag-3 humanizado comprende —1,741 de un gen LAG-3 humano correspondiente a los exones 2 a 4 y una porción del intrón 4 (por ejemplo, —68 pb) de un gen LAG-3 humano. En algunas modalidades, un roedor como se describe en la presente descripción comprende un gen Lag-3 humanizado, en donde el gen Lag-3 humanizado comprende el exón 1 de un gen Lag-3 endógeno del roedor, los exones 2 a 4 de un gen LAG-3 humano, y los exones 5-8 de un gen Lag-3 endógeno del roedor, en donde el gen Lag-3 humanizado se coloca en un locus Lag-3 endógeno y está unido operativamente al promotor de Lag-3 endógeno en el locus.

Varios aspectos de la invención se describen en detalle en las siguientes secciones. El uso de las secciones no significa que limite la invención. Cada sección puede aplicarse a cualquier aspecto de la invención. En esta solicitud, el uso de “o” significa “y/o” a menos que se indique de cualquier otra manera.

Gen 3 de activación linfocitaria (Lag-3)

El gen 3 de activación linfocitaria (Lag-3, también denominado CD223) es un receptor transmembrana que se expresa en las células T CD4 y CD8 activadas, células T y 6, células T citotóxicas naturales, células B, células citotóxicas naturales, células dendríticas plasmacitoides y células T reguladoras. Lag-3 es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas, es similar en estructura a c D4 y comprende cuatro dominios extracelulares similares a Ig (también conocidos como dominios D1, D2, D3 y D4; véanse los asteriscos en la alineación de secuencia de la Figura 2). Lag-3 funciona para atenuar la respuesta inmunitaria y se ha informado que se une a moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II (se cree que se unen a través de interacciones con los dominios D1 y D2 de Lag-3) y da como resultado la administración de señales negativas a las células que expresan Lag-3 y regula negativamente las respuestas de los linfocitos T CD4 y CD8 dependientes de antígenos. Actualmente, el MHC II es el único socio de unión conocido para Lag-3. También se ha informado que Lag-3 regula negativamente la capacidad de las células T para proliferar, producir citocinas y lisar las células diana, lo que se conoce como agotamiento de las células T. Además, se ha informado que Lag-3 juega un papel en la mejora de la función de las células T (Treg) reguladoras (Pardoll, D.M., 2012, Nat. Rev. Cáncer 12:252-64).

Las moléculas coestimuladoras y coinhibidoras de las células T (colectivamente denominadas moléculas de coseñalización) desempeñan un papel crucial en la regulación de la activación de las células T, la diferenciación de subconjuntos, la función efectora y la supervivencia (Chen, L. y D.B. Flies, 2013, Nat. Rev. Immunol. 13:227-42). Después del reconocimiento de complejos de péptido similar-MHC en células presentadoras de antígeno por el receptor de células T, los receptores de coseñalización se localizan conjuntamente con los receptores de células T en la sinapsis inmunitaria, donde se sinergizan con la señalización de TCR para promover o inhibir la activación y función de las células T (Flies, D.B. y otros, 2011, Yale J. Biol. 84:409-21). La respuesta inmunitaria definitiva está regulada por un equilibrio entre las señales coestimuladoras y las señales coinhibidoras, a las que se hace referencia como “puntos de control inmunitarios” (Pardoll, D.M., supra). Tales "puntos de control inmunitarios" pueden describirse como moléculas que operan en el sistema inmunitario para aumentar o disminuir señales, especialmente señales de células T. Lag-3 funciona como uno de los muchos “puntos de control inmunitarios” en la mediación de la tolerancia de las células T periféricas.

Se necesita una comprensión más completa y detallada de las funciones mediadas por Lag-3 y la vía Lag-3 en la inmunidad tumoral, autoinfecciosa e infecciosa para desarrollar terapias dirigidas prácticas para el tratamiento futuro de pacientes humanos.

Secuencias de Lag-3

Se exponen secuencias ilustrativas del gen 3 de activación linfocitaria (Lag-3) de roedor (por ejemplo, de rata y ratón), de humanos y humanizada en la Figura 8. Un fragmento de ADN sintético ilustrativo para la humanización de un gen Lag-3 no humano también se establece en la Figura 8. Para las secuencias de ARNm, la fuente en negrita indica la secuencia codificante y los exones consecutivos, cuando se indique, están separados por texto subrayado alternativo; para las secuencias de ARNm humanizadas, las secuencias humanas están contenidas entre paréntesis. Para las secuencias de aminoácidos, las secuencias transmembrana se indican mediante una fuente subrayada; para las secuencias de aminoácidos humanizadas, las secuencias humanas se indican en negrita y se contienen entre paréntesis.

Constructos de ADN

Típicamente, una molécula de polinucleótido que contiene un gen Lag-3, en su totalidad o en parte, se inserta en un vector, preferentemente un vector de ADN, para replicar la molécula de polinucleótido en una célula huésped adecuada.

En dependencia del tamaño, una secuencia del gen Lag-3 o que codifica para Lag-3 puede clonarse directamente a partir de fuentes de ADNc disponibles de proveedores comerciales o diseñarse in silico con base en secuencias publicadas disponibles de GenBank. Alternativamente, las bibliotecas de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) pueden proporcionar secuencias heterólogas de Lag-3 a partir de genes de interés (por ejemplo, un gen Lag-3 heterólogo). Las bibliotecas BAC contienen un tamaño de inserto promedio de 100-150 kb y son capaces de albergar insertos tan grandes como 300 kb (Shizuya, H. y otros, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 89:8794-7; Swiatek, P.J. y T. Gridley, 1993, Genes Dev. 7:2071-84; Kim, U.J. y otros, 1996, Genomics 34:213-8). Por ejemplo, se han construido bibliotecas BAC genómicas humanas y de ratón y están disponibles comercialmente (por ejemplo, Invitrogen, Carlsbad Calif ). Las bibliotecas BAC genómicas también pueden servir como fuente de secuencias heterólogas de Lag-3 así como también de regiones de control de la transcripción.

Alternativamente, las secuencias heterólogas de Lag-3 pueden aislarse, clonarse y/o transferirse desde cromosomas artificiales de levadura (YAC). Un gen o locus heterólogo completo puede clonarse y contenerse dentro de uno o varios YAC. Si se emplean múltiples YAC y contienen regiones de homología de solapamiento, pueden recombinarse dentro de las cepas del hospedero de levadura para producir un único constructo que representa todo el locus. Los brazos del YAC pueden modificarse adicionalmente con casetes de selección de mamíferos mediante el reajuste para ayudar a introducir los constructos en células madre embrionarias o embriones mediante métodos conocidos en la técnica y/o descritos en la presente descripción.

En la presente descripción se proporcionan las secuencias ilustrativas de ARNm y aminoácidos para su uso en la construcción de un gen Lag-3 humanizado en un animal no humano, por ejemplo, en la Figura 8. También pueden encontrarse otras secuencias heterólogas de Lag-3 en la base de datos GenBank u otras bases de datos de secuencias conocidas en la técnica.

Los constructos de ADN que contienen secuencias Lag-3 como se describe en la presente descripción, en algunas modalidades, comprenden secuencias genómicas de LAG-3 humano que codifican una porción extracelular de un polipéptido LAG-3 humano, por ejemplo, al menos aminoácidos 29-260 (o 23-260 o 21-260) de un polipéptido LAG-3 humano, unidos operativamente a una secuencia reguladora no humana (por ejemplo, un promotor de roedor) para la expresión en un roedor transgénico. En algunas modalidades, los constructos de ADN que contienen secuencias Lag-3 como se describe en la presente descripción comprenden secuencias genómicas de LAG-3 humano que codifican al menos los aminoácidos 29-260 de un polipéptido LAG-3 humano unido operativamente a un promotor de Lag-3 no humano y uno o más exones de Lag-3 no humano (por ejemplo, exones de Lag-3 endógenos). Las secuencias humanas y/o no humanas de Lag-3 incluidas en los constructos de ADN descritos en la presente descripción pueden ser idénticas o sustancialmente idénticas con las secuencias humanas y/o no humanas de Lag-3 que se encuentran en la naturaleza (por ejemplo, genómica), artificiales (por ejemplo, sintéticas) o pueden ser modificadas genéticamente por la mano del hombre. En algunas modalidades, las secuencias de Lag-3 son de origen sintético, e incluyen una secuencia o secuencias que se encuentran en un gen LAG-3 humano que se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, un constructo de ADN puede incluir ADN sintético que corresponde a los exones 2 a 4 de un gen LAG-3 humano, y que codifica una porción extracelular de un polipéptido LAG-3 humano, por ejemplo, al menos los aminoácidos 29-260 de un polipéptido LAG-3 humano, unido operativamente a un regulador de Lag-3 no humano (por ejemplo, un promotor) y secuencias codificantes (por ejemplo, uno o más exones no humanos) de manera que un polipéptido Lag-3 que tiene porciones humanas y no humanas sea codificado por la construcción de ADN resultante. En algunas modalidades, las secuencias Lag-3 comprenden una secuencia asociada naturalmente con un gen Lag-3 heterólogo (es decir, un gen LAG-3 humano). En algunas modalidades, las secuencias Lag-3 comprenden una secuencia que no se asocia naturalmente con un gen Lag-3 heterólogo (es decir, un gen LAG-3 humano). En algunas modalidades, las secuencias Lag-3 comprenden una secuencia que se optimiza para la expresión en un animal no humano. En algunas modalidades, las secuencias heterólogas de Lag-3 unidas operativamente a las secuencias de Lag-3 no humanas cada una codifican para una porción de un polipéptido Lag-3 que aparece en polipéptidos separados en la naturaleza. Si secuencias adicionales son útiles para optimizar la expresión de secuencias heterólogas Lag-3, tales secuencias pueden clonarse mediante el uso de secuencias existentes como sondas. Pueden obtenerse secuencias adicionales necesarias para maximizar la expresión de un gen Lag-3 heterólogo o una secuencia heteróloga de Lag-3 a partir de secuencias genómicas u otras fuentes en dependencia del resultado deseado.

Los constructos de ADN pueden prepararse mediante el uso de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un constructo de ADN puede prepararse como parte de un plásmido más grande. Tal preparación permite clonar y seleccionar las construcciones correctas de una manera eficiente como se conoce en la técnica. Los fragmentos de ADN que contienen una o más secuencias de codificación de nucleótidos como se describe en la presente descripción pueden localizarse entre sitios de restricción convenientes en el plásmido de manera que puedan aislarse fácilmente de las secuencias de plásmido restantes para su incorporación en el animal deseado.

En la técnica se conocen varios métodos empleados en la preparación de plásmidos y organismos huésped que los contienen. Para otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procariotas como eucariotas, así como también para procedimientos recombinantes generales, véase Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da Ed., ed. por Sambrook, J. y otros, Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989.

Producción de Roedores que Tienen un gen 3 de Activación Linfocitaria humanizado

Se proporcionan roedores que expresan polipéptidos Lag-3 humanizados en la superficie de las células de los roedores como resultado de una modificación genética de un locus endógeno (por ejemplo, un locus Lag-3) del roedor que codifica un polipéptido Lag-3. Los roedores son ratas o ratones, en particular, ratones.

Un gen Lag-3 humanizado, en algunas modalidades, comprende material genético de una especie heteróloga (por ejemplo, humanos), en donde el gen Lag-3 humanizado codifica un polipéptido Lag-3 que comprende la porción codificada del material genético de la especie heteróloga. En algunas modalidades, un gen Lag-3 humanizado como se describe en la presente descripción comprende ADN genómico de una especie heteróloga que codifica una porción extracelular de un polipéptido Lag-3 que se expresa en la membrana plasmática de una célula. También se proporcionan roedores, embriones, células y constructos de transformación para producir roedores, embriones de roedores y células que contienen dicho gen Lag-3 humanizado.

En algunas modalidades, se elimina un gen Lag-3 endógeno. En algunas modalidades, se altera un gen Lag-3 endógeno, en donde una porción del gen Lag-3 endógeno se reemplaza con una secuencia heteróloga (por ejemplo, una secuencia LAG-3 humana, en su totalidad o en parte). En algunas modalidades, la totalidad o sustancialmente la totalidad de un gen Lag-3 endógeno se reemplaza con un gen heterólogo (por ejemplo, un gen LAG-3 humano). En algunas modalidades, una porción de un gen Lag-3 heterólogo se inserta en un gen Lag-3 no humano endógeno en un locus Lag-3 endógeno. El gen heterólogo es un gen humano. En algunas modalidades, la modificación o humanización se realiza a una de las dos copias del gen Lag-3 endógeno, lo que da lugar a un roedor que es heterocigoto con respecto al gen Lag-3 humanizado. En otras modalidades, se proporciona un roedor que es homocigoto para un gen Lag-3 humanizado.

En varios aspectos, un roedor contiene un gen LAG-3 humano, en su totalidad o en parte, en un locus Lag-3 endógeno no humano. Por lo tanto, tales roedores pueden describirse como que tienen un gen Lag-3 heterólogo. El gen Lag-3 reemplazado, insertado, modificado o alterado en el locus Lag-3 endógeno o un polipéptido expresado a partir de tal gen puede detectarse mediante el uso de una variedad de métodos que incluyen, por ejemplo, PCR, transferencia Western, transferencia Southern, polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), o un ensayo de ganancia o pérdida de alelos. En algunas modalidades, el roedor es heterocigoto con respecto al gen Lag-3 humanizado.

En varias modalidades, un gen Lag-3 humanizado como se describe en la presente descripción incluye los exones 2 a 4 de un gen LAG-3 humano.

En varias modalidades, un gen Lag-3 humanizado como se describe en la presente descripción incluye un gen Lag-3 que tiene un segundo, tercer y cuarto exón, cada uno con una secuencia al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a un segundo, tercer y cuarto exón que aparecen en la SEQ ID NO: 5.

En varias modalidades, un gen Lag-3 humanizado como se describe en la presente descripción incluye un gen Lag-3 que tiene un segundo, tercer y cuarto exón cada uno que tiene una secuencia que es sustancialmente idéntica o idéntica a un segundo, tercer y cuarto exón que aparece en la SEQ ID NO: 5.

En varias modalidades, un gen Lag-3 humanizado como se describe en la presente descripción comprende una secuencia al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a la SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11.

En varias modalidades, un gen Lag-3 humanizado como se describe en la presente descripción comprende una secuencia que es sustancialmente idéntica o idéntica a la SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o Se Q ID NO: 11.

En varias modalidades, un gen Lag-3 humanizado como se describe en la presente descripción es o comprende la SEQ ID NO: 10.

En varias modalidades, un gen Lag-3 humanizado como se describe en la presente descripción es o comprende la SEQ ID NO: 11.

En varias modalidades, un gen Lag-3 humanizado como se describe en la presente descripción comprende los exones 1, 5, 6, 7 y 8 de un gen Lag-3 no humano, por ejemplo, un gen Lag-3 endógeno de un animal no humano.

En varias modalidades, un gen Lag-3 humanizado como se describe en la presente descripción comprende un primer, quinto, sexto, séptimo y octavo exón cada uno que tiene una secuencia de al menos el 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idénticos a un primer, quinto, sexto, séptimo y octavo exón que aparecen en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3.

En varias modalidades, un gen Lag-3 humanizado como se describe en la presente descripción comprende un primer, quinto, sexto, séptimo y octavo exón cada uno que tiene una secuencia que es sustancialmente idéntica o idéntica a un primer, quinto, sexto, séptimo y octavo exón que aparece en la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3.

En varias modalidades, un gen Lag-3 humanizado como se describe en la presente descripción comprende una región no traducida 5' y una región no traducida 3' de un gen Lag-3 no humano, por ejemplo, un gen Lag-3 endógeno de un animal no humano.

En varias modalidades, un gen Lag-3 humanizado como se describe en la presente descripción comprende una región no traducida 5' y una región no traducida 3' cada una que tiene una secuencia de al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a una región no traducida 5' y una región no traducida 3' que aparece en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3.

En varias modalidades, un gen Lag-3 humanizado como se describe en la presente descripción comprende una región no traducida 5' y una región no traducida 3' cada uno que tiene una secuencia que es sustancialmente idéntica o idéntica a una región no traducida 5' y una región no traducida 3' que aparece en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3.

En varias modalidades, un gen Lag-3 humanizado como se describe en la presente descripción comprende una secuencia codificante de nucleótidos (por ejemplo, una secuencia de ADNc) al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a una secuencia codificante de nucleótidos que aparece en SEQ ID NO: 7.

En varias modalidades, un gen Lag-3 humanizado como se describe en la presente descripción comprende una secuencia codificante de nucleótidos (por ejemplo, una secuencia de ADNc) que es sustancialmente idéntica o idéntica a una secuencia codificante de nucleótidos que aparece en la SEQ ID NO: 7.

En varias modalidades, un gen Lag-3 humanizado como se describe en la presente descripción codifica un polipéptido Lag-3 que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a una secuencia de aminoácidos que aparece en la SEQ ID NO: 8.

En varias modalidades, un gen Lag-3 humanizado como se describe en la presente descripción codifica un polipéptido Lag-3 que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica o idéntica a una secuencia de aminoácidos que aparece en la SEQ ID NO: 8.

En varias modalidades, un polipéptido Lag-3 humanizado producido por un animal no humano como se describe en la presente descripción tiene una porción extracelular, cuya porción extracelular comprende una secuencia de aminoácidos al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a los residuos de aminoácidos 29-260 de la SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8.

En varias modalidades, un polipéptido Lag-3 humanizado producido por un roedor como se describe en la presente descripción tiene una porción extracelular sustancialmente idéntica a una porción extracelular (por ejemplo, una porción extracelular que contiene los dos primeros dominios similares a Ig) de un polipéptido LAG-3 humano. En algunas modalidades, una porción extracelular de un polipéptido LAG-3 humano se representa por los residuos de aminoácidos 21-260, 23-260 o 29-260 de un polipéptido LAG-3 humano, tal como un polipéptido lAG-3 humano como se establece en la SEQ ID NO: 6.

En varias modalidades, un polipéptido Lag-3 humanizado no producido por un roedor como se describe en la presente descripción tiene una porción extracelular, cuya porción extracelular comprende una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica o idéntica a los residuos de aminoácidos 29-260 de la SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8.

En varias modalidades, un polipéptido Lag-3 humanizado producido por un animal no humano como se describe en la presente descripción tiene una porción extracelular, cuya porción extracelular comprende una secuencia de aminoácidos al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a los residuos de aminoácidos 23-260 de la SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8.

En varias modalidades, un polipéptido Lag-3 humanizado producido por un roedor como se describe en la presente descripción tiene una porción extracelular, cuya porción extracelular comprende una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica o idéntica a los residuos de aminoácidos 23-260 de la SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8.

En varias modalidades, un polipéptido Lag-3 humanizado producido por un roedor como se describe en la presente descripción tiene una porción extracelular, dicha porción extracelular comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a los residuos de aminoácidos 21-260 de la SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8.

En varias modalidades, un polipéptido Lag-3 humanizado producido por un roedor como se describe en la presente descripción tiene una porción extracelular, cuya porción extracelular comprende una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica o idéntica a los residuos de aminoácidos 21-260 de la SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8.

En varias modalidades, un polipéptido Lag-3 humanizado producido por un roedor como se describe en la presente descripción tiene una porción transmembrana y una porción citoplasmática de un polipéptido Lag-3 endógeno, por ejemplo, los dominios transmembrana y citoplasmático de un polipéptido Lag-3 endógeno de un roedor. En algunas modalidades, las secuencias del dominio transmembrana y citoplasmático de un polipéptido Lag-3 endógeno son las ilustradas en la Figura 8. En algunas modalidades, un polipéptido Lag-3 humanizado producido por un roedor como se describe en la presente descripción también tiene una porción extracelular que contiene los dos últimos dominios similares a Ig de un polipéptido Lag-3 no humano.

En varias modalidades, un polipéptido Lag-3 humanizado producido por un roedor como se describe en la presente descripción tiene una secuencia de aminoácidos al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

En varias modalidades, un polipéptido Lag-3 humanizado producido por un roedor como se describe en la presente descripción tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica o idéntica a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8.

Se proporcionan las composiciones y métodos para producir roedores que expresan un polipéptido Lag-3 humanizado, que incluye formas polimórficas específicas, variantes alélicas (por ejemplo, diferencias en un solo aminoácido) o alternativamente isoformas de corte y empalme, que incluyen las composiciones y métodos para producir roedores que expresan tales polipéptidos a partir de un promotor humano y una secuencia reguladora humana. En algunas modalidades, se proporcionan, además, composiciones y métodos para producir roedores que expresan tales proteínas a partir de un promotor no humano y una secuencia reguladora no humana. En algunas modalidades, se proporcionan, además, las composiciones y métodos para producir roedores que expresan tales proteínas a partir de un promotor endógeno y una secuencia reguladora endógena. En algunas ciertas modalidades, los promotores endógenos y las secuencias reguladoras endógenas son promotores endógenos de roedor y secuencias reguladoras endógenas de roedor. Los métodos incluyen insertar el material genético que codifica un polipéptido LAG-3 humano, en su totalidad o en parte, en un sitio preciso en el genoma de un roedor que corresponde a un gen Lag-3 endógeno para de esta manera crear un gen Lag-3 humanizado que expresa una proteína Lag-3 que es humana en su totalidad o en parte. En algunas modalidades, los métodos incluyen insertar ADN genómico correspondiente a los exones 2, 3 y 4 de un gen LAG-3 humano en un gen Lag-3 endógeno del roedor para crear de esta manera un gen humanizado que codifica un polipéptido Lag-3 que contiene una porción humana que contiene aminoácidos codificados por los exones insertados.

Cuando sea adecuado, la región codificante del material genético o la(s) secuencia(s) de polinucleótido(s) que codifica(n) un polipéptido Lag-3 humano (o humanizado) en su totalidad o en parte pueden modificarse de manera que incluyan codones optimizados para la expresión en células en el animal no humano (por ejemplo, véanse las patentes de Estados Unidos núm. 5,670,356 y 5,874,304). Las secuencias con optimización de codones son secuencias sintéticas, y, preferentemente, codifican el polipéptido idéntico (o un fragmento biológicamente activo de un polipéptido de longitud completa que tiene sustancialmente la misma actividad que el polipéptido de longitud completa) codificado por el polinucleótido original sin optimización de codones. En algunas modalidades, la región codificante del material genético que codifica un polipéptido Lag-3 humano (o humanizado), en su totalidad o en parte, puede incluir una secuencia alterada para optimizar el uso de codones en un tipo de célula particular (por ejemplo, una célula de roedor). Por ejemplo, los codones del ADN genómico correspondiente a los exones 2, 3 y 4 de un gen LAG-3 humano a insertar en un gen Lag-3 endógeno de un roedor pueden optimizarse para su expresión en una célula del roedor. Una secuencia de este tipo puede describirse como una secuencia con codones optimizados.

Los métodos para generar roedores transgénicos, que incluyen desactivaciones génicas e inserciones génicas, se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Gene Targeting: A Practical Approach, Joyner, ed., Oxford University Press, Inc. (2000)). Por ejemplo, la generación de roedores transgénicos puede implicar opcionalmente la interrupción de los loci genéticos de uno o más genes endógenos de roedor (o segmentos de genes) y la introducción de uno o más genes heterólogos (o secuencias de codificación Lag-3) en el genoma del roedor, en algunas modalidades, en el mismo lugar que un gen endógeno de roedor (o segmentos de genes).

En algunas modalidades, los genes Lag-3 heterólogos (o humanizados) o las secuencias codificadoras de Lag-3 heterólogas como se describe en la presente descripción se introducen en un gen Lag-3 endógeno en el genoma de un roedor; en ciertas modalidades, un locus del gen Lag-3 endógeno se altera, modifica genéticamente o se diseña para contener secuencias Lag-3 humanas (o fragmentos de genes) unidas operativamente a una o más secuencias Lag-3 no humanas (o fragmentos de genes).

Un enfoque del gen Lag-3 humanizado emplea una modificación relativamente mínima de las interacciones y la señalización de proteínas endógenas y da como resultado una transducción de señales mediada por Lag-3 natural en el roedor, en varias modalidades, debido a que la secuencia genómica de las secuencias de Lag-3 está modificada en un solo fragmento y, por lo tanto, retiene la funcionalidad normal al incluir las secuencias reguladoras necesarias. Por lo tanto, en tales modalidades, la modificación del gen Lag-3 no afecta otros genes circundantes u otros genes endógenos que interactúan con Lag-3 (por ejemplo, moléculas del MHC de clase II). Además, en varias modalidades, la modificación no afecta el ensamblaje de un polipéptido transmembrana Lag-3 funcional en la membrana celular y mantiene sus funciones efectoras normales por medio de la unión y posterior transducción de señales a través de la porción citoplasmática del polipéptido que no se afecta por la modificación.

Una ilustración esquemática (que no está a escala) de la organización genómica de un gen Lag-3 murino endógeno y un gen LAG-3 humano se proporciona en la Figura 1. Un método ilustrativo para la humanización de un gen Lag-3 murino endógeno mediante el uso de un fragmento genómico que contiene los exones 2, 3 y 4 y una porción del intrón 4 (por ejemplo, alrededor de 68 pb) de un gen LAG-3 humano se proporciona en la Figura 3. Como se ilustra, un fragmento de ADN sintético de 1741 pb correspondiente a los exones 2, 3 y 4 y una porción del intrón 4 de un gen LAG-3 humano se inserta en el lugar de una secuencia de 1750 pb de un locus del gen Lag-3 murino endógeno mediante un constructo de transformación. El fragmento de ADN sintético de 1741 pb puede clonarse directamente a partir de ADN humano o sintetizarse a partir de una secuencia fuente (por ejemplo, núm. de acceso de GenBank NM_002286.5, SEQ ID NO: 9). Este ADN genómico incluye la porción del gen que codifica al menos los residuos de aminoácidos 29-260 (o 23-260 o 21-260) de un polipéptido LAG-3 humano responsable de la unión al ligando.

Un roedor (por ejemplo, un ratón) que tiene un gen Lag-3 humanizado en el locus Lag-3 endógeno puede producirse mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, puede producirse un vector de transformación que introduce un gen LAG-3 humano en su totalidad o en parte con un gen marcador de selección. La Figura 3 ilustra un vector de transformación que contiene un locus Lag-3 endógeno de un genoma de ratón que comprende una inserción de un fragmento de ADN sintético de 1741 pb que corresponde a los exones 2-4 y los primeros 68 pb del intrón 4 de un gen LAG-3 humano. Como se ilustra, el constructo de transformación contiene un brazo de homología 5' que contiene una secuencia aguas arriba del exón 2 (es decir, el exón 1, etc.) de un gen Lag-3 endógeno murino (~46 Kb), seguido del fragmento de ADN sintético de 1741 pb, un casete de selección de fármacos (por ejemplo, un gen de resistencia a neomicina flanqueado en ambos lados por secuencias loxP: ~ 5 Kb) y un brazo de homología 3'que contiene la secuencia restante de los exones 5-8 murinos endógenos de un gen Lag-3 murino endógeno (~ 53 Kb). El constructo de transformación contiene un casete de autodeleción de fármaco (por ejemplo, un gen de resistencia a neomicina flanqueado por secuencias loxP; véanse las patentes de Estados Unidos núm. 8,697,851, 8,518,392 y 8,354,389). Después de la electroporación en células madre embrionarias, se crea un gen Lag-3 endógeno modificado que incluye 1741 pb de un gen LAG-3 humano (es decir, los exones 2-4 y los primeros 68 pb del intrón 4) en lugar de 1750 pb de un gen Lag-3 endógeno de tipo silvestre, que está contenido en el vector de transformación. Se crea un gen Lag-3 humanizado que da como resultado una célula o un animal no humano que expresa un polipéptido Lag-3 humanizado que contiene aminoácidos codificados por el fragmento de ADN sintético de 1741 pb (es decir, los exones 2-4 y los primeros 68 pb de intrón 4 de un gen LAG-3 humano). El casete de selección con fármaco se elimina de una manera dependiente del desarrollo, es decir, la progenie derivada de los ratones cuyas células de la línea germinal contienen el gen Lag-3 humanizado descrito anteriormente liberarán el marcador de selección de las células diferenciadas durante el desarrollo (véase la parte inferior de la Figura 3).

En algunas modalidades, un roedor que tiene un gen Lag-3 humanizado como se describe en la presente descripción puede caracterizarse como transgénico para el gen Lag-3 humanizado o un roedor Lag-3 transgénico. Tales descripciones se usan indistintamente en la presente descripción y se refieren a cualquier roedor de origen no natural en el que una o más de las células del roedor contienen una secuencia de ácido nucleico heteróloga Lag-3 y/o secuencia codificadora de Lag-3, en su totalidad o en parte, como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades, una secuencia de ácido nucleico heteróloga Lag-3 y/o secuencia codificadora de Lag-3, en su totalidad o en parte, se introduce en una célula, directa o indirectamente por introducción en una célula precursora, por medio de una manipulación genética deliberada, tal como por microinyección o por infección con un virus recombinante. En tales modalidades, la manipulación genética no incluye técnicas de mejoramiento clásicas, sino que se dirige a la introducción de molécula(s) de ADN recombinante que contienen una secuencia de ácido nucleico heteróloga Lag-3 y/o secuencia codificadora de Lag-3, en su totalidad o en parte, como se describe en la presente descripción. Tal molécula puede integrarse dentro de un cromosoma, o puede ser ADN de replicación extracromosómica como se describe en la presente descripción, los roedores transgénicos incluyen roedores que son heterocigotos u homocigotos para una secuencia de ácido nucleico heteróloga Lag-3 y/o secuencia codificadora de Lag-3, en su totalidad o en parte, y/o roedores que tienen copias únicas o múltiples de una secuencia de ácido nucleico heteróloga Lag-3 y/o secuencia codificadora de Lag-3, en su totalidad o en parte, como se describe en la presente descripción.

Un roedor fundador transgénico puede identificarse en base a la presencia de un gen Lag-3 humanizado en su genoma y/o expresión de polipéptidos Lag-3 que contienen aminoácidos codificados por el material genético insertado en tejidos o células del roedor. Un roedor fundador transgénico puede usarse entonces para criar roedores adicionales que portan el gen Lag-3 humanizado, creando de esta manera una serie de roedores que portan cada uno una o más copias de un gen Lag-3 humanizado. Además, los roedores transgénicos que portan un gen Lag-3 humanizado pueden criarse además con otros roedores transgénicos que portan otros transgenes (por ejemplo, genes de inmunoglobulina humana) según se desee.

También pueden producirse roedores transgénicos de modo que contengan sistemas seleccionados que permitan la expresión regulada o dirigida del gen Lag-3 humanizado (o transgén Lag-3 humanizado). Los sistemas ilustrativos incluyen el sistema de la recombinasa Cre/loxP del bacteriófago PI (véase, por ejemplo, Lakso, M. y otros, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236) y el sistema de la recombinasa FLP/Frt de S. cerevisiae (O'Gorman, S. y otros, 1991, Science 251:1351-1355). Tales animales pueden proporcionarse mediante la construcción de animales transgénicos "dobles", por ejemplo, mediante el apareamiento de dos animales transgénicos, uno que contiene un transgén que comprende una modificación seleccionada (por ejemplo, un gen o transgén Lag-3 humanizado) y el otro que contiene un transgén que codifica una recombinasa (por ejemplo, una Cre recombinasa).

Los roedores como se describe en la presente descripción pueden prepararse como se describió anteriormente, o usar métodos conocidos en la técnica, para comprender genes humanos o humanizados adicionales, a menudo en dependencia del uso previsto del roedor. El material genético de tales genes humanos o humanizados adicionales puede introducirse a través de la alteración adicional del genoma de las células (por ejemplo, células madre embrionarias) que tienen las modificaciones genéticas como se describió anteriormente o a través de técnicas de mejoramiento conocidas en la técnica con otras cepas modificadas genéticamente como se desee. En algunas modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción se preparan para comprender además uno o más genes humanos o humanizados seleccionados de la Proteína 1 de muerte celular programada (PD-1), el Ligando de muerte programada 1 (PD-L1) y la Proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4). En algunas modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción pueden prepararse mediante la introducción de un vector de transformación, como se describe en la presente descripción, en una célula de una cepa modificada. En algunas modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción se preparan de modo que comprendan además un gen humano o humanizado de la proteína 1 de muerte celular programada (Pdcdl). En algunas modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción comprenden un gen Lag-3 humanizado, como se describe en la presente descripción, y material genético a partir de una especie heteróloga (por ejemplo, humanos), en donde el material genético codifica, en su totalidad o en parte, una o más proteínas heterólogas seleccionadas de la Proteína 1 de muerte celular programada (PD-1), el Ligando de muerte programada 1 (PD-L1) y la Proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4). En algunas ciertas modalidades, los roedores como se describe en la presente invención comprenden un gen Lag-3 humanizado como se describe en la presente descripción y material genético de una especie heteróloga (por ejemplo, seres humanos), en donde el material genético codifica, en su totalidad o en parte, un polipéptido PD-1 heterólogo (por ejemplo, humano). En ciertas modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción comprenden además un gen Pdcdl que comprende una porción endógena y una porción humana (por ejemplo, exón 2 y exón 3, en su totalidad o en parte, de un ser gen PDCD1 humano), en donde la porción humana codifica sustancialmente todo el dominio extracelular de un polipéptido PD-1 humano (por ejemplo, los aminoácidos correspondientes a los residuos 27-169 o 26-169 de un polipéptido PD-1 humano) y la porción endógena codifica el dominio intracelular de un polipéptido PD-1 endógeno; en algunas modalidades, la porción humana y la porción endógena se unen operativamente a un promotor de Pdcdl. En ciertas modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción comprenden además un gen Pdcd1 que incluye material genético que codifica sustancialmente todo el dominio extracelular de un polipéptido PD-1 humano (por ejemplo, material genético que codifica los aminoácidos correspondientes a los residuos 27-169 o 26-169 de un polipéptido PD-1 humano; véanse, por ejemplo, SEQ ID NO: 23 del documento PCT/US15/36649 presentado el 19 de junio de 2015 y publicado como WO2015196051, y/o SEQ ID NO: 23 de la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 14/744,592, presentada el 19 de junio de 2015 y publicada como US 2015-0366174 A1). Números de Acceso de GenBank NM_005018.2 y NP_005009.2, y UniProt iD Q15116 proporcionan secuencias fuente representativas de un gen PDCD1 humano y del polipéptido PD-1 humano a partir de los cuales puede obtenerse una porción humana deseada.

Por ejemplo, como se describe en la presente descripción, los roedores que comprenden un gen Lag-3 humanizado como se describe en la presente descripción pueden comprender, además, (por ejemplo, por medio de cruzamiento o estrategias de transformación de múltiples genes) una o más modificaciones como se describió en la solicitud PCT/US15/36649, presentada el 19 de junio de 2015 y publicada como documento WO2015196051, y la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 14/744,592, presentada el 19 de junio de 2015 y publicada como US 2015-0366174 A1. Un roedor que comprende un gen Lag-3 humanizado como se describe en la presente descripción puede cruzarse a un roedor que comprende un gen Pdcdl humanizado (por ejemplo, exón 2 y una porción del exón 3 de un gen PDCD1 humano unido operativamente a los exones 1, una porción del exón 3, 4 y 5 de un roedor con un gen Pdcdl endógeno de manera que el gen Pdcd1 humanizado codifica un polipéptido PD-1 que incluye una porción extracelular de un polipéptido PD-1 humano (por ejemplo, correspondiente a los residuos de aminoácidos 27-169 o 26-169) y una porción intracelular de un polipéptido PD-1 de roedor (véanse, por ejemplo, las SEQ ID NO: 5 y 6 del documento PCT/US15/36649, presentado el 19 de junio de 2015 y publicado como WO2015196051, y/o las s Eq ID NO: 5 y 6 de la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 14/744,592, presentada el 19 de junio de 2015 y publicado como US 2015-0366174 A1). Un roedor que comprende un gen Lag-3 humanizado como se describe en la presente descripción puede cruzarse a un roedor que comprende un gen Pdcdl humanizado, cuyo gen Pdcdl humanizado incluye material genético que codifica el dominio extracelular de un polipéptido PD-1 humano (por ejemplo, material genético que codifica los aminoácidos correspondientes a los residuos 27-169 o 26-169 de un polipéptido PD-1 humano; véase, por ejemplo, la SEQ ID NO: 23 del documento PCT/US15/36649, presentado el 19 de junio de 2015 y publicado como WO2015196051, y/o la SEQ ID NO: 23 de la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 14/744,592, presentada el 19 de junio de 2015 publicada como US 2015-0366174 a 1

En algunas modalidades, un gen Pdcdl humanizado comprende un exón 1 de Pdcdl humano (por ejemplo, roedor), un exón 2 de PDCD1 humano, un exón 3 (que comprende una parte del exón 3 de un gen PDCD1 humano y una parte del exón 3 de un gen Pdcdl no humano (por ejemplo, roedor)) y los exones 4-5 de un gen Pdcdl no humano (por ejemplo, roedor), y en donde, en algunas modalidades, la porción del exón 3 de un gen PDCD1 humano es la porción 5' del exón 3 humano que codifica los aminoácidos como parte del dominio extracelular un polipéptido PD-1, tal como los aminoácidos de una secuencia de tallo de PD-1, y la porción del exón 3 de un gen Pdcdl no humano es la porción 3' del exón 3 no humano que codifica los aminoácidos como parte del dominio transmembrana de un polipéptido PD-1 no humano. En modalidades específicas, un gen Pdcdl humanizado codifica un polipéptido PD-1 humanizado que incluye un dominio extracelular sustancialmente idéntico al dominio extracelular de un polipéptido PD-1 humano, un dominio transmembrana sustancialmente idéntico al dominio transmembrana de un polipéptido PD-1 de roedor, y el dominio intracelular de un polipéptido PD-1 de roedor.

Aunque las modalidades que emplean un gen Lag-3 humanizado en un ratón (es decir, un ratón con un gen Lag-3 que codifica un polipéptido Lag-3 que incluye una porción humana y una porción de ratón) se discuten ampliamente en la presente descripción, las ratas que comprenden un gen Lag-3 humanizado también se proporcionan. En algunas modalidades, tales roedores comprenden un gen Lag-3 humanizado unido operativamente a un promotor de Lag-3 de roedor. En algunas modalidades, tales roedores comprenden un gen Lag-3 humanizado unido operativamente a un promotor de Lag-3 endógeno; en algunas modalidades, un promotor de Lag-3 endógeno de roedor. En algunas modalidades, tales roedores expresan un polipéptido Lag-3 humanizado de un locus endógeno, en donde el polipéptido Lag-3 humanizado comprende al menos los residuos de aminoácidos 29-260 (por ejemplo, 29-260, 23-260 o 21-260) de un polipéptido LAG-3 humano. Tales roedores son ratones o ratas. Para aquellos animales no humanos para los que no se dispone fácilmente de células ES genéticamente modificables adecuadas, se emplean otros métodos para producir un roedor que comprende la modificación genética. Tales métodos incluyen, por ejemplo, la modificación de un genoma de células que no son ES (por ejemplo, un fibroblasto o una célula pluripotente inducida) y el empleo de transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) para transferir el genoma modificado genéticamente a una célula adecuada, por ejemplo, un ovocito enucleado, y la gestación de la célula modificada (por ejemplo, el ovocito modificado) en un roedor bajo condiciones adecuadas para formar un embrión.

Los métodos para modificar un genoma de roedor incluyen, por ejemplo, emplear una nucleasa con dedos de zinc (ZFN), una nucleasa efectora de tipo activadora de la transcripción (TALEN), o una proteína Cas (es decir, un sistema CRISPR/Cas) para modificar un genoma para incluir un gen Lag-3 humanizado y/o Pdcdl humanizado.

Métodos que Emplean Roedores que tienen Genes Lag-3 humanizados

El uso de ratones humanizados para la investigación biomédica ha avanzado la comprensión de varios aspectos de la función de las células humanas, en particular, las células inmunitarias humanas. De hecho, el uso de varias cepas inmunodeprimidas ha proporcionado valiosos sistemas in vivo para la investigación de células inmunitarias humanas. Sin embargo, no lo han sido sin limitación. Por ejemplo, el uso de estos modelos ha resaltado diferencias distintivas en la biología de los mamíferos, en particular, la inmunología de los mamíferos. El uso de ratones inmunodeprimidos para evaluar la inmunomodulación diana no es ideal ya que la función inmunitaria aberrante observada en tales ratones a menudo complica la comprensión de los fenotipos mostrados. Esto es especialmente cierto en el contexto de la respuesta inmunitaria a los tumores. Hasta hace poco, la investigación de las respuestas inmunitarias a los tumores (por ejemplo, las respuestas de células T) en ratones se confundió, entre otras cosas, por la discrepancia de HLA debido a diferentes fuentes (es decir, donantes) de células humanas implantadas (Shultz, L.D. y otros, 2010, Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. 107(29):13022-7).

Las células tumorales pueden escapar del reconocimiento inmunológico y la respuesta efectora al alterar las vías coestimuladoras en las células T. Las vías coestimuladoras median el equilibrio entre la activación de los linfocitos T, la tolerancia y el daño tisular mediado por el sistema inmunitario mediante la regulación de la magnitud y duración de una respuesta inmunitaria dentro del entorno de la estimulación antigénica. El gen 3 de activación linfocitaria (Lag-3) es un regulador negativo de la actividad de las células T y controla el tamaño del conjunto de células T de memoria (Workman, C.J. y otros, 2004, J. Immunol. 172:5450-5). Se ha informado del papel funcional del Lag-3 en las células T CD4+ y CD8+ con experiencia en antígenos, y la regulación positiva del Lag-3 en estas células después del acoplamiento del receptor de células T (TCR) conduce a efectos negativos en la proliferación, activación y producción de citocinas proinflamatorias de las células T (Huard, B. y otros, 1994, Eur. J. Immunol. 24(12):3216-21; Huard, B. y otros, 1994, Immunogenetics 39(3):213-7; Macon-Lemaitre, L. y F. Triebel, 2005, Immunol. 115:170-8; Goldberg, M.V. y C.G. Drake, 2011, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 344:269-78). Se ha informado que el bloqueo de Lag-3 mejora la respuesta antitumoral en las células T (Grosso, J.F. y otros, 2007, J. Clin. Invest. 117:3383-92). Otros receptores con actividad inhibidora implicados en la regulación negativa de la actividad de los linfocitos T incluyen la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1) y la proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4). Junto con sus ligandos, el Ligando 1 de Muerte Programada (PD-L1, B7-H1 o CD274) y PD-L2 (B7 o CD273), PD-1 proporciona una señal de punto de control crítica para el establecimiento y mantenimiento de la tolerancia inmunitaria al medio ambiente y a los autoantígenos (Francisco, L.M. y otros, 2010, Immunol. Rev. 236:219-42). Se ha informado que tanto PD-1, como Lag-3, desempeñan un papel en la evasión de la inmunidad antitumoral al permitir que las células tumorales escapen de la vigilancia inmunitaria por el sistema inmunitario del huésped (Zou, C. 2008, Nat. Rev. Immunol. 8:467-77).

La presente invención se basa, entre otras cosas, en el reconocimiento de que la expresión de estos receptores inhibidores se asocia con la función de células T específicas de antígeno comprometida en el contexto del cáncer. La presente invención se basa, además, en el reconocimiento de que la creación de un sistema in vivo que explota los puntos de control inmunitarios puede realizarse mediante el uso de un gen Lag-3 humanizado y/o un gen Pdcdl humanizado como se describe en la presente descripción. Tal sistema in vivo mejorado permite el desarrollo de agentes terapéuticos contra puntos de control inmunitarios y/o regímenes terapéuticos que se centran en estimular la inmunidad antitumoral en pacientes con cáncer. Además, tal sistema in vivo mejorado también proporciona el desarrollo de agentes terapéuticos y/o regímenes terapéuticos que se centran en aumentar la actividad de los linfocitos T en enfermedades infecciosas y/o autoinmunitarias.

Los roedores como se describe en la presente descripción proporcionan un sistema in vivo mejorado y una fuente de materiales biológicos (por ejemplo, células) que expresan Lag-3 humana (o humanizada) que son útiles para una variedad de ensayos. En varias modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción se usan para desarrollar agentes terapéuticos que se dirigen al Lag-3 y/o modulan la señalización de Lag-3 (por ejemplo, alterando las interacciones con los socios de unión al Lag-3, tales como las moléculas de del MHC clase II). En varias modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción se usan para seleccionar y desarrollar agentes terapéuticos candidatos (por ejemplo, anticuerpos) que bloquean la interacción del Lag-3 humano con moléculas del MHC de clase II humano. En varias modalidades, los roedores de la presente invención se usan para determinar el perfil de unión de antagonistas y/o agonistas de un polipéptido Lag-3 humanizado en la superficie de una célula de un roedor como se describe en la presente descripción; en algunas modalidades, los roedores de la presente invención se usan para determinar el epítopo o epítopos de uno o más anticuerpos terapéuticos candidatos que se unen al Lag-3 humano.

En varias modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción invención se usan para determinar los perfiles farmacocinéticos de los anticuerpos anti-Lag-3. En varias modalidades, uno o más roedores de la presente como se describe en la presente descripción y uno o más roedores control o de referencia se exponen cada uno a uno o más anticuerpos terapéuticos candidatos anti-Lag-3 a varias dosis (por ejemplo, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 7,5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg o 50 mg/kg o más). Los anticuerpos terapéuticos candidatos pueden dosificarse por medio de cualquier ruta de administración deseada que incluye las rutas de administración parenteral y no parenteral. Las rutas parenterales incluyen, por ejemplo, intravenosa, intraarterial, intraportal, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intraespinal, intratecal, intracerebroventricular, intracraneal, intrapleural u otras rutas de inyección. Las rutas no parenterales incluyen, por ejemplo, oral, nasal, transdérmica, pulmonar, rectal, bucal, vaginal, ocular. La administración puede ser, además, por infusión continua, administración local, liberación sostenida a partir de implantes (geles, membranas o similares), y/o inyección intravenosa. La sangre se aísla de los animales no humanos (humanizados y control) en varios puntos de tiempo (por ejemplo, 0 h, 6 h, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, o hasta 30 o más días). Varios ensayos pueden realizarse para determinar los perfiles farmacocinéticos de los anticuerpos terapéuticos candidatos administrados mediante el uso de muestras obtenidas a partir de animales no humanos como se describe en la presente descripción, que incluyen, pero no se limitan a, IgG total, respuesta contra el anticuerpo terapéutico, aglutinación, etc.

En varias modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción se usan para medir el efecto terapéutico de bloquear o modular la señalización de Lag-3 y el efecto sobre la expresión génica como resultado de cambios celulares. En varias modalidades, un roedor como se describe en la presente descripción o las células aisladas del mismo se exponen a un candidato terapéutico que se une a un polipéptido Lag-3 humanizado (o una porción humana de un polipéptido Lag-3) en la superficie de una célula del roedor y, después de un período posterior de tiempo, se analizan para determinar los efectos sobre los procesos dependientes de Lag-3, por ejemplo, adhesión, apoptosis, producción de citocinas, inflamación, proliferación, tolerancia a lo propio e infección viral (o respuestas).

Los roedores como se describe en la presente descripción expresan el polipéptido Lag-3 humanizado, por lo tanto, pueden generarse células, líneas celulares y cultivos celulares que sirven como fuente de Lag-3 humanizado para su uso en ensayos funcionales y de unión, por ejemplo, para el ensayo de la unión o función de un antagonista o agonista de Lag-3, particularmente cuando el antagonista o agonista es específico para una secuencia o epítopo de Lag-3 humano o, alternativamente, específico para una secuencia o epítopo de Lag-3 humano que se asocia con moléculas del MHC de clase II. En varias modalidades, los epítopos de Lag-3 unidos a los anticuerpos terapéuticos candidatos pueden determinarse mediante el uso de células aisladas de roedores como se describe en la presente descripción. En varias modalidades, un polipéptido Lag-3 humanizado expresado por un roedor como se describe en la presente descripción puede comprender una variante de secuencia de aminoácidos. En varias modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción expresan una variante del polipéptido Lag-3 humanizado. En varias modalidades, la variante es polimórfica en una posición de aminoácido asociada con la unión al ligando. En varias modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción se usan para determinar el efecto de la unión del ligando a través de la interacción con una variante polimórfica de Lag-3 humano.

Las células de los roedores como se describe en la presente descripción pueden aislarse y usarse sobre una base ad hoc, o pueden mantenerse en cultivo por muchas generaciones. En varias modalidades, las células de un roedor como se describe en la presente descripción se inmortalizan (por ejemplo, por medio del uso de un virus) y se mantienen en cultivo indefinidamente (por ejemplo, en cultivos en serie).

En varias modalidades, las células y/o roedores como se describe en la presente descripción se usan en varios regímenes de inmunización para determinar las funciones mediadas por Lag-3 en la respuesta inmunitaria a un antígeno. En algunas modalidades, los agentes terapéuticos candidatos que se unen, o bloquean una o más funciones de Lag-3 humano (o humanizado) se caracterizan en un roedor de la presente descripción. Las mediciones adecuadas incluyen varios ensayos celulares, ensayos de proliferación, análisis de inmunoglobulinas séricas (por ejemplo, titulación de anticuerpos), ensayos de citotoxicidad y ensayos de inmunoprecipitación (por ejemplo, caracterización de las interacciones ligando-receptor). En algunas modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción se usan para caracterizar las funciones mediadas por Lag-3 que regulan una respuesta inmunitaria a un antígeno. En algunas modalidades, el antígeno se asocia con una enfermedad, trastorno o afección autoinmunitaria. En algunas modalidades, el antígeno se asocia con una enfermedad, trastorno o afección inflamatoria. En algunas modalidades, el antígeno se asocia con el cáncer o una neoplasia (por ejemplo, HPV, HCV, HIV, EBV, HHV-8, HTLV-1, MCV, etc.). En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno de prueba (por ejemplo, ovoalbúmina u OVA). En algunas modalidades, el antígeno es una diana asociada con una enfermedad o afección que padecen uno o más pacientes humanos que necesitan tratamiento.

En varias modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción se usan en ensayos séricos para determinar los títulos de producción de autoanticuerpos para probar los aspectos fármaco-toxicológicos de los agentes terapéuticos candidatos que se dirigen al Lag-3 humano. En algunas modalidades, la producción de autoanticuerpos en roedores como se describe en la presente descripción es el resultado de una o más enfermedades, trastornos o afecciones autoinmunitarias inducidas en los roedores.

En varias modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción se usan para el desafío con uno o más antígenos para determinar el potencial terapéutico de los compuestos o agentes biológicos para modular la regulación dependiente de Lag-3 de una respuesta inmunitaria, que incluye, pero no se limita a las respuestas específicas dependiente de células T a un antígeno dado.

En varias modalidades, las células y/o roedores como se describe en la presente descripción se usan en un ensayo de supervivencia y/o proliferación (por ejemplo, empleando células T y/o B) para seleccionar y desarrollar agentes terapéuticos candidatos que modulan la señalización de Lag-3 humano. La activación o pérdida de Lag-3 juega un papel importante en la regulación de las respuestas de las células T, y la regulación de la tolerancia a lo propio por Lag-3 puede ser el resultado de la activación de epítopos específicos del dominio extracelular de Lag-3, por lo tanto, los moduladores del candidato Lag-3 (por ejemplo, antagonistas o agonistas) pueden identificarse, caracterizarse y desarrollarse mediante el uso de células de roedores como se describe en la presente descripción y/o un roedor como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades, las células y/o los roedores como se describe en la presente descripción se usan en ensayo(s) de supervivencia o muerte para determinar el efecto sobre la proliferación o la apoptosis de una célula o células específicas (por ejemplo, células cancerosas) en presencia y ausencia de Lag-3.

En varias modalidades, las células y/o roedores como se describe en la presente descripción se usan en xenotrasplantes de células o tejidos heterólogos (por ejemplo, humanos) para determinar las funciones mediadas por Lag-3 en la respuesta fisiológica (por ejemplo, inmunitaria) a las células o tejidos humanos trasplantados. En algunas modalidades, los agentes terapéuticos candidatos que se unen o bloquean una o más funciones de LAG-3 humano se caracterizan en un roedor como se describe en la presente descripción. Las mediciones adecuadas incluyen varios ensayos celulares, ensayos de proliferación, análisis de inmunoglobulinas séricas (por ejemplo, titulación de anticuerpos), ensayos de citotoxicidad, y caracterización de las interacciones ligando-receptor (ensayos de inmunoprecipitación). En algunas modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción se usan para caracterizar las funciones mediadas por Lag-3 que regulan una respuesta inmunitaria a un antígeno. En algunas modalidades, el antígeno se asocia con un neoplasma. En algunas modalidades, el antígeno se asocia con una enfermedad, trastorno o afección autoinmunitaria. En algunas modalidades, el antígeno se asocia con una enfermedad, trastorno o afección inflamatoria. En algunas modalidades, el antígeno se asocia con cáncer o con un neoplasma. En algunas modalidades, el antígeno es una diana asociada con una enfermedad o afección que padecen uno o más pacientes humanos que necesitan tratamiento.

En varias modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción se usan en trasplantes o experimentos de transferencia adoptiva para determinar el potencial terapéutico de compuestos o agentes biológicos para modular la regulación dependiente de Lag-3 de nuevos linfocitos y su función inmunitaria. En varias modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción se trasplantan con células T humanas; en algunas modalidades, células T sin tratamiento previo; en algunas modalidades, células T activadas; en algunas modalidades, células T reguladoras (Treg); en algunas modalidades, células T de memoria.

En varias modalidades, las células de roedores como se describe en la presente descripción se usan en ensayos de células T para determinar el potencial terapéutico de los compuestos o agentes biológicos para modular la regulación dependiente de Lag-3 de la respuesta y función dependiente de células T. Los ensayos ilustrativos de células T incluyen, pero no se limitan a, ELISpot, tinción de citocinas intracelulares, restricción del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), ensayos de supresión viral, ensayos de citotoxicidad, ensayos de proliferación y ensayos de supresión de células T reguladoras.

En varias modalidades, las células de roedores como se describe en la presente descripción se usan en ensayos de transmigración celular para seleccionar y desarrollar agentes terapéuticos candidatos que modulan el Lag-3 humano. La transmigración de células involucra la migración de células a través del endotelio y los ensayos de transmigración permiten la medición de interacciones con el endotelio, y la transmigración de este, por leucocitos o células tumorales.

En varias modalidades, las células de roedores como se describe en la presente descripción se usan en ensayos de crecimiento (o proliferación) de células tumorales para determinar el potencial terapéutico de compuestos o agentes biológicos para modular la regulación dependiente de Lag-3, apoptosis y/o inhibición de células tumorales.

En varias modalidades, las células de roedores como se describe en la presente descripción se usan en ensayos de producción de citocinas para determinar el potencial terapéutico de compuestos o agentes biológicos para modular la regulación dependiente de Lag-3 de la liberación de citocinas de las células T. En algunas modalidades, las células de roedores como se describe en la presente descripción se usan para la detección (y/o medición) de la liberación de citocinas intracelulares como resultado de la interacción de Lag-3 humanizado con un fármaco dirigido al LAG-3 humano o un ligando de unión de Lag-3 (por ejemplo, MHC de clase II).

En varias modalidades, se induce una enfermedad, trastorno o afección autoinmunitaria en uno o más roedores como se describe en la presente descripción para proporcionar un sistema in vivo para determinar el potencial terapéutico de compuestos o agentes biológicos para modular la regulación dependiente de Lag-3 de una o más funciones de la enfermedad, trastorno o afección autoinmunitaria. Las enfermedades, trastornos o afecciones autoinmunitarias pueden inducirse en uno o más roedores como se describe en la presente descripción seguido de la administración de uno o más compuestos o agentes biológicos según se desee.

Los roedores como se describe en la presente descripción proporcionan un sistema in vivo para el análisis y prueba de un fármaco o vacuna. En varias modalidades, un fármaco o vacuna candidato puede administrarse a uno o más roedores como se describe en la presente descripción, seguido de la monitorización de los animales no humanos para determinar una o más de la respuesta inmunitaria al fármaco o vacuna, el perfil de seguridad del medicamento o vacuna, o el efecto sobre una enfermedad o afección. En algunas modalidades, la vacuna tiene como diana un virus tal como, por ejemplo, el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) o el virus de la hepatitis (por ejemplo, HCV). Los métodos ilustrativos usados para determinar el perfil de seguridad incluyen mediciones de toxicidad, concentración de dosis óptima, eficacia del fármaco o vacuna, y posibles factores de riesgo. Tales fármacos o vacunas pueden mejorarse y/o desarrollarse en tales roedores.

Los roedores como se describe en la presente descripción proporcionan un sistema in vivo para evaluar las propiedades farmacocinéticas de un fármaco dirigido al LAG-3 humano. En varias modalidades, un fármaco dirigido al LAG-3 humano puede suministrarse o administrarse a uno o más roedores como se describe en la presente descripción, seguido de la monitorización de, o la realización de uno o más ensayos en, los roedores (o células aisladas a partir de estos), para determinar el efecto del fármaco sobre el roedor. Las propiedades farmacocinéticas incluyen, pero no se limitan a, la manera en que un animal procesa el fármaco hacia varios metabolitos (o detección de la presencia o ausencia de uno o más metabolitos del fármaco, que incluyen, metabolitos tóxicos), tiempo de vida media del fármaco, niveles circulantes del fármaco después de su administración (por ejemplo, concentración sérica del fármaco), respuesta contra el fármaco (por ejemplo, anticuerpos contra el fármaco), absorción y distribución del fármaco, vía de administración, vías de excreción y/o eliminación del fármaco. En algunas modalidades, las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de los fármacos (por ejemplo, moduladores de PD-1) se monitorean en o a través del uso de roedores como se describe en la presente descripción.

En algunas modalidades, la realización de un ensayo incluye determinar el efecto sobre el fenotipo y/o el genotipo del roedor al que se administra el fármaco. En algunas modalidades, la realización de un ensayo incluye determinar la variabilidad lote a lote de un modulador de Lag-3 (por ejemplo, un antagonista o un agonista). En algunas modalidades, la realización de un ensayo incluye determinar las diferencias entre los efectos de un fármaco dirigido a Lag-3 administrado a un roedor como se describe en la presente descripción y a un roedor de referencia. En varias modalidades, los roedores de referencia pueden tener una modificación como se describe en la presente descripción, una modificación que es diferente a como se describe en la presente descripción (por ejemplo, una que tiene una alteración, deleción o de cualquier otra manera un gen Lag-3 no funcional y/o un gen Pdcdl, o una humanización de un gen Pdcdl) o sin modificación (es decir, un roedor de tipo silvestre).

Los parámetros ilustrativos que pueden medirse en roedores (o en y/o mediante el uso de las células aisladas de los mismos) para evaluar las propiedades farmacocinéticas de un fármaco dirigido a LAG-3 humano incluyen, pero no se limitan a, aglutinación, autofagia, división celular, muerte celular, hemólisis mediada por complemento, integridad del ADN, título de anticuerpos específicos del fármaco, metabolismo del fármaco, matrices de expresión génica, actividad metabólica, actividad mitocondrial, estrés oxidativo, fagocitosis, biosíntesis de proteínas, degradación de proteínas, secreción de proteínas, respuesta al estrés, concentración del fármaco en el tejido diana, concentración de fármaco en tejido que no es diana, actividad transcripcional y similares. En varias modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción se usan para determinar una dosis farmacéuticamente efectiva de un modulador de Lag-3.

Los roedores como se describe en la presente descripción proporcionan un sistema in vivo mejorado para el desarrollo y caracterización de agentes terapéuticos candidatos para usar en cáncer. En varias modalidades, se puede implantar un tumor a los roedores como se describe en la presente descripción, seguido de la administración de uno o más agentes terapéuticos candidatos. En algunas modalidades, los agentes terapéuticos candidatos pueden incluir un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico) o un cóctel de anticuerpos; en algunas modalidades, los agentes terapéuticos candidatos incluyen una terapia combinada tal como, por ejemplo, la administración de anticuerpos monoespecíficos dosificados de manera secuencial o simultánea. El tumor puede dejarse durante el tiempo suficiente para su establecimiento en uno o más sitios dentro del roedor. La proliferación, crecimiento, supervivencia, etc., de las células tumorales puede medirse antes y después de la administración con el o los agentes terapéuticos candidatos. La citotoxicidad de los agentes terapéuticos candidatos puede medirse, además, en el roedor según convenga.

Los roedores, como se describe en la presente descripción, pueden usarse para desarrollar uno o más modelos de enfermedad para evaluar o evaluar agentes terapéuticos candidatos y/o regímenes terapéuticos (por ejemplo, monoterapia, terapia de combinación, pruebas de rango de dosis, etc.) para tratar eficazmente enfermedades, trastornos o afecciones que afectan humanos. Varias enfermedades pueden establecerse en los roedores como se describe en la presente descripción seguido de la administración de una o más moléculas candidatas (por ejemplo, fármacos dirigidos a Lag-3) de manera que pueda determinarse la eficacia de una o más moléculas candidatas en una enfermedad. En algunas modalidades, los modelos de enfermedad incluyen enfermedades, trastornos o afecciones autoinmunitarias, inflamatorios y/o neoplásicos.

Para dar solo un ejemplo, los roedores como se describe en la presente descripción proporcionan un modelo animal mejorado para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de un tumor o células tumorales. En varias modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción pueden implantarse con una o más células tumorales, seguido de la administración de uno o más agentes terapéuticos candidatos (por ejemplo, anticuerpos). En algunas modalidades, la administración de uno o más agentes terapéuticos candidatos se realiza subsecuentemente a (por ejemplo, minutos u horas, pero típicamente en el mismo día) la implantación de una o más células tumorales y uno o más agentes terapéuticos candidatos se evalúan en roedores como se describe en la presente descripción para determinar su eficacia en la prevención del establecimiento de un tumor sólido y/o el crecimiento de células tumorales en dichos roedores. En algunas modalidades, la administración de uno o más agentes terapéuticos candidatos se realiza subsecuentemente a (por ejemplo, días después) la implantación de una o más células tumorales y, en ciertas modalidades, después de un tiempo suficiente de manera que una o más células tumorales implantadas hayan alcanzado un tamaño predeterminado (por ejemplo, volumen) en roedores como se describe en la presente descripción; y se evalúa la eficacia de uno o más agentes terapéuticos candidatos en el tratamiento de uno o más tumores establecidos. Los roedores pueden colocarse en diferentes grupos de tratamiento de acuerdo con la dosis de manera que pueda determinarse una dosis o intervalo de dosis óptima que se correlacione con el tratamiento efectivo de un tumor establecido.

Los roedores como se describe en la presente descripción proporcionan un sistema in vivo para el desarrollo y/o caracterización de las terapias combinadas que incluyen fármacos dirigidos a Lag-3 y PD-1 para su uso en cáncer. En varias modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción pueden implantarse con una o más células tumorales, seguido de la administración de fármacos (por ejemplo, anticuerpos) dirigidos a LAG-3 humano y PD-1 humano. En algunas modalidades, la administración de fármacos dirigidos a la Lag-3 humano y a PD-1 humano se realiza subsecuentemente a (por ejemplo, minutos, horas o días después) la implantación de una o más células tumorales y la terapia de combinación se evalúa en animales no humanos como se describe en la presente descripción para la eficacia en la prevención del establecimiento de un tumor sólido y/o crecimiento de células tumorales en dichos roedores. En algunas modalidades, la administración de fármacos dirigidos a LAG-3 humano y PD-1 humano se realiza después de un tiempo suficiente de manera que una o más células tumorales implantadas han alcanzado un tamaño predeterminado (por ejemplo, volumen) en roedores como se describe en la presente descripción; y la terapia de combinación se evalúa para la eficacia en el tratamiento de uno o más tumores establecidos. Los roedores pueden colocarse en diferentes grupos de tratamiento (que incluyen los grupos de monoterapia) de manera que pueda determinarse un régimen de tratamiento óptimo que se correlacione con el tratamiento efectivo de un tumor establecido.

Varias enfermedades pueden establecerse en los roedores como se describe en la presente descripción seguido de la administración de una o más moléculas candidatas (por ejemplo, fármacos dirigidos a Lag-3) de manera que pueda determinarse la eficacia de una o más moléculas candidatas en una enfermedad. En algunas modalidades, los modelos de enfermedad incluyen enfermedades, trastornos o afecciones autoinmunitarias, inflamatorios y/o neoplásicos.

Las moléculas candidatas pueden administrarse a modelos de enfermedad en roedores mediante el uso de cualquier método de administración que incluye rutas de administración parenterales y no parenterales. Las rutas parenterales incluyen, por ejemplo, intravenosa, intraarterial, intraportal, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intraespinal, intratecal, intracerebroventricular, intracraneal, intrapleural u otras rutas de inyección. Las rutas no parenterales incluyen, por ejemplo, oral, nasal, transdérmica, pulmonar, rectal, bucal, vaginal, ocular. La administración puede ser, además, por infusión continua, administración local, liberación sostenida a partir de implantes (geles, membranas o similares), y/o inyección intravenosa. Cuando se evalúa una terapia de combinación en los roedores como se describe en la presente descripción, las moléculas candidatas pueden administrarse por medio de la misma ruta de administración o por medio de rutas de administración diferentes. Cuando se evalúa un régimen de dosificación en los roedores como se describe en la presente descripción, las moléculas candidatas pueden administrarse bimensualmente, mensualmente, trisemanalmente, bisemanalmente, semanalmente, diariamente, a intervalos variables y/o en concentraciones escalonadas para determinar un régimen de dosificación que demuestre un efecto terapéutico o profiláctico deseado en un roedor en el que se han establecido uno o más modelos de enfermedad.

Los roedores como se describe en la presente descripción proporcionan un sistema in vivo mejorado para el desarrollo y la caracterización de agentes terapéuticos candidatos para usar en enfermedades infecciosas. En varias modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción pueden infectarse mediante la inyección con un virus (por ejemplo, MHV, HIV, HCV, EBV, etc.) o patógeno (por ejemplo, bacterias), seguido de la administración de uno o más agentes terapéuticos candidatos. En algunas modalidades, los agentes terapéuticos candidatos pueden incluir un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico) o un cóctel de anticuerpos; en algunas modalidades, los agentes terapéuticos candidatos incluyen una terapia de combinación tal como, por ejemplo, la administración de anticuerpos monoespecíficos dosificados de manera secuencial o simultánea; en algunas modalidades, los agentes terapéuticos candidatos pueden incluir una vacuna. El virus o patógeno puede dejarse durante el tiempo suficiente para su establecimiento en uno o más sitios o células dentro del roedor de manera que se desarrollen uno o más síntomas asociados con la infección del virus o patógeno en el roedor. La proliferación y el crecimiento de células T puede medirse antes y después de la administración con el o los candidatos terapéuticos. Además, puede medirse la supervivencia, el análisis de citocinas séricas y/o intracelulares, la histopatología del hígado y/o el bazo en roedores infectados con el virus o patógeno. En algunas modalidades, los roedores como se describe en la presente descripción se usan para determinar la extensión del daño a los órganos asociados con la infección viral. En algunas modalidades, los animales no humanos como se describe en la presente descripción se usan para determinar el perfil de expresión de citocinas en varios órganos de los roedores infectados con un virus particular.

Los roedores como se describe en la presente descripción pueden emplearse para evaluar la eficacia de un fármaco terapéutico dirigido a células humanas. En varias modalidades, un roedor como se describe en la presente descripción se trasplanta con células humanas y se administra un fármaco candidato dirigido a tales células humanas a tal roedor. Después se determina la eficacia terapéutica del fármaco mediante la monitorización de las células humanas en el roedor después de la administración del fármaco. Los fármacos que pueden evaluarse en los roedores incluyen compuestos de molécula pequeña, es decir, compuestos de pesos moleculares menores que 1500 kD, 1200 kD, 1000 kD u 800 Daltons, y compuestos moleculares grandes (tales como proteínas, por ejemplo, anticuerpos), que tienen efectos terapéuticos previstos para el tratamiento de enfermedades y afecciones humanas al dirigirse a células humanas (por ejemplo, unión a ellas y/o acción sobre ellas).

En algunas modalidades, el fármaco es un fármaco contra el cáncer y las células humanas son células cancerosas que pueden ser células de un cáncer primario o células de líneas celulares establecidas a partir de un cáncer primario. En algunas modalidades, un roedor como se describe en la presente descripción se trasplanta con células cancerosas humanas, y se administra al roedor un fármaco contra el cáncer. La eficacia del fármaco puede determinarse al evaluar si el crecimiento o la metástasis de las células cancerosas humanas en el roedor se inhibe como resultado de la administración del fármaco.

En modalidades específicas, el fármaco contra el cáncer es una molécula de anticuerpo, que se une a un antígeno en células cancerosas humanas. En modalidades particulares, el fármaco contra el cáncer es un anticuerpo biespecífico que se une a un antígeno en células cancerosas humanas, y a un antígeno en otras células humanas, por ejemplo, células del sistema inmunológico humano (o "células inmunitarias humanas") tales como células T y B.

Kits

La presente invención proporciona además un paquete o kit que comprende uno o más contenedores llenos con al menos un roedor, y/o célula de roedor, el kit puede comprender además al menos un fragmento de ADN (o constructo) y/o vector de transformación como se describe en la presente descripción. Los kits pueden usarse en cualquier método aplicable (por ejemplo, un método de investigación). Opcionalmente, asociarse con tal(es) contenedor(es) puede ser un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, el aviso refleja (a) la aprobación por parte de la agencia de fabricación, uso o venta para administración humana, (b) instrucciones de uso, o ambos, o un contrato que rige la transferencia de materiales y/o productos biológicos (por ejemplo, un roedor o una célula de roedor como se describe en la presente descripción) entre dos o más entidades.

Otras características de la invención se harán evidentes en el curso de las siguientes descripciones de las modalidades ilustrativas que se proporcionan para ilustrar la invención y no pretenden ser limitantes de la misma.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir a los expertos en la técnica cómo hacer y usar los métodos y composiciones de la invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención. A menos que se indique de cualquier otra manera, la temperatura se indica en Celsius, y la presión es la atmosférica o cercana a ella.

Ejemplo 1. Humanización de un gen 3 de activación linfocitaria endógeno

Este ejemplo ilustra métodos ilustrativos de humanización de un gen 3 de activación linfocitaria (Lag-3) endógeno en un mamífero no humano tal como un roedor (por ejemplo, un ratón). Los métodos descritos en este ejemplo pueden emplearse para humanizar un gen Lag-3 endógeno de un animal no humano mediante el uso de cualquier secuencia humana, o combinación de secuencias humanas (o fragmentos de secuencias) según convenga. En este ejemplo, un fragmento de ADN sintético de 1741 pb que contiene los exones 2, 3 y 4 de un gen LAG-3 humano que aparece en el acceso de GenBank NM_002286.5 (SEQ ID NO: 9) se emplea para humanizar un gen Lag-3 endógeno de un ratón. La alineación de la proteína ilustrativa de ratón, humana y humanizada generada en la presente descripción, con la región humanizada subrayada, se representa en la Figura 2. La Figura 3 muestra un vector de transformación para la humanización del material genético que codifica los aminoácidos 21-260 de un polipéptido Lag-3 de roedor que se construyó mediante el uso de la tecnología VELOCIGENE® (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm.

6,586,251 y Valenzuela y otros, 2003, Nature Biotech. 21(6):652-659).

Brevemente, se modificó el clon bMQ-400O17 del cromosoma artificial bacteriano (BAC) de ratón (Invitrogen) para eliminar la secuencia que contiene los exones 2-4 (1750 pb) de un gen Lag-3 endógeno e insertar los exones 2, 3 y 4 de un LAG-3 humano mediante el uso de un fragmento de ADN sintético de 1741 pb, que codifica los aminoácidos 21 260 de un polipéptido LAG-3 humano. Se retuvo el ADN endógeno que contenía los exones 1, 5, 6, 7 y 8, así como también las regiones no traducidas (UTR) 5' y 3'. El análisis de la secuencia del fragmento de ADN sintético de 1741 pb (es decir, correspondiente a los exones 2-4 de un gen LAG-3 humano) confirmó todos los exones de LAG-3 humano y las señales de empalme. El análisis de la secuencia reveló que la secuencia coincidía con el genoma de referencia y el transcrito NM_002286.5 de LAG-3.

El fragmento de ADN sintético de 1741 pb fue sintetizado por Genescript Inc. (Piscataway, NJ) y clonado en un vector plásmido resistente a ampicilina. Se emplearon sitios únicos de reconocimiento de enzimas de restricción para ligar un casete de autodelección de neomicina de -4996 pb flanqueado por sitios de reconocimiento de la recombinasa (loxP-hUb1-em7-Neo-pA-mPrm1-Crei-/oxP; véanse las patentes de Estados Unidos núm. 8,697,851, 8,518,392 y 8,354,389). La selección posterior empleó neomicina. El vector de transformación se linealizó antes de la recombinación homóloga con el clon de BAC de ratón bMQ-400O17. Por diseño, la unión entre el fragmento LAG-3 humano de 1741 pb y el de ratón aguas abajo de 509 pb incluyó una porción del intrón 4 de un gen LAG-3 humano (Figura 3). El vector de transformación resultante contenía, de 5' a 3', un brazo de homología de 5' que contenía - 46 kb de ADN genómico de ratón del clon de BAC bMQ-400O17, un fragmento de ADN sintético de 1741 pb (correspondiente a los exones 2-4 y una porción del intrón 4 de un gen LAG-3 humano), un casete de autodelección de neomicina flanqueado por sitios /oxP y alrededor de - 53 kb de ADN genómico de ratón del clon bMQ-400O17 de BAC.

El clon BAC bMQ-400O17 modificado descrito anteriormente se usó para electroporar células madre embrionarias (ES) de ratón para crear células ES modificadas que comprenden un gen Lag-3 endógeno que se humaniza desde el exón 2 hasta el exón 4 que incluye una porción del intrón 4 (es decir, deleción de 1750 pb de un gen Lag-3 endógeno e inserción de 1741 pb de la secuencia de LAG-3 humana). Las células ES dirigidas positivamente que contienen un gen Lag-3 humanizado se identificaron mediante un ensayo (Valenzuela y otros, Supra) que detectó la presencia de las secuencias de LAG-3 humanas (por ejemplo, exones 2-4) y confirmó la pérdida y/o retención de secuencias de Lag-3 de ratón (por ejemplo, exones 2-4 y/o exones 1, 4, 5, 6, 7 y 8). La Tabla 1 expone los cebadores y sondas que se usaron para confirmar la humanización de un gen Lag-3 endógeno como se describió anteriormente (Figura 4).

La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción aguas arriba incluyó lo siguiente, que indica la secuencia endógena de ratón (contenida entre paréntesis más abajo) contigua a la secuencia genómica de LAG-3 humano en el punto de inserción: (CATGATGTTT CTTTCTTAGG AAAGCCAGGG CATTTCTCTA TTCTCCAATC TCTTGGCTCA ATGCCCTTGG CCTCTCTTTT GTTCCACTAG) TGAAGCCTCT CCAGCCAGGG GCTGAGGTC CCGGTGGTG TGGGCCCAG GAGGGGGCTC CTGCCCAGCT CCC (SEQ ID NO: 12) (Figura 9A).

La secuencia de nucleótidos a través del extremo 5' del casete de autodeleción de neomicina incluyó lo siguiente, que indica la secuencia genómica de LAG-3 humano contigua a la secuencia del casete (contenida entre paréntesis más abajo con un extremo compatible con SalI-XhoI en cursiva y una secuencia loxP en negrita) aguas abajo del punto de inserción: TTCACATTTG ACCACAACTC CTTCCTGCCC CCCTTGTCAC CTCCCCTAAC (GTCGAG ATAACTTCG TATAATGTAT GCTATACGAA GTTAT ATGCATGGCC TCCGCGCCGG GTTTTGGCGC CTCCCGCGGG CGCCCCCCTC CTCACGGCGA GCGCTGCCAC GTCAGACGAA GGGCGCAGCG AGCGTCCTGA) (SEQ ID NO: 13) (Figura 9B).

La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción aguas abajo en el extremo 3' del casete de autodeleción de neomicina incluyó lo siguiente, que indica la secuencia del casete (contenida dentro del paréntesis más abajo con un sitio loxP en negrita, un sitio de reconocimiento I-CeuI subrayado y un sitio de reconocimiento NheI en cursiva) contiguo con la secuencia genómica Lag-3 de ratón: (TTTCACTGCAT Tc TAGTTGTG GTTTGTCCAA ACTCATCAa T GTATCTTATC ATGTCTGGA ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTAT GCTAGTAACT ATAACGGTCC TAAGGTAGCG A GCTAGC) GACCCCCAAA ACTTTCTCAG CTGCGTGTGG TCTCACTCCA CATCACTTTG TTTCAGTGTC CAAACCATTT TCTCTCTGGG CATCTTTTAG(SEQ ID NO: 14) (Figura 9C).

La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción aguas arriba después de la deleción del casete de neomicina (77 pb restante en el intrón 4) incluyó lo siguiente, que indica la secuencia genómica de ratón y humana yuxtapuesta con la secuencia del casete restante de la secuencia loxP (contenida dentro de los paréntesis más abajo con un extremo compatible con SalI-XhoI en cursiva, un sitio loxP en negrita, un sitio de restricción I-CeuI subrayado y un sitio de restricción NheI en cursiva): ACGTCTCCAT CATGTATAAC CTCACTGTTC TGGGTÁACT CCCCCACTCT GCTTCACATT TGACCACAAC TCCTTCCTGC CCCCCTTGTC ACCTCCCCT AAC (GTCGAG ATAACTTCGTA TAATGTATGC TATACGAAGT TAT GCTAGTA ACTATAACGG TCCTAAGGTA GCGA GCTAGC) GACCCCCAAA ACTTTCTCAG CTGCGTGTGG TCTCACTCCA CATCACTTTG TTTCAGTGTC CAAACCATTT TCTCTCTGG GCATCTTTTA GCTGCTGTCTC (SEQ ID NO: 15) (Figura 9D).

Luego se usaron clones de células ES positivas para implantar ratones hembra mediante el uso del método VELOCIMOUSE® (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 7,294,754 y Poueymirou y otros, 2007, Nature Biotech. 25(1):91-99) para generar una camada de crías que contiene una inserción de los exones 2-4 de LAG-3 humano y parte del intrón 4 de LAG-3 humano en un gen Lag-3 endógeno de un ratón. Los ratones que portan la humanización de los exones 2-4 (es decir, el fragmento de ADN sintético de 1741 pb) de un gen Lag-3 endógeno se confirmaron e identificaron nuevamente mediante el genotipado del ADN aislado de cortes de cola mediante el uso de un ensayo como se describió anteriormente (Valenzuela y otros, supra) que detectó la presencia de las secuencias del gen LAG-3 humano (Figura 4). Las crías se genotipifican y las cohortes de animales heterocigotos para el constructo del gen Lag-3 humanizado se seleccionan para su caracterización.

TABLA 1

Nombre Cebador/Sonda Secuencia (5'-3')

Directo GAGGCTGCTGACGGTCAAG (SEQ ID NO: 16) 7184 mTU Sonda TTAGGCAGGTTAACTTTATCCTCAAAGCA (SEQ ID NO: 17) Inverso GCCACGAAGAAGATGCACTCAAG (SEQ ID NO: 18) Directo GTCCCGGGTCTCTTGGAGAT (SEQ ID NO: 19) 7184 mTD Sonda CCACCCATAAACATCCCCAGGTTTCA (SEQ ID NO: 20) Inverso CCGCTCATTCCAAGTCAGTTC (SEQ ID NO: 21) Directo CGGTTGGTGGTCAAGAGAAC (SEQ ID NO: 22) 7184 hTU Sonda CGGGCTTTCTCATCCTCAACGGG (SEQ ID NO: 23) Inverso GGCGGGAAAGAGAATGGAGTTG (SEQ ID NO: 24) (continuación)

Nombre Cebador/Sonda Secuencia (5'-3')

Directo AGCCCTGCTGTGTTGGGAAA (SEQ ID NO: 25) 7184 hTD Sonda TGTTTCCAGT GGGCTGAT GAAGTC (SEQ ID NO: 26)

Inverso TGGCAGTCACTGTGCAAG (SEQ ID NO: 27)

Ejemplo 2. Expresión de Lag-3 humanizada en células T activadas

Este Ejemplo demuestra que los animales no humanos (por ejemplo, roedores) modificados de manera que contengan un gen Lag-3 humanizado de acuerdo con el Ejemplo 1 expresan un polipéptido Lag-3 humanizado en la superficie de los linfocitos activados. En particular, las células T activadas de ratones de tipo silvestre y ratones homocigotos para Lag-3 humanizado (como se describió anteriormente) se tiñeron con anticuerpos anti-Lag-3 para determinar la expresión de LAG-3 en células T estimuladas con anticuerpos anti-CD3/anti-CD28. Además, la expresión de PD-1 y LAG-3 se examinó en células T de ratones Lag-3 humanizados que contenían además un gen Pdcdl (PD-1) humanizado (ratones Lag3xPD1 doblemente humanizados).

En primer lugar, se generaron células madre embrionarias (ES) de ratón Lag3xPD1 doblemente humanizadas mediante el uso del vector de transformación Lag-3 descrito anteriormente (véase el Ejemplo 1) en células ES de ratón Pdcd1 humanizadas (para ratones PD-1 humanizados y células madre embrionarias véase la solicitud de patente de los Estados Unidos con Número de Serie 14/744,592, presentada el 19 de junio de 2015 y publicada como US 2015 0366174 A1 (que incluye particularmente el Ejemplo 1), y la solicitud de patente Internacional núm. PCT/US15036649, presentada el 19 de junio de 2015 y publicada como WO2015196051). Las células ES de ratón doblemente humanizadas se crearon por electroporación del vector de transformación Lag-3 como se describió en el Ejemplo 1 en las células madre embrionarias de ratón C57BL/6N que contenían un gen Pdcd1 humanizado que codificaba un polipéptido PD-1 que tiene una porción humana y una porción de ratón, cuya porción humana incluía el dominio extracelular de un polipéptido PD-1 humano. Luego se usaron clones de células ES doblemente humanizadas para implantar ratones hembra mediante el uso del método VELOCIMOUSE® (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 7,294,754 y Poueymirou y otros, 2007, Nature Biotech. 25(1):91-99) para generar una camada de animales que contienen ambos genes humanizados (es decir, Lag-3 y Pdcdl). La colonia de ratón se amplió por cruce.

Brevemente, los bazos se recogieron y procesaron a partir de ratones Lag-3 humanizados de tipo silvestre fabricados de acuerdo con el Ejemplo 1, ratones PD-1 humanizados y ratones Lag3xPD1 doblemente humanizados (descritos anteriormente) en suspensiones de células individuales por disociación mecánica. Las células se lavaron en medio (RPMI suplementado con FBS al 10 %), se resuspendieron a 1x106/ml y se sembraron 200 ml (200 000 células) en placas de 96 pocillos. Las células en pocillos seleccionados se estimularon con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 (ambos a 1 mg/ml) durante 72 horas. Las células se tiñeron para FACS de acuerdo con las especificaciones del fabricante con anticuerpos que reconocen CD4 y CD8, BV421 (Brilliant Violet 421 TM)-anticuerpo conjugado a PD-1 humano (clon EH12.2H7, Biolegend), anticuerpo conjugado con BV421 contra PD-1 de ratón (clon J43, BD Biosciences), anticuerpo conjugado con aloficocianina contra LAG-3 humano (clon 3DS223H, eBioscience), anticuerpo conjugado con aloficocianina contra Lag-3 de ratón (clon C9B7W, Biolegend) o controles de isotipo correspondientes. Las células teñidas se analizaron en el citómetro de flujo LSRII y los datos se analizaron mediante el uso del software Flowjo. Las células T CD4+ se detectaron en el portal (CD19-CD4+) para la expresión de Lag-3 humana y de ratón. Los resultados representativos se muestran en la Figura 5.

Como se muestra en la Figura 5, las células T CD4+ activadas de ratón de tipo silvestre (Figura 5, columna izquierda) muestran una expresión sólida de PD-1 de ratón (parte inferior izquierda) y Lag-3 de ratón (2da desde la parte superior izquierda), pero una falta completa de expresión de PD-1 humano y LAG-3 humano. Esto demostró que los anticuerpos anti-PD-1 humano y anti-LAG-3 humano no reaccionan de forma cruzada con las proteínas PD-1 y Lag-3 de ratón, respectivamente. Los linfocitos T CD4+ activados a partir de ratones Lag-3 humanizados únicos expresan de manera detectable Lag-3 humanizado y PD-1 de ratón, pero no el Lag-3 de ratón y PD-1 humano (Figura 5, segunda columna de la izquierda). En consecuencia, las células T CD4+ activadas a partir de ratones Pdcdl humanizados únicos expresan PD-1 humanizada y Lag-3 de ratón, pero carecen de cualquier expresión de PD-1 de ratón y LAG-3 humano (Figura 5, tercera columna desde la izquierda). Los ratones Lag3xPD1 doblemente humanizados demostraron la expresión de las proteínas PD-1 y Lag-3 humanas, pero no de ratón, lo que confirmó que los polipéptidos PD-1 y Lag-3 de ratón de longitud completa no se producen en estos ratones.

Tomado en conjunto, este Ejemplo demuestra que los ratones que portan un gen Lag-3 humanizado como se describió en el Ejemplo 1 expresan un polipéptido Lag-3 que comprende una porción humana y una porción endógena de ratón, cuya porción humana se expresa de manera detectable mediante el reconocimiento por un anticuerpo que reconoce el polipéptido LAG-3 humano. Este Ejemplo también demuestra que los ratones Lag3xPD1 doblemente humanizados que expresan polipéptidos PD-1 humanizados y Lag-3 humanizados proporcionan un sistema in vivo para probar la eficacia de los anticuerpos anti-Lag-3 y/o anti-PDl.

Ejemplo 3. Eficacia in vivo de los moduladores de LAG-3 y PD-1

Este ejemplo demuestra que los animales no humanos (por ejemplo, roedores) modificados para contener un gen Lag-3 humanizado de acuerdo con el Ejemplo 1 pueden usarse en un ensayo in vivo para seleccionar moduladores de Lag-3 y PD-1 (por ejemplo, anticuerpos anti-Lag-3 y anti-PD-1) y determinan varias características tales como, por ejemplo, inhibición del crecimiento tumoral y/o destrucción de células tumorales. En este Ejemplo, los anticuerpos anti-Lag-3 y anti-PD-1 se criban en ratones homocigotos para la humanización de un gen Lag-3 endógeno como se describió en el Ejemplo 1 y homocigotos para la humanización de un gen Pdcdl endógeno para determinar la eficacia de la terapia mono y de combinación mediante el uso de anticuerpos anti-Lag-3 y anti-PDl.

MC38, una línea celular de adenocarcinoma de ratón, originada a partir de una cepa de ratón C57BL/6, se obtuvo del depósito del Instituto Nacional de Salud Nacional. La línea celular MC38 se modificó genéticamente mediante transducción lentiviral estable para expresar el antígeno de ovoalbúmina de pollo transmembrana (Ova) para aumentar la inmunogenicidad tumoral. Las líneas celulares se analizaron para detectar patógenos humanos y de roedor antes de implantarse en ratones. Las células se suspendieron en 100 ml de medio RPMI libre de suero y se implantaron por vía subcutánea en el flanco del ratón.

Brevemente, se examinó la eficacia in vivo de los anticuerpos anti-Lag-3 y anti-PD-1 solos y en combinación mediante el uso de MC38 implantados en ratones Lag3xPD1 doblemente humanizados. Los ratones se implantaron por vía subcutánea con células MC38.Ova en el día 0 y se aleatorizaron en cuatro grupos de tratamiento (n = 7-12 para cada grupo de tratamiento). Los ratones recibieron un anticuerpo control (n=7, 25 mg/kg), una combinación de anti-Lag-3 (n=12, 25 mg/kg), anti-PD-1 (n=12, 10 mg/kg) o anti-Lag-3 y anti-PD-1 (n=12, 25 mg/kg y 10 mg/kg, respectivamente) mediante inyección intraperitoneal los días 3, 7, 10, 14 y 17. Los volúmenes tumorales se controlaron mediante medición de calibre dos veces por semana durante el experimento (32 días) y los animales libres de tumor se controlaron para detectar la ausencia de recurrencia del tumor durante un máximo de 80 días. Los resultados representativos se muestran en la Figura 6.

Como se muestra en la Figura 6, la monoterapia anti-PD-1 dio como resultado la inhibición del crecimiento tumoral, con regresión tumoral en 2 de 12 (17 %) animales, mientras que la monoterapia con anti-Lag-3 no fue significativamente eficaz en este experimento. Se observó regresión tumoral en 1 de 12 ratones tratados con el anticuerpo anti-Lag-3. No hubo ratones libres de tumor en el día 32 para el grupo control. Por el contrario, la terapia combinada con anti-Lag-3 y anti-PD-1 demostró una inhibición sólida del crecimiento tumoral de MC38.Ova, lo que dio como resultado 5 de 12 ratones (42 %) libres de tumor al final del experimento (Figura 6). Ninguno de los ratones libres de tumor mostró recurrencia tumoral durante 80 días después de la implantación, lo que indicó efectos duraderos de la inmunoterapia combinada.

En un experimento separado, se inocularon ratones con Lag3xPD1 doblemente humanizados con células tumorales MC38.Ova por vía subcutánea el día 0. En el día 10 se seleccionaron ratones con un volumen tumoral promedio de 100 mm3 y se aleatorizaron en cuatro grupos de tratamiento. Los ratones recibieron el anticuerpo anti-Lag-3 (n=9, 25 mg/kg), el anticuerpo anti-PD-1 (n=10, 10 mg/kg), el anticuerpo anti-Lag-3 y la combinación de anticuerpos anti-PD-1 (n=11, 25 mg/kg y 10 mg/kg, respectivamente) o un anticuerpo control (n=7, 25 mg/kg) mediante inyección IP los días 10, 14, 17, 22. Los volúmenes tumorales se supervisaron durante 28 días después de la implantación del tumor.

Como se muestra en la Figura 7, el tratamiento de ratones humanizados portadores de tumor MC38.Ova (tumores establecidos) con una combinación de anticuerpos anti-hPD-1 y anti-hLAG-3 accionó la activación de células T intratumorales y periféricas. La combinación de los anticuerpos anti-hPD-1 y anti-hLAG-3 demostró una inhibición sólida del crecimiento tumoral de MC38.Ova. La terapia combinada en estos ratones también dio como resultado un aumento significativo de la supervivencia animal, así como también la duración de la supervivencia (datos no mostrados).

En conjunto, este Ejemplo demuestra que los animales no humanos descritos en la presente descripción pueden usarse para evaluar la eficacia in vivo de fármacos (por ejemplo, uno o más anticuerpos) dirigidos a Lag-3 y/o PD-1, y tales animales, son útiles para discriminar el efecto terapéutico y profiláctico de la monoterapia anti-Lag-3 y/o la terapia de combinación mediante el uso de anticuerpos anti-PD-1. Por otra parte, los animales no humanos descritos en la presente descripción pueden usarse para evaluar la medida en la que los fármacos dirigidos a Lag-3 o a PD-1 pueden inhibir el crecimiento tumoral y/o mediar la muerte de células tumorales.

Equivalentes

Habiendo descrito así varios aspectos de al menos una modalidad de esta invención, los expertos en la técnica deberán apreciar que a los expertos en la técnica se les ocurrirán fácilmente varias alteraciones, modificaciones y mejoras. Tales alteraciones, modificaciones y mejoras pretenden ser parte de esta descripción. En consecuencia, la descripción y los dibujos anteriores son solo a manera de ejemplo y la invención se describe en detalle en las reivindicaciones que siguen.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un roedor cuyo genoma comprende un gen Lag-3 humanizado en un locus Lag-3 endógeno, en donde dicho roedor expresa un polipéptido Lag-3 humanizado de dicho gen Lag-3 humanizado, cuyo polipéptido Lag-3 humanizado comprende: una porción extracelular que contiene los dos primeros dominios N-terminales similares a inmunoglobulina (Ig) de un polipéptido LAG-3 humano y los dos últimos dominios similares a Ig de un polipéptido Lag-3 endógeno; el dominio transmembrana del polipéptido Lag-3 endógeno; y el dominio intracelular del polipéptido Lag-3 endógeno; y en donde dicho roedor es un ratón o una rata.

2. Un roedor cuyo genoma comprende un gen Lag-3 humanizado en un locus Lag-3 endógeno, en donde dicho roedor expresa un polipéptido Lag-3 humanizado a partir de dicho gen Lag-3 humanizado, cuyo polipéptido Lag-3 humanizado comprende los dos primeros dominios N-terminales similares a Ig de un polipéptido lAG-3 humano; en donde el gen Lag-3 humanizado comprende los exones 1, 5, 6, 7 y 8 de Lag-3 endógeno; y en donde dicho roedor es un ratón o una rata.

3. El roedor de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde:

(a) el polipéptido Lag-3 humanizado comprende los aminoácidos 29-260 del polipéptido LAG-3 humano; y/o (b) el roedor expresa además un polipéptido PD-1 humanizado, cuyo polipéptido PD-1 humanizado comprende una porción extracelular de un polipéptido PD-1 humano y una porción intracelular de un polipéptido PD-1 endógeno, y opcionalmente

el polipéptido PD-1 humanizado comprende además una porción transmembrana del polipéptido PD-1 endógeno; y/o

el polipéptido PD-1 humanizado comprende los aminoácidos 35-145 de dicho polipéptido PD-1 humano.

4. El roedor de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el gen Lag-3 humanizado está unido operativamente a un promotor de Lag-3 de roedor, opcionalmente en donde:

el promotor de Lag-3 de roedor es un promotor de Lag-3 de roedor endógeno; y/o

el gen Lag-3 humanizado comprende los exones 2-4 de un gen LAG-3 humano.

5. El roedor de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el genoma del roedor comprende además un gen Pdcdl humanizado que está unido operativamente a un promotor de Pdcdl de roedor y codifica dicho polipéptido PD-1 humanizado, en donde opcionalmente:

(a) el promotor de Pdcdl de roedor es un promotor de Pdcdl de roedor endógeno; y/o

(b) el gen Pdcdl humanizado comprende los exones 1, 4 y 5 de Pdcdl endógeno y comprende el exón 3 de Pdcdl endógeno en su totalidad o en parte.

6. El roedor de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la porción humana del gen Pdcdl humanizado comprende el exón 2 de un gen PDCD1 humano, opcionalmente en donde el gen Pdcdl humanizado comprende además un exón 3 de PDCD1 humano en su totalidad o en parte.

7. Un polipéptido Lag-3 humanizado producido por un roedor de cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

8. Una célula o tejido aislado del roedor de cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

9. Una célula madre embrionaria (ES) de roedor cuyo genoma comprende un gen Lag-3 humanizado en un locus Lag-3 endógeno que codifica un polipéptido Lag-3 humanizado, cuyo polipéptido Lag-3 humanizado comprende: una porción extracelular que contiene los dos primeros dominios N-terminales similares a Ig de un polipéptido LAG-3 humano y los dos últimos dominios similares a Ig de un polipéptido Lag-3 endógeno; el dominio transmembrana del polipéptido Lag-3 endógeno; y el dominio intracelular del polipéptido Lag-3 de roedor endógeno; en donde el gen Lag-3 humanizado está unido operativamente a un promotor de Lag-3 de roedor, y en donde dicha célula ES de roedor es una célula ES de ratón o rata.

10. Una célula madre embrionaria (ES) de roedor cuyo genoma comprende un gen Lag-3 humanizado en un locus Lag-3 endógeno que codifica un polipéptido Lag-3 humanizado, cuyo polipéptido Lag-3 humanizado comprende: los dos primeros dominios N-terminales similares a inmunoglobulina de un polipéptido LAG-3 humano; en donde el gen Lag-3 humanizado comprende los exones 1,5, 6, 7 y 8 de Lag-3 endógeno; en donde el gen Lag-3 humanizado está unido operativamente a un promotor de Lag-3 de roedor; y en donde dicha célula ES de roedor es una célula ES de ratón o rata.

11. Un embrión de roedor generado a partir de la célula ES de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación

12. Un método para producir un roedor que comprende:

modificar el genoma de un roedor de manera que comprenda un gen Lag-3 humanizado en un locus Lag-3 endógeno cuyo gen humanizado está unido operativamente a un promotor de Lag-3 de roedor, para de esta manera producir dicho roedor, en donde dicho roedor expresa un polipéptido Lag-3 humanizado de dicho gen Lag-3 humanizado, cuyo polipéptido Lag-3 humanizado comprende: una porción extracelular que contiene los dos primeros dominios N-terminales similares a Ig de un polipéptido LAG-3 humano y los dos últimos dominios similares a Ig de un polipéptido Lag-3 endógeno; el dominio transmembrana del polipéptido Lag-3 endógeno; y el dominio intracelular del polipéptido Lag-3 endógeno; y en donde dicho roedor es un ratón o una rata.

13. Un método para producir un roedor que comprende:

modificar el genoma de un roedor de manera que comprenda un gen Lag-3 humanizado en un locus Lag-3 endógeno cuyo gen humanizado está unido operativamente a un promotor de Lag-3 de roedor, para de esta manera producir dicho roedor, en donde dicho roedor expresa un polipéptido Lag-3 humanizado de dicho gen Lag-3 humanizado, cuyo polipéptido Lag-3 humanizado comprende: los dos primeros dominios N-terminales similares a Ig de un polipéptido LAG-3 humano; y en donde el gen Lag-3 humanizado comprende los exones 1, 5, 6, 7 y 8 de Lag-3 endógeno; y en donde dicho roedor es un ratón o una rata.

14. El método de la reivindicación 12 o la reivindicación 13, en donde el promotor de Lag-3 de roedor es un promotor de Lag-3 endógeno de roedor.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en donde el método comprende:

a) integrar un fragmento genómico en un gen Lag-3 endógeno en una célula ES de roedor, dicho fragmento genómico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica los dos primeros dominios N-terminales similares a Ig de dicho polipéptido LAG-3 humano, para obtener de esta manera una célula madre embrionaria de roedor modificada genéticamente; y,

b) crear un roedor mediante el uso de la célula ES de roedor modificada genéticamente de (a).

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 12-15, en donde:

(a) el gen Lag-3 humanizado comprende los exones 2-4 de un gen LAG-3 humano; o el gen Lag-3 humanizado codifica al menos los aminoácidos 29-260 de dicho polipéptido LAG-3 humano; y/o

(b) el método comprende además modificar el genoma del roedor de manera que comprenda un gen Pdcdl humanizado que codifica un polipéptido PD-1 humanizado que comprende una porción extracelular de un polipéptido PD-1 humano y una porción intracelular de un polipéptido PD-1 endógeno.

17. Un método para evaluar la eficacia antitumoral o las propiedades farmacocinéticas de un fármaco dirigido a LAG-3 humano, el método comprende las etapas de:

administrar el fármaco a un roedor de cualquiera de las reivindicaciones 1-6; y

(a) el fármaco dirigido al LAG-3 humano es un anticuerpo anti-Lag-3; y/o