CN102459326A - 新的gpcr蛋白及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新的GPCR(G Protein Coupled Receptor，G蛋白偶联受体)蛋白和编码该蛋白的基因，以及所述蛋白和基因的新用途。具体而言，本发明涉及新的GPCR多肽、编码所述多肽的多核苷酸、携带所述多核苷酸或者其片段的重组载体、用所述载体转化的宿主细胞及转基因动物。此外，本发明涉及：用于检测癌症标志物的组合物，其包含能测量所述新的GPCR基因的mRNA或者蛋白水平的试剂；包含所述组合物的、用于诊断癌症的试剂盒；以及检测新的GPCR多肽及编码该新的GPCR多肽的基因的方法。并且，本发明涉及用于治疗及预防癌症的组合物以及筛选新的GPCR调节剂或者癌症治疗剂的方法，所述组合物包含，抑制GPCR的表达或者活性的试剂。
Description
技术领域
本发明涉及新的G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor，GPCR)蛋白和编码该蛋白的基因，以及所述蛋白和基因的新用途。具体而言，本发明涉及新的GPCR多肽、编码所述多肽的多核苷酸、携带所述多核苷酸或者其片段的重组载体、用所述载体转化的宿主细胞及转基因动物。本发明还涉及用于检测癌症标志物的组合物，所述组合物包含，能测量本发明GPCR多核苷酸的mRNA或者蛋白表达水平的试剂；包含所述组合物的、用于诊断癌症的试剂盒；以及检测本发明的GPCR多肽及编码所述GPCR多肽的基因的方法。此外，本发明涉及用于治疗及预防癌症的组合物，其包含抑制编码本发明的GPCR多肽的基因表达的寡核苷酸或抗本发明GPCR蛋白的抗体；以及筛选本发明的GPCR的调节剂或者癌症治疗剂的方法。
背景技术
人类细胞在其表面存在多种受体。特别是，G-蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor，下文简称为“GPCR”或者“GPCRs”)是最大的跨膜受体蛋白家族之一。人类基因组内存在约30,000个人类基因，发现其中多达1,000个基因编码GPCRs。最近，基于对脊椎动物基因组所进行的研究，已将GPCR分为5类。第一类包含视紫红质受体家族，其包含670种受体蛋白。视紫红质受体家族可以与各种配体反应，包括胺(α基团)、肽(β基团)、脂类样物质(γ类)、核苷酸和糖蛋白(δ基团)，并且包含多个药物靶受体。第二类为胰泌素受体家族，并具有肽激素的结合结构域。该家族的受体与稳态有关，从而成为药物开发的重要靶标。第三类称为粘着受体家族，其特征在于具有GPCR蛋白水解位点(GPCR Proteolytic site，GPS)。该家族的GPCR成员的N-末端部分有很多种，人们对其配体的了解非常少，因此还没开发靶向该家族GPCR成员的药物。第四类为谷氨酸(Glutamate)受体家族，其中已经鉴定了22个GPCR成员。关于各个蛋白特异性，了解的相对很少。最后一类为Frizzled/Taste2家族，其包括：将Wnt糖蛋白作为配体的10个Frizzled；不需要配体的5个SMO(光滑的)；以及感知各种味道所需的25个Taste2受体。还基于内源配体的鉴定，对包括GPCRs在内的受体进行分类。受体与已知的内源化合物结合，或者被分类为内源配体还未得到鉴定的孤儿受体(orphan receptor)。
多种组织及细胞类型中发现了GPCRs，并且其与多种不同的生理机制有联系。它们被多种配体激活，例如，诸如促甲状腺刺激激素(PTH)、促肾上腺皮质激素、胰高血糖素以及后叶加压素等的激素；诸如5-HT、乙酰胆碱(毒蕈碱性AchR)、组织胺等的胺；诸如LPA和S1P等的脂质；以及诸如氨基酸、Ca2+、核酸、肽和光等的信号递质。GPCRs所发挥作用的广泛分布与多样性，是GPCRs在多种病理学疾病中发挥重要的作用证据。实际上，已知GPCRs与多种疾病有关，包括支气管收缩、高血压、糖尿病、炎症、激素失调、细胞死亡、癌症、神经传递障碍以及行为障碍等。从而，对于目前而言，GPCRs属于研发药物产品的重要领域。目前可用于药物研发的GPCR大约有360多种，其中46种已用于药物开发，而可探讨剩余的约320种基因的药物开发。推测有约150种孤儿GPCRs(orphan GPCRs，oGPCRs)。在新药开发领域中，细胞膜受体充当药物的选择性位点，并且占所有药物靶标的50％(Nature Reviews Drug Discovery，2004.2008)，尤其是GPCR活性调控药物在最频繁使用的前100名药物中占30％(400亿美元，总药物市场的9％)。因此GPCR为新药开发的最重要的目标(Nature Reviews DrugDiscovery，2004，2008)。
GPCRs具有共同的结构特征。所有的这些受体都具有七个疏水跨膜结构域，每个结构域的长度为20～30个氨基酸，并且所述7个疏水跨膜结构域通过多种长度的氨基酸序列连接。受体具有细胞外N末端，而C末端则位于细胞质中。GTP-结合蛋白(G蛋白)起到下述的媒介作用：将通过结合激素和刺激GPCR的其他化学配体所生成的信号向细胞内效应子传递。配体与GPCR结合之后，受体的分子内结构域经历能够使受体与G蛋白相互作用的构象变化，这反过来激活细胞内信号递质，如腺苷酸环化酶(adenylate cyclase)、磷脂酶C(phospholipase C)或者离子通道(ion channel)。这种系统对于一个配体结合于GPCR的情况做出反应，使得原来的信号放大至能够产生较多的次级递质。细胞能够通过该机制探测它们的外部环境的变化，并对此做出适当反应。通常，受体被内源配体激活，同时伴随构像变化，并且能够实现受体和G-蛋白之间的结合。最近几年通过研究蛋白之间的相互作用，了解了下述的事实，即，GPCR与各种蛋白相关，如含有GRK或者SH2结构域(src homology 2 domain，src同源性2结构域)的蛋白、连接子Grb2(adaptor Grb2)以及参与信号转导的G蛋白。
在正常条件下，信号转导最终带来细胞激活或者细胞抑制的结果。在生理环境下，GPCRs以非活性和活性状态的平衡状态存在于细胞膜中。非活性状态的受体不能联合细胞信号转导途径，发挥生物反应。只有当受体的结构变为活性形式时，受体才能通过信号转导途径(通过G-蛋白)，显示生物反应。通过诸如内源配体或者药物等化合物，受体可以稳定为活性形式。从而，关于克隆这类基因家族以及鉴定它们的新的配体等的功能研究，具有与开发新的候选药物相同的意义，其中，新的候选药物是指如siRNA、抗体、多肽、效应子、激动剂以及拮抗剂等物质。
对于生命体而言，生长、分化、稳态、对刺激的反应、细胞周期调控、老化以及凋亡等，主要是细胞内选择特定基因并表达的结果，这对于与疾病相关的细胞机制而言是真实的。尤其，如肿瘤发生等病理学现象，是由最终导致基因表达发生变化的基因突变诱导的。
根据肿瘤发生的多种研究，得出下述现象，即，诸如染色体杂合性缺失(loss of chromosomal heterozygosity)、癌基因的激活以及包括p53基因在内的肿瘤抑制基因的失活等多种基因变化的积累，其结果就是产生肿瘤(Bishop，J.M.，Cell，64：249-270(1991))。进而，报告指出，10-30％的癌症是因下述原因发生的，即癌基因的扩增导致癌基因激活，从而发生癌症。从而，癌基因的激活对于多种癌症的病理学研究而言都是重要的。由此亟需鉴定癌基因并研发调控癌基因的方法。
发明内容
本发明人为鉴定癌基因而付出了努力，结果导致下述内容，从而完成本发明：克隆推断的孤儿GPCR基因，并且发现所述基因的超表达诱导肿瘤发生。
本发明的目的在于提供由SEQ ID NO：1或者2的氨基酸序列构成的GPCR(G Protein Coupled Receptor，G蛋白偶联受体)多肽。
本发明的另一目的在于提供编码所述多肽的多核苷酸。
本发明的再一目的在于提供携带所述多核苷酸或者其片段的重组载体。
本发明的再一目的在于提供用所述载体转化的宿主细胞。
本发明的再一目的在于提供代孕母体分娩的转基因动物，在所述代孕母体的子宫中，植入了所述载体。
本发明的再一目的在于提供用于检测癌症标志物的组合物，所述组合物包含能测量本发明GPCR多核苷酸的mRNA或者蛋白表达水平的试剂。
本发明的再一目的在于提供包含所述组合物的、用于诊断癌症的试剂盒。
本发明的再一目的在于提供检测本发明的GPCR多肽及编码该GPCR多肽的基因的方法。
本发明的再一目的在于提供用于治疗及预防癌症的组合物，所述组合物包含：抑制编码本发明的GPCR多肽的基因表达的寡核苷酸或者抗本发明的GPCR蛋白的抗体。
本发明的再一目的在于提供筛选本发明的GPCR蛋白调控剂或者癌症治疗剂的方法，所述方法包括：用候选化合物处理表达本发明的GPCR蛋白的细胞，并测定GPCR介导的所述蛋白信号转导活性的增加或者减少。
本发明的新的GPCR基因和GPCR蛋白的功能最初是由本发明人鉴定的，其可用作抑制癌症转移或者癌症自身的靶标。并且，通过检测所述基因或者所述基因编码的多肽，从而可以诊断是否发生癌症疾病。因此，通过使用反义、siRNA或者shRNA来抑制本发明的新的GPCR基因，从而可望治疗或者预防癌症的发作或者转移。进而，通过使用携带所述基因的载体和容纳所述载体的转化的细胞、具有所述基因的转基因动物，从而可以更加具体地确认GPCR基因的功能，同时还可以用作癌症模型。
附图说明
在图1显示新的GPCR基因(人的hstm1基因)同种型1(isoform 1)和2的可选的转录变体(A)；通过RT-PCR所测量的新的GPCR基因(hstm1基因)在各种人类组织中的表达水平(B)；新的GPCR基因(hstm1基因)在各种人类组织中的相对表达水平(C)。
图2表示通过RT-PCR(A)和实时PCR(B)所测量的GPCR基因(hstm1基因)在代表性消化器官和相关器官的细胞系中的相对表达水平；图2C是通过实时PCR所测量的GPCR基因(hstm1基因)在胃癌患者的非肿瘤和肿瘤组织中的表达水平。
在图3A表示超表达GPCR基因(hstm1基因)的正常细胞的聚集体的形成以及所述细胞对接触抑制(contact inhibition)不敏感性；图3B表示显示与对照相比，不同细胞浓度下，超表达GPCR基因(hstm1基因)的正常细胞的生长和聚集体形成；图3C表示与对照相比，超表达GPCR基因(hstm1基因)的正常细胞的生长速度更快；图3D表示超表达GPCR基因(hstm1基因)的正常细胞的细胞周期；图3E表示超表达GPCR基因(hstm1基因)的正常细胞的锚定非依赖性生长(anchorage-independent growth)的图片和图表；图3F表示在免疫缺陷小鼠的皮下注射超表达GPCR基因(hstm1基因)的正常细胞或对照细胞后，所述免疫缺陷小鼠中的肿瘤形成。
图4是参与以下途径的蛋白的蛋白印迹：与细胞生长和肿瘤形成有关的MAP激酶途径(A)；和超表达GPCR基因(hstm1基因)的正常细胞中的抗凋亡途径(B)。
在图5A表示根据cAMP激活剂即毛喉素(forskolin)的浓度，超表达本GPCR基因(hstm1基因)的正常细胞中cAMP浓度的变化；图5B是显示在存在或不存在毛喉素的情况下，在具有或不具有超表达GPCR基因(hstm1基因)的细胞中的相对CRE(cAMP反应元件，cAMPresponse element)-Luc报告基因分析结果；图5C表示p-raf1基因在瞬时超表达GPCR基因(hstm1基因)的正常细胞中的磷酸化；图5D表示p-raf1基因在稳定地超表达GPCR基因(hstm1基因)的正常细胞中的磷酸化。
在图6A表示当用或不用PTX处理稳定地超表达GPCR基因(hstm1基因)的正常细胞后，所述细胞的血清反应；图6B表示在存在或不存在PTX的情况下，超表达GPCR基因(hstm1基因)的正常细胞对各种生长因子和已知的GPCR配体的反应。
在图7A表示IGFI和IGFII的转录水平以及下游因子即细胞周期蛋白D1的表达水平，IGFI和IGFII在超表达GPCR基因(hstm1基因)的正常细胞中比在对照中诱导更高的细胞生长反应；图7B表示在确定细胞生长的免疫保护分析之后的蛋白印迹，其中用抗IGFI和/或抗IGFII抗体处理超表达GPCR基因(hstm1基因)的正常细胞，以抑制生长因子IFG所诱导的信号转导；图7C表示用抗IGFI和/或抗IGFII抗体处理后的细胞生长的图片；图7D表示用抗IGFI和/或抗IGFII抗体处理之后的细胞生长的定量WST分析(WST assay)结果。
在图8A表示体外结合分析结果，其中利用在E.coli中超表达的His标记的GPCR蛋白(His标记的hstm1蛋白)，鉴定与GPCR蛋白偶联的G蛋白；图8B表示在瞬时超表达GPCR基因(hstm1基因)的细胞中，利用flag标记的GPCR(flag-标记的hstm1)的免疫共沉淀分析(co-immunoprecipitation assay)；图8C表示通过RNA干扰(Gαi1、2、3)所测量的细胞周期蛋白D1和SP1/Egr1蛋白与IGFI和IGFII mRNAs量的变化。
图9是显示GPCR siRNA(hstm1 siRNA)对胃癌细胞(A)和肝癌细胞(B)细胞细胞生长的抑制作用；图9C变示GPCR siRNA(hstm1 siRNA)对胃癌细胞和肝癌细胞细胞生长的抑制作用的图表；
在图10A表示稳定地超表达GPCR基因(hstm1基因)的正常细胞的运动性；图10B表示超表达GPCR基因(hstm1基因)的正常细胞的转移能力的图表，是显示其定量结果的图表。
具体实施方式
由此，作为实现上述目的的一优选形态，本发明涉及由SEQ ID NO：3的氨基酸序列构成的GPCR(G Protein Coupled Receptor，G蛋白偶联受体)多肽。
本发明的新的GPCR多肽(下文称为“本发明的GPCR多肽”或者“本发明的GPCR蛋白”)由SEQ ID NO：1或者2的氨基酸序列构成，所述氨基酸序列可以由具有SEQ ID NO：3、4或者5的核苷酸序列的转录物翻译。本发明人研究出了下述内容，即，所述多肽为GPCR，并且存在两个同种型(isoform)，由其三个转录变体翻译而来。并且还观察到，本发明的GPCR多肽的异常超表达诱导癌症，从而本发明的多肽能够用作治疗癌症或者抑制癌症转移的靶标。
优选地，本发明的GPCR蛋白包含所述多肽整体或者一部分片段。优选地，所述片段包含至少10个、20个、30个或者40个氨基酸残基，优选至少50个氨基酸残基，更优选至少75个氨基酸残基，甚至更优选至少100个氨基酸残基，最优选至少150个氨基酸残基，并且所述片段与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少50％、优选至少60％、70％、80％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、最优选至少98％的同源性。并且，优选地，本发明的GPCR蛋白由SEQ ID NO：1或者2的氨基酸序列构成的蛋白。这些蛋白在人正常组织内的表达水平相当不同。同种型1大量存在于睾丸和肺，而在胸腺、骨髓、胰腺等中减少，而与其他组织相比在小肠、心脏、前列腺等中则更少。可以看出，与其他组织相比，同种型2的表达水平在睾丸、胰脏、小肠、前列腺中较高(图1B、1C)。
另一方面，本发明涉及编码GPCR多肽的多核苷酸。
编码本发明的GPCR蛋白的多核苷酸(下文称为“本发明的GPCR多核苷酸”、“本发明GPCR基因”)是在人类基因组中存在的基因，其功能最初是由本发明人鉴定的。所述多核苷酸位于人的一号染色体的1p36.13中，并且具有多个可变转录物(alternative transcript)。转录物的序列公开于SEQ ID NO：3、4以及5中。SEQ ID NO：3、4或者5的多核苷酸是具有非翻译区的cDNA，且最长的转录物具有约2279个核苷酸构成，同种型1和2由三种转录物翻译而来，在翻译后修饰之前为分别约30kDa和约23kDa的蛋白。同种型2缺少同种型1的65个N-末端氨基酸。所述多核苷酸是编码发挥GPCR(G-protein coupledreceptor)功能的这两种蛋白同种型的新基因。所述蛋白不属于目前所知的任何GPCR类别，换而言之，是孤儿GPCRs。这些受体含有PQ基序(对于将胱氨酸病蛋白(cystinosin)定位于溶酶体非常关键)。
本发明的GPCR多核苷酸包括能够编码本发明的新的GPCR多肽的所有多核苷酸序列。所属技术领域的技术人员能够明白下述内容：考虑到在遗传密码的简并性或者考虑到想要表达所述多核苷酸的生物中优选的密码子，可以在本发明多核苷酸的序列内进行各种修饰，只要所述修饰不改变由编码区翻译的多肽的氨基酸序列。并且，甚至可以在处理编码区以外的区域中，引入各种修饰或改变，至少它们不影响基因的表达即可。换而言之，可以修饰本发明的多核苷酸，至少所得多核苷酸具有相同的或功能等同的生物活性，并且它们也在本发明的范围内。因此，本发明所包括的本发明GPCR多核苷酸的变体，与SEQ ID NO：1、2或3的核苷酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、最优选至少95％的核苷酸序列同源性。
作为再一优选形态，本发明涉及携带所述多核苷酸或者其片段的重组载体。
就本发明而言，术语“载体”是指在适当的宿主细胞中能够表达目的蛋白的表达载体，是包含可操作地连接的基本调控元件的基因构建体，其中，可操作地连接的基本调控元件使插入的基因得以表达。优选地，将重组载体构造为，携带编码本发明的GPCR蛋白的多核苷酸或者其片段。可以将所述重组载体转化或者转染进宿主细胞。
并且，本发明的重组载体还可以通过将本发明的基因连接(插入)于适当的载体而获得。只要能够在宿主内复制，则对将会插入本发明的基因的载体并无特别的限制。例如，可以使用质粒DNA、噬菌体DNA等。具体地，可以用于本发明的质粒DNA的实例包括如pcDNA3.1+(Invitrogen)等商业质粒，除此之外可以使用pYG601BR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUB110、pTP5、YEp13、YEp24、YCp50、Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、gt10、gt11、ZAP等，另外可以使用如逆转录病毒、腺病毒和痘苗病毒等动物病毒和如杆状病毒等昆虫病毒，但是能够用于本发明的质粒并不限于所述实例。
另外，为了将本发明的基因导入载体，可以使用适当的限制酶消化纯化的DNA，并插入载体DNA的限制位点或者克隆位点。为了将本发明的基因可操作地连接于载体，本发明的载体除了启动子以及本发明的基因之外，还可以包含顺式元件，如增强子、剪接信号、Poly A(聚A)添加信号(poly A addition signal)、选择标记，和核糖体结合序列。
作为另一优选形态，本发明涉及用所述载体转化的宿主细胞。
可将构造的载体通过转化(或者转染)导入宿主细胞。可以使用任何方法进行转化。通常，转化方法有以下几种：CaCl2沉淀法；Hanahan方法，其中联合DMSO(dimethyl sulfoxide，二甲基亚砜)，提高CaCl2沉淀法的效率；电穿孔法；磷酸钙沉淀法；原生质融合法；碳化硅纤维介导的转化法；土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化法；PEG介导的转化法；硫酸葡聚糖、阳离子脂质体(lipofectamine)和干燥/抑制的转化法等。
通过如上所述的载体以及采用该载体的转染，能够将编码本发明的GPCR蛋白的基因导入宿主细胞内。
只要能够表达本发明的基因，则对于在本发明中使用的宿主细胞没有特别的限制。并且，对于所属技术领域的技术人员而言，利用本发明的癌基因能够建立可持续增殖的癌细胞系是显而易见的。在本发明的优选实施方案中，将携带本发明的新GPCR基因的载体转染到NIH3T3细胞中，从而建立瞬间或者稳定地超表达本发明的GPCR蛋白的细胞系。
作为再一优选形态，本发明涉及通过将转化有所述载体的宿主细胞植入代孕母体的子宫所得到的转基因动物。
本发明的“转基因动物”是指，通过重组将编码新的GPCR多肽的外源多核苷酸序列以人工方式插入动物的基因组，从而其至少一部分特征发生变化的动物。可用于产生转基因动物的动物的实例，包括例如有小鼠、大鼠、兔子、猪等哺乳类以及鸟类等，但并不限于所述实例。优选地，可以在受精卵到达至少8细胞胚胎之前阶段，将编码本发明的GPCR蛋白的多肽导入所述受精卵。所得的转基因动物可用作表达所述基因的动物模型，例如，可以有效地用作用于筛选调控、促进或者抑制癌基因表达的试剂或者抗癌剂的疾病模型。
只要在所属技术领域中是已知的，任何方法都可以用于制备可用于产生转基因动物的受精卵。所述方法的实例包括，显微注射技术(microinjection technique)、干细胞插入技术(Stem cell insertiontechnique)、逆转录病毒插入技术(retrovirus insertion technique)以及精子介导的基因转移技术(sperm-mediated gene tranfer technique)等，但并不限于所述实例。
随后，将转化的受精卵植入代孕母体的子宫，从而可以得到转基因动物。
作为再一优选形态，本发明涉及用于检测癌症标志物的组合物，其包含能测量本发明的GPCR基因在mRNA水平或者蛋白水平上的表达的试剂。
在本发明中，术语“标志物或者诊断标志物”是指，能通过区分癌细胞或者患有癌症疾病的个体与正常细胞或者正常个体而诊断癌症的物质，包括与正常细胞相比在癌细胞或者个体内量显示增加或者减少的有机生物分子，如多肽、蛋白或者核酸(例如，mRNA等)、脂质、糖脂、糖蛋白或者糖(单糖、二糖、寡糖等)等。就本发明的目的而言，本发明的癌症诊断标志物是指如下所述的物质，即，与正常细胞或者组织细胞相比，在癌细胞内以高水平特异性表达的新的GPCR多肽或者编码该新的GPCR多肽的多核苷酸。
在本发明中“测量mRNA表达水平”活性相应的措词是指，为了诊断癌症而评估生物样品中癌症标志物基因mRNA的存成和表达水平的过程，其可以通过测量mRNA的量来评估。对此的分析方法有：逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、竞争性RT-PCR(CompetitiveRT-PCR)、实时RT-PCR(Real-time RT-PCR)、RNA酶保护分析(RNaseprotection assay，简称为RPA)、Northern印迹(Northern blotting)、DNA芯片分析等，但是并不限于此。
在本发明中“测量蛋白表达水平”是指，为了诊断癌症而评估生物样品中癌症标志物基因所表达的蛋白的存在和表达水平的过程，通过利用与所述蛋白特异性结合的抗体来测量标志物基因的蛋白产物的量。对此的分析方法有：蛋白印迹、ELISA(enzyme linkedimmunosorbent asay，酶联免疫吸附测定)、放射免疫分析(Radioimmunoassay，简称为RIA)、放射免疫扩散法(radioimmunodiffusion)、奥克特洛尼免疫扩散法(Ouchterlonyimmunodiffusion)、火箭免疫电泳(rocket immunoelectrophoresis)、组织免疫染色、免疫沉淀分析法、补足物固定分析法(Complement FixationAssay)、FACS、蛋白芯片等，但是并不限于此。
优选地，测量所述mRNA水平的试剂为对应于本发明的GPCR多核苷酸或者其片段的引物对、探针或者反义核苷酸。根据本发明的多核苷酸序列，所属技术领域的技术人员能够容易地设计引物、探针或者反义核苷酸序列。优选地，引物序列公开于SEQ ID NO：8和9中。
在本发明中，术语“引物”表示具有游离的3’羟基的短核酸链，其与互补模板形成碱基对，从而充当模板链复制的起点。除了引物，DNA的合成或复制还需要适当的缓冲溶液、合适的温度、聚合酶(即，DNA聚合酶或者逆转录酶)和四种不同的三磷酸核苷。在本发明中，GPCR多核苷酸的特异性有义和反义引物，可用于PCR扩增，从而可以用PCR产物来诊断癌症。基于所属技术领域的公知常识，可适当地改变PCR条件、有义和反义引物的长度。
在本发明中，术语“探针”表示能够与mRAN特异性结合并且已被检测目的mRNA的标记标记、长度短则小于10个碱基长则数百个碱基的寡核苷酸，如RNA或者DNA。能够以下述形态构造用于本发明的探针：寡核苷酸探针、单链DNA探针、双链DNA探针或RNA探针。在本发明的实施方案中，通过确定与本发明的GPCR多核苷酸互补的探针是否与目的核苷酸杂交，从而实现癌症的诊断。基于所属技术领域的公知常识，可选择适当的探针并且可改变杂交条件。
采用亚磷酰胺固体支持体方法或者其他已公知的方法，能够化学合成可用于本发明的引物或者探针。它们的核苷酸序列亦可以使用本领域公知的多种手段来修饰。这种修饰的非限制性实例有甲基化、加帽、用一个或多个同系物取代天然核苷酸以及核苷酸之间的改变，例如未带电的连接体(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoroamidate)、氨基甲酸酯等)，或者带电的连接体(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)。
优选地，所述引物或者探针包含八个或者更多个核苷酸，杂交方法可通过下述方式实现：使所述引物或者探针暴露于或者接触本发明的GPCR多核苷酸。优选地，这些序列在已适当调控以便使非特异性结合最小化的条件下杂交，例如，为了检测与本发明的GPCR多核苷酸具有约80％-90％同源性的序列，适当的杂交条件包括：在含有0.25M的Na2HPO4、pH7.2、6.5％的SDS、10％的硫酸葡聚糖的缓冲液内，在42℃下杂交过夜；最后在含有0.1xSSC、0.1％SDS的溶液内，在55℃下洗涤。另外，适合检测与本发明的GPCR多核苷酸具有约90％以上同源性的序列的适当的条件可以包括：在0.25M的Na2HPO4、pH7.2、6.5％的SDS、10％的硫酸葡聚糖内，在65℃下杂交过夜；最后在含有0.1xSSC和0.1％的SDS的溶液内，在60℃下洗涤。
优选地，能测量本发明的GPCR蛋白水平的试剂为抗体。在本发明中，术语“抗体”为本领域中公知的术语，表示指向抗原区域的特异性蛋白分子。就本发明的目的而言，抗体是指与本发明的标志物即GPCR多肽特异性结合的抗体，这种抗体可通过下述方法产生，即，根据常规方法将各个基因克隆至表达载体，从而得到被所述标志物基因得以编码的蛋白，通过通常方法，由得到的蛋白产生这种抗体。由标志物基因所编码的担保所产生的部分肽，也落在抗体的范围内。为了发挥抗体功能，所述部分肽可以含有至少七个氨基酸残基，优选地九个氨基酸残基，更优选地十二个或更多个氨基酸残基。对于本发明的抗体形态并没有特别的限制，只要是多克隆抗体、单克隆抗体或者其具有抗原结合部位的片段，并且包括所有免疫球蛋白抗体。此外，本发明的抗体还包含人化抗体等特殊抗体。这种本发明的GPCR蛋白抗体包括能够以所属技术领域的公知方法制备的所有抗体。优选地，抗体肽具有SEQ ID NO：6或者7的序列。
本发明的用于检测诊断癌症的标志物的抗体不仅包括具有两个全长轻链和两个全长重链的完整形态，还包括抗体分子的功能片段。抗体分子的功能片段是指至少保持抗原结合功能的片段，有Fab、F(ab′)、F(ab′)2以及Fv等。
本发明的术语“癌症(cancer)”是与细胞死亡调控相关的一类疾病，是指由正常的凋亡平衡被破坏时细胞会并不受控地过度增长而导致的疾病。这种非正常的过于增殖的细胞根据情况浸润到周围的组织和器官以形成肿瘤块，从而破坏或者体内的正常结构或使之变形，将这种状态称为癌症。通常，肿瘤是细胞的异常过度生长而形成的瘤或实质性病变。肿瘤可分为良性肿瘤和恶性肿瘤。与良性肿瘤相比，恶性肿瘤的生长速度非常快，并且浸润周围组织且经常发生转移，从而威胁生命。将这种恶性肿瘤通常称为“癌症”，可用本发明检测癌症标志物的组合物检测的癌症的实例包括：髓样癌、头颈癌、肺癌、乳腺癌、胸腺瘤、间皮瘤、食道癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、胃癌、肝小胆管癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、精原细胞瘤、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、结肠直肠癌、淋巴瘤、急性白血病、慢性白血病、多发性骨髓瘤、肉瘤、恶性黑素瘤以及皮肤癌，但是癌症的种类并不限于所述实例。本发明的用于检测癌症标志物的组合物可用作用于诊断所述癌症。在本发明的优选实施方案中，以胃癌、结肠癌、肝癌细胞系以及患有这些癌症的个体为对象观察了本发明的新GPCR蛋白的表达结果，确认了其表达量与正常细胞和正常个体即对照相比显著增加。
“转移性癌”意图描述癌症的性质，并表示从初次生长的癌症部位通过血管、淋巴管向其他部位转移所生成的癌症。为了根治癌症，不仅要治疗原发性癌症，还需要控制癌症的转移部位。转移性癌的实例有通过血流转移的癌症，如结肠直肠癌、前列腺癌、妇科癌、胃癌、多发性骨髓瘤、肝癌、肺癌、胰腺癌、甲状腺癌、肾癌、肝小胆管癌、胆囊癌、神经母细胞瘤以及霍杰金淋巴瘤等。并且，已知尤其是妇科癌之一的乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠直肠癌是易于向骨骼和肝等中转移的癌症。本发明的转移性包括所述实例，并且，只要肿瘤是具有转移性质的癌症，则并不限于此。本发明的GPC蛋白的同种型2的表达在转移性癌中尤其增加。因此，同种型2可用作诊断转移性癌的标志物。当抑制同种型2的表达时，不仅可以有效地预防或者治疗原发性癌症，还可以有效地预防或者治疗转移性癌。
作为再一优选形态，本发明涉及包含所述组合物的用于诊断癌症的试剂盒。
在本发明中使用的术语“诊断”是指，通过确定生物样品或者组织样品中本发明的GPCR多肽或编码该GPCR多肽的多核苷酸的有无来确认与所述基因的表达相关的疾病的存在或者特征。
本发明的试剂盒可以通过测定癌症诊断标志物即新的GPCR多肽或者编码该新的GPCR多肽的多核苷酸的表达水平来检测该标志物。本发明的试剂盒不仅包含用于测量癌症诊断标志物表达水平的引物或探针，选择性地识别癌症标志物的抗体或者其保留抗原结合功能的片段，而且可以包含适合分析所述多肽或者多核苷酸的一个或多个其他试剂、装置或组合物。例如，用于定量分析本发明的多核苷酸或者基因的诊断试剂盒可以包含与编码GPCR多肽的多核苷酸特异性结合的至少一种寡核苷酸。优选地，用于定量检测本发明的基因的诊断试剂盒可以包含SEQ ID NO：3、4或者5的特异性引物对、逆转录酶、Taq聚合酶、PCR引物以及dNTP。在“测量mRNA表达水平”的背景下，只要利用已知的分析方法，可以使用任何试剂盒而无限制。
优选地，测定本发明的新的GPCR蛋白水平的癌症诊断试剂盒可以包含与本发明的GPCR蛋白特异地结合的抗体。在“测量蛋白表达水平”的背景下，只要利用了已知的分析方法，可以使用任何试剂盒而无限制。ELISA试剂盒或者蛋白芯片试剂盒是优选的。
利用抗体测量蛋白表达，是通过在GPCR蛋白和其抗体之间形成抗原-抗体复合体来实现的，并且通过多种方法测量所述复合体的量，从而可以实现蛋白表达水平的测定。
本发明中术语“抗原-抗体复合体”是指癌症标志物蛋白与该癌症标志物蛋白的特异性抗体结合所形成的产物，可通过测量检测标记的信号大小来定量测定抗原-抗体复合体的形成。
例如，通过比较癌症疑似个体和正常对照之间的抗原-抗体复合体的量来测定GPCR蛋白表达水平的显著增加，从而可以诊断癌症。若对疑似患有癌症的个体样品用本发明的GPCR蛋白的特异性抗体进行处理，则GPCR蛋白和抗体形成抗原-抗体复合体，通过基于下述方法的试剂盒可以定量分析所述复合体：ELISA、RIA、夹心分析、蛋白印迹、放射免疫扩散法、奥克特洛尼免疫扩散法、火箭免疫电泳、组织免疫染色、免疫沉淀分析法、补体固定分析、FACS、蛋白芯片以及蛋白印迹方法。另外，比较分析所述分析结果与正常个体的结果，从而可以诊断是否发生由本发明的GPCR蛋白表达增加诱导的癌症。
作为再一优选形态，本发明涉及检测本发明的GPCR多肽和编码该GPCR多肽的多核苷酸的方法。
更具体而言，可以在mRNA水平或者蛋白水平检测基因的表达，并且可以采用公知方法实现mRNA或者蛋白在生物样品中的分离。
本发明中，术语“生物样品”是指能够测量GPCR基因或者蛋白表达水平的样品，可用于本发明的生物样品的实例包括如组织、细胞、全血、血清、血浆、唾液、痰、脑脊髓液或者尿等，但是并不限于此。
本发明的检测方法可以通过比较正常对照中的基因表达水平与疑似患有癌症的个体中的基因表达水平，来确认疑似患有癌症的个体中是否实际发生癌症疾病。更具体而言，测量存在于来自疑似患有癌症的个体的样品中的本发明标志物的表达水平。将所述水平与来自正常对照的生物样品中所测量的水平进行比较。当本发明标志物的表达水平在所述个体中比在所述正常对照中高时，则确定所述个体受到癌症的侵袭。
优选地，当将编码本发明的GPCR多肽的多核苷酸用作标志物时，所述方法可以包括：(a)制备生物样品；(b)用测量GPCR的mRNA水平所用的试剂处理所述生物样品；(c)检测所述试剂和与所述试剂互补的多核苷酸之间的复合体；以及(d)将检测的量与正常对照进行比较。另外，当使用本发明的GPCR多肽作为标志物时，所述方法可以包括：(a)制备生物样品；(b)用本发明的GPCR蛋白的特异性抗体处理所述生物样品；(c)检测所述抗体和与其互补的蛋白之间的复合体；以及(d)将检测的量与正常对照进行比较；利用所述方法可以检测本发明的GPCR蛋白。
作为再一优选形态，本发明涉及用于治疗及预防癌症的组合物，其包含抑制本发明的GPCR基因表达的寡核苷酸或抑制本发明的GPCR蛋白活性的抗体，作为活性成分。
为了确定本发明的新的GPCR基因或者蛋白的致癌性，本发明人观察表达该基因的细胞系NIH3T3中的接触抑制(contact inhibition)，和非停泊性生长(anchorage independent growth)，结果确认了在稳定地表达本发明GPCR基因的细胞系中所述抑制和生长都增加的情况。并且向没有免疫力的裸鼠注射携带本发明GPCR基因的载体，诱导癌症的形成。
优选地，本发明的组合物可以包含抑制本发明的GPCR多核苷酸表达的物质，抑制所述多核苷酸表达的物质可选自siRNA、shRNA、适体以及反义寡核苷酸。优选地，寡核苷酸选自SEQ ID NO：20-23、SEQ ID NO：36-51和其组合。
本发明的术语“siRNA(small interfering RNA，小干扰RNA)”是指能够介导RNA干扰或者基因沉默的约20个核苷酸大小的小核酸分子。当将siRNA导入细胞内时，则其被Dicer蛋白识别，从而降解编码所述GPCR多肽的基因，结果特异性抑制GPCR基因的表达。
“shRNA(short hairpin RNA)”是指短发夹RNA(short hairpinRNA)，其中siRNA靶序列的有义和反义序列被5-9个碱基的环状结构(loop structuce)隔开。
最近，作为用于在基因水平上调控蛋白的表达的方法，研究了RNA干扰(RNAinterference，RNAi)现象。通常，siRNA特异性结合具有与靶基因互补的序列的mRNA，从而抑制蛋白的表达。
按照基于这些RNA的基因疗法所采用的典型方法，将包含本发明的siRNA或者shRNA的组合物给予个体，从而可以抑制癌基因或者转移基因的表达。例如，根据Filleur et al.，Cancer Res.，63(14)：3919-22，2003所述方法，通过少量静脉内注射siRNA，能够调控基因表达。并且，为了增加siRNA的细胞吸收和稳定性，根据Chien et al.，CancerGene Ther.，12(3)321-8，2005等文献，还可以注射缀合物形式的siRNA。
制造本发明的组合物所包含的siRNA的方法有直接化学合成(SuiG et al.，(2002)Proc Natl Acad Sci USA 99：5515-5520)、体外转录(Brummelkamp et al.，(2002)Science 296：550-553)等，但是并不限于此。另外，shRNA用于克服由siRNA的高生物合成成本、低转染效率所引起的、RNA干扰效果的保持时间短等缺点，其可以由通过腺病毒、慢病毒或质粒表达载体系统所含的基于RNA聚合酶的启动子表达，所述表达系统已经导入至细胞内。利用细胞内的siRNA加工酶(Dicer或RNA酶(Rnase))，将所述shRNA加工成功能siRNA分子，从而诱导靶基因沉默。
术语“反义”是指，具有核苷酸碱基序列和亚基与亚基主链的寡聚体，所述主链允许反义寡聚体与RNA中的靶序列、通常与mRNA通过沃森-克里克碱基配对杂交，在靶序列中形成RNA：寡聚体异源双链。寡聚体可具有对靶序列的准确序列互补性或者近似互补性。这些反义寡聚体可以使阻滞或者抑制mRNA的翻译和/或修饰mRNA的加工以产生所述mRNA的剪接变体。从而，本发明的反义寡聚体为与编码GPCR多肽的多核苷酸互补的反义寡聚体。对于基因疗法，可以将本发明的反义寡核苷酸通过通常方法给予。组合物的给药，可以预防或抑制癌基因表达。例如，按照J.S.kim et al.，J controlled Release 53，175-182(1998)所述，通过静电引力，将混合反义寡聚脱氧核苷酸装载到基于聚-L-赖氨酸的微粒上，并静脉内注射装载了寡核苷酸的微粒，但是将本发明的反义基因给予个体的方法并不限于所述实例。
优选地，可将公知的治疗剂直接或者间接地缀合于本发明的组合物中或者使其一并包含于本发明的组合物中。能够与抗体结合的治疗剂包括放射性核素、药物、淋巴因子、毒素以及双特异性抗体等，但是本发明的组合物所包含的治疗剂并不限于此，只要是能够与抗体缀合后发挥癌症治疗效果或者可以与抗体、siRNA、shRNA以及反义寡核苷酸联合给药，任何已知的治疗剂都可以用于本发明中。
上述放射性核素有3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I以及186Re等，但是并不限于此。
可用于本发明的药物以及毒素有依托泊苷、替尼泊苷、阿霉素、柔红霉素、洋红霉素、氨蝶呤、放线菌素、丝裂霉素、顺铂以及顺铂类似物、博莱霉素、埃斯培拉霉素、5-氟尿嘧啶、美法仑以及氮芥等，但是并不限于此。
另外，优选地，本发明的组合物可以是包含抑制GPCR蛋白的活性或者表达的物质的、抑制癌症的生长或者转移的组合物。优选地，所述活性抑制物质为特异性地识别GPCR蛋白的抗体。这种抗体包括所有单克隆抗体和嵌合抗体、人源化抗体以及其人类抗体。并且，只要所述抗体具有特异性地识别GPCR蛋白的结合特性，则其不仅包含具有两个全长重链和两个全长轻链的完整形式，而且可以是抗体分子功能片段的形式。抗体分子的功能片段是指至少具有抗原结合功能的片段，有Fab、F(ab′)、F(ab′)2以及Fv等。
优选地，根据给药方式，本发明的组合物可包含可接受的载体。
活性成分可以与药学可接受的载体、赋形剂或者添加剂一并混合。可用于本发明的药学可接受的载体种类包括，生理盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇、脂质体。它们可以单独使用或组合使用。根据需求，组合物还可以进一步包含如抗氧化剂、缓冲液等通常使用的其他添加剂。另外，根据给药模式，可以将组合物与稀释剂、分散剂、表面活性剂、结合剂以及润滑剂一起配制成注射剂量形式，如水溶液、悬浮液、乳液等，或配制成口服剂量形式，如药丸、胶囊、颗粒或者片剂。与所述载体缀合后，靶器官、组织特异性抗体或者配体，可以将活性成分引导向所述器官或组织。本领域已知的通常载体、赋形剂或者添加剂都可以用于本发明中，并且可使用的载体、赋形剂或者添加剂的种类并不限于所述实例。
根据目的或者需求，按照所属技术领域中所使用的通常方法、给药途径、治疗有效量可以将如上所述的组合物或者制剂适当地给予个体。给药途径例如可以有口服、非肠道、皮下、腹膜内、肺内以及鼻腔内给药。对于局部免疫抑制治疗，必要时通过包含病变内给药的适当的方法给予所述组合物。非肠道注射包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或者皮下途径。包含本发明的反义寡核苷酸、siRNA或者shRNA的组合物的治疗有效量和给药次数，可根据多种因素适当地决定，如要预防或者治疗的症状的种类、给药途径、性别、健康状态、食饵、个体年龄和体重以及疾病的严重程度等。
作为再一优选形态，本发明涉及筛选本发明GPCR蛋白的调控剂的方法，所述筛选方法包括：用候选化合物处理表达本发明的GPCR蛋白的细胞，并测量细胞中GPCR介导的信号转导活性。
根据需求，可采用上述的重组载体、用所述载体转化的宿主细胞或者容纳所述基因的转基因动物来适当地选择表达本发明的GPCR蛋白的细胞。将与GPCR介导的信号转导活性相关的候选化合物应用于细胞，从而可以确定候选化合物是否发挥本发明的GPCR蛋白调控剂的功能。更具体而言，如果候选化合物诱导GPCR介导的信号转导活性增加，则确定其为本发明PGCR蛋白的激动剂。相反，如果GPCR介导的信号转导活性因此减少，则确定候选化合物为拮抗剂。
本发明的术语“激动剂”是指，与受体结合从而能够直接或者间接地诱导、改善或者增强受体对配体的生物学活性或者激活的分子。就本发明的目的而言，激动剂是指与本发明的GPCR蛋白结合从而能够诱导或者改善受体的生物学活性或者激活的物质。本发明的术语“拮抗剂”是指显示拮抗作用的物质。当一起使用两种以上的物质时，如果一种物质减少另一种物质的效果则称其为拮抗剂。就本发明的目的而言，拮抗剂是指与GPCR蛋白的配体互相作用以减少配体的效果的物质。
另外，为了确定所述GPCR介导的信号转导活性是否增加或者减少，可以使用多种方法，包括如测量参与信号转导途径的各种蛋白或者化合物中的一个多个的水平的方法。优选地，可通过监测cAMP的水平来判断GPCR介导的信号转导活性的增加或者减少。在本发明的优选实施方案中，为了验证对新的GPCR蛋白产生影响的外部刺激因子，用一些已知为GPCR配体的物质检查细胞生长是否根据本发明的新的GPCR蛋白的超表达而得以促进。具体为，用EGF、PDGF、胰岛素、IGF-1、HGF、VEGF、血管紧张肽II、缓激肽、LPA以及PTX处理细胞，结果观察到PDGF、胰岛素、IGF-1、VEGF、血管紧张肽II、缓激肽、LPA促进细胞生长，而PTX抑制细胞生长。
作为再一优选形态，本发明涉及筛选癌症治疗剂的方法，所述筛选方法包括：用候选化合物处理表达本发明的GPCR蛋白的细胞，并测量细胞中GPCR介导的信号转导活性。
可以以与上述调控剂的筛选方法类似的方法，进行本发明的癌症治疗剂的筛选方法。即，当候选化合物诱导GPCR介导的信号转导活性增加时，作为致癌蛋白和基因的本发明的GPCR蛋白和基因的表达是增加的，因此可将所述候选化合物判断为促进肿瘤发生的化合物。另外，若候选化合物减少GPCR介导的信号转导活性，则可通过该化合物抑制癌基因和蛋白的表达，确定候选化合物是癌症的可能治疗剂。对于这种筛选方法而言，可根据cAMP的表达水平而容易地判断所述候选化合物的活性。
下面通过实施例更加详细地说明本发明。但是这些实施例仅用于示例性地说明本发明，本发明的范围并不限于这些实施例。
实施例1：新的GPCR的分析
将在胃、结肠直肠、肝癌细胞系中超表达的新的孤儿GPCR命名为hstm1(human seven transmembrane protein 1，人类七次跨膜蛋白)(在下文中，将本发明的新的GPCR基因命名为“hstm1”、将本发明的新的GPCR蛋白命名为“hstm1蛋白”或者“hSTM1”，并且与本发明的“新的GPCR”互换使用)。用表达量根据外部胁迫和氮或者糖的量而发生变化的裂殖酵母粟酒裂殖酵母(S.pombe)基因stm1+来检测鉴定为新的孤儿GPCR并且命名为hstm1的人类同源基因。该新的受体基因位于一号染色体的1p36.13位置处，并且具有多个可变转录物。转录变体1(hstm1a)是包含完整N末端的全长基因，其编码2种hstm1同种型中的一个。hstm1的同种型1可由两个不同的可变剪接变体(SEQID NO：1、2)形成，所述剪接变体亦属于本发明的一部分。hstm1的同种型2来源于可变剪接变体3(SEQ ID NO：3)，并且编码缺少65个N末端氨基酸的蛋白。
实施例2.人类正常细胞组织中新的GPCR的mRNA水平
从Clontech.Co.购买正常总细胞组织的总RNA。使用人类胃(目录号(cat.No)636578)、睾丸(目录号636533)、胸腺(目录号636549)、骨髓(目录号636548)、脑(目录号636530)、肝(目录号636531)、大肠(目录号636553)、肾脏(目录号636529)、肺(目录号636524)、乳腺(目录号636570)、卵巢(目录号636555)、心脏(目录号636532)、甲状腺(目录号636530)、胰腺(目录号636577)、小肠(目录号636539)、前列腺(目录号636539)总RNA。向1μg每一总RNA(total RNA)中添加1μl oligo(dT)15。并且在65度下煮沸十分钟之后再冷却。将混合物与1μl RNA酶抑制剂、4μl 5X RT缓冲液、2μl dNTP、2μl DTT、0.5μl RT酶(逆转录酶)混合，并使用蒸馏水将总体积调整为20μl，之后42℃下孵育60分钟，随后70℃下孵育5分钟，从而制备c-DNA(iNtRON Biotech)。
接着混合2μl制备的c-DNA和30pmole每一GAPDH引物，并使用蒸馏水将最终体积调整为10μl之后添加10μl 2X Taq premix(Hotstart)，进行RT-PCR。进行PCR，94℃下30秒、在55℃下30秒、在72℃下一分钟，22个循环，并将制备的PCR产物装载至琼脂糖凝胶上从而测量产物的量。进行校准，从而使所有样品中的GAPDH PCR产物的量相同。使用校准的c-DNA相同的量、采用hstm1引物，以如上所述的条件进行35个循环，将由此获得的PCR产物装载至琼脂糖凝胶上，从而可视地测定在各个组织中的mRNA水平。通过实时PCR(Corbrtt Research公司的RG-6000)定量在各个组织中hstm1的mRNA量。试剂使用了Qiagen公司的2X Quantitect SYBR Green PCR试剂盒。其结果可知下述内容，即，以在胃中的mRNA水平为基准，在心脏、胰腺、胸腺、前列腺、小肠观察到了相对更小水平的mRNA，而与对照相比在肺、睾丸中有更高水平的mRNA表达。尤其是与其他组织相比，在睾丸的表达水平表现出显著的差别。实时PCR中所用的引物如表1所示，用作对照所用的GAPDH的引物购自Qiagen(QT00079247)。以95℃下5秒、55℃下15秒、72℃下20秒，40～45个循环，进行实时PCR。
表1
实施例3.人类胃肠癌细胞系中新的GPCR的mRNA表达水平
以含有10％胎牛血清和抗生素的RPMI培养基在6孔板中培养胃癌、结肠直肠癌和肝癌细胞系。当达到80％汇合时，以PBS缓冲液洗涤细胞，并采用1ml TRIZOL来破裂细胞，以分离总RNA，并且以与实施例2相同的方法将其转变为c-DNA并定量其GAPDH。采用RT-PCR和实时PCR来测定hstm1水平。可知在胃肠细胞系即胃癌细胞系、结肠直肠癌细胞系和肝癌细胞系中都表达出相比正常组织更多的hstm1，尤其在胃癌细胞系中均匀地大量表达。
实施例4.人类胃癌患者临床样品中的新的GPCR表达水平
在从胃癌患者得到的正常组织和胃癌组织中分离mRNA。使用总RNA提取试剂盒(Total RNAextraction kit，iNtRON Biotech.)。用1mleasy-BLUE试剂破裂20mg胃组织，将其与200μl氯仿(Chloroform)一起涡旋，之后离心10分钟。将400μl上清液移到新的试管中，添加400μl异丙醇并充分混合之后在室温下孵育10分钟，然后13,000rpm离心10分钟，从而分离RNA。以75％乙醇洗涤RNA颗粒状物(pellet)之后使其干燥，并溶解于50μl DEPC水中。定量RNA之后，以与实施例2相同的方式，用1μg每一RNA制备cDNA。使用SEQ ID NO：8和9的hstm1引物来进行实时PCR。其结果，早期胃癌或者1、2期癌组织中未能获得与胃的正常组织相比显著的结果，但是在3期或以后的胃癌组织中，hstm1的表达水平显著增加的样品为37％。尤其是在扩散型组织中显著增加的比例更多，由此认为hstm1基因的表达与3期或以后的扩散型和渐进性胃癌有关。
实施例5：向NIH3T3细胞的瞬时和稳定转染
为了进一步研究新的人类孤儿受体hstm1的特性，使用Lipefectamine Plus瞬时或者稳定转染NIH3T3细胞。
细胞培养和转染方法
将NIH3T3细胞维持在添加了10％热失活化的胎牛血清、100IU/ml青霉素G以及100μg/ml硫酸链霉素的DMEM(Gibco)中。在5％CO2环境、37℃条件下使细胞在多种尺寸的培养烧瓶中生长。对于稳定转染，将维持的细胞培养于含有400μg/ml遗传霉素(G418)的DMEM中。
为了瞬时转染NIH3T3细胞，使用Lipofectamine Plus(LifeTechnologies)。在转染一天前，将NIH3T3细胞接种到60mm皿或者6孔板中，对于一个皮氏培养皿的转染，将2μg DNA和4μl Plus试剂(Life Technologies混合在一起，并添加到每一皿或孔中，然后在室温下孵育15分钟(溶液A)。
将6μl Lipofectamine Plus添加于150μl无血清培养基中(溶液B)。将溶液A与B并轻轻地混合，且在室温下孵育15分钟，从而形成复合体。15分钟之后将900μl无血清培养基添加至此混合物中。以无血清培养基洗涤细胞一次，将DNA-Lipofectamine Plus复合体添加至细胞(最终体积为1200μl)，从而在在5％的CO2培养箱中在37℃条件下孵育5个小时。然后去除培养基，向细胞添加3～5ml补充了10％热失活胎牛血清的新鲜DMEM，然后在培养箱中孵育细胞。
为了制备稳定转染的稳定细胞系，使用了以Lipofectamine Plus方法瞬时转染的细胞。转染之后，每隔2至3天以添加了400～1000μg/ml遗传霉素(G418)的新鲜选择培养基替换培养基，直至看到集落为止，使细胞生长(需要8-10天)。对于其他培养和实验，将细胞转移到100mm皿中。通过在96孔板中的有限稀释测定筛选单克隆细胞。通过重复这种方法大量培养并收集完全分离为单克隆的稳定细胞系之后，将所述细胞添加于含有10％DMSO、20％血清的培养基中，并在液氮在保存。在实验过程中，必须小心以防细胞的传代数达到15。
实施例6：使用hstm1稳定细胞系分析新的GPCR基因促进细胞
生长和肿瘤发生的能力
1)观察用hstm1稳定转染的细胞系的聚集体(focus)
以低汇合(500个细胞/皿)接种分别用模拟载体和携带hstm1基因的载体转染的细胞，并观察细胞聚集体的形成。由此可知锚定模拟载体的细胞不规则扩散生长，而表达hstm1的细胞则形成聚集体(图3A和图3B)。
2)观察用hstm1稳定转染的细胞系由接触抑制引起的生长抑制
以高汇合(5x106个细胞)接种对照细胞系和表达hstm1的细胞系，并以每隔两天替换一次新鲜培养基的方式培养五天。通常，当正常细胞系与许多周围的细胞发生接触，则停止生长。但是，在表达hstm1的细胞系的情况下，观察到下述现象，即，其生长不会停止而是持续生长，从而细胞间距离非常密集(图3A和图3B)。
3)将表达hstm1的细胞系和对照细胞系计数，将相同数量的细胞接种在相同数量的96孔皿中，并孵育12小时，以将细胞附着于皿。将该时间设为T0，通过WST分析(Takara目录号MK400，将10μl wst等分到96孔板的每一孔中，在所述孔中培养细胞，并经过预定的时间段之后，使用分光光度计以450nm波长测量每一孔)确定细胞的量。将细胞在无牛血清或在补充10％牛血清的培养基中培养24小时。在T24，通过WST分析测定相对于T0值的T24值。将表达hstm1的细胞系的生长速率与对照的生长速率相比。在无牛血清的培养基中，有轻微的生长促进，而补充了牛血清的培养基中则观察到了约30％左右的生长促进(图3C)。
4)用胰蛋白酶/EDTA剥离在补充了牛血清的培养基中生长的细胞系之后以乙醇固定12-24小时，然后用PBS缓冲液洗涤乙醇并用RNA酶处理，从而降解RNA。向该细胞样品添加DAPI溶液以染色DNA，然后利用Facs分析(Facs analysis)观察细胞周期。其结果，由于表达hstm1的细胞系的细胞生长较快，因此G2期的细胞相对较多(图3D)。
FACS(Fluorescent activated cell sorter，荧光激活细胞分选器)分析法
以4×105个和5×105个细胞/皿的细胞密度，将用荧光表达载体即pIRES-EGFP2和携带hSTM1的表达载体即pIRES-EGFP2-hSTM1转染的NIH3T3细胞，接种到60mm细胞培养皿中。
在包含10％FBS(胎牛血清)、1％抗生素的DMEM生长培养基中孵育24小时之后，再一次以相同的新鲜培养基替换，直到细胞覆盖碟表面的70％左右为止持续培养。然后以1×PBS洗涤细胞，之后用胰蛋白酶-EDTA(Tripsin-EDTA)洗涤，从而剥离细胞。将剥离的细胞移到分别有5ml PBS的15ml Corting试管(Corning tube)中，通过离心将细胞充分地沉淀。离心之后丢弃上清液，并再一次使用5ml PBS充分地洗涤细胞之后通过离心将细胞充分地沉淀。完全丢弃上清液之后，向将细胞在5ml的70％冰凉乙醇、在-20℃条件下固定并保存1小时以上。实施FACS分析三小时之前重复两次下述过程：使用离心收集细胞之后丢弃上清液，使用5ml PBS洗涤细胞。离心之后向细胞添加0.5ml的PI(Propidium Iodide，碘化丙啶)染色溶液，使用吸量管充分混合细胞(PI染色溶液：3mM柠檬酸钠、50μg/ml PI[Sigma，P4170]，在PBS中)。为了防止细胞的RNA被染色，添加10μg/ml RNA酶A，然后在4℃下孵育3小时或者在-20℃下孵育过夜，从而制备样品。制备的样品用于利用FACS的细胞周期分析中。
5)调查稳定表达hstm1的细胞系的锚定非依赖性生长。首先将1.8％诺贝尔琼脂溶液(nobel agar solution)与含有20％牛血清的培养基按1∶1混合，并将混合物以2.5ml的量等分至60mm皿中，并固化。将含有20％牛血清的培养基中的5×104个细胞的悬浮液与0.6％诺贝尔琼脂溶液按1∶1混合并倒入之前皿中以前固化的琼脂上以供再次固化。为防止琼脂干燥，添加2ml培养基，随后将细胞孵育约20天直到形成集落为止，每隔两天更换新鲜培养基。计数形成的集落数量以观察其差异。其结果可知表达hstm1的细胞系的锚定非依赖性生长增加(图3E)。
6)在没有免疫力的裸鼠的皮下分别注射稳定转染hstm1的细胞系和转染载体的细胞系，以观察是否形成肿瘤。采用胰蛋白酶/EDTA得到采用实施例5的细胞培养方法所培养的细胞系，以PBS洗涤两次，最终重悬浮于PBS缓冲液中，以计数相同数量的细胞并注射到裸鼠中。在注射之后35天，观察小鼠中是否形成肿瘤。其结果可以观察到，在注射了包含载体的NIH3T3细胞系的免疫缺乏大鼠中，第28天完全看不到肿瘤，而在第35天，10只中有3只形成了小尺寸肿瘤，注射了表达hstm1的细胞系时，10只中有9只在过30天之后形成了相比对照更大的肿瘤。
实施例7.观察由新的GPCR的超表达诱导的基因表达变化
为了研究hstm1的超表达促进肿瘤发生的机制，通过蛋白印迹分析，调查参与MAP激酶途径(MAP kinase pathway)、与细胞生长相关的信号传输途径和抗凋亡途径的蛋白因子。结果是，hstm1基因激活MAP激酶途径和抗凋亡途径，这揭示，其通过这些途径参与肿瘤发生。有关所用抗体的信息如下。
蛋白印迹分析法
如实施例6的说明，以PBS洗涤一次在60mm皿上培养的细胞，并在用于溶解蛋白的冰凉缓冲液(RIPA细胞裂解缓冲液：50mmTris-Cl(pH 7.5)、150mmNaCl、1％诺乃洗涤剂(Nonidet)P-40、10％甘油、1mm PMSF、1mm DTT、20mm NaF、1mm EDTA、蛋白酶抑制剂)中裂解，从而制备细胞的蛋白。分别使用30μg所制备的各个蛋白样品来在10％或者12％SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶中筛选以分离不同尺寸的蛋白之后将其移到PVDF膜。
以适当的尺寸剪切转移有蛋白的过滤器，并用相应抗体处理。抗体信息如下：抗hstm1(制备的)、抗p-raf(S438.1∶1000，Cell signal#9427)、抗p-raf(S259)(1∶1000，Cell signaling#9421)、抗phospho Erk1/2(1∶10000，Pharmingen，554093)、抗Erk1/2(1∶3000，Santa Cruz，sc-7382)、抗细胞周期蛋白D1(1∶3000，Pharmingen.554180)、抗细胞周期蛋白A(1∶3000，Santa Cruz，sc-751)、抗cdk2(1∶1000，Santa Cruz，sc-6248)、抗c-myc(1∶1000，Santa Cruz，sc-7890)、抗Akt(1∶3000，Cellsignal，#9272)、抗p-AKT(S473)(1∶2000，Cell signal，#9271)、抗AKT(Thr-308)(1∶2000，Cell signal，#9275)、抗p-GSK3b(1∶3000，Cell signal，#9336)、抗p70S6K(1∶2000，Cell signal#9202)、抗p-p70S6K(1∶2000，Cell signal，#9208)、抗4EBP1(1∶3000，Cell signaling，#9452)、抗p-4EBP1(1∶3000，Cell signaling，#9451)、抗eIF4E(1∶3000，Cellsignaling，#9742)、抗p-eIF4E(1∶3000，Cell signaling，#9741)、SP-1(1∶3000，Millipore，07-645)、Egr-1(1∶5000，Santa cruz sc-110)、抗flag(1∶5000，Sigma)、抗Gia1/2/3(Santa Cruz.sc-26761，1∶3000)。使用ImmobilonTM蛋白印迹检测试剂(Western Blotting Detection reagents)(Millipore)，以条带定量各个蛋白。发现每一样品所用的蛋白的量，和通过与抗β-肌动蛋白抗体(1∶10000，Cell signaling)所测量的量相同。hstm1蛋白的情况下，使用蛋白A琼脂糖(5000∶1)纯化注射SEQ ID NO：6和7的肽后所获得的血清。
实施例8：测量用新的GPCR基因瞬时或稳定转染的NIH3T3细
胞的cAMP
为了研究hstm1的功能，在瞬时超表达hstm1的细胞和稳定表达hstm1的细胞中定量cAMP。所有这些实验随同锚定模拟载体的NIH3T3一起进行。用福斯高林(forskolin)(Sigma，F3917)即cAMP诱导剂处理细胞。进行实验，一式三份，其结果表明，稳定超表达hstm1的细胞中有30％或更多cAMP水平受到抑制，当用福斯高林刺激时，细胞中cAMP水平比仅锚定模拟载体的细胞中的cAMP水平低40％或更多。
图5A描述相对于野生型NIH3T3细胞的cAMP水平，用hstm1稳定转染的NIH3T3细胞中的cAMP水平。
瞬时转染的情况下，当没有福斯高林刺激时，cAMP水平降低多达70％左右，从而其抑制效果更大。在被福斯高林刺激时，cAMP水平中则表现出约40％的抑制(图5B)。
cAMP分析
使用promega公司的cAMP-GloTM分析试剂盒，并采用NIH3T3-IRES-EV、NIH3T3-IRES-hSTM1稳定细胞系，研究hSTM1基因对细胞内cAMP水平的影响。
首先以每孔5000个细胞，将NIH3T3-IRES-EV和NIH3T3-IRES-hSTM1a-A细胞接种到96孔板，并使其生长至80％汇合。然后，按照Promega公司的手册，向每个孔添加或不添加20μM福斯高林，用PBS和20μl诱导缓冲液充分洗涤细胞。经过六个小时的孵育之后，向每个孔添加20μl的cAMP-GloTM裂解缓冲液，以裂解细胞，并且将各个孔的样品转移用于荧光酶分析的新的96孔板(不透明的白色)。为了定量cAMP，按照手册，向每个孔添加40μl的cAMP-GloTM检测溶液，并振荡1分钟以促进反应，在室温下孵育20分钟，之后添加80μl的激酶Glo(Kinase-Glo)试剂，再次振荡1分钟之后在室温下孵育10分钟。通过96-孔酶标仪(96-well microplate reader)读取吸光度。图表所示的数值为将NIH3T3-IRES-EV细胞中所显示的的cAMP水平设为1时的相对值，显示了三次独立实验的平均值。
对于瞬时转染的NIH3T3细胞，则使用了在实施例5中说明的转染方法，之后的过程则与上述方法相同。
荧光素酶报告基因分析(Luciferase Reporter assay)
使用CRE-luc报告DNA质粒来确认hSTM1对cAMP水平的影响。首先将NIH3T3小鼠成纤维细胞以4×104个细胞的浓度等分到24-孔板，并使其在10％FBS-DMEM培养基中生长至50％汇合。首先使用下述物质制备总计500ng的DNA混合物，即，与200ng的报告质粒(Reporter plasmid)一并使用10ng的雷尼利亚(Renilla)(转染效率对照)表达载体、150-300ng的pCMV-hSTM1表达载体、将pCMV-taq1表达载体用作对照。然后按照制造公司的手册向每一DNA混合物添加1μl Lipofectamine Plus试剂(Invitrogen)，并孵育15分钟，从而形成DNA复合体。在该期间以PBS洗净细胞并悬浮于无血清培养基中。将生成的DNA复合体以预定量等分到每个孔，孵育4小时。再一次以PBS洗涤细胞，并且维持在补充了10％FBS的培养基中。孵育DNA复合体48小时后，向每个孔添加100μl细胞裂解缓冲溶液(用于荧光素酶分析，Promega)以制备样品，使50μl每一样品与50μl荧光素反应，从而通过光度计(Luminometer)测量各个报告基因的活性。然后添加终止缓冲液(Stop buffer)，通过光度计测量雷尼利亚的活性。上述各个报告基因活性的数值除以各个样品的雷尼利亚活性值，并针对与实验组(含pCMV-hSTM1的样品)对于对照(含pCMV-taq1的样品)的活性的相对比例表示。图片为4次独立实验的平均值。
另外，已知cAMP水平的变化对下游效应子即蛋白激酶A的活性产生影响，由此对MAP激酶的上游因子即raf1激酶的磷酸化产生影响。利用p-raf1的蛋白印迹研究下述内容，即，hstm1(稳定的和瞬时的)对raf1激酶的磷酸化产生影响，从而促进细胞生长。除了使用了抗p-raf(S259)(1∶1000，Cell signaling#9421)抗体以外，如实施例6所述，进行蛋白印迹。
实施例9.外部上游信号递质对新的GPCR促进细胞生长的影响
探讨了影响hstm1活性的外表刺激因子。为此，为了研究对hstm1产生影响的外部刺激因素而使用细胞生长因子，为了确认已知的几个GPCR配体是否对由hstm1的超表达引起的细胞生长促进产生影响而采用WST分析(参考实施例6)分析细胞生长促进程度。通常引起cAMP水平降低的G-蛋白为Gi家族，已知G蛋白介导的信号途径受到PTX(Pertussis toxin，百日咳毒素)的抑制。因此，水平根据PTX而变化的生长因子很可能是hstm1上游的信号因子。在本实施例中，与对照相比，添加血清促进细胞4倍生长，但其效果由于PTX处理而减少。因此可证明受到PTX抑制的信号途径参与hstm1的细胞生长促进(图6A)。
具体而言，研究EGF、PDGF、胰岛素、IGF-I、HGF、VEGF、血管紧张肽、缓激肽、LPA等血清内的生长因子和配体促进细胞生长的能力。下表示出了细胞生长因子和其浓度。其结果可知，用PDGF、胰岛素、IGF-I、VEGF、血管紧张肽、缓激肽、LPA等处理促进细胞生长，而PTX抑制所述促进。从而可知上述提及的细胞生长因子和配体是对hstm1的细胞生长促进产生影响的物质(图6B)。
表2
| 生长因子 | 公司 | 目录号 | 终浓度 |
| EGF | R&D System | 236-EG | 200ng/ml |
| PDGF | Calbiochem | 521225 | 20ng/ml |
| 胰岛素 | Sigma | I9278 | 1μg/ml |
| IGF-1 | R&D System | 291-G1 | 0.2ng/ml |
| HGF | R&D System | 294-HG | 20ng/ml |
| VEGF | R&D System | 293VE | 10ng/ml |
| 血管紧张肽II | Sigma | A9525 | 200nM |
| 缓激肽 | Sigma | B3259 | 10nM |
| LPA | Sigma | L7260 | 1μM |
实施例10.使用RT-PCR进行基因表达分析
为了研究与各稳定细胞系的细胞生长促进相关的基因表达变化，以RT-PCR测量了在实施例9中得到确认的细胞生长因子即IGFI和II以及细胞周期蛋白D1的相对RNA水平。RNA的分离和c-DNA的合成使用与实施例3、4相同的方法。使用Dr.Taq(Dr.Taq Master mix，Doctor Protein公司)，并且按照制造公司手册，进行PCR。引物则分别使用2μl 20pmol的母液。下文表3总结了各个基因的PCR引物序列和退火温度信息。
表3
由图7A可以看出，可知在超表达hstm1的细胞中，IGF-I、IGF-II、和细胞周期蛋白D1的转录得到了促进。
实施例11.IGF-I和IGF-II对细胞生长影响的免疫中和分析
通过实施例9得知在表达hstm1的细胞中IGF-I、-II的表达增加，从而期望通过进行实验来研究利用抗体中和IGF-I、IGF-II防止其与受体结合时，表达hstm1的细胞的细胞生长促进是否减少。为此，用40μg/ml抗IGF-I和抗IGF-II抗体处理细胞培养物，使得存在于培养基中的IGF-I或者IGF-II不能发挥功能，并通过SRB分析，分析细胞生长程度。通过对分离自相同样品的蛋白进行蛋白印迹，检查蛋白表达变化。其结果可知，用抗IGF-I抗体中和，使对照的细胞生长减少12％左右，实验组的细胞生长减少25％(图7C、D)，而用蛋白印迹未检测到p-Erk1/2、细胞周期蛋白D1和p-AKT表达水平的显著变化(图7B)。通过抗IGF-II抗体实施中和时，对照的细胞生长减少18％、实验组的细胞生长减少35％左右(图7C、D)，而蛋白印迹表明，p-erk1/2、细胞周期蛋白D1和p-AKT的表达水平发生变化(图7B)。通过全部使用IGF-I和IGF-II的抗体来实施实验时，在观察到细胞以较慢的速率生长，而通过蛋白印迹，与单独的IGF-II的抗体在蛋白表达模式方面并无差别。由此可知IGF-I、IGF-II参与由hstm1诱导的细胞生长促进，尤其是IGF-II参与由hstm1诱导的细胞生长促进。
免疫中和分析
以每孔1×105个细胞的密度，将NIH3T3/IRES-EV细胞和NIH3T3/IRES-hSTM1细胞接种于12孔板上，并以每孔5,000个细胞的密度接种于96-孔板上，并使之生长到50％汇合。然后，分别以下述培养基替换原来的培养基：对于对照，以含有PBS的5％FBS-DMEM予以替换，对于实验组，以含有抗IGF-1抗体(Santacuz、40μg/ml)或者抗IGF-2抗体(Santacuz、40μg/ml)或者含有这两者的5％FBS-DMEM予以替换。在用抗体孵育24小时之后，以PBS洗涤一次12孔板的细胞，然后使用RIPA细胞裂解缓冲溶液分离蛋白并且用于蛋白印迹，其中，所述蛋白印迹使用了抗细胞周期蛋白D1抗体、抗-p-ERK1/2(抗phospho-ERK1/2)抗体、抗ERK1/2抗体、抗-p-AKT(抗p-AKT)抗体。向96-孔板的细胞添加与培养基相同体积的10％福尔马林溶液来固定细胞。孵育30分钟之后使用PBS洗净细胞，并且使其干燥过夜。向干燥的细胞添加1％SRB溶液之后孵育1小时以便使细胞染色。然后丢弃染色溶液之后以蒸馏水再一次洗净细胞并将其干燥。通过向干燥的细胞添加10mM的Tris溶液来提取染料，并将其移至新的96孔板，使用540nm波长测定吸光度。用吸光度分析免疫中和对细胞增殖的影响。
实施例12.鉴定与新的GPCR偶联的G蛋白
1)体外结合-用His标记的hstm1鉴定相关的G蛋白
a.6xHis标记的蛋白的制备
将hSTM1插入至E.coli表达载体pET28a中，其中，所述E.coli表达载体用于将6xHis与蛋白结合。将pET28a、pET28a-hSTM1转化至BL21大肠杆菌之后，当细胞生长至OD600＝0.5时，添加IPTG使得最终浓度达到0.5mM，然后在20℃下恒温振荡孵育8小时，从而诱导蛋白的表达。
通过离心收获上述各个大肠杆菌细胞，使其悬浮于1X结合缓冲液(20mMTris、500mM NaCl、pH 7.5+蛋白酶抑制剂)中之后，使用超声波粉碎机(sonicator)破裂大肠杆菌细胞。离心(12,000rpm、30分钟、4℃)后，使用注射过滤器(0.45μm)过滤上清液。
b.6x His标记的蛋白与His结合琼脂糖树脂的结合
-用3体积蒸馏水随后用3体积1X结合缓冲液洗涤从ELPIS购买(ELPIS Cat.No.EBE-1031)的结合有镍离子的His结合琼脂糖树脂。
-将1的树脂添加至步骤a)的每一6xHis标记的蛋白样品中之后，在4℃下离心3小时，使得蛋白与His树脂结合。
-将2的样品转载到柱子上，以0.6～0.7体积的结合缓冲液洗涤三次。
c.制备与结合有His结合琼脂糖的6xHis标记的蛋白发生反应的总细胞裂解物
大量培养SW620细胞系之后，以D-PBS(Dulbecco′sPhosphate-Buffered Saline，GIBCO，Ca.No.21600-010，达尔伯克氏磷酸缓冲盐水)收获，然后以超声波粉碎机破裂细胞。离心(12,000rpm，30分钟，4℃)破裂的细胞后，使用注射过滤器(0.45μm)过滤上清液。向过滤的总细胞裂解物添加若干His树脂之后在4℃下离心3小时以去除不需要的蛋白等，由此制备样品。
d.检测与结合有His结合琼脂糖树脂的6xHis标记的蛋白相互作用的蛋白
将步骤c的细胞裂解物添加至结合有His标记的蛋白的步骤b)的树脂，在4℃下混合12小时，然后以D-PBS洗涤3次。通过添加多种浓度的NaCl缓冲液，洗脱细胞裂解物的蛋白，其结合有His标记的蛋白，然后添加SDS样品缓冲液并在95℃下进行15分钟的变性，然后在10％SDS-PAGE凝胶中电泳。以蛋白印迹鉴定各个蛋白。使用的抗体有抗-His(抗His)、抗-Gia1/2/3(抗Gia1/2/3)。蛋白印迹模式表明，Gαi亚单位(subunit)与hstm1偶联。
2)免疫沉淀法-使用Flag标记的hstm1鉴定偶联的G蛋白
用Flag标记的hstm1转染SW620细胞系，孵育72小时，然后用来以与实施例11的c相同的方法制备样品。使用Flag珠(sigma)将Flag标记的hstm1结合于珠之后以与步骤d相同的方法去除其他蛋白，然后利用电泳和蛋白印迹鉴定与受体偶联的蛋白。使用的抗体为抗-flag(抗flag)和抗-Gαi1/2/3(抗Gαi1/2/3)。实施例6描述了抗体的信息。
实施例13.用siRNA研究细胞信号转导途径
1)G蛋白siRNA对hstm1信号转导的抑制及确定相关Gαi亚基
采用siRNA进行基因抑制，来研究Gαi蛋白的哪种同种型传递hSTM1a介导的信号转导。将NIH3T3-IRES-EV和NIH3T3-IRES-hSTM1细胞系以每孔1.5×105个、2×105个细胞分别接种在6-孔板之后，并使其生长至40％汇合。然后向500μl的无血清DMEM分别添加5μl Gαi-1、Gαi-2、Gαi-3的siRNA和乱序siRNA(1+2)(母液：20nmol)。按照制造公司的手册，向上述各个样品分别添加15μl siRNA转染试剂即hiperfect(Qiagen)，之后使用搅拌机充分搅拌，并在室温下静置15分钟以便形成siRNA转染复合体。在该期间，以1.5ml新鲜10％FBS-DMEM替换各个孔的培养基。经过15分钟之后，将各个样品逐滴缓慢地添加至各个孔(添加至细胞的siRNA的最终浓度为5pmol)。孵育48小时之后，使用相同浓度的siRNA，再一次重复使用hiperfect(Qiagen)的转染步骤。第二次添加siRNA之后24小时，向细胞分别添加200μl细胞裂解缓冲液或者添加500μl Trizol，从而从各个样品中提取蛋白或者RNA。
蛋白提取物的情况下，在各个样品中仅使用30μg蛋白，实施SDS-PAGE、蛋白印迹，来利用siRNA确定哪种蛋白的表达由于Gαi-1、Gαi-2、Gαi-3的基因抑制而发生变化。
对于RNA提取物，将其应用于RT-PCR，利用siRNA来确认哪种基因由于基因抑制而在mRNA表达水平上发生变化。使用的siRNA的核苷酸序列和RT-PCR引物如下。
表4
表5
制备相同样品的蛋白样品，通过蛋白印迹监测细胞周期蛋白D1、β-肌动蛋白的蛋白水平的变化。其结果，可知hstm1介导的细胞信号转导受到Gαi-2、Gαi-3的siRNA的抑制。
2)hstm1 siRNA对癌细胞系生长潜力的抑制
使用胃癌细胞系和肝癌细胞系，以与1)相同方法用hstm1 siRNA单独处理48小时之后观察细胞生长抑制程度。图9A是显示在用si-hstm1(hstm1 siRNA)处理之后平板上胃癌细胞系细胞的图片，图9B是使用肝癌细胞系实施实验的结果。从细胞形态和饱和度可以看出，当用si-hstm1处理样品时，细胞整体生长缓慢。通过WST分析，以图表显示其结果(图9C)。尽管在定量图表中也存在一些没有反应的细胞系，但是大多数胃癌细胞系(5/7)和肝癌细胞系(2/4)的生长受到si-hstm1的抑制。所用的siRNA序列在表6中给出，且预测的hstm1 siRNA的序列总结于表7中。
表6
表7
实施例14.迁移(Migration)以及侵入分析(Invasion assay)
为了调查超表达hstm1的细胞系的运动性，将分离的细胞置于皿中的ibidi Culture-Insert(Cat No.80206)上，并允许其粘附于插件(insert)的底部，当细胞完全贴壁之后去除Culture-Insert，从而观察到细胞通过插件内构建的路径迁移。每小时以显微镜进行观察并拍照。
从照片中可以看出，与对照相比，超表达hstm1的细胞系中有更多数量的细胞系通过细胞间空间，这显示超表达hstm1的细胞系具有更高的运动性(图10A)。
另外，为了研究超表达hstm1的细胞系的转移能力而使用了Chemicon的ECM侵入腔(ECM Invasion Chamber，70019)。将无血清培养基添加至腔的内部并孵育30分钟，以适合用于侵袭分析。计数相同数量的重悬浮在无血清培养基中的细胞以添加至腔的内部，而在腔外的孔添加补充有10％血清的培养基，并在CO2培养箱中孵育24小时。24小时之后取出腔并且浸在1％结晶紫溶液中以染色细胞，以水洗净剩余的颜料之后观察从腔内侵入至腔外的细胞(图10B)。为了定量分析，以1％乙酸溶液从染色的细胞中分离颜料，采用分光光度计读取吸光度。结果可知超表达hstm1的细胞系的转移能力增加(图10B)。
Claims (24)
1.GPCR(G蛋白偶联受体)多肽，由SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列构成。
2.编码权利要求1所述的GPCR多肽的多核苷酸。
3.根据权利要求2所述的多核苷酸，由SEQ ID NO：3、4或者5的核苷酸序列构成。
4.重组载体，携带权利要求2所述的多核苷酸或者其片段。
5.用权利要求4所述的重组载体转化的宿主细胞。
6.转基因动物，通过在代孕母体的子宫中植入权利要求5所述的细胞而产生。
7.用于检测癌症标志物的组合物，包含能测量权利要求2所述多核苷酸的mRNA或者蛋白表达水平的试剂。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中，所述能测量所述多核苷酸的mRNA表达水平的试剂为与所述多核苷酸特异性结合的引物对、探针和反义核苷酸。
9.根据权利要求7所述的组合物，其中所述能测量蛋白表达水平的试剂为抗体。
10.根据权利要求7所述的组合物，其中所述癌症为胃癌、结肠直肠癌或者肝癌。
11.根据权利要求7所述的组合物，其中所述癌症为转移性癌。
12.用于诊断癌症的试剂盒，包含权利要求7-11中任意一项所述的组合物。
13.根据权利要求12所述的用于诊断癌症的试剂盒，所述试剂盒为逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)试剂盒、竞争性RT-PCR试剂盒、实时RT-PCR试剂盒、DNA芯片试剂盒或者蛋白芯片试剂盒。
14.检测权利要求2所述的多核苷酸的方法，包括：
a.制备生物样品；
b.用权利要求8所述的试剂处理所述生物样品；
c.检测所述试剂和与所述试剂互补的多核苷酸之间的复合体；以及
d.将检测的量与正常对照进行比较。
15.检测权利要求1所述的蛋白的方法，包括：
a.制备生物样品；
b.用权利要求1所述的蛋白的特异性抗体处理所述生物样品；
c.检测所述抗体和与其互补的蛋白之间的复合体；以及
d.将检测的量与正常对照进行比较。
16.用于治疗及预防癌症的组合物，包含抑制权利要求2所述的多核苷酸表达的寡核苷酸。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述寡核苷酸为针对权利要求2所述基因的反义寡核苷酸、siRNA或者shRNA。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述siRNA的核苷酸序列选自SEQ ID NO：20-23、SEQ ID NO：36-51和其组合。
19.根据权利要求15所述的组合物，其中所述癌症为胃癌、结肠直肠癌或者肝癌。
20.根据权利要求15所述的组合物，其中所述癌症为转移性癌。
21.用于治疗及预防癌症的组合物，包含抑制权利要求1所述多肽的活性的抗体或者其抗原结合片段。
22.筛选权利要求1所述多肽的调控剂的方法，包括：
用候选化合物处理表达权利要求1所述的多肽的细胞；以及
测定所述多肽的GPCR介导的信号转导活性的增加或者减少。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，通过监测cAMP水平的增加或者减少来测定所述GPCR介导的信号转导活性的增加或者减少。
24.筛选癌症治疗剂的方法，包括：
用候选化合物处理表达权利要求1所述的多肽的细胞；以及
测定所述多肽的GPCR介导的信号转导活性的增加或者减少。
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