CN108366548B - 具有人源化淋巴细胞活化基因3的非人动物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了非人动物，以及用于制备和使用所述非人动物的方法和组合物，其中所述非人动物包含人源化的淋巴细胞活化基因3(Lag3)。在一些实施方案中，所述非人动物可以描述为具有对内源性Lag3基因座的遗传修饰，使得所述非人动物表达包含人部分和内源性部分(例如，非人部分)的Lag3多肽。

Description

具有人源化淋巴细胞活化基因3的非人动物
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2015年11月20日提交的美国临时申请No.62/258,181和2016年8月3日提交的美国临时申+请No.62/370,430的权益，这些临时申请的全部内容以引用方式并入本文。
序列表以引用方式并入
序列表为2016年10月18日创建的名称为34031_10212US01_SequenceListing.txt、大小为49KB的ASCII文本文件，其经由EFS-Web提交给美国专利及商标局，并且以引用方式并入本文。
背景技术
癌症在全球医疗行业仍然是巨大的挑战，部分是因为癌细胞具有逃避宿主免疫系统的能力。这种能力已被认为会导致抗肿瘤免疫的抑制和/或下调。对能够最佳地确定被设计为活化和/或促进抗肿瘤免疫的新癌症疗法和/或治疗方案的治疗潜力以及确定癌细胞如何为免疫细胞特别是T细胞提供抑制信号的机制的有用体内系统的开发仍然不足。此类系统提供用于评估促进体内抗肿瘤环境的候选药剂的治疗功效的测定源。
发明内容
本发明涵盖以下认知：对非人动物进行工程化改造，以允许改进的系统鉴定和开发可用于治疗癌症的新疗法和/或治疗方案是所期望的。本发明还涵盖以下认知：对非人动物进行工程化改造，以允许改进的体内系统鉴定和开发可用于治疗自体免疫(或炎性、或感染性)疾病、障碍或病症的新疗法是所期望的。本发明还涵盖以下认知：对非人动物进行工程化改造，以允许改进的体内系统鉴定和开发促进抗肿瘤免疫的新疗法是所期望的。另外，本发明还涵盖以下认知：具有人源化淋巴细胞活化基因3(Lag-3)和/或另外地表达、包含或产生人或人源化Lag-3多肽的非人动物，例如用于鉴定和开发上调抗肿瘤免疫的癌症疗法是所期望的。在一些实施方案中，本发明的非人动物提供用于鉴定和开发包括靶向Lag-3和/或程序性细胞死亡1(PD-1)的联合疗法的改进的体内系统。
在一些实施方案中，本发明提供具有包含工程化Lag-3基因的基因组的非人动物，其中工程化Lag-3基因包含来自两个不同物种(例如，人和非人)的遗传物质。在一些实施方案中，这种工程化Lag-3基因包含编码人LAG-3多肽的一个或多个免疫球蛋白样(Ig样)域的遗传物质。在一些实施方案中，遗传物质编码负责配体结合(例如，MHC II类结合)的人LAG-3多肽的Ig样域。因此，在一些实施方案中，如本文所述的非人动物的工程化Lag-3基因编码包含人和非人部分的Lag-3多肽，其中所述人和非人部分连接在一起并且形成功能性Lag-3多肽。在一些实施方案中，如本文所述的非人动物的工程化Lag-3基因编码包含人LAG-3多肽的前两个Ig样域(D1和D2)的全部或部分的Lag-3多肽。一般来讲，前两个Ig样域(D1和D2)包含在人LAG-3多肽的N-末端260个氨基酸内；在一些实施方案中，在人LAG-3多肽的氨基酸残基21-260、23-260或29-260内。另见例如图1至2。
在一些实施方案中，提供了表达Lag-3多肽的非人动物，其中Lag-3多肽包含人部分和内源性部分。
在一些实施方案中，提供了基因组包含人源化Lag-3基因(或基因座)的非人动物，所述人源化Lag-3基因(或基因座)包含内源性部分和人部分，其中所述内源性和人部分可操作地连接到非人Lag-3启动子。
在一些实施方案中，Lag-3多肽的内源性部分包含内源性Lag-3多肽的胞内部分。在一些实施方案中，Lag-3多肽的内源性部分包含内源性Lag-3多肽的胞内域。在某些实施方案中，Lag-3多肽的内源性部分还包含内源性Lag-3多肽的跨膜部分。在一些实施方案中，Lag-3多肽的内源性部分包含内源性Lag-3多肽的跨膜域。在一些实施方案中，Lag-3多肽的内源性部分还包含内源性Lag-3多肽的胞外部分，例如不包含前两个Ig样域、但包含后两个Ig样域(D3和D4)的内源性Lag-3多肽的胞外域的C-末端部分。在一些实施方案中，Lag-3多肽的内源性部分包含内源性Lag-3多肽的信号肽的氨基酸。例如，Lag-3多肽的内源性部分包含内源性Lag-3多肽的基本上信号肽。
在一些实施方案中，Lag-3多肽的内源性部分具有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的啮齿类动物Lag-3多肽中出现的对应氨基酸序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，Lag-3多肽的内源性部分具有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的啮齿类动物Lag-3多肽中出现的对应氨基酸序列基本上相同或相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，人源化Lag-3基因的内源性部分包含内源性非人Lag-3外显子1、5、6、7和8。在一些实施方案中，内源性非人Lag-3基因的外显子1、5、6、7和8与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的啮齿类动物Lag-3mRNA序列中出现的对应外显子1、5、6、7和8至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同。在一些实施方案中，内源性非人Lag-3基因的外显子1、5、6、7和8与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的啮齿类动物Lag-3mRNA序列中出现的对应外显子1、5、6、7和8基本上相同或相同。
在一些实施方案中，人源化Lag-3多肽的人部分(或人序列)包含负责配体结合(例如，MHC II类结合)的人LAG-3多肽的一个或多个Ig样域。在一些实施方案中，人源化Lag-3多肽的人部分包含人LAG-3多肽的前两个Ig样域(D1和D2)的全部或部分。在一些实施方案中，在人LAG-3多肽的氨基酸残基21-260、23-260或29-260内。在一些实施方案中，人源化Lag-3多肽的人部分包含人LAG-3多肽的氨基酸29-260(或23-260或21-260)。在一些实施方案中，Lag-3多肽的人部分(或人序列)包含与SEQ ID NO:6的人LAG-3多肽中出现的对应氨基酸序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，Lag-3多肽的人部分(或人序列)包含与SEQ ID NO:6的人LAG-3多肽中出现的对应氨基酸序列基本上相同或相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，人源化Lag-3基因的人部分(或人序列)编码人LAG-3多肽的至少氨基酸29-260(或23-260或21-260)。在一些实施方案中，人源化Lag-3基因的人部分(或人序列)包含人LAG-3基因的外显子2-4(或外显子2、3和4)。
在一些实施方案中，人LAG-3基因的外显子2-4与SEQ ID NO:5的人LAG-3mRNA序列中出现的对应外显子2-4至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同。在一些实施方案中，人LAG-3基因的外显子2-4与SEQ ID NO:5的人LAG-3mRNA序列中出现的对应外显子2-4基本上相同或相同。在一些实施方案中，人源化Lag-3基因的人部分包含为在本文所述的非人动物中表达而密码子优化的序列。
在一些实施方案中，包含人部分和内源性部分的Lag-3多肽由置于本文所述的内源性Lag-3基因座(或基因)的核酸序列编码。
在一些实施方案中，Lag-3多肽的内源性部分由内源性Lag-3外显子1、5、6、7和8编码。
在一些实施方案中，人源化Lag-3基因包含内源性非人Lag-3外显子1、人LAG-3外显子2-4和非人Lag-3外显子5-8，其中所述非人和人外显子可操作地彼此连接并且连接至内源性非人Lag-3启动子。在一些实施方案中，这种人源化Lag-3基因置于内源性Lag-3基因座。
在一些实施方案中，人源化Lag-3基因编码包含：与内源性非人Lag-3多肽的信号肽基本上相同的信号肽的人源化Lag-3多肽；包含人部分和非人部分的胞外域，其中所述人部分包含人LAG-3多肽的前两个Ig样域(例如，包含氨基酸26-290的序列)，非人部分包含内源性非人Lag-3多肽的后两个Ig样域；以及内源性非人Lag-3多肽的跨膜和胞内域。
在一些实施方案中，提供了本文所述的非人动物产生或表达的Lag-3多肽。在一些实施方案中，本文所述的非人动物产生或表达的Lag-3多肽在非人动物的细胞中使用非人信号肽的全部或部分(例如，嵌合信号肽)翻译。在一些实施方案中，本文所述的非人动物产生或表达的Lag-3多肽包含与SEQ ID NO:8的人源化Lag-3多肽中出现的氨基酸序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的非人动物产生或表达的Lag-3多肽包含SEQ ID NO:8的人源化Lag-3多肽中出现的氨基酸序列基本上相同或相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供了基因组包含本文所述的Lag-3基因(或基因座)的分离的非人细胞或组织。在一些实施方案中，细胞为淋巴细胞。在一些实施方案中，细胞选自B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞和T细胞。在一些实施方案中，组织选自脂肪、膀胱、大脑、乳房、骨髓、眼、心、肠、肾、肝、肺、淋巴结、肌肉、胰腺、血浆、血清、皮肤、脾、胃、胸腺、睾丸、卵子以及它们的组合。
在一些实施方案中，提供了从本文所述的分离的非人细胞制备、生成或产生的永生化细胞。
在一些实施方案中，提供了基因组包含本文所述的Lag-3基因(或基因座)的非人胚胎干(ES)细胞。在一些实施方案中，非人胚胎干细胞是啮齿类动物胚胎干细胞。在某些实施方案中，啮齿类动物胚胎干细胞是小鼠胚胎干细胞并且来自129品系、C57BL品系或它们的混合物。在某些实施方案中，啮齿类动物胚胎干细胞是小鼠胚胎干细胞并且是129和C57BL品系的混合物。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15中的任一者的本文所述的非人ES细胞。
在一些实施方案中，提供了本文所述的非人胚胎干细胞用于制备非人动物的用途。在某些实施方案中，非人胚胎干细胞是小鼠胚胎干细胞并且用于制备包含本文所述的人源化Lag-3基因(或基因座)的小鼠。在某些实施方案中，非人胚胎干细胞是大鼠胚胎干细胞并且用于制备包含本文所述的人源化Lag-3基因(或基因座)的大鼠。
在一些实施方案中，提供了包含本文所述的非人胚胎干细胞、由其制备、由其获得或由其产生的非人胚胎。在某些实施方案中，非人胚胎为啮齿类动物胚胎；在一些实施方案中，为小鼠胚胎；在一些实施方案中，为大鼠胚胎。
在一些实施方案中，提供了本文描述的非人胚胎用于制备非人动物的用途。在某些实施方案中，非人胚胎是小鼠胚胎并且用于制备包含本文所述的人源化Lag-3基因(或基因座)的小鼠。在某些实施方案中，非人胚胎是大鼠胚胎并且用于制备包含本文所述的人源化Lag-3基因(或基因座)的大鼠。
在一些实施方案中，提供了包含本文所述的分离的非人细胞或组织、本文所述的永生化细胞、本文所述的非人胚胎干细胞、本文所述的非人胚胎或本文所述的非人动物的试剂盒。
在一些实施方案中，提供了用于制造和/或开发用于治疗或诊断的药物(例如，抗体或其抗原结合片段)的本文所述的试剂盒。
在一些实施方案中，提供了用于制造和/或开发用于治疗、预防或改善疾病、障碍或病症的药物(例如，抗体或其抗原结合片段)的本文所述的试剂盒。
在一些实施方案中，提供了本文所述的转基因、核酸构建体、DNA构建体或靶向载体。在某些实施方案中，转基因、核酸构建体、DNA构建体或靶向载体包含本文所述的Lag-3基因(或基因座)的全部或部分。在某些实施方案中，转基因、核酸构建体、DNA构建体或靶向载体包含含有本文所述的Lag-3基因(或基因座)的全部或部分的DNA片段。在某些实施方案中，转基因、核酸构建体、DNA构建体或靶向载体包含含有SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15中的任一者的Lag-3基因(或基因座)。在某些实施方案中，转基因、核酸构建体、DNA构建体或靶向载体还包含一个或多个选择性标记。在某些实施方案中，转基因、核酸构建体、DNA构建体或靶向载体还包含一个或多个位点特异性重组位点(例如，loxP、Frt或它们的组合)。在某些实施方案中，转基因、核酸构建体、DNA构建体或靶向载体如图3所示。
在一些实施方案中，提供了本文所述的转基因、核酸构建体、DNA构建体或靶向载体用于制备非人胚胎干细胞、非人细胞、非人胚胎和/或非人动物的用途。
在一些实施方案中，提供了制备从内源性Lag-3基因表达Lag-3多肽的非人动物的方法，其中所述Lag-3多肽包含人序列，所述方法包括(a)将基因组片段置于非人胚胎干细胞中的内源性Lag-3基因中，所述基因组片段包含编码人Lag-3多肽的全部或部分的核苷酸序列；(b)获得(a)中产生的非人胚胎干细胞；以及(c)使用(b)的非人胚胎干细胞形成非人动物。
在制备从内源性Lag-3基因表达Lag-3多肽的非人动物的方法的一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：将基因组片段置于(a)的非人胚胎干细胞的内源性Pdcd1基因中，所述基因组片段包含编码人PD-1多肽的全部或部分的核苷酸序列。在制备从内源性Lag-3基因表达Lag-3多肽的非人动物的方法的一些实施方案中，在将包含编码人Lag-3多肽的全部或部分的核苷酸序列的基因组片段置于内源性Lag-3基因中之前、同时或之后，将包含编码人PD-1多肽的全部或部分的核苷酸序列的基因组片段置于(a)的非人胚胎干细胞的内源性Pdcd1基因中。在制备从内源性Lag-3基因表达Lag-3多肽的非人动物的方法的一些实施方案中，所述方法还包括使(c)的非人动物与第二非人动物交配，所述第二非人动物具有包含编码包含人部分和内源性部分的PD-1多肽的Pdcd1基因的基因组。
在一些实施方案中，核苷酸序列包含人Lag-3外显子2-4。在一些实施方案中，核苷酸序列编码人LAG-3多肽的至少氨基酸29-260(或23-260或21-260)。在一些实施方案中，核苷酸序列包含一个或多个选择性标记。在一些实施方案中，核苷酸序列包含一个或多个位点特异性重组位点。
在一些实施方案中，提供了制备基因组包含编码具有人部分和内源性部分的Lag-3多肽的Lag-3基因的非人动物的方法，所述方法包括修饰非人动物的基因组以使其包含编码具有人部分和内源性部分的Lag-3多肽的Lag-3基因，所述部分可操作地连接到非人Lag-3启动子，从而制备所述非人动物。
在制备基因组包含编码具有人部分和内源性部分的Lag-3多肽的Lag-3基因的非人动物的方法的一些实施方案中，Lag-3基因被修饰为包含人LAG-3基因的外显子2-4(或外显子2、3和4)。在制备基因组包含编码具有人部分和内源性部分的Lag-3多肽的Lag-3基因的非人动物的方法的一些实施方案中，Lag-3基因被修饰为编码人LAG-3多肽的至少氨基酸29-260(或23-260或21-260)。
在制备基因组包含编码具有人部分和内源性部分的Lag-3多肽的Lag-3基因的非人动物的方法的一些实施方案中，所述方法还包括修饰非人动物的基因组以使其包含编码包含人部分和内源性部分的PD-1多肽的Pdcd1基因。在制备基因组包含编码具有人部分和内源性部分的Lag-3多肽的Lag-3基因的非人动物的方法的一些实施方案中，在修饰非人动物的基因组以使其包含编码具有人部分和内源性部分的Lag-3多肽的Lag-3基因之前、同时或之后，进行非人动物的基因组的修饰以使其包含编码包含人部分和内源性部分的PD-1多肽的Pdcd1基因。在制备基因组包含编码具有人部分和内源性部分的Lag-3多肽的Lag-3基因的非人动物的方法的一些实施方案中，所述方法还包括使基因组包含编码具有人部分和内源性部分的Lag-3多肽的Lag-3基因的非人动物与第二非人动物交配，所述第二非人动物具有包含编码包含人部分和内源性部分的PD-1多肽的Pdcd1基因的基因组。
在一些实施方案中，提供了通过本文所述的方法中的任一种获得(由其制备、由其获得或由其产生)的非人动物。
在一些实施方案中，提供了评估靶向人LAG-3的药物的抗肿瘤功效的方法，所述方法包括以下步骤：将药物施用于本文所述的非人动物，以及进行测定以确定靶向人LAG-3的药物的一个或多个抗肿瘤性质。
在一些实施方案中，提供了评估靶向人LAG-3的药物的药代动力学性质的方法，所述方法包括以下步骤：将药物施用于本文所述的非人动物，以及进行测定以确定靶向人LAG-3的药物的一个或多个药代动力学性质。
在一些实施方案中，靶向人LAG-3的药物是Lag-3拮抗剂。在一些实施方案中，靶向人LAG-3的药物是Lag-3激动剂。在一些实施方案中，靶向人LAG-3的药物是抗Lag-3抗体。
在一些实施方案中，将靶向人LAG-3的药物经静脉内、腹膜内或皮下施用于本文所述的非人动物。
在一些实施方案中，提供了基因组包含Lag-3基因的非人动物，所述Lag-3基因包括包含内源性Lag-3外显子1、5、6、7和8的内源性部分；和包含人LAG-3基因的外显子2-4(或外显子2、3和4)的人部分；其中内源性和人部分可操作地连接到内源性非人Lag-3启动子，并且其中非人动物表达包含人LAG-3多肽的氨基酸29-260(或23-260或21-260)的Lag-3多肽。
在一些实施方案中，提供了非人动物肿瘤模型，所述非人动物表达本文所述的Lag-3和/或PD-1多肽。
在一些实施方案中，提供了非人动物肿瘤模型，所述非人动物具有包含本文所述的Lag-3和/或Pdcd1基因的基因组。
在一些实施方案中，提供了通过以下方式获得的非人动物肿瘤模型(a)提供基因组包含本文所述的Lag-3和/或Pdcd1基因的非人动物；以及(b)将一种或多种肿瘤细胞植入(a)的非人动物；从而提供所述非人动物肿瘤模型。
在一些实施方案中，提供了用于制造和/或开发用于治疗或诊断的药物的本文所述的非人动物或细胞。
在一些实施方案中，提供了用于制造用于治疗、预防或改善疾病、障碍或病症的药剂的本文所述的非人动物或细胞。
在一些实施方案中，提供了本文所述的非人动物或细胞用于制造和/或开发用于医学(诸如用作药剂)的药物或疫苗的用途。
在一些实施方案中，提供了本文所述的非人动物或细胞用于制造用于治疗疾病、障碍或病症的药剂的用途。
在一些实施方案中，提供了本文所述的非人动物或细胞用于制造和/或开发结合免疫检查点分子的抗体的用途。
在一些实施方案中，本文所述的疾病、障碍或病症是癌症或赘生物。在一些实施方案中，本文所述的疾病、障碍或病症是自体免疫(或炎性)疾病、障碍或病症。在一些实施方案中，本文所述的疾病、障碍或病症是感染性疾病、障碍或病症。
在多个实施方案中，非人Lag-3启动子是或包含内源性非人Lag-3启动子。
在多个实施方案中，本文所述的Lag-3或Pdcd1基因的人部分(或人序列、或核苷酸序列)是或包含为在本文所述的非人动物(或非人细胞或组织)中表达而密码子优化的序列。
在多个实施方案中，本文所述的非人动物(或非人细胞或组织、或非人胚胎干细胞、或非人胚胎)还表达人源化PD-1多肽，所述人源化PD-1多肽包含人部分和内源性部分。在一些实施方案中，PD-1多肽的人部分包含人PD-1多肽的基本上胞外域；在具体实施方案中，人部分包含人PD-1多肽的氨基酸21-170、26-169、27-169、27-145或35-145。在一些实施方案中，PD-1多肽的内源性部分包含内源性PD-1多肽的胞内部分和/或跨膜部分；在一些实施方案中，PD-1多肽的内源性部分包含内源性PD-1多肽的胞内域，在某些实施方案中，PD-1多肽的内源性部分还包含内源性PD-1多肽的基本上跨膜域。
在多个实施方案中，本文所述的非人动物(或非人细胞或组织、或非人胚胎干细胞、或非人胚胎)的基因组还包含含有内源性部分和人部分的Pdcd1基因，其中内源性和人部分可操作地连接到非人Pdcd1启动子。在一些实施方案中，Pdcd1基因的内源性部分包含内源性Pdcd1外显子1、4和5。在一些实施方案中，Pdcd1基因的内源性部分还包含内源性Pdcd1外显子3的全部或部分，例如编码作为内源性PD-1多肽的跨膜域的一部分的氨基酸的内源性外显子3的3’部分。在一些实施方案中，Pdcd1基因的人部分编码人PD-1多肽的氨基酸35-145、27-145、27-169、26-169或21-170。在一些实施方案中，Pdcd1基因的人部分包含人PDCD1基因的外显子2；在某些实施方案中，还包含人PDCD1外显子3的全部或部分，例如编码作为人PD-1多肽的胞外域的一部分的氨基酸的人外显子3的5'部分。在具体实施方案中，非人动物中的人源化Pdcd1基因包含非人动物的内源性Pdcd1基因的外显子1，人PDCD1基因的外显子2和外显子3的一部分(例如，编码作为胞外域的一部分的氨基酸的外显子3的5'部分)，然后是内源性非人Pdcd1基因的外显子3的一部分(例如，编码作为跨膜域的一部分的氨基酸的外显子3的3'部分)和外显子4-5。
在多个实施方案中，非人Pdcd1启动子是或包含内源性非人Pdcd1启动子。
在多个实施方案中，Lag-3基因的人部分编码人LAG-3多肽的免疫球蛋白样(Ig样)域1(D1)和免疫球蛋白样域2(D2)的氨基酸序列，或编码负责结合MHC II的人LAG-3多肽的氨基酸序列。
在多个实施方案中，Lag-3多肽的人部分包含人LAG-3多肽的免疫球蛋白样(Ig样)域1(D1)和免疫球蛋白样域2(D2)的氨基酸序列，或包含负责结合MHC II的人LAG-3多肽的氨基酸序列。
在多个实施方案中，本文所述的非人动物是啮齿类动物；在一些实施方案中，小鼠；在一些实施方案中，大鼠。在一些实施方案中，本文所述的小鼠选自129品系、BALB/C品系、C57BL/6品系和混合的129xC57BL/6品系；在某些实施方案中，C57BL/6品系。
如本申请中所用，术语"约"和"大约"可等同使用。本申请中与或不与约/大约一起使用的任何数字意在涵盖由相关领域普通技术人员所理解的任何正常波动。
附图说明
本文中包括的由以下各图组成的附图仅用于举例说明目的而非用于限制。
图1示出了非人(例如，小鼠)和人淋巴细胞活化基因3(Lag-3)的基因组组织的示意图(未按比例绘制)。外显子的编号在每个外显子上面或下面。还指出了每个基因的非翻译区(空心方框)。免疫球蛋白样域以斜纹方框表示，上面的符号缩写“Ig”表示编码外显子(未按比例绘制)。
图2示出了人LAG-3(hLAG3)(SEQ ID NO:6)、小鼠Lag-3(mLag3)(SEQ ID NO:4)和人源化Lag-3(HumLAG3)(SEQ ID NO:8)的代表性氨基酸序列的比对。星号表示免疫球蛋白样(Ig样)域，下划线文本表示由插入的人LAG-3外显子(即，外显子2、3和4)编码的氨基酸。Ig样域1(D1)和2(D2)被以序列下面的正斜线表示的单个氨基分隔开。
图3示出了用于非人淋巴细胞活化基因3(Lag-3)的人源化的示例性方法的示意图(未按比例绘制)。所选的核苷酸连接位置在每个连接下面以横线标记，并且由SEQ ID NO指出每个连接。
图4示出了小鼠和人淋巴细胞活化基因3(Lag-3)的基因组组织的示意图(未按比例绘制)，指出了实施例1中描述的测定中所用的探针的大致位置。
图5示出了用人LAG-3、人PD-1、小鼠Lag-3和小鼠PD-1的抗体染色或用相应的同种型对照抗体染色的野生型C57BL/6(野生型)、纯合人源化Lag-3(HumLAG-3)、纯合人源化PD-1(HumPD-1)和纯合双重人源化Lag-3xPD-1(HumPD-1xLAG-3)小鼠的活化脾细胞的代表性直方图。阳性染色以填充曲线表示，而用同种型对照抗体染色以未填充曲线表示。所有染色图谱代表在CD4+门控内的细胞。对于每个直方图，指出了CD4+ T细胞上染色的抗体的中等荧光强度(MFI)(顶部行：人LAG-3表达；第2行：小鼠Lag-3表达；第3行：人PD-1表达；底部行：小鼠PD-1表达)。小鼠的基因型在每列的顶部指出。对于人源化PD-1小鼠，参见2015年6月19日提交的美国专利申请序列号14/744,592和2015年6月19日提交的国际专利申请No.PCT/US15/036649；这两个专利申请以引用方式并入本文。
图6示出了在双重人源化Lag-3/PD-1小鼠的多个治疗组中35天的代表性平均肿瘤体积(mm3±SEM)(对照，圆形：对小鼠或人LAG-3或者小鼠或人PD-1无特异性的人同种型对照抗体；抗LAG3，菱形：抗人LAG-3抗体；抗PD1，六边形：抗人PD-1抗体)。箭头指示抗体治疗的天数。
图7示出了在评估单独的抗LAG3抗体和与针对建立的MC38肿瘤的抗人PD-1抗体组合的功效的实验中，在肿瘤移植后的多个时间点的双重人源化Lag-3/PD-1小鼠的多个治疗组中的平均肿瘤体积(mm3±SEM)(对照，圆形：对小鼠或人LAG-3或者小鼠或人PD-1无特异性的人同种型对照抗体；抗LAG3，菱形：抗人LAG-3抗体；抗PD1，六边形：抗人PD-1抗体；抗LAG3+抗PD-1，三角形：抗人LAG-3抗体和抗人PD-1抗体的组合)。治疗天数以箭头表示。
图8示出了示例性啮齿类动物(例如，大鼠和小鼠)、人和人源化淋巴细胞活化基因3(Lag-3)序列，以及用于非人Lag-3基因的人源化的示例性合成DNA片段。对于mRNA序列，加粗字体表示编码序列，并且连续外显子(在标示的情况下)被交替的下划线文本分隔开；对于人源化mRNA序列，人序列包含于括号内。对于氨基酸序列，跨膜序列以下划线字体表示；对于人源化氨基酸序列，人序列以加粗字体表示，并且包含于括号内。
图9A-9D示出了某些示例性人源化Lag-3基因座中的连接序列。图9A示出了整个上游插入点的核苷酸序列(SEQ ID NO:12)，其指出了与插入点处的人LAG-3基因组序列邻接的内源性小鼠序列(包含在下面的括号内)。图9B示出了整个自缺失新霉素盒的5’末端的核苷酸序列(SEQ ID NO:13)，其指出了与插入点下游的盒序列(包含在下面的括号内，其中SalI-XhoI相容性末端以斜体表示并且loxP序列以加粗字体表示)邻接的人LAG-3基因组序列。图9C示出了整个自缺失新霉素盒的3'末端的下游插入点的核苷酸序列(SEQ ID NO:14)，其指出了与小鼠Lag-3基因组序列邻接的盒序列(包含在下面的括号内，其中loxP位点加粗表示，I-CeuI识别位点以下划线表示，NheI识别位点以斜体表示)。图9D示出了新霉素盒缺失(内含子4中的其余77bp)后整个上游插入点的核苷酸序列(SEQ ID NO:15)，其指出了与其余的盒序列loxP序列(包含在下面的括号内，其中SalI-XhoI相容性末端以斜体表示，loxP位点加粗表示，I-CeuI限制性位点以下划线表示，NheI限制性位点以斜体表示)并置的小鼠和人基因组序列。
定义
本发明不限于本文中描述的特定方法和实验条件，因为此类方法和条件可以变化。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而无意进行限制，因为本发明的范围仅由权利要求限定。
除非另有定义，否则本文中使用的所有术语和短语包括所述术语和短语在本领域中已获得的含义，除非明确地指出相反或根据其中使用所述术语或短语的上下文明显相反。尽管与本文中描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试，但现在描述具体的方法和材料。本文提及的所有专利和非专利出版物据此以引用方式并入。
大约：本文应用于一个或多个所关注的值，包括与所述参考值类似的值。在某些实施方案中，除非另外指明或者与上下文明显冲突，否则术语“大约”或“约”包括在任一方向(大于或小于)上落入所述参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小之内的值的范围(这样的数字将超过可能值的100％的情况除外)。
生物学活性：如本文所用，包括在生物系统的体外或体内(例如，在生物体中)具有活性的任何药剂的特性。例如，当存在于生物体中时在生物体内具有生物效应的药剂被认为具有生物活性。在特定实施方案，当蛋白质或多肽具有生物活性时，所述该蛋白质或多肽的共享所述蛋白质或多肽的至少一种生物活性的部分通常被称为“生物活性”部分。
可比较的：如本文所用，包括两种或更多种药剂、实体、情形、条件组等，它们可彼此不相同但充分相似以允许它们之间进行比较，以使得可基于观察到的差异或相似性合理地得出结论。本领域普通技术人员在上下文中将理解，在任何给定的情况下，对于两种或更多种这样的药剂、实体、情形、条件组等需要多大程度的同一性来被认为是可比较的。
保守：本文用于描述保守氨基酸置换，包括氨基酸残基被具有化学性质(例如，电荷或疏水性)类似的侧链R基的另一个氨基酸残基置换。一般来讲，保守氨基酸置换基本上不会改变蛋白质的所关注的功能性质，例如，受体结合配体的能力。具有带相似化学性质的侧链的氨基酸的组的实例包括：脂族侧链诸如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；脂族-羟基侧链诸如丝氨酸和苏氨酸；含酰胺侧链诸如天冬酰胺和谷氨酰胺；芳族侧链诸如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；碱性侧链诸如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；酸性侧链诸如天冬氨酸和谷氨酸；和含硫侧链诸如半胱氨酸和甲硫氨酸。保守氨基酸置换组包括例如缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸、赖氨酸/精氨酸、丙氨酸/缬氨酸、谷氨酸/天冬氨酸以及天冬酰胺/谷氨酰胺。在一些实施方案中，保守氨基酸置换可为丙氨酸对蛋白质中的任何天然残基的置换，如例如丙氨酸扫描诱变中所使用的。在一些实施方案中，进行保守置换以使得在Gonnet等人(1992)Exhaustive Matching of the Entire Protein SequenceDatabase,Science 256:1443-45(以引用方式并入)中公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值。在一些实施方案中，如果置换在PAM250对数似然矩阵中具有非负值，则该置换被认为是"适度保守的"。
对照：如本文所用，包括在本领域中所理解的“对照”的含义，所述对照是比较结果所参照的标准。通常，对照通过分离变量以得出有关此类变量的结论而用于增进实验完整性。在一些实施方案中，对照是与测试反应或测定同时进行以提供对比物的反应或测定。如本文所用，“对照”可包括“对照动物”。“对照动物”可具有如本文所述的修饰，与本文所述的修饰不同的修饰或不具有修饰(即，野生型动物)。在一个实验中，应用"测试"(即，测试的变量)。在第二实验中，“对照”(即，被测试的变量)不适用。在一些实施方案中，对照是历史对照(即，此前进行的测试或测定，或此前已知的量或结果)。在一些实施方案中，对照是或包括印刷或以其他方式保存的记录。对照可为阳性对照或阴性对照。
断裂：如本文所用，包括与DNA分子(例如，与内源性同源序列诸如基因或基因座)的同源重组事件的结果。在一些实施方案中，破坏可实现或代表插入、缺失、取代、替换、错义突变或DNA序列移码或它们的组合。插入可包括插入整个基因或基因片段，例如外显子，其可来源于除内源性序列之外的其他来源(例如异源序列)。在一些实施方案中，破坏可提高基因或基因产物的(例如由基因编码的蛋白质的)表达和/或活性。在一些实施方案中，破坏可降低基因或基因产物的表达和/或活性。在一些实施方案中，破坏可改变基因或编码的基因产物(例如编码的蛋白质)的序列。在一些实施方案中，破坏可截短基因或编码的基因产物(例如编码的蛋白质)或使其片段化。在一些实施方案中，破坏可使基因或编码的基因产物延长；在一些这样的实施方案中，破坏可实现融合蛋白的组装。在一些实施方案中，破坏可影响基因或基因产物的水平但不影响其活性。在一些实施方案中，破坏可影响基因或基因产物的活性但不影响其水平。在一些实施方案中，破坏可对基因或基因产物的水平没有显著影响。在一些实施方案中，破坏可对基因或基因产物的活性没有显著影响。在一些实施方案中，破坏可对基因或基因产物的水平或活性都没有显著影响。
确定、测量、评价、评估、测定和分析：在本文中可互换使用，包括任何形式的测量，并且包括确定某要素是否存在。这些术语包括定量和/或定性测定。测定可为相对的或绝对的。“测定...的存在”包括确定存在的某物的量和/或确定其是否存在。
内源性基因座或内源性基因：如本文所用，包括如本文所述在引入改变、断裂、缺失、插入、修饰、替换或置换之前可见于亲本或参考生物体中的遗传基因座。在一些实施方案中，内源性基因座具有天然存在的序列。在一些实施方案中，内源性基因座为野生型基因座。在一些实施方案中，参考生物体为野生型生物体。在一些实施方案中，参考生物体为工程化生物体。在一些实施方案中，参考生物体是实验室培育的生物体(无论是野生型的还是工程化的)。
内源性启动子：如本文所用，包括与内源性基因天然相关(例如在野生型生物体中)的启动子。
工程化：如本文所用，一般来讲包括已经由人工操纵的方面。例如，在一些实施方案中，当不以自然界中的顺序连接在一起的两个或更多个序列通过人工操纵而在工程化多核苷酸中直接彼此连接时，多核苷酸可被视为“工程化的”。在一些具体的此类实施方案中，经工程化多核苷酸可以包含自然界中存在的与第一编码序列可操作地结合但不与第二编码序列可操作地结合的调控序列，该调控序列通过人工连接而使得其与第二编码序列可操作地结合。替代地或另外地，在一些实施方案中，各自编码自然中不彼此连接的多肽元件或结构域的第一和第二核酸序列可以在单个经工程化多核苷酸中彼此连接。相比之下，在一些实施方案中，如果细胞或生物体已被操纵而使得其遗传信息被改变(例如，先前不存在的新遗传物质已经被引入，或者先前存在的遗传物质已被改变或移除)，则该细胞或生物体可以被视为“工程化的”。如通常实践并且由本领域的技术人员所理解的，即使实际的操作是对先前的实体进行的，经工程化多核苷酸或细胞的子代通常仍然被称为“工程化的”。此外，本领域的技术人员将认识到，可以通过多种可用的方法来实现本文所述的“工程化”。例如，在一些实施方案中，“工程化”可以涉及通过使用计算机系统进行选择或设计(例如，核酸序列、多肽序列、细胞、组织和/或生物体)，所述计算机系统经编程以执行分析或比较，或者分析、推荐和/或选择序列、改变等)。替代地或另外地，在一些实施方案中，“工程化”可以涉及使用体外化学合成方法和/或重组核酸技术，比如核酸扩增(例如经由聚合酶链式反应)杂交、突变、转化、转染等，和/或多种受控交配方法中的任一种。如本领域技术人员将理解的，多种确立的此类技术(例如，用于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养与转化(例如电穿孔、脂质转染等))是本领域中熟知的并且描述于本说明书全文中所引用和/或讨论的各种一般和更具体的参考文献中。参见例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A LaboratoryManual(第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)。
基因：如本文所用，包括染色体中编码产物(例如，RNA产物和/或多肽产物)的DNA序列。在一些实施方案中，基因包括编码序列(即，编码特定产物的序列)。在一些实施方案中，基因包括非编码序列。在一些特定实施方案中，基因可以包括编码(例如，外显子)和非编码(例如，内含子)序列二者。在一些实施方案中，基因可以包括例如可以控制或影响基因表达的一个或多个方面(例如，细胞类型特异性表达、诱导型表达等)的一个或多个调控序列(例如，启动子、增强子等)和/或内含子序列。为了清晰起见，我们注意到，如本专利申请中所用，术语“基因”通常包括编码多肽的核酸的一部分；该术语可以任选地涵盖调控序列，如本领域的普通技术人员将从上下文清晰地理解那样。该定义无意排除将术语“基因”应用于非蛋白质编码表达单元，而是为了阐明，在大多数情况下，本文档所用的术语包括编码多肽的核酸。
异源：如本文所用，包括来自不同来源的药剂或实体。例如，当参考存在于特定细胞或生物体中的多肽、基因或基因产物使用时，该术语阐明了相关多肽、基因或基因产物：1)被人工工程化；2)被人工(例如，经由遗传工程)引入细胞或生物体(或其前体)中；和/或3)是由相关细胞或生物体(例如，相关细胞类型或生物体类型)非天然地产生或非天然地存在于所述细胞或生物体中。
宿主细胞：如本文所用，包括将异源(例如，外源)核酸或蛋白质引入其中的细胞。技术人员在阅读本公开后将会理解，此类术语不仅包括特定的受试者细胞，而且还用于包括该细胞的子代。因为某些修饰可因突变或环境影响而在后续世代中发生，所以这样的子代事实上可不等同于亲本细胞，但仍包括在如本文中使用的术语“宿主细胞”的范围内。在一些实施方案中，宿主细胞为原核或真核细胞或包含原核或真核细胞。一般来讲，宿主细胞是适于接受和/或产生异源核酸或蛋白质的任何细胞，而与所述细胞被指定所属的生命界无关。示例性细胞包括原核生物和真核生物的细胞(单细胞或多细胞)、细菌细胞(例如，大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌属菌种(Bacillus spp.)、链霉菌属菌种(Streptomyces spp.)等的菌株)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、甲醇毕赤酵母(P.methanolica)等)、植物细胞、昆虫细胞(例如，SF-9、SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾(Trichoplusiani)等)、非人动物细胞、人细胞或细胞融合物例如杂交瘤或四源杂交瘤。在一些实施方案中，细胞为人、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施方案中，细胞为真核细胞并且选自以下细胞：CHO(例如CHO K1、DXB-11CHO、Veggie-CHO)、COS(例如COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾(例如HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo205、HB 8065、HL-60、(例如BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(表皮的)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT060562、Sertoli细胞、BRL 3A细胞、HT1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞和来源于前述细胞的细胞系。在一些实施方案中，细胞包含一个或多个病毒基因，例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如PER.C6TM细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞为分离的细胞或包含分离的细胞。在一些实施方案中，宿主细胞为组织的一部分。在一些实施方案中，宿主细胞为生物体的一部分。
人源化：根据其领域所理解的含义在本文中用于包括这样的核酸或蛋白质：其结构(即，核苷酸或氨基酸序列)包括与非人动物中天然存在的特定基因或蛋白质的结构基本上或完全对应的部分，并且还包括与相关的特定非人基因或蛋白质中存在的不同，而与对应的人类基因或蛋白质中存在的可比较结构更紧密对应的部分。在一些实施方案中，“人源化”基因是编码具有与人多肽(例如，人蛋白质或其部分-例如其特征性部分)的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的多肽的基因。只是给出一个实例，在膜受体的情况下，“人源化”基因可编码全部或部分的具有胞外部分的多肽，所述胞外部分具有的氨基酸序列与人胞外部分的氨基酸序列相同，并且剩余序列与非人(例如小鼠)多肽的序列相同。在一些实施方案中，人源化基因包含人基因的DNA序列的至少一部分。在一些实施方案中，人源化基因包含人类基因的整个DNA序列。在一些实施方案中，人源化蛋白质包含出现在人蛋白质中的部分的序列。在一些实施方案中，人源化蛋白质包含人蛋白质的完整序列，并且由对应于人基因的同源物或直向同源物的非人动物的内源性基因座表达。
同一性：如本文结合序列比较所用，包括本领域已知的可用于测量核苷酸和/或氨基酸序列同一性的许多不同算法所确定的同一性。在一些实施方案中，使用ClustalWv.1.83(慢)比对(利用10.0的开放缺口罚分、0.1的延伸缺口罚分)和使用Gonnet相似性矩阵(MACVECTORTM10.0.2,MacVector Inc.,2008)来确定本文所述的同一性。
体外：如本文所用，包括在人造环境中，例如在试管或反应容器中，在细胞培养物中等，而不是在多细胞生物体内发生的事件。
体内：如本文所用，包括在多细胞生物体，诸如人和非人动物内发生的事件。在基于细胞的系统的语境中，该术语可用于包括在活细胞内(与例如体外系统相对)发生的事件。
分离的：如本文所用，包括已经(1)从在最初产生时(无论在自然界中和/或在实验环境中)与其结合的至少一些组分分离，和/或(2)被人工设计、产生、制备和/或制造的物质和/或实体。分离的物质和/或实体可与约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％的最初与其关联的其他组分分离。在一些实施方案中，分离的药剂为约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％纯的。如本文所用，如果物质基本上不含其他组分，则其是“纯的”。在一些实施方案中，如将被本领域技术人员所理解的，物质在与某些其他组分例如一种或多种载体或赋形剂(例如，缓冲液、溶剂、水等)组合后，仍可被认为是“分离的”或甚至“纯的”；在此类实施方案中，计算物质在不包括此类载体或赋形剂情况下的分离百分比或纯度。只是给出一个实例，在一些实施方案中，天然存在的生物聚合物诸如多肽或多核苷酸a)在因其衍生的起源或来源而不与在其天然状态下天然伴随其的一些或全部组分关联时；b)在其基本上不含与天然产生其的物种相同的物种的其他多肽或核酸时；c)当由不是天然产生其的物种的细胞或其他表达系统表达或以其他方式与来自所述细胞或其他表达系统的组分关联时，被认为是“分离的”。因此，例如，在一些实施方案中，化学合成或在与在自然界中产生多肽的细胞系统不同的细胞系统中合成的多肽被视为“分离的”多肽。替代地或另外地，在一些实施方案中，已历经一种或多种纯化技术的多肽在其已与a)在自然界中与其关联的；和/或b)当最初产生时与其关联的其他组分分离的程度上可被认为是“分离的”多肽。
“基因座”：如本文所用，包括基因(或重要序列)、DNA序列、编码多肽的序列的一个或多个特定位置，或生物体的基因组的染色体上的位置。例如，“Lag-3基因座”可以包括Lag-3基因、Lag-3DNA序列、编码Lag-3的序列的特定位置，或已鉴定为此类序列所在的地方的生物体基因组的染色体上的Lag-3位置。“Lag-3基因座”可以包括Lag-3基因的调控元件，包括但不限于增强子、启动子、5’和/或3’UTR或它们的组合。本领域的普通技术人员将会理解，在一些实施方案中，染色体可以包含几百个或甚至几千个基因，并且在不同物种之间进行比较时显示出相似的遗传基因座的物理共定位。此类遗传基因座可以描述为具有共有的同线性。
非人动物：如本文所用，包括任何非人的脊椎生物体。在一些实施方案中，非人动物为圆口纲脊椎动物、硬骨鱼、软骨鱼(例如，鲨鱼或鳐)、两栖动物、爬行动物、哺乳动物或鸟。在一些实施方案中，本文所述的非人动物是哺乳动物。在一些实施方案中，非人哺乳动物为灵长类动物、山羊、绵羊、猪、狗、牛或啮齿类动物。在一些实施方案中，本文所述的非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠总科(Dipodoidea)或鼠总科(Muroidea)的小型哺乳动物。在一些实施方案中，本文所述的遗传修饰的动物是啮齿类动物。在一些实施方案中，本文所述的啮齿类动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一些实施方案中，本文所述的啮齿类动物选自鼠总科。在一些实施方案中，本文所述的遗传修饰的动物来自选自下列的家族：丽仓鼠科(Calomyscidae)(例如，类小鼠的仓鼠)、仓鼠科(Cricetidae)(例如，仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠科(Muridae)(真小鼠和大鼠、沙鼠、棘鼠、冠鼠)、马岛鼠科(Nesomyidae)(攀鼠、岩鼠、具尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺山鼠科(Platacanthomyidae)(例如，刺棒睡鼠)和鼹形鼠科(Spalacidae)(例如，鼹鼠、竹鼠和鼢鼠)。在某些实施方案中，本文所述的遗传修饰的啮齿类动物选自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、棘鼠和冠鼠。在某些实施方案中，本文所述的遗传修饰的小鼠来自鼠科的成员。在一些实施方案中，本文所述的非人动物是啮齿类动物。在某些实施方案中，本文所述的啮齿类动物选自小鼠和大鼠。在一些实施方案中，本文所述的非人动物是小鼠。
在一些实施方案中，本文所述的非人动物是啮齿类动物，所述啮齿类动物是选自以下的C57BL品系的小鼠：C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola。在某些实施方案中，本文所述的小鼠是选自以下品系的129品系：129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如，129S1/SV、129S1/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129/SvJae、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(参见例如Festing等人，1999，Mammalian Genome10:836；Auerbach,W.等人，2000，Biotechniques 29(5):1024-1028，1030，1032)。在某些实施方案中，本文所述的遗传修饰的小鼠是前述129品系和前述C57BL/6品系的混合物。在某些实施方案中，本文所述的小鼠是前述129品系的混合物，或前述BL/6品系的混合物。在某些实施方案中，如本文所述的混合物的129品系为129S6(129/SvEvTac)品系。在一些实施方案中，本文所述的小鼠是BALB品系，例如BALB/C品系。在一些实施方案中，本文所述的小鼠是BALB品系和另一种前述品系的混合物。
在一些实施方案中，本文所述的非人动物是大鼠。在某些实施方案中，本文所述的大鼠选自Wistar大鼠、LEA品系、Sprague Dawley品系、Fischer品系、F344、F6和DarkAgouti。在某些实施方案中，本文所述的大鼠品系为选自Wistar、LEA、Sprague Dawley、Fischer、F344、F6和Dark Agouti的两个或更多个品系的混合物。
核酸：如本文所用，在其最宽泛的意义上包括被掺入或可被掺入寡核苷酸链的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，“核酸”是通过磷酸二酯键联被掺入到或可被掺入到寡核苷酸链中的化合物和/或物质。如根据上下文将清楚的，在一些实施方案中，“核酸”包含单个核酸残基(例如核苷酸和/或核苷)；在一些实施方案中，“核酸”包含含有含单个核酸残基的寡核苷酸链。在一些实施方案中，“核酸”为RNA或包含RNA；在一些实施方案中，“核酸”为DNA或包含DNA。在一些实施方案中，“核酸”为一个或多个天然核酸残基、包含一个或多个天然核酸残基或由一个或多个天然核酸残基组成。在一些实施方案中，“核酸”为一个或多个核酸类似物、包含一个或多个核酸类似物或由一个或多个核酸类似物组成。在一些实施方案中，核酸类似物与“核酸”的差别在于其不利用磷酸二酯主链。例如，在一些实施方案中，“核酸”为一个或多个“肽核酸”、包含一个或多个肽核酸或由一个或多个肽核酸组成，所述肽核酸在本领域中是已知的并且在主链中具有肽键而非磷酸二酯键，其被认为在本发明的范围之内。替代地或另外地，在一些实施方案中，“核酸”具有一个或多个硫代磷酸酯和/或5’-N-亚磷酰胺键联而非磷酸二酯键。在一些实施方案中，“核酸”为一个或多个天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)、包含一个或多个天然核苷、或由一个或多个天然核苷组成。在一些实施方案中，“核酸”为一个或多个核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化碱基、插入型碱基及其组合)、包含一个或多个核苷类似物或由一个或多个核苷类似物组成。在一些实施方案中，与天然核酸中的糖相比，“核酸”包含一个或多个经修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2’-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些实施方案中，“核酸”具有编码功能性基因产物诸如RNA或蛋白质的核苷酸序列。在一些实施方案中，“核酸”包括一个或多个内含子。在一些实施方案中，“核酸”通过下述方式中的一种或多种来制备：从天然来源分离、通过基于互补模板的聚合(体内或体外)进行的酶促合成、在重组细胞或系统中的复制、化学合成及其组合。在一些实施方案中，“核酸”的长度为至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000个或更多个残基。在一些实施方案中，“核酸”为单链的；在一些实施方案中，“核酸”为双链的。在一些实施方案中，“核酸”具有包含至少一个元件的核苷酸序列，所述元件编码多肽或与编码多肽的序列互补。在一些实施方案中，“核酸”具有酶促活性。
可操作地连接：如本文所用，包括并置，其中所描述的组分处于允许它们以预期方式起作用的关系。与编码序列"可操作地连接"的控制序列以这样的方式连接，使得在与控制序列相容的条件下获得编码序列的表达。"可操作地连接"序列包括与所关注的基因相邻的表达控制序列和以反式方式作用或远距离作用以控制所关注的基因的表达控制序列。如本文所用，术语“表达控制序列”，包括这样的多核苷酸序列：所述多核苷酸序列是实现与其相连接的编码序列表达和加工所必需的。“表达控制序列”包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号例如剪接和多聚腺苷酸化信号；使细胞质mRNA稳定的序列；增强翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白稳质定性的序列；以及当需要时，增强蛋白分质泌的序列。这种控制序列的性质取决于宿主生物体而不同。例如，在原核生物中，此类控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列，而在真核生物中，典型地，此类表达控制序列包括启动子和转录终止序列。术语"控制序列"旨在包括其存在对于表达和加工来说是必需的组分，并且还可包括额外的组分，其存在是有利的，例如，前导序列和融合伴侣序列。
患者或受试者：如本文所用，包括被施用或可被施用所提供的组合物以例如用于实验、诊断、预防、美容和/或治疗目的的任何生物体。典型的患者包括动物(例如哺乳动物如小鼠、大鼠、兔子、非人灵长类和/或人)。在一些实施方案中，患者为非人动物。在一些实施方案中，患者(例如非人动物患者)可具有如本文所述的修饰、与本文所述的修饰不同的修饰或不具有修饰(即，野生型非人动物患者)。在一些实施方案中，非人动物患有或易患一种或多种障碍或病症。在一些实施方案中，非人动物显示出障碍或病症的一种或多种症状。在一些实施方案中，非人动物已被诊断患有一种或多种障碍或病症。
多肽：如本文所用，包括任何氨基酸聚合链。在一些实施方案中，多肽具有天然存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有非天然存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有氨基酸序列，其包含彼此单独天然存在的部分(即，来自两种或更多种不同的生物体，例如，人和非人部分)。在一些实施方案中，多肽具有通过人工行为进行设计和/或产生的被工程化氨基酸序列。
重组：如本文所用，旨在包括通过重组手段设计、工程化、制备、表达、形成或分离的多肽(例如，本文所述的Lag-3多肽)，诸如使用转染至宿主细胞的重组表达载体表达的多肽，从重组、组合人多肽文库分离的多肽(Hoogenboom H.R.,1997,TIB Tech.15:62-70；Azzazy H.和Highsmith W.E.,2002,Clin.Biochem.35:425-445；Gavilondo J.V.和Larrick J.W.,2002,BioTechniques 29:128-145；Hoogenboom H.和Chames P.,2000,Immunology Today 21:371-378)，从对人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如，小鼠)分离的抗体(参见例如Taylor,L.D.等人,1992,Nucl.Acids Res.20:6287-6295；Kellermann S-A.和Green L.L.,2002,Current Opinion in Biotechnology 13:593-597；Little M.等人,2000,Immunology Today 21:364-370；Murphy,A.J.等人,2014,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111(14):5153-5158)或通过涉及将所选的序列元件剪接至彼此的任何其他手段制备、表达、形成或分离的多肽。在一些实施方案中，此类选定的序列元件中的一个或多个是天然存在的。在一些实施方案中，此类选定的序列元件中的一个或多个是计算机设计的(in silico)。在一些实施方案中，一个或多个此类选定的序列元件由已知序列元件的诱变(例如体内或体外)产生，所述已知序列元件例如来自天然来源或合成来源。例如，在一些实施方案中，重组多肽由存在于所关注的来源生物体(例如人、小鼠等)的基因组中的序列构成。在一些实施方案中，重组多肽具有由诱变(例如，体外或体内，例如在非人动物中)产生的氨基酸序列，以使得所述重组多肽的氨基酸序列为这样的序列，该序列虽然源自多肽序列且与多肽序列相关，但可能不天然存在于非人动物体内的基因组内。
替换：如本文所用，包括通过其将宿主基因座中(例如，基因组中)存在的“被替换的”核酸序列(例如，基因)从该基因座移除，并且将不同的“替换”核酸置于该位置的过程。在一些实施方案中，被替换的核酸序列与替换核酸序列是相互可比较的，因为，例如，它们彼此同源和/或含有相应的元件(例如，蛋白质编码元件、调控元件等)。在一些实施方案中，被替换的核酸序列包含启动子、增强子、剪接供体位点、剪接受体位点、内含子、外显子、非翻译区(UTR)中的一个或多个；在一些实施方案中，替换核酸序列包含一个或多个编码序列。在一些实施方案中，替换核酸序列为被替换的核酸序列的同源物。在一些实施方案中，替换核酸序列为被替换的序列的直向同源物。在一些实施方案中，替换核酸序列为人核酸序列或包含人核酸序列。在一些实施方案中，包括在替换核酸序列为人核酸序列或包含人核酸序列的情况下，被替换的核酸序列为啮齿类动物序列或包含啮齿类动物序列(例如小鼠或大鼠序列)。这样放置的核酸序列可包含其为用于获得这样放置的序列的来源核酸序列的部分的一个或多个调节序列(例如，启动子、增强子、5'-或3'-非翻译区等)。例如，在多个实施方案中，替换是异源序列对内源性序列的置换，所述置换导致从这样放置的核酸序列(包含异源序列)产生基因产物，但不表达内源性序列；替换是用编码与由内源性序列编码的多肽具有相似功能的多肽的核酸序列替换内源性基因组序列(例如，内源性基因组序列编码Lag-3多肽，并且DNA片段编码一个或多个人Lag-3多肽的全部或部分)。在多个实施方案中，内源性基因或其片段被对应的人基因或其片段替换。对应的人基因或其片段是作为被替换的内源性基因或其片段的直向同源物的人基因或片段，或在结构和/或功能上与被替换的内源性基因或其片段基本上相似或相同的人基因或片段。
参照：如本文所用，描述了与所关注的药剂、动物、队列、个体、群体、样品、序列或值相比较的标准或对照药剂、队列、个体、群体、样品、序列或值。在一些实施方案中，参照药剂、队列、个体、群体、样本、序列或值的测试或测定与所关注的药剂、队列、个体、群体、样本、序列或值的测试或测定基本上同时进行。在一些实施方案中，参照药剂、队列、个体、群体、样本、序列或值为历史参照，其任选地以有形媒介体现。在一些实施方案中，参照可指对照。如本文所用，“参照”可以指“参照动物”。“参照动物”可具有如本文所述的修饰，与本文所述的修饰不同的修饰或不具有修饰(即，野生型动物)。通常，本领域内的技术人员将理解，参照药剂、动物、队列、个体、群体、样本、序列或值一定的条件下进行测定或表征，所述条件与用来测定或表征所关注的药剂、动物(例如哺乳动物)、队列、个体、群体、样本、序列或值的条件类似。
基本上：如本文所用，包括表现出全部或接近全部范围或程度的所关注的特性或性质的定性状况。生物学领域的普通技术人员将理解，生物和化学现象很少(如果有的话)进行至完成和/或进行至完全，或实现或避免绝对的结果。因此术语“基本上”用于捕捉潜在的在许多生物和化学现象中固有的完全性的缺乏。本文在与参考序列、分子或域相比，提及序列、核酸或蛋白质分子或蛋白域时，也使用该术语。例如，在提及包含非人Lag-3多肽的基本上信号肽的人源化Lag-3多肽时，短语“非人Lag-3多肽的基本上信号肽”包括与非人Lag-3多肽的信号肽基本上相同的肽，在一些实施方案中，所述肽的序列与非人Lag-3多肽的信号肽至少85％、90％、95％、95％、99％或100％相同；在一些实施方案中，与非人Lag-3多肽的信号肽的差异不超过5个、4个、3个、2个或1个氨基酸，优选地仅在信号肽的N-或C-末端，例如在信号肽的N-或C-末端缺乏一个或多个氨基酸或具有一个或多个另外的氨基酸。又如，在提及包含人PD-1蛋白的基本上胞外域的人源化PD-1多肽时，短语“人PD-1蛋白的基本上胞外域”包括与人PD-1蛋白的胞外域基本上相同的多肽，在一些实施方案中，所述多肽的序列与人PD-1蛋白的胞外域至少85％、90％、95％、95％、99％或100％相同；在一些实施方案中，与人PD-1蛋白的胞外域的差异不超过5个、4个、3个、2个或1个氨基酸，优选地仅在N-或C-末端，例如在N-或C-末端缺乏氨基酸或具有另外的氨基酸。
基本上同源：如本文所用，包括氨基酸或核酸序列之间的比较。如本领域普通技术人员将理解的，如果两个序列在对应的位置上含有同源残基，则它们通常被认为是“基本上同源的”。同源残基可为相同的残基。或者，同源残基可以是不相同的残基，具有适当相似的结构和/或功能特征。例如，如由本领域的普通技术人员所熟知的，某些氨基酸通常被归类为“疏水性”或“亲水性”氨基酸，和/或归类为具有“极性”或“非极性”侧链。一个氨基酸对另一个相同类型的氨基酸的置换可通常被认为是“同源”置换。典型的氨基酸分类汇总如下：
Figure BDA0001665051410000241
Figure BDA0001665051410000242
如本领域中所熟知的，氨基酸或核酸序列可使用多种算法中的任意算法来进行比较，所述算法包括商业计算机程序中可获得的那些算法如用于核苷酸序列的BLASTN以及用于氨基酸序列的BLASTP、空位BLAST和PSI-BLAST。示例性的此类程序描述于以下文献中：Altschul等人,1990,Basic local alignment search tool,J.Mol.Biol.,215(3):403-410；Altschul等人,1996,Methods Enzymol.266:160-80；Altschul等人,1997,NucleicAcids Res.25:3389-3402；Baxevanis等人,1998Bioinformatics:A Practical Guide tothe Analysis of Genes and Proteins,Wiley；和Misener等人(编)(1999)Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology，第132卷)，Humana Press。除了鉴定同源序列以外，上文提及的程序通常还提供同源性程度的指示。在一些实施方案中，如果两个序列的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的相应残基在相关的残基序列段(stretch)上是同源的，则这两个序列被认为是基本上同源的。在一些实施方案中，相关序列段为完全序列。在一些实施方案中，相关序列段为至少9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或更多个残基。在一些实施方案中，相关序列段包括沿着完全序列的连续残基。在一些实施方案中，相关序列段包括沿着完全序列的不连续的残基。在一些实施方案中，相关区段为至少10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个残基。
基本上同一性：如本文所用，包括氨基酸或核酸序列之间的比较。如本领域普通技术人员将理解的，如果两个序列在对应的位置上含有相同残基，则它们通常被认为是“基本上相同的”。如本领域中所熟知的，氨基酸或核酸序列可使用多种算法中的任意算法来进行比较，所述算法包括商业计算机程序中可获得的那些算法如用于核苷酸序列的BLASTN以及用于氨基酸序列的BLASTP、空位BLAST和PSI-BLAST。示例性的此类程序描述于以下文献中：Altschul等人,1990,Basic local alignment search tool,J.Mol.Biol.,215(3):403-410；Altschul等人,1996,Methods Enzymol.266:160-80；Altschul等人,1997,NucleicAcids Res.25:3389-3402；Baxevanis等人,1998,Bioinformatics:A Practical Guide tothe Analysis of Genes and Proteins,Wiley；Misener等人(编)(1999)BioinformaticsMethods and Protocols(Methods in Molecular Biology，第132卷)，Humana Press。除了鉴定相同的序列以外，上文提及的程序通常还提供同一性程度的指示。在一些实施方案中，如果两个序列的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的相应残基在相关的残基序列段上是相同的，则这两个序列被认为是基本上相同的。在一些实施方案中，相关序列段为完全序列。在一些实施方案中，相关区段为至少10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个残基。
靶向载体或靶向构建体：如本文所用，包括包含靶向区域的多核苷酸分子。靶向区域包含与靶细胞、组织或动物中的序列相同或基本上相同并且提供靶向构建体经由同源重组至所述细胞、组织或动物的基因组内的位置中的整合的序列。还包括使用位点特异性重组酶识别位点(例如，loxP和/或Frt位点)靶向的靶向区域。在一些实施方案中，靶向构建体还包含尤其受人关注的核酸序列或基因、选择性标记、控制和/或调控序列、以及允许通过帮助或促进涉及此类序列的重组的蛋白质的外源添加而介导的重组的其他核酸序列。在一些实施方案中，靶向构建体还包含所关注的基因的全部或部分，其中所述所关注的基因为编码具有与由内源性序列编码的蛋白质相似的功能的蛋白质的全部或部分的异源基因。在一些实施方案中，靶向构建体还包含所关注的人源化基因的全部或部分，其中所述所关注的人源化基因编码具有与由内源性序列编码的蛋白质相似的功能的蛋白质的全部或部分。在一些实施方案中，靶向构建体还包含所关注的工程化基因的全部或部分，其中所述所关注的工程化基因编码具有与由内源性序列编码的蛋白质相似的功能的蛋白质的全部或部分。
变体：如本文所用，包括显示出与参照实体的显著结构同一性但相较于所述参照实体在一个或多个化学部分的存在或水平上与所述参照实体结构上不同的实体。在许多实施方案中，“变体”还在功能上与其参照实体不同。一般来讲，特定实体是否被适当地认为是参照实体的“变体”是基于其与参照实体的结构同一性的程度。如本领域技术人员将理解的，任何生物或化学参照实体具有某些特征性结构元件。根据定义，“变体”是共享一个或多个此类特征性结构元件的不同的化学实体。只是给出一些实例，小分子可具有特征性核结构元件(例如，大环核)和/或一个或多个特征性侧链部分，以使得小分子的变体是共享核结构元件和特征性侧链部分，但在其他侧链部分上和/或在存在于核内的键的类型(单键相对于双键，E相对于Z，等)上不同的分子，多肽可具有包含在线性或三维空间中相对于彼此具有指定的位置和/或促成特定生物功能的多个氨基酸的特征性序列元件，核酸可具有包含在线性或三维空间中相对于彼此具有指定的位置的多个核苷酸残基的特征性序列元件。例如，“变体多肽”可由于氨基酸序列中的一个或多个差异和/或共价附接于多肽主链的化学部分(例如，碳水化合物、脂质等)中的一个或多个差异而与参照多肽不同。在一些实施方案中，“变体多肽”显示出与参照多肽具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％的总体序列同一性。替代地或另外地，在一些实施方案中，“变体多肽”不与参照多肽共享至少一个特征性序列元件。在一些实施方案中，参照多肽具有一种或多种生物活性。在一些实施方案中，“变体多肽”共享参照多肽的一种或多种生物活性。在一些实施方案中，“变体多肽”缺乏参照多肽的一种或多种生物活性。在一些实施方案中，“变体多肽”显示出相较于参照多肽降低水平的一种或多种生物活性。在许多实施方案中，如果所关注的多肽具有与亲代的氨基酸序列相同但在特定位置上具有少数序列改变的氨基酸序列，则所关注的多肽被认为是亲代或参照多肽的“变体”。通常，变体中少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％的残基相较于亲代被置换。在一些实施方案中，“变体”变体相较于亲代具有10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个置换的残基。通常，“变体”具有很少数目(例如，少于5个、4个、3个、2个或1个)的置换的功能残基(即，参与特定生物学活性的残基)。此外，相较于亲代，“变体”通常具有不超过5个、4个、3个、2个或1个添加或缺失，并且通常不具有添加或缺失。此外，任何添加或缺失通常少于约25个、约20个、约19个、约18个、约17个、约16个、约15个、约14个、约13个、约10个、约9个、约8个、约7个、约6个残基，并且通常少于约5个、约4个、约3个或约2个残基。在一些实施方案中，亲代或参照多肽是天然发现的多肽。如将由本领域普通技术人员所理解的，所关注的特定多肽的多个变体通常可为天然存在的，特别是当所关注的多肽为传染原多肽时。
载体：如本文所用，包括能够转运与其关联的另一种核酸的核酸分子。在一些实施方案中，载体能够在宿主细胞诸如真核和/或原核细胞中进行染色体外复制和/或表达与它们连接的核酸。能够引导可操作地连接的基因的表达的载体在本文中称为“表达载体”。
野生型：如本文所用，具有其领域所理解的含义，包括具有如在“正常”(相对于突变、患病的、改变的等)状态或环境中天然存在的结构和/或活性的实体。本领域的普通技术人员将理解，野生型基因和多肽通常以多种不同的形式(例如，等位基因)存在。
某些实施方案的详述
本发明尤其提供了具有编码淋巴细胞活化基因3(Lag-3)多肽的人源化遗传物质的改进的和/或工程化非人动物，其用于确定Lag-3调节剂(例如，抗Lag-3抗体)用于癌症治疗的治疗功效，以及T细胞应答和信号转导中的测定。可想到的是，此类非人动物在确定Lag-3调节剂的治疗功效及其用于Lag-3阻断的潜力方面提供改进。所以，本发明特别用于开发多种癌症和自体免疫疾病、障碍或病症的治疗的抗Lag-3治疗剂。具体地讲，本发明涵盖非人(诸如鼠科)Lag-3基因的人源化，其导致人源化Lag-3多肽在非人动物的细胞表面上表达。此类人源化Lag-3多肽能够提供用于确定抗Lag-3治疗剂促进抗肿瘤免疫应答的功效人Lag-3+细胞的来源。在一些实施方案中，本文所述的非人动物显示出经由阻断通过在非人动物的细胞表面上表达的人源化Lag-3多肽的Lag-3信号转导的增强的免疫应答。在一些实施方案中，人源化Lag-3多肽包含人LAG-3多肽的胞外部分，例如含有人LAG-3多肽的前两个Ig样域的胞外部分对应的序列。在一些实施方案中，人源化Lag-3多肽包含人LAG-3多肽的氨基酸29-260(或23-260或21-260)对应的序列。在一些实施方案中，人源化Lag-3多肽包含非人(例如，啮齿类动物诸如鼠科)Lag-3多肽的跨膜域和/或胞内尾对应的序列。在一些实施方案中，人源化Lag-3多肽包含含有人LAG-3多肽的前两个Ig样域的胞外部分，其中人源化Lag-3多肽的其余部分由非人(例如，啮齿类动物诸如鼠科)Lag-3多肽的氨基酸构成。在一些实施方案中，人源化Lag-3多肽包含与内源性非人Lag-3多肽的信号肽基本上相同的信号肽，包含人部分和非人部分的胞外域，其中所述人部分包含人LAG-3多肽的前两个Ig样域，并且非人部分包含内源性非人Lag-3多肽的后两个Ig样域；以及内源性非人Lag-3多肽的跨膜和胞内域。在一些实施方案中，本文所述的非人动物包含含有来自非人动物和异源物种(例如，人)的遗传物质的人源化Lag-3基因。在一些实施方案中，本文所述的非人动物包含人源化Lag-3基因，其中所述人源化Lag-3基因包含人LAG-3基因的外显子2至4。在某些实施方案中，本文所述的非人动物包含人源化Lag-3基因，其中所述人源化Lag-3基因包含人LAG-3基因的外显子2至4和一部分内含子4(例如，～68bp)对应的～1,741bp的人LAG-3基因。在一些实施方案中，本文所述的非人动物包含人源化Lag-3基因，其中所述人源化Lag-3基因包含非人动物的内源性Lag-3基因的外显子1，人LAG-3基因的外显子2至4，和非人动物的内源性Lag-3基因的外显子5-8，其中人源化Lag-3基因置于内源性Lag-3基因座并且可操作地连接到该基因座上的内源性Lag-3启动子。
在下面的章节中详细地描述本发明的各个方面。章节的使用不意味着限制本发明。每一个章节可适用于本发明的任何方面。在本申请中，除非另有说明，"或"的使用意指"和/或"。
淋巴细胞活化基因3(Lag-3)
淋巴细胞活化基因3(Lag-3，也称为CD223)是在活化的CD4和CD8T细胞、γδT细胞、自然杀伤T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、浆细胞样树突状细胞和调节性T细胞上表达的跨膜受体。Lag-3是免疫球蛋白超家族成员，在结构上类似于CD4，且包含四个胞外Ig样域(也称为D1、D2、D3和D4域，参见图2的序列比对中的星号)。Lag-3具有减弱免疫应答的作用，据报道其结合主要组织相容性复合体(MHC)II类分子(据信通过与Lag-3的D1和D2域的相互作用而结合)，并且导致负信号递送至表达Lag-3的细胞且下调抗原依赖性CD4和CD8T细胞应答。目前，MHC II是唯一已知的Lag-3结合伴侣。另据报道，Lag-3负调节T细胞增殖、产生细胞因子和裂解靶细胞(被称为T细胞耗竭)的能力。另外，据报道Lag-3在增强调节性T(Treg)细胞功能中发挥作用(Pardoll,D.M.,2012,Nat.Rev.Cancer 12:252-64)。
T细胞共刺激和共抑制分子(统称为共信号转导分子)在调节T细胞活化、亚群分化、效应子功能和存活中发挥关键作用(Chen,L.和D.B.Flies,2013,Nat.Rev.Immunol.13:227-42)。在T细胞受体识别抗原呈递细胞上的同源肽-MHC复合物之后，共信号转导受体与免疫突触处的T细胞受体共定位，其中它们与TCR信号转导协同作用以促进或抑制T细胞活化和功能(Flies,D.B.等人,2011,Yale J.Biol.Med.84:409-21)。最终免疫应答由共刺激和共抑制信号之间的平衡调节，其被称为“免疫检查点”(Pardoll,D.M.,supra)。此类“免疫检查点”可以被描述为在免疫系统中工作以调高或调低信号，特别是T细胞信号的分子。Lag-3在介导外周T细胞耐受性中作为许多“免疫检查点”之一发挥功能。
为了更充分和详细地理解肿瘤中的Lag-3介导的功能和Lag-3途径，需要自体免疫和感染性免疫来开发未来治疗人类患者的可行靶向疗法。
Lag-3序列
示例性啮齿类动物(例如，大鼠和小鼠)、人和人源化淋巴细胞活化基因3(Lag-3)序列在图8中示出。用于非人Lag-3基因的人源化的示例性合成DNA片段也在图8中示出。对于mRNA序列，加粗字体表示编码序列，并且连续外显子(在标示的情况下)被交替的下划线文本分隔开；对于人源化mRNA序列，人序列包含于括号内。对于氨基酸序列，跨膜序列以下划线字体表示；对于人源化氨基酸序列，人序列以加粗字体表示，并且包含于括号内。
DNA构建体
通常，将含有Lag-3基因的全部或部分的多核苷酸分子插入载体，优选地DNA载体中，以在合适的宿主细胞中复制多核苷酸分子。
根据大小，Lag-3基因或编码Lag-3的序列可以从商业供应商获得的cDNA来源直接克隆或基于GenBank提供的公布序列以计算机设计。或者，细菌人工染色体(BAC)文库可以提供来自所关注的基因的异源Lag-3序列(例如，异源Lag-3基因)。BAC文库含有100-150kb的平均插入片段大小，并且能够携带高达300kb的插入片段(Shizuya,H.等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.89:8794-7；Swiatek,P.J.和T.Gridley,1993,Genes Dev.7:2071-84；Kim,U.J.等人,1996,Genomics 34:213-8；以引用方式并入本文)。例如，已构建人和小鼠基因组BAC文库，并且这些文库可商购获得(例如，Invitrogen,Carlsbad Calif.)。基因组BAC文库也可以作为异源Lag-3序列以及转录控制区域的来源。
或者，可以从酵母人工染色体(YAC)分离、克隆和/或转移异源Lag-3序列。整个异源基因或基因座可以被克隆并包含在一个或几个YAC内。如果使用多个YAC并且它们含有重叠同源性区域，则它们可以在酵母宿主菌株内重组以产生代表整个基因座的单一构建体。YAC臂可以通过改造用哺乳动物选择盒进一步修饰，以帮助通过本领域已知的和/或本文所述的方法将构建体引入胚胎干细胞或胚胎。
本文例如在图8中提供了用于在非人动物中构建人源化Lag-3基因的示例性mRNA和氨基酸序列。其他异源Lag-3序列还可见于GenBank数据库或本领域已知的其他序列数据库。
在一些实施方案中，含有本文所述的Lag-3序列的DNA构建体包含编码人LAG-3多肽的胞外部分的人LAG-3基因组序列，例如可操作地连接到用于在转基因非人动物中表达的非人调控序列(例如，啮齿类动物启动子)的人LAG-3多肽的至少氨基酸29-260(或23-260或21-260)。在一些实施方案中，含有本文所述的Lag-3序列的DNA构建体包含编码人LAG-3多肽的至少氨基酸29-260的人LAG-3基因组序列，所述人LAG-3基因组序列可操作地连接到非人Lag-3启动子和一个或多个非人Lag-3外显子(例如，内源性Lag-3外显子)。本文所述的DNA构建体中包含的人和/或非人Lag-3序列可以与天然存在(例如，基因组)、人工(例如，合成)的人和/或非人Lag-3序列相同或基本上相同，或可以通过人工工程化。在一些实施方案中，Lag-3序列从起点合成，并且包含天然存在的人LAG-3基因中存在的一个或多个序列。例如，DNA构建体可以包含对应于人LAG-3基因的外显子2至4，并且编码人LAG-3多肽的胞外部分，例如人LAG-3多肽的至少氨基酸29-260的合成DNA，所述的合成DNA可操作地连接到非人Lag-3调控(例如，启动子)和编码序列(例如，一个或多个非人外显子)，使得具有人和非人部分的Lag-3多肽由所得的DNA构建体编码。在一些实施方案中，Lag-3序列包含与异源Lag-3基因(即，人LAG-3基因)天然相关的序列。在一些实施方案中，Lag-3序列包含不与异源Lag-3基因(即，人LAG-3基因)天然相关的序列。在一些实施方案中，Lag-3序列包含为在非人动物中表达而优化的序列。在一些实施方案中，可操作地连接到非人Lag-3序列的异源Lag-3序列各自编码天然的单独多肽中出现的Lag-3多肽的一部分。如果将另外的序列用于优化异源Lag-3序列的表达，则可以使用现有的序列作为探针来克隆此类序列。根据期望的结果，可以从基因组序列或其他来源获得使异源Lag-3基因或异源Lag-3编码序列的表达最大化必需的另外的序列。
DNA构建体可以使用本领域已知的方法制备。例如，DNA构建体可以制备为较大质粒的一部分。这种制备允许以本领域已知的有效方式克隆和选择正确的构建体。含有本文所述的一个或多个核苷酸编码序列的DNA片段可以定位于质粒上的简便限制性位点之间，使得它们可易于从其余的质粒序列分离，以掺入所需的动物。
用于制备质粒和包含所述质粒的宿主生物体的许多方法是本领域已知的。对于用于原核和真核细胞二者的其他合适的表达系统，以及一般重组步骤，参见MolecularCloning:A Laboratory Manual，第2版，Sambrook,J.等人编，Cold Spring HarborLaboratory Press:1989。
具有人源化淋巴细胞活化基因3的非人动物的产生
提供了在非人动物的细胞表面上表达人源化Lag-3多肽的非人动物，所述人源化Lag-3多肽由编码Lag-3多肽的非人动物的内源性基因座(例如，Lag-3基因座)的遗传修饰而产生。本文描述的合适的实例包括啮齿类动物，具体地讲，小鼠。
在一些实施方案中，人源化Lag-3基因包含来自异源物种(例如，人)的遗传物质，其中所述人源化Lag-3基因编码包含来自异源物种的遗传物质的编码部分的Lag-3多肽。在一些实施方案中，本文所述的人源化Lag-3基因包含异源物种的基因组DNA，所述基因组DNA编码在细胞质膜上表达的Lag-3多肽的胞外部分。还提供了用于制备含有所述人源化Lag-3基因的非人动物、非人胚胎和细胞的非人动物、胚胎、细胞和靶向构建体。
在一些实施方案中，内源性Lag-3基因被缺失。在一些实施方案中，内源性Lag-3基因被改变，其中内源性Lag-3基因的一部分被异源序列(例如，人LAG-3序列的全部或部分)替换。在一些实施方案中，内源性Lag-3基因的全部或基本上全部被异源基因(例如，人LAG-3基因)替换。在一些实施方案中，异源Lag-3基因的一部分插入内源性Lag-3基因座处的内源性非人Lag-3基因。在一些实施方案中，异源基因为人基因。在一些实施方案中，对内源性Lag-3基因的两个拷贝之一进行修饰或人源化，产生相对于人源化Lag-3基因杂合的非人动物。在其他实施方案中，提供了对于人源化Lag-3基因而言是纯合的非人动物。
在多个方面，非人动物在内源性非人Lag-3基因座处含有人LAG-3基因的全部或部分。因此，此类非人动物可以描述为具有异源Lag-3基因。内源性Lag-3基因座处的替换、插入、修饰或改变的Lag-3基因或从此类基因表达的多肽可使用多种方法(包括例如PCR、Western印迹、Southern印迹、限制性片段长度多态性(RFLP)或等位基因获得或丧失测定)来检测。在一些实施方案中，非人动物相对于人源化Lag-3基因而言是杂合的。
在多个实施方案中，本文所述的人源化Lag-3基因包含人LAG-3基因的外显子2至4。
在多个实施方案中，本文所述的人源化Lag-3基因包括具有第二、第三和第四外显子的Lag-3基因，所述第二、第三和第四外显子各自具有与SEQ ID NO:5中出现的第二、第三和第四外显子至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)相同的序列。
在多个实施方案中，本文所述的人源化Lag-3基因包括具有第二、第三和第四外显子的Lag-3基因，所述第二、第三和第四外显子各自具有与SEQ ID NO:5中出现的第二、第三和第四外显子基本上相同或相同的序列。
在多个实施方案中，本文所述的人源化Lag-3基因包含与SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:11至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)相同的序列。
在多个实施方案中，本文所述的人源化Lag-3基因包含与SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:11基本上相同或相同的序列。
在多个实施方案中，本文所述的人源化Lag-3基因是或包含SEQ ID NO:10。
在多个实施方案中，本文所述的人源化Lag-3基因是或包含SEQ ID NO:11。
在多个实施方案中，本文所述的人源化Lag-3基因包含非人Lag-3基因，例如非人动物的内源性Lag-3基因的外显子1、5、6、7和8。
在多个实施方案中，本文所述的人源化Lag-3基因包含第一、第五、第六、第七和第八外显子，所述第一、第五、第六、第七和第八外显子各自具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中出现的第一、第五、第六、第七和第八外显子至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)相同的序列。
在多个实施方案中，本文所述的人源化Lag-3基因包含第一、第五、第六、第七和第八外显子，所述第一、第五、第六、第七和第八外显子各自具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中出现的第一、第五、第六、第七和第八外显子基本上相同或相同的序列。
在多个实施方案中，本文所述的人源化Lag-3基因包含非人Lag-3基因，例如非人动物的内源性Lag-3基因的5’非翻译区和3’非翻译区。
在多个实施方案中，本文所述的人源化Lag-3基因包含5’非翻译区和3’非翻译区，所述5’非翻译区和3’非翻译区各自具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中出现的5’非翻译区和3’非翻译区至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)相同的序列。
在多个实施方案中，本文所述的人源化Lag-3基因包含5’非翻译区和3’非翻译区，所述5’非翻译区和3’非翻译区各自具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中出现的5’非翻译区和3’非翻译区基本上相同或相同的序列。
在多个实施方案中，本文所述的人源化Lag-3基因包含与SEQ ID NO:7中出现的核苷酸编码序列至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)相同的核苷酸编码序列(例如，cDNA序列)。
在多个实施方案中，本文所述的人源化Lag-3基因包含与SEQ ID NO:7中出现的核苷酸编码序列基本上相同或相同的核苷酸编码序列(例如，cDNA序列)。
在多个实施方案中，本文所述的人源化Lag-3基因编码Lag-3多肽，所述Lag-3多肽具有与SEQ ID NO:8中出现的氨基酸序列至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)相同的氨基酸序列。
在多个实施方案中，本文所述的人源化Lag-3基因编码Lag-3多肽，所述Lag-3多肽具有与SEQ ID NO:8中出现的氨基酸序列基本上相同或相同的氨基酸序列。
在多个实施方案中，本文所述的非人动物产生的人源化Lag-3多肽具有胞外部分，所述胞外部分包含与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的氨基酸残基29-260至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)相同的氨基酸序列。
在多个实施方案中，本文所述的非人动物产生的人源化Lag-3多肽具有与人LAG-3多肽的胞外部分(例如，含有前两个Ig样域的胞外部分)基本上相同的胞外部分。在一些实施方案中，人LAG-3多肽的胞外部分以人LAG-3多肽，诸如SEQ ID NO:6中示出的人LAG-3多肽的氨基酸残基21-260、23-260或29-260表示。
在多个实施方案中，本文所述的非人动物产生的人源化Lag-3多肽具有胞外部分，所述胞外部分包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的氨基酸残基29-260基本上相同或相同的氨基酸序列。
在多个实施方案中，本文所述的非人动物产生的人源化Lag-3多肽具有胞外部分，所述胞外部分包含与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的氨基酸残基23-260至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)相同的氨基酸序列。
在多个实施方案中，本文所述的非人动物产生的人源化Lag-3多肽具有胞外部分，所述胞外部分包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的氨基酸残基23-260基本上相同或相同的氨基酸序列。
在多个实施方案中，本文所述的非人动物产生的人源化Lag-3多肽具有胞外部分，所述胞外部分包含与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的氨基酸残基21-260至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)相同的氨基酸序列。
在多个实施方案中，本文所述的非人动物产生的人源化Lag-3多肽具有胞外部分，所述胞外部分包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的氨基酸残基21-260基本上相同或相同的氨基酸序列。
在多个实施方案中，本文所述的非人动物产生的人源化Lag-3多肽具有非人Lag-3多肽的跨膜部分和胞质部分，例如非人动物的内源性Lag-3多肽的跨膜和胞质域。在一些实施方案中，非人Lag-3多肽的跨膜和胞质域序列是图8所示的那些序列。在一些实施方案中，本文所述的非人动物产生的人源化Lag-3多肽还具有含有非人Lag-3多肽的后两个Ig样域的胞外部分。
在多个实施方案中，本文所述的非人动物产生的人源化Lag-3多肽具有与SEQ IDNO:8的氨基酸序列至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)相同的氨基酸序列。
在多个实施方案中，本文所述的非人动物产生的人源化Lag-3多肽具有与SEQ IDNO:8的氨基酸序列基本上相同或相同的氨基酸序列。
提供了用于制备表达人源化Lag-3多肽，包括特定的多态性形式、等位基因变体(例如，单氨基酸差异)或者剪接同种型的非人动物的组合物和方法，包括用于制备从人启动子和人调控序列表达此类多肽的非人动物的组合物和方法。在一些实施方案中，还提供了用于制备从非人启动子和非人调控序列表达此类蛋白质的非人动物的组合物和方法。在一些实施方案中，还提供用于制备从内源性启动子和内源性调节序列表达此类蛋白质的非人动物的组合物和方法。在某些实施方案中，内源性启动子和内源性调节序列为内源性啮齿类动物启动子和内源性啮齿类动物调节序列。所述方法包括将编码人LAG-3多肽的全部或部分的遗传物质插入内源性Lag-3基因对应的非人动物基因组中的精确位置，从而形成表达Lag-3蛋白质的人全部或部分的人源化Lag-3基因。在一些实施方案中，所述方法包括将人LAG-3基因的外显子2、3和4对应的基因组DNA插入非人动物的内源性Lag-3基因，从而形成编码Lag-3多肽的人源化基因，所述Lag-3多肽包含含有插入的外显子编码的氨基酸的人部分。
在适当时，编码人(或人源化)Lag-3多肽的全部或部分的遗传物质或一个或多个多核苷酸序列的编码区可以修饰为包括被优化用于在非人动物中从细胞表达的密码子(例如，参见美国专利No.5,670,356和5,874,304)。密码子优化序列为合成序列，并且优选地编码与非密码子优化亲代多核苷酸所编码的多肽相同的多肽(或具有与全长多肽基本上相同活性的全长多肽的生物活性片段)。在一些实施方案中，编码人(或人源化)Lag-3多肽的全部或部分的遗传物质的编码区可以包括为特定细胞类型(例如，啮齿类动物细胞)而优化密码子使用的改变的序列。例如，待插入非人动物(例如，啮齿类动物)的内源性Lag-3基因的人LAG-3基因的外显子2、3和4对应的基因组DNA的密码子可优化用于在非人动物的细胞中表达。此序列可描述为密码子优化序列。
用于产生转基因非人动物的方法，包括敲除和敲入，是本领域熟知的(参见例如Gene Targeting:A Practical Approach,Joyner编,Oxford University Press,Inc.(2000))。例如，转基因啮齿类动物的产生可以任选地涉及一个或多个内源性啮齿类动物基因(或基因区段)的遗传基因座的断裂以及一个或多个异源基因(或Lag-3编码序列)引入啮齿类动物基因组，在一些实施方案中，与内源性啮齿类动物基因(或基因区段)相同的位置处。
在一些实施方案中，将本文所述的异源(或人源化)Lag-3基因或异源Lag-3编码序列随机引入啮齿类动物的基因组。在此类实施方案，随机包含、含有或者携带引入的异源(或人源化Lag-3基因或异源Lag-3编码序列)的啮齿类动物可以表征为具有异源Lag-3转基因或异源Lag-3转基因构建体。通常，转基因和/或转基因构建体尤其包括使用本文描述的或者本领域已知的方法通过人工引入非人细胞(例如，啮齿类动物胚胎干细胞)的核酸序列(编码例如所关注的多肽的全部或部分)。另外，转基因可以是对于其引入的非人动物或细胞部分或完全异源的，即外源的。转基因还可以包含一个或多个转录调控序列和任何其他核酸，诸如内含子或启动子，它们可能是所选的核酸序列的表达所必需的。在一些实施方案中，将本文所述的异源(或人源化)Lag-3基因或异源Lag-3编码序列引入啮齿类动物的基因组中的内源性Lag-3基因；在某些实施方案中，内源性Lag-3基因座被改变、修饰或工程化为含有可操作地连接到一个或多个非人Lag-3序列(或基因片段)的人Lag-3序列(或基因片段)。
人源化Lag-3基因方法采用内源性蛋白质相互作用和信号转导的相对极小修饰，并在非人动物中产生天然的Lag-3介导的信号转导，在多个实施方案中，因为Lag-3序列的基因组序列在单个片段中修饰，所以通过包括必需的调控序列保持正常功能。因此，在此类实施方案中，Lag-3基因修饰不影响其他周围的基因或其他内源性Lag-3相互作用基因(例如，MHC II类分子)。另外，在多个实施方案中，修饰不影响功能性Lag-3跨膜多肽在细胞膜上的组装，并经由结合和随后的信号转导通过多肽胞质部分(其不受修饰的影响)来维持正常的效应子功能。
内源性鼠科Lag-3基因和人LAG-3基因的基因组组织的示意图(未按比例绘制)提供于图1中。使用含有人LAG-3基因的外显子2、3和4和内含子4的一部分(例如，约68bp)的基因组片段来使内源性鼠科Lag-3基因人源化的示例性方法提供于图3中。如图所示，将人LAG-3基因的外显子2、3和4和内含子4的一部分对应的1,741bp合成DNA片段通过靶向构建体插入内源性鼠科Lag-3基因座的1,750bp序列的位置。1,741bp合成DNA片段可以从人DNA直接克隆或从来源序列(例如，GenBank登录号NM_002286.5、SEQ ID NO:9)合成。此基因组DNA包含编码负责配体结合的人LAG-3多肽的至少氨基酸残基29-260(或23-260或21-260)的基因的部分。
在内源性Lag-3基因座上具有人源化Lag-3基因的非人动物(例如，小鼠)可通过本领域已知的任何方法制备。例如，靶向载体可制备为引入具有选择性标记基因的人LAG-3基因的全部或部分。图3示出了含有小鼠基因组的内源性Lag-3基因座的靶向载体，所述小鼠基因组包含人LAG-3基因的外显子2-4和内含子4的前68bp对应的1,741bp合成DNA片段插入物。如图所示，靶向构建体包含含有内源性鼠科Lag-3基因(～46Kb)的外显子2上游的序列(即，外显子1等)的5’同源臂，然后是1,741bp合成DNA片段、药物选择盒(例如，loxP序列两侧侧接的新霉素抗性基因；～5Kb)以及含有内源性鼠科Lag-3基因(～53Kb)的内源性鼠科外显子5-8的其余序列的3’同源臂。靶向构建体含有自缺失药物选择盒(例如，loxP序列侧接的新霉素抗性基因；参见美国专利No.8,697,851、8,518,392和8,354,389，所有这些专利以引用方式并入本文)。在胚胎干细胞中电穿孔时，产生修饰的内源性Lag-3基因，所述修饰的内源性Lag-3基因在内源性野生型Lag-3基因的1,750bp位置包含1,741bp的人LAG-3基因(即，外显子2-4和内含子4的前68bp)，所述内源性野生型Lag-3基因包含在靶向载体中。产生人源化Lag-3基因，得到表达含有1,741bp合成DNA片段(即，人LAG-3基因的外显子2-4和内含子4的前68bp)编码的氨基酸的人源化Lag-3多肽的细胞或非人动物。药物选择盒以发育依赖性方式移除，即从种系细胞包含上述人源化Lag-3基因的小鼠衍生的子代将在发育期间使选择性标记从分化的细胞脱落(参见图3的底部)。
在一些实施方案中，本文所述的具有人源化Lag-3基因的非人动物可以表征为人源化Lag-3基因转基因或转基因Lag-3非人动物。这种描述在本文中可互换使用，是指任何非天然存在的非人动物，其中非人动物的一种或多种细胞含有本文所述的异源Lag-3核酸序列和/或编码Lag-3的序列的全部或部分。在一些实施方案中，将异源Lag-3核酸序列和/或编码Lag-3的序列的全部或部分直接引入细胞或通过引入前体细胞来间接引入细胞，所述引入细胞以有意遗传操纵，诸如通过显微注射或通过重组病毒感染的方式进行。在此类实施方案中，遗传操纵不包括经典繁育技术，而是涉及含有本文所述的异源Lag-3核酸序列和/或编码Lag-3的序列的全部或部分的一种或多种重组DNA分子的引入。这种分子可以整合在染色体内，或它可以是染色体外复制的DNA。如本文所述，转基因非人动物包括异源Lag-3核酸序列和/或编码Lag-3的序列的全部或部分杂合的或纯合的动物，和/或具有单个或多个拷贝的本文所述的异源Lag-3核酸序列和/或编码Lag-3的序列的全部或部分的动物。
转基因首建者非人动物可以根据其基因组中存在人源化Lag-3基因和/或在非人动物的组织或细胞中表达含有插入的遗传物质编码的氨基酸的Lag-3多肽鉴定。然后转基因首建者非人动物可以用于繁育携带人源化Lag-3基因的另外的非人动物，从而形成一系列各自携带一个或多个拷贝的人源化Lag-3基因的非人动物。此外，根据需要，携带人源化Lag-3基因的转基因非人动物还可以与携带其他转基因(例如，人免疫球蛋白基因)的其他转基因非人动物交配。
还可以产生含有所选的系统的转基因非人动物，这些系统允许调节或引导人源化Lag-3基因(或人源化Lag-3转基因)的表达。示例性系统包括噬菌体P1的Cre/loxP重组酶系统(参见例如Lakso,M.等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:6232-6236)和酿酒酵母的FLP/Frt重组酶系统(O’Gorman,S.等人,1991,Science 251:1351-1355)。此类动物可以通过构建“双”转基因动物，例如通过使两种转基因动物交配来提供，其中一种含有包含所选的修饰(例如，人源化Lag-3基因或转基因)的转基因，另一种含有编码重组酶(例如，Cre重组酶)的转基因。
本文所述的非人动物可以如上文所述那样或使用本领域已知的方法制备为包含另外的人或人源化基因，这通常取决于非人动物的预期用途。此类另外的人或人源化基因的遗传物质可通过进一步改变具有上述遗传修饰的细胞(例如，胚胎干细胞)的基因组，或通过本领域已知的繁育技术利用所需的其他基因修饰品系引入。在一些实施方案中，本文所述的非人动物制备为另外包含一个或多个选自以下的人或人源化基因：程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、程序性死亡配体1(PD-L1)和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)。在一些实施方案中，本文所述的非人动物可以通过将本文所述的靶向载体引入修饰品系的细胞来制备。在一些实施方案中，本文所述的非人动物制备为另外包含人或人源化程序性细胞死亡蛋白1(Pdcd1)基因。在一些实施方案中，本文所述的非人动物包含本文所述的人源化Lag-3基因和来自异源物种(例如，人)的遗传物质，其中所述遗传物质编码一种或多种选自以下的异源蛋白质的全部或部分：程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、程序性死亡配体1(PD-L1)和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)。在某些实施方案中，本文所述的非人动物包含本文所述的人源化Lag-3基因和来自异源物种(例如，人)的遗传物质，其中所述遗传物质编码异源(例如，人)PD-1多肽的全部或部分。在某些实施方案中，本文所述的非人动物还包含含有内源性部分和人部分(例如，人PDCD1基因的外显子2和外显子3的全部或部分)的Pdcd1基因，其中所述人部分编码基本上全部人PD-1多肽的胞外域(例如，人PD-1多肽的残基27-169或26-169对应的氨基酸)，内源性部分编码内源性PD-1多肽的胞内域；在一些实施方案中，人部分和内源性部分可操作地连接到内源性Pdcd1启动子。在某些实施方案中，本文所述的非人动物还包含含有遗传物质的Pdcd1基因，所述遗传物质编码基本上全部人PD-1多肽的胞外域(例如，编码人PD-1多肽的残基27-169或26-169对应的氨基酸的遗传物质；参见例如2015年6月19日提交的并且以WO2015196051公布的PCT/US15/36649的SEQ ID NO:23，和/或2015年6月19日提交的并且以US 2015-0366174A1公布的美国专利申请No.14/744,592的SEQ ID NO:23；这两个专利申请以引用方式并入本文)。GenBank登录号NM_005018.2和NP_005009.2，以及UniProt ID Q15116提供了由其可以获得所需的人部分的人PDCD1基因和人PD-1多肽的代表性来源序列。
例如，如本文所述，包含本文所述的人源化Lag-3基因的非人动物还可以包含(例如，经由杂交或多基因靶向策略)2015年6月19日提交的并且以WO2015196051公布的PCT/US15/36649和2015年6月19日提交的并且以US 2015-0366174A1公布的美国专利申请No.14/744,592所描述的一个或多个修饰；这些专利申请全文以引用方式并入本文。在某些实施方案中，使包含本文所述的人源化Lag-3基因的啮齿类动物与包含人源化Pdcd1基因(例如，可操作地连接到内源性啮齿类动物Pdcd1基因的外显子1、外显子3、4和5的一部分的人PDCD1基因的外显子2和外显子3的一部分)的啮齿类动物交配，使得人源化Pdcd1基因编码PD-1多肽，所述PD-1多肽包含人PD-1多肽的胞外部分(例如，对应于氨基酸残基27-169或26-169)和啮齿类动物PD-1多肽蛋白的胞内部分(参见例如2015年6月19日提交的并且以WO2015196051公布的PCT/US15/36649的SEQ ID NO:5和6，和/或2015年6月19日提交的并且以US 2015-0366174A1公布的美国专利申请No.14/744,592的SEQ ID NO:5和6；这两个专利申请以引用方式并入本文)。在某些实施方案中，使包含本文所述的人源化Lag-3基因的啮齿类动物与包含人源化Pdcd1基因的啮齿类动物交配，所述人源化Pdcd1基因包含编码人PD-1多肽的胞外域的遗传物质(例如，编码人PD-1多肽的残基27-169或26-169对应的氨基酸的遗传物质；参见例如2015年6月19日提交的并且以WO2015196051公布的PCT/US15/36649的SEQ ID NO:23，和/或2015年6月19日提交的并且以US 2015-0366174A1公布的美国专利申请No.14/744,592的SEQ ID NO:23；这两个专利申请以引用方式并入本文)。
在一些实施方案中，人源化Pdcd1基因包含非人(例如，啮齿类动物)Pdcd1外显子1、人PDCD1外显子2、外显子3(其包含人PDCD1基因的外显子3的一部分和非人(例如，啮齿类动物)Pdcd1基因的外显子3的一部分)，以及非人(例如，啮齿类动物)Pdcd1基因的外显子4-5，其中在一些实施方案中，人PDCD1基因的外显子3的一部分是编码作为人PD-1多肽的胞外域的一部分的氨基酸，诸如PD-1茎序列的氨基酸的人外显子3的5'部分，并且非人Pdcd1基因的外显子3的一部分是编码作为非人PD-1多肽的跨膜域的一部分的氨基酸的非人外显子3的3'部分。在具体实施方案中，人源化Pdcd1基因编码人源化PD-1多肽，所述人源化PD-1多肽包含与人PD-1多肽的胞外域基本上相同的胞外域，与啮齿类动物PD-1多肽的跨膜域基本上相同的跨膜域，和啮齿类动物PD-1多肽的胞内域。
虽然本文广泛讨论了将人源化Lag-3基因用于小鼠(即，具有编码包含人部分和小鼠部分的Lag-3多肽的Lag-3基因的小鼠)的实施方案，但还提供了包含人源化Lag-3基因的其他非人动物。在一些实施方案中，此类非人动物包含可操作地连接到啮齿类动物Lag-3启动子的人源化Lag-3基因。在一些实施方案中，此类非人动物包含可操作地连接到内源性Lag-3启动子；在一些实施方案中，内源性啮齿类动物Lag-3启动子的人源化Lag-3基因。在一些实施方案中，此类非人动物表达来自内源性基因座的人源化Lag-3多肽，其中所述人源化Lag-3多肽包含人LAG-3多肽的至少氨基酸残基29-260(例如，29-260、23-260或21-260)。此类非人动物包括可以遗传修饰为表达本文公开的Lag-3多肽的那些动物中的任一种，包括例如哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、猪、牛(例如，奶牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、狗、貂、灵长类动物(例如，狨猴、猕猴)等。例如，对于那些适当的可经遗传修饰的ES细胞不容易获得的非人动物，采用其他方法来制备包含遗传修饰的非人动物。此类方法包括例如修饰非ES细胞基因组(例如成纤维细胞或诱导的多能细胞)并利用体细胞核转移(SCNT)来将遗传修饰的基因组转移至合适的细胞，例如去核卵母细胞，以及在适于形成胚胎的条件下在非人动物中孕育所述修饰的细胞(例如修饰的卵母细胞)。
用于修饰非人动物基因组(例如，猪、奶牛、啮齿类动物、鸡等基因组)的方法包括例如利用锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应子核酸酶(TALEN)或Cas蛋白(即，CRISPR/Cas系统)将基因组修饰为包含人源化Lag-3和/或人源化Pdcd1基因。
采用具有人源化Lag-3基因的非人动物的方法
人源化小鼠用于生物医学研究提高了对人细胞，特别是人免疫细胞功能的许多方面的理解。事实上，许多免疫受损品系的使用为人免疫细胞研究提供了有价值的体内系统。然而，它们并非不受限制。例如，这些模型的使用突出了哺乳动物生物学，特别是哺乳动物免疫学的显著差异。将免疫受损小鼠用于评估靶标免疫调节并不理想，因为此类小鼠中观察到的异常免疫功能往往会混淆对显示的表型的理解。在对肿瘤的免疫应答的上下文中更是如此。直到最近，在小鼠中对肿瘤的免疫应答(例如，T细胞应答)的研究受到特别是由于不同来源(即，供体)的移植人细胞而导致的HLA错配混淆(Shultz,L.D.等人,2010,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.107(29):13022-7)。
肿瘤细胞可以通过改变T细胞中的共刺激途径来逃离免疫识别和效应子应答。共刺激途径通过调节抗原刺激的环境内免疫应答的大小和持续时间来介导T细胞活化、耐受性和免疫介导的组织损伤之间的平衡。淋巴细胞活化基因3(Lag-3)是T细胞活性的负调节剂，并且控制记忆T细胞库的大小(Workman,C.J.等人,2004,J.Immunol.172:5450-5)。已经报道抗原经历的CD4+和CD8+ T细胞上Lag-3的功能作用，并且T细胞受体(TCR)接合后这些细胞上Lag-3的上调会导致对T细胞增殖、活化和促炎性细胞因子产生的造成负面影响(Huard,B.等人,1994,Eur.J.Immunol.24(12):3216-21；Huard,B.等人,1994,Immunogenetics 39(3):213-7；Macon-Lemaitre,L.和F.Triebel,2005,Immunol.115:170-8；Goldberg,M.V.和C.G.Drake,2011,Curr.Top.Microbiol.Immunol.344:269-78)。据报道，Lag-3阻断增强了T细胞中的抗肿瘤应答(Grosso,J.F.等人,2007,J.Clin.Invest.117:3383-92)。T细胞活性的负调节涉及的其他抑制性受体包括程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)。除了其配体程序性死亡配体1(PD-L1、B7-H1或CD274)和PD-L2(B7-DC或CD273)之外，PD-1还提供了对于建立和维持对环境和自身抗原的免疫耐受性关键的检查点信号(Francisco,L.M.等人,2010,Immunol.Rev.236:219-42)。据报道，PD-1类似于Lag-3，在逃避抗肿瘤免疫中发挥作用，其允许肿瘤细胞通过宿主免疫系统来逃离免疫监视(Zou,C.2008,Nat.Rev.Immunol.8:467-77)。
本发明尤其基于以下认识：在癌症的上下文中，这些抑制性受体的表达与抗原特异性T细胞功能受损相关。本发明还基于以下认识：利用免疫检查点的体内系统的形成可以使用本文所述的人源化Lag-3基因和/或人源化Pdcd1基因制备。这种改进的体内系统允许开发专注于刺激癌症患者中的抗肿瘤免疫的抗免疫检查点治疗剂和/或治疗方案。另外，这种改进的体内系统还提供了专注于增强感染性和/或自体免疫疾病中的T细胞活性的治疗剂和/或治疗方案的开发。
如本文所述的非人动物提供了改进的体内系统和表达可用于许多测定的人(或人源化)Lag-3的生物材料(例如，细胞)来源。在多个实施方案中，本文所述的非人动物用于开发靶向Lag-3和/或调节Lag-3信号转导(例如，破坏与Lag-3结合伴侣，诸如MHC II类分子的相互作用)的治疗剂。在多个实施方案中，本文所述的非人动物用于筛选和开发阻断人Lag-3与人MHC II类分子的相互作用的候选治疗剂(例如，抗体)。在多个实施方案中，本文所述的非人动物用于确定本文所述的非人动物的细胞表面上的人源化Lag-3的拮抗剂和/或激动剂的结合性质；在一些实施方案中，本文所述的非人动物用于确定结合人Lag-3的一个或多个候选治疗抗体的一个或多个表位。
在多个实施方案中，本文所述的非人动物用于确定抗Lag-3抗体的药代动力学性质。在多个实施方案中，一种或多种本文所述的非人动物和一种或多种对照或参照非人动物各自以多个剂量(例如，0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/mg、7.5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg或50mg/kg或更高)暴露于一种或多种候选治疗性抗Lag-3抗体。候选治疗性抗体可经由各种所需的施用途径(包括肠胃外和非肠胃外施用途径)来给药。肠胃外途径包括例如静脉内、动脉内、门静脉内、肌内、皮下、腹膜内、脊柱内、鞘内、脑室内、颅内、胸膜内或其他注射途径。非肠胃外途径包括例如经服、经鼻、经皮、经肺、经直肠、经颊面、经阴道、经眼。施用还可通过连续输注、局部施用、从植入物(凝胶、膜等)持续释放和/或静脉内注射来进行。在多个时间点(例如0hr、6hr、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天或最多30或更多天)从非人动物(人源化和对照组)分离血液。可使用得自如文中所述的非人动物的样本进行各种测定以确定施用的候选治疗性抗体的药代动力学性质，包括但不限于总IgG、抗-治疗性抗体应答、凝集等。
在多个实施方案中，本文所述的非人动物用于测定阻断或调节Lag-3信号转导的治疗效果以及作为细胞变化的结果对基因表达的作用。在多个实施方案中，本文所述的非人动物或从其分离的细胞暴露于结合非人动物的细胞表面上的人源化Lag-3多肽(或Lag-3多肽的人部分)的候选治疗剂，在随后的一段时间后，分析对Lag-3依赖性过程，例如粘附、凋亡、细胞因子产生、发炎、增殖、自体耐受性和病毒感染(或应答)的作用。
本文所述的非人动物表达人源化Lag-3多肽，因此可以产生细胞、细胞系和细胞培养物，以作为用于结合和功能测定的人源化Lag-3的来源，例如分析Lag-3拮抗剂或激动剂的结合或功能，特别是其中拮抗剂或激动剂对人Lag-3序列或表位具有特异性，或者对MHCII类分子相关的人Lag-3序列或表位具有特异性的情况下。在多个实施方案中，候选治疗抗体结合的Lag-3表位可使用从本文所述的非人动物分离的细胞来确定。在多个实施方案中，本文所述的非人动物表达的人源化Lag-3多肽可以包含变体氨基酸序列。在多个实施方案中，本文所述的非人动物表达人源化Lag-3多肽变体。在多个实施方案中，变体在与配体结合相关联的氨基酸位置上具有多态性。在多个实施方案中，本文所述的非人动物用于通过与人Lag-3的多态性变体的相互作用来确定配体结合的效应。
本文所述的非人动物的细胞可以随时分离和使用，或可以在培养中维持多代。在多个实施方案中，来自本文所述的非人动物的细胞是永生化的(例如，通过使用病毒)并且在培养中无限期维持(例如，在连续培养中)。
在多个实施方案中，本文所述的细胞和/或非人动物用于许多免疫方案，以确定对抗原的免疫应答中Lag-3介导的功能。在一些实施方案中，在本文所述的非人动物中表征了结合或阻断人(或人源化)Lag-3的一种或多种功能的候选治疗剂。合适的测量包括多种细胞测定、增殖测定、血清免疫球蛋白测定(例如，抗体滴定)、细胞毒性测定和免疫沉淀测定(例如，配体-受体相互作用的表征)。在一些实施方案中，本文所述的非人动物用于表征Lag-3介导的调节对抗原的免疫应答的功能。在一些实施方案中，抗原与自体免疫疾病、障碍或病症相关联。在一些实施方案中，抗原与炎性疾病、障碍或病症相关联。在一些实施方案中，抗原与癌症或赘生物(例如，HPV、HCV、HIV、EBV、HHV-8、HTLV-1、MCV等)相关。在一些实施方案中，抗原为测试抗原(例如，卵白蛋白或OVA)。在一些实施方案中，抗原为与需要治疗的一个或多个患者所患有的疾病或病症相关联的靶标。
在多个实施方案中，本文所述的非人动物用于确定自身抗体产生的滴定度的血清测定，以用于测试靶向人Lag-3的候选治疗剂的药物毒理学方面。在一些实施方案中，本文所述的非人动物中的自身抗体产生由非人动物中诱导的一种或多种自体免疫疾病、障碍或病症引起。
在多个实施方案中，本文所述的非人动物用于使用一种或多种抗原进行挑战，以确定化合物或生物制剂调节免疫应答(包括但不限于针对给定抗原的特定T细胞依赖性应答)的Lag-3依赖性调节的治疗潜力。
在多个实施方案中，本文所述的细胞和/或非人动物用于存活和/或增殖测定(例如，利用T和/或B细胞)，以筛选和开发调节人Lag-3信号转导的候选治疗剂。Lag-3的活化或丧失在调节T细胞应答中起到重要作用，并且Lag-3的自体耐受性调节可由Lag-3的胞外域的特定表位的活化引起，所以可以使用本文所述的非人动物的细胞和/或本文所述的非人动物来鉴定、表征和开发候选Lag-3调节剂(例如，拮抗剂或激动剂)。在一些实施方案中，本文所述的细胞和/或非人动物用于一种或多种存活或死亡测定，以确定在存在或不存在Lag-3的情况下对一种或多种特定细胞(例如，癌细胞)的增殖或凋亡的作用。
在多个实施方案中，本文所述的细胞和/或非人动物用于异源(例如，人)细胞或组织的异种移植，以确定对移植的人细胞或组织的生理(例如，免疫)应答中Lag-3介导的功能。在一些实施方案中，结合或阻断人LAG-3的一种或多种功能的候选治疗剂在本文所述的非人动物中表征。合适的测量包括各种细胞测定、增殖测定、血清免疫球蛋白测定(例如，抗体滴度)、细胞毒性测定以及配体-受体相互作用的表征(免疫沉淀测定)。在一些实施方案中，本文所述的非人动物用于表征Lag-3介导的调节对抗原的免疫应答的功能。在一些实施方案中，抗原与瘤相关联。在一些实施方案中，抗原与自体免疫疾病、障碍或病症相关联。在一些实施方案中，抗原与炎性疾病、障碍或病症相关联。在一些实施方案中，抗原与癌症或赘生物相关联。在一些实施方案中，抗原为与需要治疗的一个或多个患者所患有的疾病或病症相关联的靶标。
在多个实施方案中，本文所述的非人动物用于移植或过继转移实验，以确定化合物或生物制剂调节新淋巴细胞及其免疫功能的Lag-3依赖性调节的治疗潜力。在多个实施方案中，本文所述的非人动物移植有人T细胞；在一些实施方案中，未暴露的T细胞；在一些实施方案中，活化的T细胞；在一些实施方案中，调节性T细胞(Treg)；在一些实施方案中，记忆T细胞。
在多个实施方案中，本文所述的非人动物细胞用于T细胞测定，以确定化合物或生物制剂调节T细胞依赖性应答和功能的Lag-3依赖性调节的治疗潜力。示例性T细胞测定包括但不限于ELISpot、胞内细胞因子染色、主要组织相容性复合体(MHC)限制性、病毒抑制测定、细胞毒性测定、增殖测定和调节性T细胞抑制测定。
在多个实施方案中，本文所述的非人动物的细胞用于细胞移行测定，以筛选和开发调节人Lag-3的候选治疗剂。细胞移行涉及细胞横跨内皮的迁移，并且移行测定允许测量通过白细胞或肿瘤细胞与内皮的相互作用及其移行。
在多个实施方案中，本文所述的非人动物的细胞用于肿瘤细胞生长(或增殖)测定，以确定化合物或生物制剂调节肿瘤细胞的Lag-3依赖性调节、凋亡和/或抑制的治疗潜力。
在多个实施方案中，本文所述的非人动物的细胞用于细胞因子产生测定，以确定化合物或生物制剂调节细胞因子从T细胞释放的Lag-3依赖性调节的治疗潜力。在一些实施方案中，本文所述的非人动物的细胞用于由人源化Lag-3与靶向人LAG-3的药物或Lag-3结合伴侣(例如，MHC II类)的相互作用产生的胞内细胞因子释放的检测(和/或测定)。
在多个实施方案中，在本文所述的一种或多种非人动物中诱导自体免疫疾病、障碍或病症以提供体内系统，所述体内系统用于确定化合物或生物制剂调节自体免疫疾病、障碍或病症的一种或多种功能的Lag-3依赖性调节的治疗潜力。自体免疫疾病、障碍或病症可以在一种或多种本文所述的非人动物中诱导，然后根据需要施用一种或多种化合物或生物制剂。
本文所述的非人动物提供了用于分析和测试药物或疫苗的体内系统。在多个实施方案中，候选药物或疫苗可以递送至一种或多种本文所述的非人动物，然后监测该非人动物以确定对药物或疫苗的一种或多种免疫应答、药物或疫苗的安全性质，或对疾病或病症的作用。在一些实施方案中，疫苗靶向病毒，比如人类免疫缺陷病毒(HIV)或肝炎病毒(例如，HCV)。用于确定安全性质的示例性方法包括测量毒性、最佳剂量浓度、药物或疫苗的功效和可能的风险因素。此类药物或疫苗可在此类非人动物中进行改进和/或开发。
本文所述的非人动物提供体内系统，所述体内系统用于评估靶向人LAG-3的药物的药代动力学性质。在多个实施方案中，靶向人LAG-3的药物可以递送或施用于一种或多种本文所述的非人动物，然后监测非人动物(或从其分离的细胞)或对其进行一种或多种测定，以确定药物对非人动物的作用。药代动力学性质包括但不限于动物将药物处理成各种代谢物的方式(或一种或多种药物代谢物，包括毒性代谢物的存在或不存在的检测)、药物半衰期、施用后药物的循环水平(例如药物的血清浓度)、抗药物应答(例如抗药物抗体)、药物吸收和分布、施用途径、排泄途径和/或药物清除。在一些实施方案中，药物(例如，PD-1调节剂)的药代动力学和药效动力学性质在本文所述的非人动物中或通过使用本文所述的非人动物监测。
在一些实施方案中，进行测定包括确定对施用药物的非人动物的表型(例如体重改变)和/或基因型的效应。在一些实施方案中，进行测定包括确定Lag-3调节剂(例如，拮抗剂或激动剂)的批次间差异。在一些实施方案中，进行测定包括确定将靶向Lag-3的药物施用于本文所述的非人动物和参照非人动物的作用之间的差异。在多个实施方案中，参照非人动物可以具有本文所述的修饰、与本文所述的修饰不同的修饰(例如，具有断裂、缺失或者非功能性Lag-3基因和/或Pdcd1基因的修饰，或Pdcd1基因的人源化)或无修饰(即，野生型非人动物)。
可以在非人动物(或在细胞中和/或使用由其分离的细胞)中测定，以评估靶向人LAG-3的药物的药代动力学性质的示例性参数包括但不限于凝集、自噬、细胞分裂、细胞死亡、补体介导的溶血、DNA完整性、药物特异性抗体滴定、药物代谢、基因表达阵列、代谢活性、线粒体活性、氧化应激、吞噬作用、蛋白质生物合成、蛋白质降解、蛋白质分泌、应激反应、靶组织药物浓缩、非靶组织药物浓缩、转录活性等等。在多个实施方案中，本文所述的非人动物用于确定Lag-3调节剂的药学有效剂量。
本文所述的非人动物提供了改进的体内系统，用于开发和表征用于癌症的候选治疗剂。在多个实施方案中，本文所述的非人动物可以移植有肿瘤，然后施用一种或多种候选治疗剂。在一些实施方案中，候选治疗剂可包括多特异性抗体(例如双特异性抗体)或抗体混合物；在一些实施方案中，候选治疗剂系包括联合疗法，例如依次或同时给药的单特异性抗体的施用。允许肿瘤有足够的时间建立在非人动物内的一或多个位置上。可在施用候选治疗之前和之后测量肿瘤细胞增殖、生长、存活等。也可在非人动物中测量候选治疗剂的细胞毒性。
本文所述的非人动物可用于开发一种或多种疾病模型，以评价或评估有效地治疗影响人的疾病、障碍或病症的候选治疗剂和/或治疗方案(例如，单一疗法、联合疗法、剂量范围测试等)。多种疾病病症可以在本文所述的非人动物中建立，然后施用一种或多种候选分子(例如，靶向Lag-3的药物)，从而可以确定一种或多种候选分子在疾病病症中的功效。在一些实施方案中，疾病模型包括自体免疫性、炎性和/或肿瘤性疾病、障碍或病症。
只是给出一个实例，本文所述的非人动物提供了改进的动物模型，以用于肿瘤或肿瘤细胞的预防性和/或治疗性治疗。在多个实施方案中，本文所述的非人动物可以移植有一种或多种肿瘤细胞，然后施用一种或多种候选治疗剂(例如，抗体)。在一些实施方案中，一种或多种候选治疗剂的施用在一种或多种肿瘤细胞的移植之后(例如，几分钟或几小时，但通常在同一天)进行，在本文所述的非人动物中评价一种或多种候选治疗剂在防止在所述非人动物中建立实体肿瘤和/或肿瘤细胞生长中的功效。在一些实施方案中，一种或多种候选治疗剂的施用在一种或多种肿瘤细胞的植入之后(例如，几天之后)，在某些实施方案中，在足以使得一种或多种移植的肿瘤细胞在本文所述的非人动物中达到预定大小(例如，体积)的时间之后进行；并且评价一种或多种候选治疗剂在治疗一种或多种建立的肿瘤中的功效。可以根据剂量将非人动物置于不同的治疗组，使得可以确定建立的肿瘤的有效治疗相关的最佳剂量或剂量范围。
本文所述的非人动物提供了体内系统，所述体内系统用于开发和/或表征包括用于癌症的靶向Lag-3和PD-1的药物的联合疗法。在多个实施方案中，本文所述的非人动物可以移植有一种或多种肿瘤细胞，然后施用靶向人LAG-3和人PD-1的药物(例如，抗体)。在一些实施方案中，靶向人Lag-3和人PD-1的药物的施用在一种或多种肿瘤细胞的移植之后(例如，几分钟、几小时或几天之后)进行，并且在本文所述的非人动物中评价联合疗法在防止在所述非人动物中建立实体肿瘤和/或肿瘤细胞生长中的功效。在一些实施方案中，靶向人Lag-3和人PD-1的药物的施用在足以使得一种或多种移植的肿瘤细胞在本文所述的非人动物中达到预定大小(例如，体积)的时间之后进行；并且评价联合疗法在治疗一种或多种建立的肿瘤中的功效。可以将非人动物置于不同的治疗组(包括单一疗法组)，使得可以确定建立的肿瘤的有效治疗相关的最佳治疗方案。
多种疾病病症可以在本文所述的非人动物中建立，然后施用一种或多种候选分子(例如，靶向Lag-3的药物)，从而可以确定一种或多种候选分子在疾病病症中的功效。在一些实施方案中，疾病模型包括自体免疫性、炎性和/或肿瘤性疾病、障碍或病症。
可使用包括肠胃外和非肠胃外施用途径在内的任何施用方法将候选分子施用给非人动物疾病模型。肠胃外途径包括例如静脉内、动脉内、门静脉内、肌内、皮下、腹膜内、脊柱内、鞘内、脑室内、颅内、胸膜内或其他注射途径。非肠胃外途径包括例如经服、经鼻、经皮、经肺、经直肠、经颊面、经阴道、经眼。施用还可通过连续输注、局部施用、从植入物(凝胶、膜等)持续释放和/或静脉内注射来进行。当在本文所述的非人动物中评价联合疗法时，候选分子可以经由相同的施用途径或经由不同的施用途径施用。当在本文所述的非人动物中评价给药方案时，候选分子可以两月一次、每月一次、三周一次、两周一次、每周一次、每日一次以可变的间隔和/或以逐步增加的浓度施用，以确定给药方案，所述给药方案在其中已建立一个或多个疾病模型的非人动物中显示出所需的治疗或预防效果。
本文所述的非人动物提供了改进的体内系统，所述体内系统用于开发和表征用于感染性疾病的候选治疗剂。在多个实施方案中，本文所述的非人动物可以通过病毒(例如，MHV、HIV、HCV、EBV等)或病原体(例如，细菌)注射而被感染，然后施用一种或多种候选治疗剂。在一些实施方案中，候选治疗剂可以包括多特异性抗体(例如，双特异性抗体)或抗体混合物；在一些实施方案中，候选治疗剂包括联合疗法，比如施用依次或同时给药的单特异性抗体；在一些实施方案中，候选治疗剂可以包括疫苗。允许病毒或病原体有足够的时间确立在非人动物内的一或多个位置或细胞中，使得与所述病毒或病原体相关联的一种或多种症状在非人动物中发展。可在施用候选治疗之前和之后测量T细胞增殖和生长。另外，可在病毒或病原体感染的非人动物中测量存活、血清和/或胞内细胞因子分析、肝脏和/或脾组织病理学。在一些实施方案中，本文所述的非人动物用于确定与病毒感染相关的器官损伤的程度。在一些实施方案中，本文所述的非人动物用于确定特定病毒感染的非人动物的多个器官中的细胞因子表达性质。
本文所述的非人动物可以用于评估靶向人细胞的治疗药物的功效。在多个实施方案中，本文所述的非人动物移植有人细胞，并且将靶向此类人细胞的候选药物施用于此类非人动物。然后通过在施用药物后监测非人动物中的人细胞来确定药物的治疗功效。可在非人动物中测试的药物包括小分子化合物，即分子量小于1500kD、1200kD、1000kD或800道尔顿的化合物，以及大分子化合物(例如蛋白质，如抗体)，其通过靶向人细胞(例如结合和/或作用其上)而对治疗人疾病和病症具有预期的治疗效果。
在一些实施方案中，药物为抗癌药物，并且人细胞为癌细胞，其可为原发癌的细胞或由原发癌所建立的细胞系的细胞。在这些实施方案中，本文所述的非人动物移植有人癌细胞，并且将抗癌药物给予非人动物。药物的功效可通过评估非人动物中的人癌细胞的生长或转移是否因施用该药物而受到抑制来加以确定。
在具体实施方案中，抗癌药物为抗体分子，其与人癌细胞上的抗原结合。在特定实施方案中，抗癌药物是结合人癌细胞上的抗原和其他人细胞例如人免疫系统细胞(或“人免疫细胞”)诸如T和B细胞上的抗原的双特异性抗体。
试剂盒
本发明还提供包装或试剂盒，其包括装有至少一种本文所述的非人动物、非人细胞、DNA片段(或构建体)和/或靶向载体的一个或多个容器。试剂盒可以用于任何适用的方法(例如，研究方法)。任选地与一个或多个此类容器相关的可以是由政府机构规定形式的注意事项，该注意事项规定药物或生物产品的制造、使用或销售，该注意事项反映了(a)机构关于用于人类施用的制造、使用或销售的批准，(b)使用说明或它们二者，或管理两个或更多个实体之间的材料和/或生物产品(例如，本文所述的非人动物或非人细胞)的转移的合约。
本发明的其他特征将在以下对示例性实施方案的描述的过程中显而易见，这些示例性实施方案是为了说明而给出的，而无意限制本发明。
实施例
提供以下实施例是为了向本领域普通技术人员描述如何制备和使用本发明的方法和组合物，而非旨在限制发明人所认为的其发明的范围。除非另外指明，否则所给出的温度为摄氏度，压力是大气压或接近大气压。
实施例1.内源性淋巴细胞活化基因3的人源化
本实施例示出了在非人哺乳动物诸如啮齿类动物(例如，小鼠)中人源化内源性淋巴细胞活化基因3(Lag-3)的示例性方法。本实施例中描述的方法可以用于根据需要使用任何人序列或人序列(或序列片段)的组合人源化非人动物的内源性Lag-3基因。在本实施例中，将含有GenBank登录号NM_002286.5(SEQ ID NO:9)中出现的人LAG3基因的外显子2、3和4的1,741bp合成DNA片段用于人源化小鼠的内源性Lag-3基因。本文产生的小鼠、人和示例性人源化蛋白质的比对如图2所示，其中人源化区域以下划线表示。图3示出了用于编码啮齿类动物Lag-3多肽的氨基酸21-260的遗传物质的人源化的靶向载体，该靶向载体使用
Figure BDA0001665051410000501
技术构建(参见例如美国专利No.6,586,251和Valenzuela等人,2003,Nature Biotech.21(6):652-659；这些文献以引用方式并入本文)。
简而言之，将小鼠细菌人工染色体(BAC)克隆bMQ-400O17(Invitrogen)修饰为使含有内源性Lag-3基因的外显子2-4(1,750bp)的序列缺失，并且使用1,741bp合成DNA片段将人LAG-3基因的外显子2、3和4插入，该合成DNA片段编码人LAG-3多肽的氨基酸21-260。保留含有外显子1、5、6、7和8以及5’和3’非翻译区(UTR)的内源性DNA。1,741bp合成DNA片段(即，对应于人LAG3基因的外显子2-4)的序列分析确认了所有人LAG-3外显子和剪接信号。序列分析揭示，该序列匹配参照基因组和LAG-3转录物NM_002286.5。
1,741bp合成DNA片段由Genescript Inc.(Piscataway,NJ)合成并克隆至氨苄青霉素抗性质粒载体。将唯一限制性酶识别位点用于连接由重组酶识别位点侧接的～4,996bp自缺失新霉素盒(loxP-hUb1-em7-Neo-pA-mPrm1-Crei-loxP；参见美国专利No.8,697,851、8,518,392和8,354,389，所有这些专利以引用方式并入本文)。后续选择采用新霉素。使靶向载体线性化，然后与小鼠BAC克隆bMQ-400O17同源重组。通过设计，人LAG-31,741bp片段和小鼠下游509bp之间的连接包含人LAG-3基因的内含子4的一部分(图3)。所得的靶向载体从5’至3’包含5’同源臂，其含有～46kb来自BAC克隆bMQ-400O17的小鼠基因组DNA、1,741bp合成DNA片段(对应于人LAG-3基因的外显子2-4和内含子4的一部分)、loxP位点侧接的自缺失新霉素盒以及～53kb来自BAC克隆bMQ-400O17的小鼠基因组DNA。
上述修饰的bMQ-400O17BAC克隆用于对小鼠胚胎干(ES)细胞进行电穿孔以形成修饰的ES细胞，所述修饰的ES细胞包含内源性Lag-3基因，所述内源性Lag-3基因从外显子2-4，包括内含子4的一部分人源化(即，缺失1,750bp内源性Lag-3基因，并且插入1,741bp人LAG-3序列)。含有人源化Lag-3基因的正向靶向的ES细胞通过测定(Valenzuela等人，出处同上)来鉴定，所述分析检测人LAG-3序列(例如，外显子2-4)的存在并且确认小鼠Lag-3序列(例如，外显子2-4和/或外显子1、4、5、6、7和8)的丧失和/或保留。表1示出了用于确认上述内源性Lag-3基因的人源化的引物和探针(图4)。
整个上游插入点的核苷酸序列包括以下序列，其指出了在插入点处与人LAG-3基因组序列邻接的内源性小鼠序列(包含在下面的括号内)：
Figure BDA0001665051410000511
Figure BDA0001665051410000512
(图9A)。
整个自缺失新霉素盒的5’末端的核苷酸序列包括以下序列，其指出了与插入点下游的盒序列(包含在下面的括号内，其中SalI-XhoI相容性末端以斜体表示并且loxP序列以加粗字体表示)邻接的人LAG-3基因组序列：
Figure BDA0001665051410000513
Figure BDA0001665051410000514
(图9B)。
整个自缺失新霉素盒的3’末端的下游插入点的核苷酸序列包括以下序列，其指出了与小鼠Lag-3基因组序列邻接的盒序列(包含在下面的括号内，其中loxP位点加粗表示，I-CeuI识别位点以下划线表示，NheI识别位点以斜体表示)：
Figure BDA0001665051410000515
Figure BDA0001665051410000516
Figure BDA0001665051410000517
(图9C)。
新霉素盒缺失(内含子4中的其余77bp)后整个上游插入点的核苷酸序列包括以下序列，其指出了与其余盒序列loxP序列并置的小鼠和人基因组序列(包含在下面的括号内，其中SalI-XhoI相容性末端以斜体表示，loxP位点加粗表示，I-CeuI限制性位点以下划线表示，NheI限制性位点以斜体表示)：
Figure BDA0001665051410000518
Figure BDA0001665051410000519
Figure BDA0001665051410000521
Figure BDA0001665051410000522
(图9D)。
然后使用
Figure BDA0001665051410000523
方法将阳性ES细胞克隆用于移植雌性小鼠(参见例如美国专利No.7,294,754和Poueymirou等人,2007,Nature Biotech.25(1):91-99)，以产生包含人LAG-3外显子2-4和人LAG-3内含子4的一部分插入小鼠的内源性Lag-3基因的一窝幼鼠。使用检测人LAG-3基因序列的存在的前述测定，通过从剪尾分离的DNA基因分型再次确认和鉴定携带内源性Lag-3基因的外显子2-4(即，1,741bp合成DNA片段)人源化的小鼠(Valenzuela等人，出处同上)(图4)。将幼鼠进行基因分型并选择针对人源化Lag-3基因构建体杂合的动物队列进行表征。
表1
Figure BDA0001665051410000524
实施例2.人源化Lag-3在活化的T细胞上的表达
本实施例显示出，根据实施例1被修饰为包含人源化Lag-3基因的非人动物(例如，啮齿类动物)在活化的淋巴细胞表面上表达人源化Lag-3多肽。具体地讲，用抗Lag-3抗体对来自野生型小鼠和人源化Lag-3纯合的小鼠的活化的T细胞(如上所述)染色，以确定抗CD3/抗CD28抗体刺激的T细胞中LAG-3的表达。另外，在人源化Lag-3小鼠的T细胞上检测到PD-1和LAG-3的表达，所述T细胞还包含人源化Pdcd1(PD-1)基因(双重人源化Lag3xPD1小鼠)。
首先，使用上述Lag-3靶向载体(参见实施例1)在人源化Pdcd1小鼠ES细胞中产生双重人源化Lag3xPD1小鼠胚胎干(ES)细胞(对于人源化PD-1小鼠和胚胎干细胞，参见2015年6月19日提交并且以US 2015-0366174A1公布的美国专利申请序列号14/744,592(特别包括其中的实施例1)，以及2015年6月19日提交并且以WO2015196051公布的国际专利申请No.PCT/US15036649；这两个专利申请以引用方式并入本文)。通过使实施例1中所述的Lag-3靶向载体电穿孔进入C57BL/6N小鼠胚胎干细胞来产生双重人源化小鼠ES细胞，所述C57BL/6N小鼠胚胎干细胞包含具有人部分和小鼠部分的PD-1多肽编码的人源化Pdcd1基因，所述人部分包含人PD-1多肽的胞外域。然后使用
Figure BDA0001665051410000531
方法将双重人源化ES细胞克隆用于移植雌性小鼠(参见例如美国专利No.7,294,754和Poueymirou等人,2007,Nature Biotech.25(1):91-99)，以产生包含两个人源化基因(即，Lag-3和Pdcd1)的一窝幼鼠。小鼠群通过杂交扩大。
简而言之，从根据实施例1制备的野生型人源化Lag-3小鼠、人源化PD-1小鼠和双重人源化Lag3xPD1小鼠(如上所述)收集脾脏，并通过机械分离处理成单细胞悬浮液。在培养基(补充有10％FBS的RPMI)中洗涤细胞，以1×106/mL和200μL(200,000个细胞)重悬，并接种于96孔板中。将所选细胞中的细胞用抗-CD3和抗-CD28抗体(均为1μg/mL)刺激72小时。使用识别CD4和CD8的抗体、针对人PD-1的BV421(亮紫421TM)缀合抗体(克隆EH12.2H7，Biolegend)、针对小鼠PD-1的BV421缀合抗体(克隆J43，BD Biosciences)、针对人LAG-3的别藻蓝蛋白缀合抗体(克隆3DS223H，eBioscience)、针对小鼠Lag-3的别藻蓝蛋白缀合抗体(克隆C9B7W，Biolegend)或对应的同种型对照根据制造商的说明对细胞进行FACS染色。将染色的细胞在LSRII流式细胞仪上运行并使用Flowjo软件分析数据。对表达人和小鼠Lag-3的CD4+ T细胞设门(CD19-CD4+)。代表性结果在图5中示出。
如图5所示，来自野生型小鼠的活化的CD4+ T细胞(图5，左列)显示出小鼠PD-1(左下)和小鼠Lag-3(左上第2)的稳健表达，但完全没有人PD-1和人LAG-3表达。这显示，抗人PD-1和抗人LAG-3抗体不会分别与小鼠PD-1和小鼠Lag-3蛋白交叉反应。来自单一人源化Lag-3小鼠的活化的CD4+ T细胞可检测地表达人源化Lag-3和小鼠PD-1，但不表达小鼠Lag-3和人PD-1(图5，从左第二列)。相应地，来自单一人源化Pdcd1小鼠的活化的CD4+ T细胞表达人源化PD-1和小鼠Lag-3，但没有小鼠PD-1和人LAG-3的任何表达(图5，从左第三列)。双重人源化Lag3xPD1小鼠显示出人而非小鼠PD-1和Lag-3蛋白的表达，这确认了这些小鼠中不产生全长小鼠PD-1和Lag-3多肽。
总而言之，本实施例显示，如实施例1所述携带人源化Lag-3基因的小鼠表达包含人部分和内源性小鼠部分的Lag-3多肽，所述人部分经由识别人LAG-3多肽的抗体的识别可检测地表达。本实施例还显示，表达人源化PD-1和人源化Lag-3多肽二者的双重人源化Lag3xPD1小鼠提供了用于测试抗Lag-3和/或抗PD1抗体的功效的体内系统。
实施例3LAG3和PD1调节剂的体内功效
本实施例显示，根据实施例1被修饰为包含人源化Lag-3基因的非人动物(例如，啮齿类动物)可用于体内测定，以筛选Lag-3和PD-1调节剂二者(例如，抗Lag-3和抗PD-1抗体)，并确定许多特性，比如肿瘤生长的抑制和/或肿瘤细胞的杀灭。在本实施例中，在实施例1所述的内源性Lag-3基因的人源化纯合的和内源性Pdcd1基因的人源化纯合的小鼠中筛选抗Lag-3和抗PD-1抗体，以确定使用抗Lag-3和抗PD1抗体的单一和联合疗法的功效。
起源于C57BL/6小鼠品系的小鼠腺癌细胞系MC38从美国国立卫生研究所(National Health Institute)保藏库获得。MC38.Ova细胞系通过稳定慢病毒转导而工程化为表达跨膜鸡卵清蛋白抗原(Ova)，以增加肿瘤免疫原性。测试细胞系的人和啮齿类动物病原体，然后植入小鼠。将细胞悬浮于100μl无血清RPMI培养基中，并皮下植入小鼠侧腹。
简而言之，使用植入双重人源化Lag3xPD1小鼠的MC38.Ova肿瘤检测抗Lag-3和抗PD-1抗体单独和组合的体内功效。在第0天给小鼠皮下植入MC38.Ova细胞，并随机分入四个治疗组(每个治疗组n＝7-12)。在第3、7、10、14和17天经由腹膜内注射给小鼠施用对照抗体(n＝7，25mg/kg)、抗Lag-3(n＝12，25mg/kg)、抗PD-1(n＝12，10mg/kg)或抗Lag-3和抗PD-1抗体组合(n＝12，分别为25mg/kg和10mg/kg)。在实验的持续时间(32天)内每周两次通过卡尺测量来监测肿瘤体积，并监测无肿瘤动物的肿瘤复发长达80天。代表性结果在图6中示出。
如图6所示，抗PD-1单一疗法导致肿瘤生长抑制，在12只动物的2只(17％)中出现肿瘤消退，而抗Lag-3单一疗法在该实验中无明显功效。在12只抗Lag-3抗体处理的小鼠的1只中观察到肿瘤消退。在第32天对照组存在无肿瘤的小鼠。相比之下，抗Lag-3和抗PD-1的联合疗法显示出MC38.Ova肿瘤生长的稳健抑制，在实验结束时12只小鼠中产生5只(42％)无肿瘤的小鼠(图6)。在移植后80天，这些无肿瘤的小鼠均未显示出肿瘤复发，这表明联合免疫疗法具有长期效果。
在单独的实验中，在第0天给双重人源化Lag3xPD1小鼠皮下接种MC38.Ova肿瘤细胞。在第10天，选择平均肿瘤体积为100mm3的小鼠，并随机分入四个治疗组。在第10、14、17、22天通过腹腔注射给小鼠施用抗Lag-3抗体(n＝9，25mg/kg)、抗PD-1抗体(n＝10，10mg/kg)、抗lag-3抗体和抗PD-1抗体组合(N＝11，分别为25mg/kg和10mg/kg)或对照抗体(n＝7，25mg/kg)。在肿瘤移植后28天监测肿瘤体积。
如图7所示，用抗hPD-1和抗hLAG-3抗体的组合治疗携带MC38.ova肿瘤的人源化小鼠(建立的肿瘤)引发了肿瘤内和外周T细胞的活化。抗hPD-1和抗hLAG-3抗体的组合显示出MC38.Ova肿瘤生长的稳健抑制。在这些小鼠中联合疗法还使得动物存活率以及存活时间显著提高(数据未示出)。
总而言之，本实施例显示，本文所述的非人动物可用于评估靶向Lag-3和/或PD-1的药物(例如，一种或多种抗体)的体内功效，并且此类动物可用于辨别使用抗PD-1抗体的抗Lag-3单一疗法和/或联合疗法的治疗性和预防性作用。此外，本文所述的非人动物可用于评估靶向Lag-3或PD-1的药物可抑制肿瘤生长和/或介导杀灭肿瘤细胞的程度。
等同物
在如此地描述了本发明的至少一个实施方案的若干方面后，本领域技术人员将理解，各种改变、修改和改进对于本领域技术人员来说将是容易进行的。此类改变、修改和改进旨在是本公开内容的一部分，并且旨在处于本发明的精神和范围之内。因此，上述描述和附图仅仅作为举例的方式，并且本发明通过下面的权利要求进行详细描述。
在权利要求中使用序数术语如"第一"、"第二"、"第三"等来修饰权利要求元素，其本身并不意味着一个权利要求要素相对于另一个要素的任何优先性、优先级或顺序或者其中执行方法行为的时间顺序，而是仅用作区分具有某一名称的一个权利要求元素与具有同一名称的另一个元素(但使用序数术语)的标记，以区分权利要求元素。
除非明确地指出相反，否则本文说明书和权利要求中所使用的冠词"一个"和"一种"在说明书和权利要求中应被理解为包括多个指代物。在组的一个或多个成员之间包括"或"的权利要求或描述应当被视为是满足以下情况，即组成员中的一个、多于一个或全部存在于、被应用于给定的产品或方法中，或以其他方式与给定的产品或方法相关，除非指出相反或根据上下文明显不同。本发明包括这样的实施方案，其中组中的一个确切成员存在于、被应用于给定的产品或方法中，或以其他方式与给定的产品或方法相关。本发明还包括这样的实施方案，其中多于一个组成员或全部组成员存在于、被应用于给定的产品或方法中，或以其他方式与给定的产品或方法相关。此外，应当理解，本发明包括涵盖所有的变型、组合和置换，其中来自一条或多条所列权利要求的一个或多个限制、要素、子句、描述性用语被引入从属于同一基础权利要求的另一个权利要求(或者相关的任何其他权利要求)中，除非另外指出或除非对于本领域普通技术人员来说明显会引起矛盾或不一致。当要素以列表的形式(例如以马库什组或类似形式)呈现时，应当理解这些要素的每个亚组也被公开，并且任何要素可从该组中去除。应当理解，通常，当本发明或本发明的方面被称为包含特定的要素、特征等时，本发明的某些实施方案或本发明的方面由此类要素、特征等组成或基本上由它们组成。为了简化的目的，这些实施方案并不是在每种情况下都明确用本文陈述的那么多用词来具体描述。应当理解，本发明的任何实施方案或方面可明确地从权利要求排除，不管在说明书中是否描述了此类具体排除。
本领域技术人员将理解可归因于本文中所述的测定或其他方法中获得的值的典型标准偏差或误差。本文引用的用以描述本发明背景以及用以提供与其实施有关的其他细节的出版物、网站和其他参考材料均据此以引用方式并入。
序列表
<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
<120> 具有人源化淋巴细胞活化基因3的非人动物
<130> 34031 (10212US01)
<150> 62/370,430
<151> 2016-08-03
<150> 62/258,181
<151> 2015-11-20
<160> 27
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 1817
<212> DNA
<213> 褐家鼠
<400> 1
acattctttg cctcacctcc ctccttgtgg aatttctctc tctctctctc tttttttttt 60
ctcccaggac ctttttctga actcccttgc agggcctgtg aagcccgggg gccacagagg 120
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385 390 395 400
Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln
405 410 415
Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser
420 425 430
Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly
435 440 445
His Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Ser Leu Leu Leu Leu
450 455 460
Val Thr Gly Ala Phe Gly Phe His Leu Trp Arg Arg Gln Trp Arg Pro
465 470 475 480
Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu Gln Gly Ile His Pro Pro Gln Ala Gln
485 490 495
Ser Lys Ile Glu Glu Leu Glu Gln Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro
500 505 510
Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Gln Leu
515 520 525
<210> 7
<211> 2038
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性人源化Lag-3核酸序列
<400> 7
gggcagtggg gaggagaagc agaaggactg ggtctggagg agcagctcaa gttctagcta 60
gctgcagtgg gtttgcctgc actctgctct gggtcccagc ccgggcctct gatcattatc 120
catcctgctg tctccagtcc ccactcctgg ggcgtcctct tcaccctaca ttctttccct 180
ccgcctcacc tcctccttgt agaacttctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc 240
tctctctctc tctgtgtgtg tgtgtgtgtc tgtctgtctg tctgtctctc tctcctccca 300
ggaccttttt ctaacctccc ttggagggct ggggaggccc gggccataga ggagatgagg 360
gaggacctgc tccttggctt tttgcttctg ggactgcttt gggaagctcc agtgaagcct 420
ctccagccag gggctgaggt cccggtggtg tgggcccagg agggggctcc tgcccagctc 480
ccctgcagcc ccacaatccc cctccaggat ctcagccttc tgcgaagagc aggggtcact 540
tggcagcatc agccagacag tggcccgccc gctgccgccc ccggccatcc cctggccccc 600
ggccctcacc cggcggcgcc ctcctcctgg gggcccaggc cccgccgcta cacggtgctg 660
agcgtgggtc ccggaggcct gcgcagcggg aggctgcccc tgcagccccg cgtccagctg 720
gatgagcgcg gccggcagcg cggggacttc tcgctatggc tgcgcccagc ccggcgcgcg 780
gacgccggcg agtaccgcgc cgcggtgcac ctcagggacc gcgccctctc ctgccgcctc 840
cgtctgcgcc tgggccaggc ctcgatgact gccagccccc caggatctct cagagcctcc 900
gactgggtca ttttgaactg ctccttcagc cgccctgacc gcccagcctc tgtgcattgg 960
ttccggaacc ggggccaggg ccgagtccct gtccgggagt ccccccatca ccacttagcg 1020
gaaagcttcc tcttcctgcc ccaagtcagc cccatggact ctgggccctg gggctgcatc 1080
ctcacctaca gagatggctt caacgtctcc atcatgtata acctcactgt tctgggtctg 1140
gagcccgtag cccctctgac agtgtacgct gctgaaggtt ctagggtgga gctgccctgt 1200
catttgcccc caggagtggg gaccccttct ttgctcattg ccaagtggac tcctcctgga 1260
ggaggtcctg agctccccgt ggctggaaag agtggcaatt ttacccttca ccttgaggct 1320
gtgggtctgg cacaggctgg gacctacacc tgtagcatcc atctgcaggg acagcagctc 1380
aatgccactg tcacgttggc ggtcatcaca gtgactccca aatccttcgg gttacctggc 1440
tcccggggga agctgttgtg tgaggtaacc ccggcatctg gaaaggaaag atttgtgtgg 1500
cgtcccctga acaatctgtc caggagttgc ccgggccctg tgctggagat tcaggaggcc 1560
aggctccttg ctgagcgatg gcagtgtcag ctgtacgagg gccagaggct tcttggagcg 1620
acagtgtacg ccgcagagtc tagctcaggc gcccacagtg ctaggagaat ctcaggtgac 1680
cttaaaggag gccatctcgt tctcgttctc atccttggtg ccctctccct gttccttttg 1740
gtggccgggg cctttggctt tcactggtgg agaaaacagt tgctactgag aagattttct 1800
gccttagaac atgggattca gccatttccg gctcagagga agatagagga gctggagcga 1860
gaactggaga cggagatggg acaggagccg gagcccgagc cggagccaca gctggagcca 1920
gagcccaggc agctctgacc tggagccgag gcagccagca ggtctcagca gctccgcccg 1980
cccgcccgcc cgcccgaata aactccctgt cagcagcatc aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2038
<210> 8
<211> 527
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性人源化Lag-3氨基酸序列
<400> 8
Met Arg Glu Asp Leu Leu Leu Gly Phe Leu Leu Leu Gly Leu Leu Trp
1 5 10 15
Glu Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val
20 25 30
Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile
35 40 45
Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln
50 55 60
His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu
65 70 75 80
Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro
85 90 95
Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly
100 105 110
Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln
115 120 125
Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala
130 135 140
Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys
145 150 155 160
Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro
165 170 175
Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser
180 185 190
Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln
195 200 205
Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser
210 215 220
Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly
225 230 235 240
Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn
245 250 255
Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Val Ala Pro Leu Thr Val Tyr Ala
260 265 270
Ala Glu Gly Ser Arg Val Glu Leu Pro Cys His Leu Pro Pro Gly Val
275 280 285
Gly Thr Pro Ser Leu Leu Ile Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Pro Glu Leu Pro Val Ala Gly Lys Ser Gly Asn Phe Thr Leu His Leu
305 310 315 320
Glu Ala Val Gly Leu Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys Ser Ile His
325 330 335
Leu Gln Gly Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Val Ile Thr
340 345 350
Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Leu Pro Gly Ser Arg Gly Lys Leu Leu
355 360 365
Cys Glu Val Thr Pro Ala Ser Gly Lys Glu Arg Phe Val Trp Arg Pro
370 375 380
Leu Asn Asn Leu Ser Arg Ser Cys Pro Gly Pro Val Leu Glu Ile Gln
385 390 395 400
Glu Ala Arg Leu Leu Ala Glu Arg Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Glu Gly
405 410 415
Gln Arg Leu Leu Gly Ala Thr Val Tyr Ala Ala Glu Ser Ser Ser Gly
420 425 430
Ala His Ser Ala Arg Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Gly Gly His Leu
435 440 445
Val Leu Val Leu Ile Leu Gly Ala Leu Ser Leu Phe Leu Leu Val Ala
450 455 460
Gly Ala Phe Gly Phe His Trp Trp Arg Lys Gln Leu Leu Leu Arg Arg
465 470 475 480
Phe Ser Ala Leu Glu His Gly Ile Gln Pro Phe Pro Ala Gln Arg Lys
485 490 495
Ile Glu Glu Leu Glu Arg Glu Leu Glu Thr Glu Met Gly Gln Glu Pro
500 505 510
Glu Pro Glu Pro Glu Pro Gln Leu Glu Pro Glu Pro Arg Gln Leu
515 520 525
<210> 9
<211> 1741
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于人源化的示例性合成DNA片段（1,741bp，包含人LAG3基因的外显子2-4和一部分内含子4）
<400> 9
tgaagcctct ccagccaggg gctgaggtcc cggtggtgtg ggcccaggag ggggctcctg 60
cccagctccc ctgcagcccc acaatccccc tccaggatct cagccttctg cgaagagcag 120
gggtcacttg gcagcatcag ccagacaggt atgcacccca aacttgggca acaggacctc 180
cgaatccagc actcaacccc acacccgtgc cggtcctctg tcccctgccc tgaggtgtca 240
ctccctctga agccagtgac ccagtctccc tgccctcgct tgcaccgttc ctgcccttgc 300
tctgcaatca gcgaccctca cgccagcatc ccttctctcc agaagtggat gcggccagtc 360
caacagaggg gtcgggcgtg aggggacggt tggtggtcaa gagaactctt ggggcgggct 420
ttctcatcct caacgggtgg ctgcctgcat cctcccgggc ttcctacccc tggagcttct 480
caactccatt ctctttcccg cccagtggcc cgcccgctgc cgcccccggc catcccctgg 540
cccccggccc tcacccggcg gcgccctcct cctgggggcc caggccccgc cgctacacgg 600
tgctgagcgt gggtcccgga ggcctgcgca gcgggaggct gcccctgcag ccccgcgtcc 660
agctggatga gcgcggccgg cagcgcgggg acttctcgct atggctgcgc ccagcccggc 720
gcgcggacgc cggcgagtac cgcgccgcgg tgcacctcag ggaccgcgcc ctctcctgcc 780
gcctccgtct gcgcctgggc caggcctcga gtatgtgggg cgggacgatg ggagaagggc 840
tgggaggtgg gtccccatcc cctgcctccc gggacgcagg aagggctggg gcagaggctg 900
cgccctaggc cctgtcggag agctcccaga agagtagagg aagggggtgg gcggcctgct 960
ggagtggaag gtgcccccga agcacgtgta tggggggccc tgtggagaga ttgtgtcacc 1020
cccgagctcc ccttctccca cccacgcggg agtgcccaga gggaggggga gggggggaga 1080
gcatggggct aaagtgattc atttcagata tctgtagctc agggggtggg cttcgcgggg 1140
ttccaggcca ggaaaacggc aagggtggct gatgccaagt aaactccagg ccagggacgg 1200
ggaaagtggt cctggggagt cttggggatc cactttatgc acctccaggt gctggaagct 1260
gagatgggga gagggtgatg tgggagagga gaagacaagt ctaaagccag gtgcctgttt 1320
ccaggagctt ccggcttggc agccctgctg tgttgggaaa ttgtttccag tgggctgatg 1380
aagtcttctt tatccttgca cagtgactgc cagcccccca ggatctctca gagcctccga 1440
ctgggtcatt ttgaactgct ccttcagccg ccctgaccgc ccagcctctg tgcattggtt 1500
ccggaaccgg ggccagggcc gagtccctgt ccgggagtcc ccccatcacc acttagcgga 1560
aagcttcctc ttcctgcccc aagtcagccc catggactct gggccctggg gctgcatcct 1620
cacctacaga gatggcttca acgtctccat catgtataac ctcactgttc tgggtaactc 1680
ccccactctg cttcacattt gaccacaact ccttcctgcc ccccttgtca cctcccctaa 1740
c 1741
<210> 10
<211> 7522
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含选择盒的示例性人源化Lag3等位基因
<400> 10
tgaagcctct ccagccaggg gctgaggtcc cggtggtgtg ggcccaggag ggggctcctg 60
cccagctccc ctgcagcccc acaatccccc tccaggatct cagccttctg cgaagagcag 120
gggtcacttg gcagcatcag ccagacaggt atgcacccca aacttgggca acaggacctc 180
cgaatccagc actcaacccc acacccgtgc cggtcctctg tcccctgccc tgaggtgtca 240
ctccctctga agccagtgac ccagtctccc tgccctcgct tgcaccgttc ctgcccttgc 300
tctgcaatca gcgaccctca cgccagcatc ccttctctcc agaagtggat gcggccagtc 360
caacagaggg gtcgggcgtg aggggacggt tggtggtcaa gagaactctt ggggcgggct 420
ttctcatcct caacgggtgg ctgcctgcat cctcccgggc ttcctacccc tggagcttct 480
caactccatt ctctttcccg cccagtggcc cgcccgctgc cgcccccggc catcccctgg 540
cccccggccc tcacccggcg gcgccctcct cctgggggcc caggccccgc cgctacacgg 600
tgctgagcgt gggtcccgga ggcctgcgca gcgggaggct gcccctgcag ccccgcgtcc 660
agctggatga gcgcggccgg cagcgcgggg acttctcgct atggctgcgc ccagcccggc 720
gcgcggacgc cggcgagtac cgcgccgcgg tgcacctcag ggaccgcgcc ctctcctgcc 780
gcctccgtct gcgcctgggc caggcctcga gtatgtgggg cgggacgatg ggagaagggc 840
tgggaggtgg gtccccatcc cctgcctccc gggacgcagg aagggctggg gcagaggctg 900
cgccctaggc cctgtcggag agctcccaga agagtagagg aagggggtgg gcggcctgct 960
ggagtggaag gtgcccccga agcacgtgta tggggggccc tgtggagaga ttgtgtcacc 1020
cccgagctcc ccttctccca cccacgcggg agtgcccaga gggaggggga gggggggaga 1080
gcatggggct aaagtgattc atttcagata tctgtagctc agggggtggg cttcgcgggg 1140
ttccaggcca ggaaaacggc aagggtggct gatgccaagt aaactccagg ccagggacgg 1200
ggaaagtggt cctggggagt cttggggatc cactttatgc acctccaggt gctggaagct 1260
gagatgggga gagggtgatg tgggagagga gaagacaagt ctaaagccag gtgcctgttt 1320
ccaggagctt ccggcttggc agccctgctg tgttgggaaa ttgtttccag tgggctgatg 1380
aagtcttctt tatccttgca cagtgactgc cagcccccca ggatctctca gagcctccga 1440
ctgggtcatt ttgaactgct ccttcagccg ccctgaccgc ccagcctctg tgcattggtt 1500
ccggaaccgg ggccagggcc gagtccctgt ccgggagtcc ccccatcacc acttagcgga 1560
aagcttcctc ttcctgcccc aagtcagccc catggactct gggccctggg gctgcatcct 1620
cacctacaga gatggcttca acgtctccat catgtataac ctcactgttc tgggtaactc 1680
ccccactctg cttcacattt gaccacaact ccttcctgcc ccccttgtca cctcccctaa 1740
cgtcgagata acttcgtata atgtatgcta tacgaagtta tatgcatggc ctccgcgccg 1800
ggttttggcg cctcccgcgg gcgcccccct cctcacggcg agcgctgcca cgtcagacga 1860
agggcgcagc gagcgtcctg atccttccgc ccggacgctc aggacagcgg cccgctgctc 1920
ataagactcg gccttagaac cccagtatca gcagaaggac attttaggac gggacttggg 1980
tgactctagg gcactggttt tctttccaga gagcggaaca ggcgaggaaa agtagtccct 2040
tctcggcgat tctgcggagg gatctccgtg gggcggtgaa cgccgatgat tatataagga 2100
cgcgccgggt gtggcacagc tagttccgtc gcagccggga tttgggtcgc ggttcttgtt 2160
tgtggatcgc tgtgatcgtc acttggtgag tagcgggctg ctgggctggc cggggctttc 2220
gtggccgccg ggccgctcgg tgggacggaa gcgtgtggag agaccgccaa gggctgtagt 2280
ctgggtccgc gagcaaggtt gccctgaact gggggttggg gggagcgcag caaaatggcg 2340
gctgttcccg agtcttgaat ggaagacgct tgtgaggcgg gctgtgaggt cgttgaaaca 2400
aggtgggggg catggtgggc ggcaagaacc caaggtcttg aggccttcgc taatgcggga 2460
aagctcttat tcgggtgaga tgggctgggg caccatctgg ggaccctgac gtgaagtttg 2520
tcactgactg gagaactcgg tttgtcgtct gttgcggggg cggcagttat ggcggtgccg 2580
ttgggcagtg cacccgtacc tttgggagcg cgcgccctcg tcgtgtcgtg acgtcacccg 2640
ttctgttggc ttataatgca gggtggggcc acctgccggt aggtgtgcgg taggcttttc 2700
tccgtcgcag gacgcagggt tcgggcctag ggtaggctct cctgaatcga caggcgccgg 2760
acctctggtg aggggaggga taagtgaggc gtcagtttct ttggtcggtt ttatgtacct 2820
atcttcttaa gtagctgaag ctccggtttt gaactatgcg ctcggggttg gcgagtgtgt 2880
tttgtgaagt tttttaggca ccttttgaaa tgtaatcatt tgggtcaata tgtaattttc 2940
agtgttagac tagtaaattg tccgctaaat tctggccgtt tttggctttt ttgttagacg 3000
tgttgacaat taatcatcgg catagtatat cggcatagta taatacgaca aggtgaggaa 3060
ctaaaccatg ggatcggcca ttgaacaaga tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg 3120
ggtggagagg ctattcggct atgactgggc acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc 3180
cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg 3240
tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt 3300
tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga agggactggc tgctattggg 3360
cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat 3420
catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca 3480
ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca 3540
ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa 3600
ggcgcgcatg cccgacggcg atgatctcgt cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa 3660
tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc 3720
ggaccgctat caggacatag cgttggctac ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga 3780
atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc 3840
cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg aggggatccg ctgtaagtct gcagaaattg 3900
atgatctatt aaacaataaa gatgtccact aaaatggaag tttttcctgt catactttgt 3960
taagaagggt gagaacagag tacctacatt ttgaatggaa ggattggagc tacgggggtg 4020
ggggtggggt gggattagat aaatgcctgc tctttactga aggctcttta ctattgcttt 4080
atgataatgt ttcatagttg gatatcataa tttaaacaag caaaaccaaa ttaagggcca 4140
gctcattcct cccactcatg atctatagat ctatagatct ctcgtgggat cattgttttt 4200
ctcttgattc ccactttgtg gttctaagta ctgtggtttc caaatgtgtc agtttcatag 4260
cctgaagaac gagatcagca gcctctgttc cacatacact tcattctcag tattgttttg 4320
ccaagttcta attccatcag acctcgacct gcagccccta gcccgggcgc cagtagcagc 4380
acccacgtcc accttctgtc tagtaatgtc caacacctcc ctcagtccaa acactgctct 4440
gcatccatgt ggctcccatt tatacctgaa gcacttgatg gggcctcaat gttttactag 4500
agcccacccc cctgcaactc tgagaccctc tggatttgtc tgtcagtgcc tcactggggc 4560
gttggataat ttcttaaaag gtcaagttcc ctcagcagca ttctctgagc agtctgaaga 4620
tgtgtgcttt tcacagttca aatccatgtg gctgtttcac ccacctgcct ggccttgggt 4680
tatctatcag gacctagcct agaagcaggt gtgtggcact taacacctaa gctgagtgac 4740
taactgaaca ctcaagtgga tgccatcttt gtcacttctt gactgtgaca caagcaactc 4800
ctgatgccaa agccctgccc acccctctca tgcccatatt tggacatggt acaggtcctc 4860
actggccatg gtctgtgagg tcctggtcct ctttgacttc ataattccta ggggccacta 4920
gtatctataa gaggaagagg gtgctggctc ccaggccaca gcccacaaaa ttccacctgc 4980
tcacaggttg gctggctcga cccaggtggt gtcccctgct ctgagccagc tcccggccaa 5040
gccagcacca tgggtacccc caagaagaag aggaaggtgc gtaccgattt aaattccaat 5100
ttactgaccg tacaccaaaa tttgcctgca ttaccggtcg atgcaacgag tgatgaggtt 5160
cgcaagaacc tgatggacat gttcagggat cgccaggcgt tttctgagca tacctggaaa 5220
atgcttctgt ccgtttgccg gtcgtgggcg gcatggtgca agttgaataa ccggaaatgg 5280
tttcccgcag aacctgaaga tgttcgcgat tatcttctat atcttcaggc gcgcggtctg 5340
gcagtaaaaa ctatccagca acatttgggc cagctaaaca tgcttcatcg tcggtccggg 5400
ctgccacgac caagtgacag caatgctgtt tcactggtta tgcggcggat ccgaaaagaa 5460
aacgttgatg ccggtgaacg tgcaaaacag gctctagcgt tcgaacgcac tgatttcgac 5520
caggttcgtt cactcatgga aaatagtgat cgctgccagg atatacgtaa tctggcattt 5580
ctggggattg cttataacac cctgttacgt atagccgaaa ttgccaggat cagggttaaa 5640
gatatctcac gtactgacgg tgggagaatg ttaatccata ttggcagaac gaaaacgctg 5700
gttagcaccg caggtgtaga gaaggcactt agcctggggg taactaaact ggtcgagcga 5760
tggatttccg tctctggtgt agctgatgat ccgaataact acctgttttg ccgggtcaga 5820
aaaaatggtg ttgccgcgcc atctgccacc agccagctat caactcgcgc cctggaaggg 5880
atttttgaag caactcatcg attgatttac ggcgctaagg taaatataaa atttttaagt 5940
gtataatgtg ttaaactact gattctaatt gtttgtgtat tttaggatga ctctggtcag 6000
agatacctgg cctggtctgg acacagtgcc cgtgtcggag ccgcgcgaga tatggcccgc 6060
gctggagttt caataccgga gatcatgcaa gctggtggct ggaccaatgt aaatattgtc 6120
atgaactata tccgtaacct ggatagtgaa acaggggcaa tggtgcgcct gctggaagat 6180
ggcgattgat ctagataagt aatgatcata atcagccata tcacatctgt agaggtttta 6240
cttgctttaa aaaacctccc acacctcccc ctgaacctga aacataaaat gaatgcaatt 6300
gttgttgtta aacctgccct agttgcggcc aattccagct gagcgtgcct ccgcaccatt 6360
accagttggt ctggtgtcaa aaataataat aaccgggcag gggggatcta agctctagat 6420
aagtaatgat cataatcagc catatcacat ctgtagaggt tttacttgct ttaaaaaacc 6480
tcccacacct ccccctgaac ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt gttaacttgt 6540
ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag 6600
catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg 6660
tctggaataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat gctagtaact ataacggtcc 6720
taaggtagcg agctagcgac ccccaaaact ttctcagctg cgtgtggtct cactccacat 6780
cactttgttt cagtgtccaa accattttct ctctgggcat cttttagctg ctgtctctct 6840
tacttttatt tatttatttg tgtgtttatt tatttatttt cattttagcg tgcgttggtg 6900
ttttgcctgc atagatgtct gtgtcagggt attggattcc ctggaacttg acctacagac 6960
agtcatgaga taccatatgg gtgctgggaa ttgaacccag ctcctctgga aggacagcca 7020
gtgttctaat ctgccatctc tcactgttta tcccttggct gttcagcctc ctgagccttt 7080
ggtctcttgc tgcctcagtt tccctagttt ctctgctttg ctctgtttct ttctgtgtta 7140
cagccaaatg cctccttccc ccttctgcct tacttccttg atgtctccac cctctggccc 7200
actgcttacc cttggtaacg gcttggcttt tccttcttct ctccaggtct ggagcccgta 7260
gcccctctga cagtgtacgc tgctgaaggt tctagggtgg agctgccctg tcatttgccc 7320
ccaggagtgg ggaccccttc tttgctcatt gccaagtgga ctcctcctgg aggaggtcct 7380
gagctccccg tggctggaaa gagtggcaat tttacccttc accttgaggc tgtgggtctg 7440
gcacaggctg ggacctacac ctgtagcatc catctgcagg gacagcagct caatgccact 7500
gtcacgttgg cggtcatcac ag 7522
<210> 11
<211> 2292
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组酶介导的选择盒切割之后的人源化Lag3等位基因
<400> 11
ccatcacttt gtataagggc agatcccaaa gctgcctcag cctcccttca acagggaggc 60
atgatgtttc tttcttagga aagccagggc atttctctat tctccaatct cttggctcaa 120
tgcccttggc ctctcttttg ttccactagt gaagcctctc cagccagggg ctgaggtccc 180
ggtggtgtgg gcccaggagg gggctcctgc ccagctcccc tgcagcccca caatccccct 240
ccaggatctc agccttctgc gaagagcagg ggtcacttgg cagcatcagc cagacaggta 300
tgcaccccaa acttgggcaa caggacctcc gaatccagca ctcaacccca cacccgtgcc 360
ggtcctctgt cccctgccct gaggtgtcac tccctctgaa gccagtgacc cagtctccct 420
gccctcgctt gcaccgttcc tgcccttgct ctgcaatcag cgaccctcac gccagcatcc 480
cttctctcca gaagtggatg cggccagtcc aacagagggg tcgggcgtga ggggacggtt 540
ggtggtcaag agaactcttg gggcgggctt tctcatcctc aacgggtggc tgcctgcatc 600
ctcccgggct tcctacccct ggagcttctc aactccattc tctttcccgc ccagtggccc 660
gcccgctgcc gcccccggcc atcccctggc ccccggccct cacccggcgg cgccctcctc 720
ctgggggccc aggccccgcc gctacacggt gctgagcgtg ggtcccggag gcctgcgcag 780
cgggaggctg cccctgcagc cccgcgtcca gctggatgag cgcggccggc agcgcgggga 840
cttctcgcta tggctgcgcc cagcccggcg cgcggacgcc ggcgagtacc gcgccgcggt 900
gcacctcagg gaccgcgccc tctcctgccg cctccgtctg cgcctgggcc aggcctcgag 960
tatgtggggc gggacgatgg gagaagggct gggaggtggg tccccatccc ctgcctcccg 1020
ggacgcagga agggctgggg cagaggctgc gccctaggcc ctgtcggaga gctcccagaa 1080
gagtagagga agggggtggg cggcctgctg gagtggaagg tgcccccgaa gcacgtgtat 1140
ggggggccct gtggagagat tgtgtcaccc ccgagctccc cttctcccac ccacgcggga 1200
gtgcccagag ggagggggag ggggggagag catggggcta aagtgattca tttcagatat 1260
ctgtagctca gggggtgggc ttcgcggggt tccaggccag gaaaacggca agggtggctg 1320
atgccaagta aactccaggc cagggacggg gaaagtggtc ctggggagtc ttggggatcc 1380
actttatgca cctccaggtg ctggaagctg agatggggag agggtgatgt gggagaggag 1440
aagacaagtc taaagccagg tgcctgtttc caggagcttc cggcttggca gccctgctgt 1500
gttgggaaat tgtttccagt gggctgatga agtcttcttt atccttgcac agtgactgcc 1560
agccccccag gatctctcag agcctccgac tgggtcattt tgaactgctc cttcagccgc 1620
cctgaccgcc cagcctctgt gcattggttc cggaaccggg gccagggccg agtccctgtc 1680
cgggagtccc cccatcacca cttagcggaa agcttcctct tcctgcccca agtcagcccc 1740
atggactctg ggccctgggg ctgcatcctc acctacagag atggcttcaa cgtctccatc 1800
atgtataacc tcactgttct gggtaactcc cccactctgc ttcacatttg accacaactc 1860
cttcctgccc cccttgtcac ctcccctaac gtcgagataa cttcgtataa tgtatgctat 1920
acgaagttat gctagtaact ataacggtcc taaggtagcg agctagcgac ccccaaaact 1980
ttctcagctg cgtgtggtct cactccacat cactttgttt cagtgtccaa accattttct 2040
ctctgggcat cttttagctg ctgtctctct tacttttatt tatttatttg tgtgtttatt 2100
tatttatttt cattttagcg tgcgttggtg ttttgcctgc atagatgtct gtgtcagggt 2160
attggattcc ctggaacttg acctacagac agtcatgaga taccatatgg gtgctgggaa 2220
ttgaacccag ctcctctgga aggacagcca gtgttctaat ctgccatctc tcactgttta 2280
tcccttggct gt 2292
<210> 12
<211> 160
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠Lag-3基因组序列与人LAG-3基因组序列之间的整个上游插入点的核苷酸序列
<400> 12
catgatgttt ctttcttagg aaagccaggg catttctcta ttctccaatc tcttggctca 60
atgcccttgg cctctctttt gttccactag tgaagcctct ccagccaggg gctgaggtcc 120
cggtggtgtg ggcccaggag ggggctcctg cccagctccc 160
<210> 13
<211> 190
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含与自缺失新霉素盒的5'末端邻接的人LAG-3基因组序列的核苷酸序列
<400> 13
ttcacatttg accacaactc cttcctgccc cccttgtcac ctcccctaac gtcgagataa 60
cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat atgcatggcc tccgcgccgg gttttggcgc 120
ctcccgcggg cgcccccctc ctcacggcga gcgctgccac gtcagacgaa gggcgcagcg 180
agcgtcctga 190
<210> 14
<211> 221
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含与小鼠Lag-3基因组序列邻接的自缺失新霉素盒的3'末端的整个下游插入点的核苷酸序列
<400> 14
tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctgga 60
ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatgctagt aactataacg gtcctaaggt 120
agcgagctag cgacccccaa aactttctca gctgcgtgtg gtctcactcc acatcacttt 180
gtttcagtgt ccaaaccatt ttctctctgg gcatctttta g 221
<210> 15
<211> 278
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 在新霉素盒缺失之后整个上游插入点的核苷酸序列
<400> 15
acgtctccat catgtataac ctcactgttc tgggtaactc ccccactctg cttcacattt 60
gaccacaact ccttcctgcc ccccttgtca cctcccctaa cgtcgagata acttcgtata 120
atgtatgcta tacgaagtta tgctagtaac tataacggtc ctaaggtagc gagctagcga 180
cccccaaaac tttctcagct gcgtgtggtc tcactccaca tcactttgtt tcagtgtcca 240
aaccattttc tctctgggca tcttttagct gctgtctc 278
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 16
gaggctgctg acggtcaag 19
<210> 17
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 17
ttaggcaggt taactttatc ctcaaagca 29
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 18
gccacgaaga agatgcactc aag 23
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 19
gtcccgggtc tcttggagat 20
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 20
ccacccataa acatccccag gtttca 26
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 21
ccgctcattc caagtcagtt c 21
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 22
cggttggtgg tcaagagaac 20
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 23
cgggctttct catcctcaac ggg 23
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 24
ggcgggaaag agaatggagt tg 22
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 25
agccctgctg tgttgggaaa 20
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 26
tgtttccagt gggctgatga agtc 24
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 27
tggcagtcac tgtgcaag 18

Claims (24)

1.一种啮齿类动物基因组，其在内源性啮齿类动物淋巴细胞活化基因3(Lag-3)基因座包含人源化Lag-3基因，
其中所述人源化Lag-3基因编码人源化Lag-3多肽，其包含人Lag-3多肽的前两个N-末端免疫球蛋白样域和内源性啮齿类动物Lag-3多肽的胞内域，
其中所述人源化Lag-3基因可操作地连接到啮齿类动物Lag-3启动子，以及
其中所述啮齿类动物是小鼠或大鼠。
2.根据权利要求1所述的啮齿类动物基因组，其中所述人源化Lag-3多肽还包含所述内源性啮齿类动物Lag-3多肽的跨膜部分。
3.根据权利要求1所述的啮齿类动物基因组，其中所述人源化Lag-3多肽包含所述人Lag-3多肽的氨基酸29至氨基酸260。
4.根据权利要求1所述的啮齿类动物基因组，其中所述人源化Lag-3基因包含内源性啮齿类动物Lag-3外显子1、外显子5、外显子6、外显子7和外显子8。
5.根据权利要求1所述的啮齿类动物基因组，其中所述啮齿类动物Lag-3启动子是内源性啮齿类动物Lag-3启动子。
6.根据权利要求4所述的啮齿类动物基因组，其中所述人源化Lag-3基因包含人Lag-3基因的外显子2至外显子4。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的啮齿类动物基因组，其中所述啮齿类动物基因组还编码人源化PD-1多肽，所述人源化PD-1多肽包含人PD-1多肽的胞外部分和内源性PD-1多肽的胞内部分。
8.根据权利要求7所述的啮齿类动物基因组，其中所述人源化PD-1多肽还包含所述内源性啮齿类动物PD-1多肽的跨膜部分。
9.根据权利要求7所述的啮齿类动物基因组，其中所述人源化PD-1多肽包含所述人PD-1多肽的氨基酸35至氨基酸145。
10.根据权利要求7所述的啮齿类动物基因组，其还包含人源化Pdcd1基因，所述人源化Pdcd1基因可操作地连接到啮齿类动物Pdcd1启动子并编码所述人源化PD-1多肽。
11.根据权利要求10所述的啮齿类动物基因组，其中所述啮齿类动物Pdcd1启动子是内源性啮齿类动物Pdcd1启动子。
12.根据权利要求10所述的啮齿类动物基因组，其中所述人源化Pdcd1基因包含内源性Pdcd1外显子1、外显子4和外显子5并且包含内源性Pdcd1外显子的全部或部分。
13.根据权利要求12所述的啮齿类动物基因组，其中所述人源化Pdcd1基因包含人Pdcd1基因的外显子2。
14.根据权利要求13所述的啮齿类动物基因组，其中所述人源化Pdcd1基因还包含人Pdcd1外显子3的全部或部分。
15.一种人源化Lag-3多肽，其由包含根据权利要求1至6中任一项所述的啮齿类动物基因组的啮齿类动物产生。
16.一种包含根据权利要求1至6中任一项所述的啮齿类动物基因组的分离的啮齿类动物细胞或组织，其中所述啮齿类动物细胞或组织不是啮齿类动物胚胎干细胞(ES细胞)或啮齿类动物各个形成和发育阶段的细胞或组织。
17.一种制备啮齿类动物的方法，所述方法包括
修饰啮齿类动物基因组，使得经修饰的基因组在内源性啮齿类动物Lag-3基因座包含人源化Lag-3基因，
其中所述人源化Lag-3基因可操作地连接到啮齿类动物Lag-3启动子并且编码人源化Lag-3多肽，以及
其中所述人源化Lag-3多肽包含人Lag-3多肽的前两个N-末端免疫球蛋白样域和内源性啮齿类动物Lag-3多肽的胞内域，以及
制备包含经修饰的基因组的啮齿类动物，其中所述啮齿类动物是小鼠或大鼠。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述啮齿类动物Lag-3启动子是内源性啮齿类动物Lag-3启动子。
19.根据权利要求17所述的方法，所述方法包括
(a)将基因组片段整合到啮齿类动物ES细胞的内源性Lag-3基因中，其中所述基因组片段包含编码所述人Lag-3多肽的前两个N-末端免疫球蛋白样域的核苷酸序列，从而获得遗传修饰的啮齿类动物ES细胞；以及
(b)使用(a)所述的遗传修饰的啮齿类动物ES细胞形成啮齿类动物。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的方法，其中所述人源化Lag-3基因包含人Lag-3基因的外显子2至外显子4。
21.根据权利要求17至19中任一项所述的方法，其中所述人源化Lag-3基因编码所述人Lag-3多肽的至少氨基酸29至氨基酸260。
22.根据权利要求17至19中任一项所述的方法，其中所述方法还包括修饰所述啮齿类动物基因组，使得经修饰的基因组包含人源化Pdcd1基因，所述Pdcd1基因编码包含人PD-1多肽的胞外部分和内源性PD-1多肽的胞内部分的人源化PD-1多肽。
23.包含根据权利要求1至6中任一项所述的啮齿类动物基因组的啮齿类动物在制备用于评估靶向人Lag-3的药物的抗肿瘤功效或药代动力学性质的啮齿类动物模型中的用途。
24.根据权利要求23所述的用途，其中所述靶向人Lag-3的药物是抗Lag-3抗体。
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