CN105467137A - 游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒及其测试方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)测试试剂盒,该试剂盒由磁分离试剂,试剂R1,试剂R2,标准品,质控品,校准品,清洗浓缩液及发光底物组成,本发明还公开了该试剂盒的制备方法。本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合,提供了一种接近均相的反应体系,与现有酶联免疫的技术相比,本发明具有更高的特异性,灵敏度,获得检测结果的时间短,操作方式简便,检测结果准确可靠,大大降低了产品成本。
Description
技术领域
本发明涉及测定血清的试剂盒及其测试方法,尤其是涉及测定血清中游离人绒毛膜性腺激素β亚单位含量的试剂盒及其测试方法。
背景技术
人绒毛膜促性腺激素(hCG)是一种胎盘滋养层细胞分泌的糖蛋白激素,由α亚基和β亚基组合而成。两种亚基均可以游离态出现在血液中。hCGα亚基与垂体糖蛋白激素的α亚基相同,用免疫学方法无法将它们区别开,而hCG的β亚基是hCG的特有结构,也决定了其分子的生物学和免疫学特性,分子量为22.2KD。在整个怀孕过程中,游离F-β-hCG通常是随完整的hCG一起出现和增长,所以游离β-hCG是诊断早孕的一项重要的检测指标,其分泌与滋养细胞的数量密切相关。血清F-β-hCG测定还能诊断异位妊娠、先兆流产、葡萄胎及滋养细胞肿瘤,而且也是治疗后的及预后观察的重要检测指标,对其他疾病如卵巢生殖细胞肿瘤、男性肇丸肿瘤,非滋养细胞疾病、非生殖细胞也有辅助诊断意义。从检测角度上来说,目前临床上用于测定F-B-hCG的方法主要有放免法、ELISA法、化学发光法等。
过去以放免为代表的人绒毛膜促性腺激素β亚单位(F-β-hCG)测定试剂盒受方法学的限制,其灵敏度和抗干扰能力严重不足,存在很大的弊端,已基本上退出市场;酶联免疫法(ELISA)作为定性检测的方法,抗原、抗体的结合反应是在固相(ELISA板反应孔)表面进行的,其灵敏度、特异性均较好,且经济实惠,所以是应用得最广、最多的方法。化学发光法其灵敏度高,从化学角度和自动化程度看,化学发光法优于酶联免疫法。这些方法虽然都有很多优点,但在检测的灵敏度、特异性、稳定性、检测用时等方面还有待进一步提高。
发明内容
有鉴于此,本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足,提供一种特异性强,灵敏度高,获得检测结果的时间短,操作方式简便,检测结果稳定可靠的的游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)的测试试剂盒及其测试方法。
为达到上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)测试试剂盒,该试剂盒由磁分离试剂,试剂R1,试剂R2,标准品,质控品,校准品,清洗浓缩液及发光底物组成,其中:磁分离试剂:标记有小鼠抗人F-β-hCG的单克隆抗体的纳米磁性微球,所述标记有小鼠抗人F-β-hCG的单克隆抗体的纳米磁性微球浓度为100μg/ml;试剂R1:含有碱性磷酸酶标记的F-β-hCG抗体,所述碱性磷酸酶标记的F-β-hCG抗体的浓度为0.2μg/ml;试剂R2:含有牛γ球蛋白质组分的缓冲液;标准品,质控品和校准品:含有一定量F-β-hCG抗原的小牛血清溶液,所述标准品的浓度为0(S0)、5(S1)、15(S2)、40(S3)、80(S4)、200(S5)mIU/ml,所述质控品浓度为10,80mIU/ml,所述校准品浓度为15,80μIU/ml;清洗浓缩液:含有Tween-20和Proclin-300的缓冲液;发光底物:金刚烷的衍生物IUMIPHOS530,所述金刚烷的衍生物IUMIPHOS530的浓度为10μg/ml。
一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)测试试剂盒,由下述体积分数组成:磁分离试剂5%-7%,试剂R15%-7%,试剂R25%-7%,标准品5%-7%,质控品1%-3%,校准品3%-6%,清洗浓缩液20%-40%,发光底物30%-50%。
优选地,一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒,由下述体积分数组成:磁分离试剂5%,试剂R15%,试剂R25%,校准品5%,质控品1%,校准品3%,清洗浓缩液26%,发光底物50%。
优选地,一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒,由下述体积分数组成:磁分离试剂6%,试剂R16%,试剂R26%,校准品6%,质控品2%,校准品4%,清洗浓缩液30%,发光底物40%。
优选地,一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒,由下述体积分数组成:磁分离试剂7%,试剂R17%,试剂R27%,校准品7%,质控品3%,校准品6%,清洗浓缩液33%,发光底物30%。
所述试剂盒中各组分按照如下制备方法制得:
第一步:磁分离试剂的制备过程
一、磁珠缓冲液配制操作规程:
(1)称取Tris4.58g和NaCl6.81g于1L容器中,称取0.96gTween-20于20ml容器中加适量水使其完全溶解后,倒入上述容器中;
(2)用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入上述1L容器中;然后在1L容器中加入800ml纯化水,充分搅拌,使试剂完全溶解;
(3)调节PH计测量其PH值;用4MHCl或4MNaOH调PH,测量其PH在7.95-8.05之间即符合要求;
(4)称取BSAV(牛血清白蛋白(第五组分))3g倒入上述1L容器中;
(5)最后定容至1000ml,测PH值,范围在7.95-8.05之间即符合要求,用0.2um滤器过滤即得;过滤完后贴好标签于2-8℃冷库贮存;
二、磁分离试剂的配制:
(1)将1.0mgDSS(辛二酸二琥珀酰亚胺)溶于50ulDMSO中,即浓度为20mg/mL;取2mgF-β-hCG抗体溶于PH9.5的0.1mol/LPB缓冲液中至总体积为1ml;
(2)计算DSS的投入量,按照以下公式计算:(抗体质量/16000)×10×368/CDSS),其中CDSS指代DSS的物质的量浓度mol/L;
(3)用移液枪吸取相应体积的DSS加入到步骤1的抗体溶液中,置室温90min;
(4)将步骤3抗体溶液加入到Centricon-10浓缩管中,然后放入到sigma2-16k高速冷冻离心机中在3000g的离心力下浓缩约30min至体积为0.5ml;
(5)取0.5ml磁珠,所述的磁珠直径在0.9-1.5μm之间,加入5ml反应杯中,放入专用试管架,经磁铁吸附2分钟后吸取上清;
(6)每次加入1.5mlPH9.50.1mol/LPB,混匀30秒,上架,去上清,重复操作3次;将步骤4获得的抗体溶液加入到磁珠中,混匀后室温反应4小时,保持混匀状态;
(7)加入0.3ml1mol/L的Tris溶液37℃15分钟,其中Tris的加样量为1mg抗体加0.15mlTris;
(8)每次加入1.5mlPH7.20.1mol/LPB清洗已经标记的磁珠,混匀30秒,上架,去上清,重复操作3次;
(9)用100ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶,即为0.05%的F-β-hCG磁分离试剂;
(10)将步骤9获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1:2.3的比例混匀,即得本发明试剂盒中磁分离试剂;
第二步:试剂R1的制备过程
一、试剂R1稀释液配制操作规程:
(1)取Tris6.06g、NaCl13.0g、Zncl20.05g、Proclin-3000.2ml和MgCl20.05g于烧瓶中;然后在烧瓶中加入800ml纯化水,充分搅拌,使试剂完全溶解;
(2)用4MHCl或4MNaOH调PH,测量使PH在7.35-7.45范围内;
(3)称取BSAV3g倒入上述烧瓶中;
(4)最后定容至1000ml,测PH值,范围在7.35-7.45之间即符合要求,用0.2um滤器过滤;过滤完后,贴好标签于2-8℃冷库贮存;
二、试剂R1的配制(碱性磷酸酶(ALP)与F-β-hCG单克隆抗体的偶联)
(1)取10mgALP加入5ml生理盐水中,加入到Centricon-10浓缩管中,3000rpm离心大约20分钟,浓缩至1毫升;
(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1MNaIO4溶液,室温下避光搅拌20分钟;
(3)将上述溶液装入透析袋中,用1mMPH4.4的醋酸钠缓冲液透析,4℃过夜;
(4)加20μl0.2MPH9.5碳酸盐缓冲液,使以上醛化ALP的PH升高到9.0~9.5,然后立即加入2.5mgIgG抗体,在1ml0.01M碳酸盐缓冲液中,室温避光轻轻搅拌2小时;
(5)加0.1ml新配的4mg/mlNaBH4液,混匀,再置4℃2小时;
(6)将上述液装入透析袋中,对0.15MPH7.4PBS透析,4℃过夜;
(7)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置4℃1小时;
(8)3000rpm离心半小时,弃上清;沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,最后沉淀物溶于少量0.15MPH7.4的PBS中;
(9)将上述溶液装入透析袋中,对0.15MPH7.4的PB缓冲盐水透析约5个小时,去除铵离子后,10000rpm离心30分钟去除沉淀,上清液即为酶结合物,加入体积1/100的1MMgcl2溶液4℃保存;收集到的碱性磷酸酶(ALP)与F-β-hCG单克隆抗体的偶联物用上述酶反应物稀释液以1:3000的体积比混合均匀,即得本发明试剂盒中试剂R1;
第三步:试剂R2的制备
试剂R2配制操作规程:
(1)称取Tris(三羟甲基氨基甲烷,分子式:(HOCH2)3CNH2)1.56g和NaCl4.23g于1L烧杯中;用移液器将Proclin-300量取0.2ml于少量纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入上述1L容器中;
(2)用量筒量取800ml纯化水于烧杯中,充分搅拌,直至完全溶解;用4MHCL或4MNaOH调PH,测量其范围在7.35-7.45之间;
(3)称取牛γ球蛋白(IgG)1.8g于800ml纯化水的烧杯中;
(4)最后定容1000ml,完全溶解后,测PH值,范围在7.35-7.45之间即符合要求,用0.2um滤器过滤;过滤完后,贴好标签于2-8℃冷库贮存;
第四步:标准品、质控品和校准品的配制:
(1)游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)定量测定试剂盒F-β-hCG标准品原料配制成浓度点为0,5,15,40,80,200mIU/ml;质控品配制的浓度点为10,80mIU/ml,校准品的浓度点为15,80mIU/ml;
(2)充分混匀后,贴好标签于2-8℃冷库贮存;
第五步:清洗浓缩液配制操作规程:
(1)称取Tris12.54g和NaCl325.6g于1L容器中;
(2)称取5gTween-20于100ml容器中加20ml水使其完全溶解后,倒入上述容器中;
(3)用移液器将Proclin-300量取0.2ml于盛有10ml纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入上述1L容器中;
(4)用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中,充分搅拌,直至完全溶解;
(5)用4MHCL或4MNaOH调PH,测量其范围在7.35-7.45之间;
(6)最后定容1000ml,测PH值,范围在7.35-7.45之间即符合要求,完全溶解后用0.2um滤器过滤即得;过滤完后,贴好标签于2-8℃冷库贮存;
第六步:发光底物配制
发光底物配制操作规程:
(1)称取Tris2.35g、NaCl6.41g、Na2SO30.002g和Proclin-3000.2ml于1L烧杯中;
(2)用量筒量取800ml纯化水于烧杯中,充分搅拌,直至完全溶解;用4MHCl或4MNaOH调PH,测量其范围在7.95-8.05之间;
(3)最后定容至1000ml,测PH值,范围在7.95-8.05之间即符合要求,用0.2um滤器过滤;过滤完后,加入250mlIUMIPHOS530,混匀后,贴好标签于2-8℃冷库贮存;
1.一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)的测试方法,包括下列步骤:
(1)使用前,需使用试剂盒内校准品(选)进行曲线校正,并用质控品进行质量控制,测试结果在质控范围内方可进行样本的检测;
(2)加F-β-hCG标准品、质控品、待测标本至对应试管底部;
(3)加试剂R1至每一试管中;
(4)加试剂R2至每一试管中;
(5)加磁分离试剂至每一试管中;
(6)用塑料薄膜覆盖试管,多管混匀器轻轻振荡试管架30秒后,置37℃水浴30分钟;
(7)试管连架放至磁分离器上,确保每支试管都与分离器表面接触,沉淀2分钟。缓慢的倒转分离器倒出上清液,把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上,用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴;
(8)清洗浓缩液用纯化水稀释7倍后,加稀释后的清洗液至每一试管中,置多管混匀器上轻轻振荡混匀30s;加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出;混匀要彻底;
(9)重复步骤6、7、6一遍;
(10)加发光底物溶液至试管中混匀3秒,迅速用准备好的发光检测仪进行检测。
本发明的有益效果在于:
(1)本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合,提供了一种接近均相的反应体系,与现有技术相比,在出结果时间上较传统酶联免疫法少10-20分钟,同时抗体的用量降低了20%以上,在提高产品性能的同时,大大降低了产品成本。
(2)本发明公开了一种新的专用试剂R2,使得反应过程更加稳定可靠,具有更高的检测灵敏度和特异性,并达到了较佳的性能参数。
(3)试剂盒中的磁分离试剂,试剂R1,试剂R2,标准品,质控品,校准品,清洗浓缩液、稀释液以及发光底物的配比均是反应体系下的最优配方,给该试剂盒的使用有效期及检测性能提供了有力保障。
(4)本发明试剂盒的精确度、灵敏度以及稳定性均优于市场同类产品,并且成本低廉,操作简单,应用前景广阔。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式,对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1:
一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)测试试剂盒,该试剂盒由磁分离试剂,试剂R1,试剂R2,标准品,质控品,校准品,清洗浓缩液及发光底物组成,其中:磁分离试剂:标记有小鼠抗人F-β-hCG的单克隆抗体的纳米磁性微球,所述标记有小鼠抗人F-β-hCG的单克隆抗体的纳米磁性微球浓度为100μg/ml;试剂R1:含有碱性磷酸酶标记的F-β-hCG抗体,所述碱性磷酸酶标记的F-β-hCG抗体的浓度为0.2μg/ml;试剂R2:含有牛γ球蛋白质组分的缓冲液;标准品,质控品和校准品:含有一定量F-β-hCG抗原的小牛血清溶液,所述标准品的浓度为0(S0)、5(S1)、15(S2)、40(S3)、80(S4)、200(S5)mIU/ml,所述质控品浓度为10,80mIU/ml,所述校准品浓度为15,80mIU/ml;清洗浓缩液:含有Tween-20和Proclin-300的缓冲液;发光底物:金刚烷的衍生物IUMIPHOS530,所述金刚烷的衍生物IUMIPHOS530的浓度为10μg/ml;
本实施例游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)测试试剂盒,由下述体积分数组成:磁分离试剂5%,试剂R15%,试剂R25%,校准品5%,质控品1%,校准品3%,清洗浓缩液26%,发光底物50%。
本发明上述游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)测定试剂盒的制备方法,其具体步骤如下:
第一步:磁分离试剂的制备过程
一、磁珠缓冲液配制操作规程:配方见表1,以配制1L为例:
(1)称取Tris4.58g和NaCl6.81g于1L容器中,称取0.96gTween-20于20ml容器中加适量水使其完全溶解后,倒入上述容器中;
(2)用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入上述1L容器中;然后在1L容器中加入800ml纯化水,充分搅拌,使试剂完全溶解;
(3)调节PH计测量其PH值;用4MHCl或4MNaOH调PH,测量其PH在7.95-8.05之间即符合要求;
(4)称取BSAV(牛血清白蛋白(第五组分))3g倒入上述1L容器中;
(5)最后定容至1000ml,测PH值,范围在7.95-8.05之间即符合要求,用0.2um滤器过滤即得;过滤完后贴好标签于2-8℃冷库贮存;
磁珠缓冲液(表1)
二、磁分离试剂的配制
(1)将1.0mgDSS(辛二酸二琥珀酰亚胺)溶于50ulDMSO中,即浓度为20mg/mL;取2mgF-β-hCG抗体溶于PH9.5的0.1mol/LPB缓冲液中至总体积为1ml;
(2)计算DSS的投入量,按照以下公式计算:(抗体质量/16000)×10×368/CDSS),其中CDSS指代DSS的物质的量浓度mol/L;
(3)用移液枪吸取相应体积的DSS加入到步骤1的抗体溶液中,置室温90min;
(4)将步骤3抗体溶液加入到Centricon-10浓缩管中,然后放入到sigma2-16k高速冷冻离心机中在3000g的离心力下浓缩约30min至体积为0.5ml;
(5)取0.5ml磁珠,所述的磁珠直径在0.9-1.5μm之间,加入5ml反应杯中,放入专用试管架,经磁铁吸附2分钟后吸取上清;
(6)每次加入1.5mlPH9.50.1mol/LPB,混匀30秒,上架,去上清,重复操作3次;将步骤4获得的抗体溶液加入到磁珠中,混匀后室温反应4小时,保持混匀状态;
(7)加入0.3ml1mol/L的Tris溶液37℃15分钟,其中Tris的加样量为1mg抗体加0.15mlTris;
(8)每次加入1.5mlPH7.20.1mol/LPB清洗已经标记的磁珠,混匀30秒,上架,去上清,重复操作3次;
(9)用100ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶,即为0.05%的F-β-hCG磁分离试剂;
(10)将步骤9获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1:2.3的比例混匀,即得本发明试剂盒中磁分离试剂;
第二步:试剂R1的制备过程
一、试剂R1稀释液配制操作规程:配方见表2,以配制1L为例:
(1)取Tris6.06g、NaCl13.0g、Zncl20.05g、Proclin-3000.2ml和MgCl20.05g于烧瓶中;然后在烧瓶中加入800ml纯化水,充分搅拌,使试剂完全溶解;
(2)用4MHCl或4MNaOH调PH,测量使PH在7.35-7.45范围内;
(3)称取BSAV3g倒入上述烧瓶中;
(4)最后定容至1000ml,测PH值,范围在7.35-7.45之间即符合要求,用0.2um滤器过滤;过滤完后,贴好标签于2-8℃冷库贮存;
试剂R1稀释液(表2)
二、试剂R1的配制(碱性磷酸酶(ALP)标记的小鼠抗人F-β-hCG单克隆抗体)
(1)取10mgALP加入5ml生理盐水中,加入到Centricon-10浓缩管中,3000rpm离心大约20分钟,浓缩至1毫升;
(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1MNaIO4溶液,室温下避光搅拌20分钟;
(3)将上述溶液装入透析袋中,用1mMPH4.4的醋酸钠缓冲液透析,4℃过夜;
(4)加20μl0.2MPH9.5碳酸盐缓冲液,使以上醛化ALP的PH升高到9.0~9.5,然后立即加入2.5mgIgG抗体,在1ml0.01M碳酸盐缓冲液中,室温避光轻轻搅拌2小时;
(5)加0.1ml新配的4mg/mlNaBH4液,混匀,再置4℃2小时;
(6)将上述液装入透析袋中,对0.15MPH7.4PBS透析,4℃过夜;
(7)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置4℃1小时;
(8)3000rpm离心半小时,弃上清,沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,最后沉淀物溶于少量0.15MPH7.4的PBS中;
(9)将上述溶液装入透析袋中,对0.15MPH7.4的PB缓冲盐水透析约5个小时,去除铵离子后,10000rpm离心30分钟去除沉淀,上清液即为酶结合物,加入体积1/100的1MMgcl2溶液4℃保存;收集到的碱性磷酸酶(ALP)与F-β-hCG单克隆抗体的偶联物用上述酶反应物稀释液以1:3000的体积比混合均匀,即得本发明试剂盒中试剂R1;
第三步:试剂R2的制备
试剂R2配制操作规程:配方见(表3),以配制1L为例:
(1)称取Tris(三羟甲基氨基甲烷,分子式:(HOCH2)3CNH2)1.56g和NaCl4.23g于1L烧杯中;用移液器将Proclin-300量取0.2ml于少量纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入上述1L容器中;
(2)用量筒量取800ml纯化水于烧杯中,充分搅拌,直至完全溶解;用4MHCL或4MNaOH调PH,测量其范围在7.35-7.45之间;
(3)称取牛γ球蛋白(IgG)1.8g于800ml纯化水的烧杯中;
(4)最后定容1000ml,完全溶解后,测PH值,范围在7.35-7.45之间即符合要求,用0.2um滤器过滤;过滤完后,贴好标签于2-8℃冷库贮存;
试剂R2的配制(表3)
第四步:标准品、质控品和校准品的配制:
(1)最高点:最高浓度点为X,目标点浓度为A,B,C,D,E,F,配制V体积的溶液时,需加入原料的体积为分别为:(表4)
浓度 | 加入标准品稀释液体积 | 加入X体积 |
A | V-A*V/X | A*V/X |
B | V-B*V/X | B*V/X |
C | V-C*V/X | C*V/X |
D | V-D*V/X | D*V/X |
E | V-E*V/X | E*V/X |
F | V-F*V/X | F*V/X |
(2)游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)定量测定试剂盒F-β-hCG标准品原料配制成浓度点为0,5,15,40,80,200mIU/ml;质控品配制的浓度点为10,80mIU/ml,校准品的浓度点为15,80mIU/ml;
(3)充分混匀后,贴好标签于2-8℃冷库贮存;
第五步:清洗浓缩液配制操作规程:配方见(表5),以配制1L为例:
(1)称取Tris12.54g和NaCl325.6g于1L容器中;
(2)称取5gTween-20于100ml容器中加20ml水使其完全溶解后,倒入上述容器中;
(3)用移液器将Proclin-300量取0.2ml于盛有10ml纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入上述1L容器中;
(4)用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中,充分搅拌,直至完全溶解;
(5)用4MHCL或4MNaOH调PH,测量其范围在7.35-7.45之间;
(6)最后定容1000ml,测PH值,范围在7.35-7.45之间即符合要求,完全溶解后用0.2um滤器过滤即得;过滤完后,贴好标签于2-8℃冷库贮存;
清洗浓缩液的配制(表5)
第六步:发光底物配制操作规程:配方见(表6),以配制1L为例:
(1)称取Tris2.35g、NaCl6.41g、Na2SO30.002g和Proclin-3000.2ml于1L烧杯中;
(2)用量筒量取800ml纯化水于烧杯中,充分搅拌,直至完全溶解;用4MHCl或4MNaOH调PH,测量其范围在7.95-8.05之间;
(3)最后定容至1000ml,测PH值,范围在7.95-8.05之间即符合要求,用0.2um滤器过滤;过滤完后,加入250mlIUMIPHOS530,混匀后,贴好标签于2-8℃冷库贮存;
发光底物的配制(表6)
本发明一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)的测试方法(以100μl为例),包括下列步骤:
(1)使用前,需使用试剂盒内5μl校准品(选)进行曲线校正,并用X(X<1μl)质控品进行质量控制,测试结果在质控范围内方可进行样本的检测;
(2)加5μlF-β-hCG标准品、(1-X)μl质控品、待测标本至对应试管底部;
(3)加试剂5μlR1至每一试管中;
(4)加试剂5μlR2至每一试管中;
(5)加5μl磁分离试剂至每一试管中;
(6)用塑料薄膜覆盖试管,多管混匀器轻轻振荡试管架30秒后,置37℃水浴30分钟;
(7)试管连架放至磁分离器上,确保每支试管都与分离器表面接触,沉淀2分钟。缓慢的倒转分离器倒出上清液,把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上,用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴;
(8)将26μl清洗浓缩液用纯化水稀释7倍后,加200μl稀释后的清洗液至每一试管中,置多管混匀器上轻轻振荡混匀30s;加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出。混匀要彻底;
(9)重复步骤6、7、6一遍;
(10)加50μl发光底物溶液至试管中混匀3秒,迅速用准备好的发光检测仪进行检测。
实施例2:
一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)测试试剂盒,该试剂盒由磁分离试剂,试剂R1,试剂R2,标准品,质控品,校准品,清洗浓缩液及发光底物组成,其中:磁分离试剂:标记有小鼠抗人F-β-hCG的单克隆抗体的纳米磁性微球,所述标记有小鼠抗人F-β-hCG的单克隆抗体的纳米磁性微球浓度为100μg/ml;试剂R1:含有碱性磷酸酶标记的F-β-hCG抗体,所述碱性磷酸酶标记的F-β-hCG抗体的浓度为0.2μg/ml;试剂R2:含有牛γ球蛋白质组分的缓冲液;标准品,质控品和校准品:含有一定量F-β-hCG抗原的小牛血清溶液,所述标准品的浓度为0(S0)、5(S1)、15(S2)、40(S3)、80(S4)、200(S5)mIU/ml,所述质控品浓度为10,80mIU/ml,所述校准品浓度为15,80mIU/ml;清洗浓缩液:含有Tween-20和Proclin-300的缓冲液;发光底物:金刚烷的衍生物IUMIPHOS530,所述金刚烷的衍生物IUMIPHOS530的浓度为10μg/ml;
本实施例一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)测试试剂盒,由下述体积分数组成的:磁分离试剂6%,试剂R16%,试剂R26%,校准品6%,质控品2%,校准品4%,清洗浓缩液30%,发光底物40%。
本发明一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)的测试方法(以100μl为例),包括下列步骤:
(1)使用前,需使用试剂盒内6μl校准品(选)进行曲线校正,并用X(X<2μl)质控品进行质量控制,测试结果在质控范围内方可进行样本的检测。
(2)加6μlF-β-hCG标准品、(1-X)μl质控品、待测标本至对应试管底部;
(3)加试剂6μlR1至每一试管中;
(4)加试剂6μlR2至每一试管中;
(5)加6μl磁分离试剂至每一试管中;
(6)用塑料薄膜覆盖试管,多管混匀器轻轻振荡试管架30秒后,置37℃水浴30分钟;
(7)试管连架放至磁分离器上,确保每支试管都与分离器表面接触,沉淀2分钟。缓慢的倒转分离器倒出上清液,把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上,用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴;
(8)将30μl清洗浓缩液用纯化水稀释7倍后,加200μl稀释后的清洗液至每一试管中,置多管混匀器上轻轻振荡混匀30s;加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出。混匀要彻底;
(9)重复步骤6、7、6一遍;
(10)加40μl发光底物溶液至试管中混匀3秒,迅速用准备好的发光检测仪进行检测。
本实施例采用所述的试剂盒各组分的配制方法与实施例1相同。
实施例3:
一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)测试试剂盒,该试剂盒由磁分离试剂,试剂R1,试剂R2,标准品,质控品,校准品,清洗浓缩液及发光底物组成,其中:磁分离试剂:标记有小鼠抗人F-β-hCG的单克隆抗体的纳米磁性微球,所述标记有小鼠抗人F-β-hCG的单克隆抗体的纳米磁性微球浓度为100μg/ml;试剂R1:含有碱性磷酸酶标记的F-β-hCG抗体,所述碱性磷酸酶标记的F-β-hCG抗体的浓度为0.2μg/ml;试剂R2:含有牛γ球蛋白质组分的缓冲液;标准品,质控品和校准品:含有一定量F-β-hCG抗原的小牛血清溶液,所述标准品的浓度为0(S0)、5(S1)、15(S2)、40(S3)、80(S4)、200(S5)mIU/ml,所述质控品浓度为10,80mIU/ml,所述校准品浓度为15,80mIU/ml;清洗浓缩液:含有Tween-20和Proclin-300的缓冲液;发光底物:金刚烷的衍生物IUMIPHOS530,所述金刚烷的衍生物IUMIPHOS530的浓度为10μg/ml;
本实施例一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)测试试剂盒,由下述体积分数组成的:磁分离试剂7%,试剂R17%,试剂R27%,校准品7%,质控品3%,校准品6%,清洗浓缩液33%,发光底物30%;
本发明一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)的测试方法(以100μl为例),包括下列步骤:
(1)使用前,需使用试剂盒内6μl校准品(选)进行曲线校正,并用X(X<3μl)质控品进行质量控制,测试结果在质控范围内方可进行样本的检测。
(2)加7<1μlF-β-hCG标准品、(1-X)μl质控品、待测标本至对应试管底部;
(3)加试剂7μlR1至每一试管中;
(4)加试剂7μlR2至每一试管中;
(5)加7μl磁分离试剂至每一试管中;
(6)用塑料薄膜覆盖试管,多管混匀器轻轻振荡试管架30秒后,置37℃水浴30分钟;
(7)试管连架放至磁分离器上,确保每支试管都与分离器表面接触,沉淀2分钟。缓慢的倒转分离器倒出上清液,把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上,用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴;
(8)将33μl清洗浓缩液用纯化水稀释7倍后,加200μl稀释后的清洗液至每一试管中,置多管混匀器上轻轻振荡混匀30s;加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出。混匀要彻底;
(9)重复步骤6、7、6一遍;
(10)加30μl发光底物溶液至试管中混匀3秒,迅速用准备好的发光检测仪进行检测。
本实施例采用所述的试剂盒各组分的配制方法与实施例1相同。
临床试验:
1、检测数据
为了确定本试剂盒的临床参考值,对1270份血清、血浆样本采用本试剂盒进行了检测,结果表明本试剂盒的参考值(参考范围)为:
孕周 | 样本数 | 浓度(mIU/ml) |
14 | 120 | 4.8~65.6 |
15 | 140 | 6.2~52.7 |
16 | 200 | 5.4~43.8 |
17 | 250 | 4.2~37.0 |
18 | 200 | 3.6~29.9 |
19 | 120 | 3.5~23.9 |
20 | 120 | 2.7~21.9 |
21 | 120 | 2.2~18.5 |
2、本发明试剂盒性能指标
外观:试剂盒中的组分应澄清,应无沉淀和絮状物,磁分离试剂摇匀后,应为均匀悬浊液,无明显凝集;最低检出限:应不大于0.5mIU/ml;准确度:用纯品(外购于AMG公司)作回收实验,其回收率应在(85%~115%)范围内;重复性:用不同浓度的两个样本进行检测,各重复检测10次,其变异系数CV应不大于10%;线性范围:在0.5mIU/ml~200mIU/ml测量范围内,用logit-log数学模型拟合,剂量-反应曲线线性相关系数R≥0.9900;批间差:用三个批号试剂盒检测同一份样本,则三批试剂盒之间的批间变异系数CV应不大于15%;特异性:测定高浓度的交叉反应物质,结果如下:
最后说明的是,以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述,但本领域技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (7)
1.一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒,该试剂盒由磁分离试剂,试剂R1,试剂R2,标准品,质控品,校准品,清洗浓缩液及发光底物组成,其中:磁分离试剂:标记有小鼠抗人F-β-hCG的单克隆抗体的纳米磁性微球,所述标记有小鼠抗人F-β-hCG的单克隆抗体的纳米磁性微球浓度为100μg/ml;试剂R1:含有碱性磷酸酶标记的F-β-hCG抗体,所述碱性磷酸酶标记的F-β-hCG抗体的浓度为0.2μg/ml;试剂R2:含有牛γ球蛋白质组分的缓冲液;标准品,质控品和校准品:含有一定量F-β-hCG抗原的小牛血清溶液,所述标准品的浓度为0(S0)、5(S1)、15(S2)、40(S3)、80(S4)、200(S5)mIU/ml,所述质控品浓度为10,80mIU/ml,所述校准品浓度为15,80mIU/ml;清洗浓缩液:含有Tween-20和Proclin-300的缓冲液;发光底物:金刚烷的衍生物IUMIPHOS530,所述金刚烷的衍生物IUMIPHOS530的浓度为10μg/ml。
2.根据权利要求1所述的一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒,其特征在于:所述试剂盒由下述体积分数组成的:磁分离试剂5%-7%,试剂R15%-7%,试剂R25%-7%,标准品5%-7%,质控品1%-3%,校准品3%-6%,清洗浓缩液20%-40%,发光底物30%-50%。
3.根据权利要求2所述的一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒,其特征在于:所述试剂盒由下述体积分数组成的:磁分离试剂5%,试剂R15%,试剂R25%,校准品5%,质控品1%,校准品3%,清洗浓缩液26%,发光底物50%。
4.根据权利要求2所述的一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒,其特征在于:所述试剂盒由下述体积分数组成的:磁分离试剂6%,试剂R16%,试剂R26%,校准品6%,质控品2%,校准品4%,清洗浓缩液30%,发光底物40%。
5.根据权利要求2所述的一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒,其特征在于:所述试剂盒由下述体积分数组成的:磁分离试剂7%,试剂R17%,试剂R27%,校准品7%,质控品3%,校准品6%,清洗浓缩液33%,发光底物30%。
6.根据权利要求1-5任一所述的一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒,其特征在于:所述试剂盒中各组分按照如下制备方法制得:
第一步:磁分离试剂的制备过程
一、磁珠缓冲液配制操作规程:
(1)称取Tris4.58g和NaCl6.81g于1L容器中,称取0.96gTween-20于20ml容器中加适量水使其完全溶解后,倒入上述容器中;
(2)用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入上述1L容器中;然后在1L容器中加入800ml纯化水,充分搅拌,使试剂完全溶解;
(3)调节PH计测量其PH值;用4MHCl或4MNaOH调PH,测量其PH在7.95-8.05之间即符合要求;
(4)称取BSAV(牛血清白蛋白(第五组分))3g倒入上述1L容器中;
(5)最后定容至1000ml,测PH值,范围在7.95-8.05之间即符合要求,用0.2um滤器过滤即得;过滤完后贴好标签于2-8℃冷库贮存;
二、磁分离试剂的配制:
(1)将1.0mgDSS(辛二酸二琥珀酰亚胺)溶于50ulDMSO中,即浓度为20mg/mL;取2mgF-β-hCG抗体溶于PH9.5的0.1mol/LPB缓冲液中至总体积为1ml;
(2)计算DSS的投入量,按照以下公式计算:(抗体质量/16000)×10×368/CDSS),其中CDSS指代DSS的物质的量浓度mol/L;
(3)用移液枪吸取相应体积的DSS加入到步骤1的抗体溶液中,置室温90min;
(4)将步骤3抗体溶液加入到Centricon-10浓缩管中,然后放入到sigma2-16k高速冷冻离心机中在3000g的离心力下浓缩约30min至体积为0.5ml;
(5)取0.5ml磁珠,所述的磁珠直径在0.9-1.5μm之间,加入5ml反应杯中,放入专用试管架,经磁铁吸附2分钟后吸取上清;
(6)每次加入1.5mlPH9.50.1mol/LPB,混匀30秒,上架,去上清,重复操作3次;将步骤4获得的抗体溶液加入到磁珠中,混匀后室温反应4小时,保持混匀状态;
(7)加入0.3ml1mol/L的Tris溶液37℃15分钟,其中Tris的加样量为1mg抗体加0.15mlTris;
(8)每次加入1.5mlPH7.20.1mol/LPB清洗已经标记的磁珠,混匀30秒,上架,去上清,重复操作3次;
(9)用100ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶,即为0.05%的F-β-hCG磁分离试剂;
(10)将步骤9获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1:2.3的比例混匀,即得本发明试剂盒中磁分离试剂;
第二步:试剂R1的制备过程
一、试剂R1稀释液配制操作规程:
(1)取Tris6.06g、NaCl13.0g、Zncl20.05g、Proclin-3000.2ml和MgCl20.05g于烧瓶中;然后在烧瓶中加入800ml纯化水,充分搅拌,使试剂完全溶解;
(2)用4MHCl或4MNaOH调PH,测量使PH在7.35-7.45范围内;
(3)称取BSAV3g倒入上述烧瓶中;
(4)最后定容至1000ml,测PH值,范围在7.35-7.45之间即符合要求,用0.2um滤器过滤;过滤完后,贴好标签于2-8℃冷库贮存;
二、试剂R1的配制(碱性磷酸酶(ALP)与F-β-hCG单克隆抗体的偶联)
(1)取10mgALP加入5ml生理盐水中,加入到Centricon-10浓缩管中,3000rpm离心大约20分钟,浓缩至1毫升;
(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1MNaIO4溶液,室温下避光搅拌20分钟;
(3)将上述溶液装入透析袋中,用1mMPH4.4的醋酸钠缓冲液透析,4℃过夜;
(4)加20μl0.2MPH9.5碳酸盐缓冲液,使以上醛化ALP的PH升高到9.0~9.5,然后立即加入2.5mgIgG抗体,在1ml0.01M碳酸盐缓冲液中,室温避光轻轻搅拌2小时;
(5)加0.1ml新配的4mg/mlNaBH4液,混匀,再置4℃2小时;
(6)将上述液装入透析袋中,对0.15MPH7.4PBS透析,4℃过夜;
(7)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置4℃1小时;
(8)3000rpm离心半小时,弃上清,沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,最后沉淀物溶于少量0.15MPH7.4的PBS中;
(9)将上述溶液装入透析袋中,对0.15MPH7.4的PB缓冲盐水透析约5个小时,去除铵离子后,10000rpm离心30分钟去除沉淀,上清液即为酶结合物,加入体积1/100的1MMgcl2溶液4℃保存;收集到的碱性磷酸酶(ALP)与F-β-hCG单克隆抗体的偶联物用上述酶反应物稀释液以1:3000的体积比混合均匀,即得本发明试剂盒中试剂R1;
第三步:试剂R2的制备
试剂R2配制操作规程:
(1)称取Tris(三羟甲基氨基甲烷,分子式:(HOCH2)3CNH2)1.56g和NaCl4.23g于1L烧杯中;用移液器将Proclin-300量取0.2ml于少量纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入上述1L容器中;
(2)用量筒量取800ml纯化水于烧杯中,充分搅拌,直至完全溶解;用4MHCL或4MNaOH调PH,测量其范围在7.35-7.45之间;
(3)称取牛γ球蛋白(IgG)1.8g于800ml纯化水的烧杯中;
(4)最后定容1000ml,完全溶解后,测PH值,范围在7.35-7.45之间即符合要求,用0.2um滤器过滤;过滤完后,贴好标签于2-8℃冷库贮存;
第四步:标准品、质控品和校准品的配制:
(1)游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)定量测定试剂盒F-β-hCG标准品原料配制成浓度点为0,5,15,40,80,200mIU/ml;质控品配制的浓度点为10,80mIU/ml,校准品的浓度点为15,80μIU/ml;
(2)充分混匀后,贴好标签于2-8℃冷库贮存;
第五步:清洗浓缩液配制操作规程:
(1)称取Tris12.54g和NaCl325.6g于1L容器中;
(2)称取5gTween-20于100ml容器中加20ml水使其完全溶解后,倒入上述容器中;
(3)用移液器将Proclin-300量取0.2ml于盛有10ml纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入上述1L容器中;
(4)用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中,充分搅拌,直至完全溶解;
(5)用4MHCL或4MNaOH调PH,测量其范围在7.35-7.45之间;
(6)最后定容1000ml,测PH值,范围在7.35-7.45之间即符合要求,完全溶解后用0.2um滤器过滤即得;过滤完后,贴好标签于2-8℃冷库贮存;
第六步:发光底物配制
发光底物配制操作规程:
(1)称取Tris2.35g、NaCl6.41g、Na2SO30.002g和Proclin-3000.2ml于1L烧杯中;
(2)用量筒量取800ml纯化水于烧杯中,充分搅拌,直至完全溶解;用4MHCl或4MNaOH调PH,测量其范围在7.95-8.05之间;
(3)最后定容至1000ml,测PH值,范围在7.95-8.05之间即符合要求,用0.2um滤器过滤;过滤完后,加入250mlIUMIPHOS530,混匀后,贴好标签于2-8℃冷库贮存。
7.一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)的测试方法,包括下列步骤:
(1)使用前,需使用试剂盒内校准品(选)进行曲线校正,并用质控品进行质量控制,测试结果在质控范围内方可进行样本的检测;
(2)加F-β-hCG标准品、质控品、待测标本至对应试管底部;
(3)加试剂R1至每一试管中;
(4)加试剂R2至每一试管中;
(5)加磁分离试剂至每一试管中;
(6)用塑料薄膜覆盖试管,多管混匀器轻轻振荡试管架30秒后,置37℃水浴30分钟;
(7)试管连架放至磁分离器上,确保每支试管都与分离器表面接触,沉淀2分钟。缓慢的倒转分离器倒出上清液,把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上,用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴;
(8)清洗浓缩液用纯化水稀释7倍后,加稀释后的清洗液至每一试管中,置多管混匀器上轻轻振荡混匀30s;加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出,混匀要彻底;
(9)重复步骤6、7、6一遍;
(10)加发光底物溶液至试管中混匀3秒,迅速用准备好的发光检测仪进行检测。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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2015
- 2015-11-26 CN CN201510834583.2A patent/CN105467137A/zh active Pending
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