CN105467137A - 游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒及其测试方法 - Google Patents

游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒及其测试方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)测试试剂盒，该试剂盒由磁分离试剂，试剂R1，试剂R2，标准品，质控品，校准品，清洗浓缩液及发光底物组成，本发明还公开了该试剂盒的制备方法。本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，与现有酶联免疫的技术相比，本发明具有更高的特异性，灵敏度，获得检测结果的时间短，操作方式简便，检测结果准确可靠，大大降低了产品成本。

Description

游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒及其测试方法
技术领域
本发明涉及测定血清的试剂盒及其测试方法，尤其是涉及测定血清中游离人绒毛膜性腺激素β亚单位含量的试剂盒及其测试方法。
背景技术
人绒毛膜促性腺激素(hCG)是一种胎盘滋养层细胞分泌的糖蛋白激素，由α亚基和β亚基组合而成。两种亚基均可以游离态出现在血液中。hCGα亚基与垂体糖蛋白激素的α亚基相同，用免疫学方法无法将它们区别开，而hCG的β亚基是hCG的特有结构，也决定了其分子的生物学和免疫学特性，分子量为22.2KD。在整个怀孕过程中，游离F-β-hCG通常是随完整的hCG一起出现和增长，所以游离β-hCG是诊断早孕的一项重要的检测指标，其分泌与滋养细胞的数量密切相关。血清F-β-hCG测定还能诊断异位妊娠、先兆流产、葡萄胎及滋养细胞肿瘤，而且也是治疗后的及预后观察的重要检测指标，对其他疾病如卵巢生殖细胞肿瘤、男性肇丸肿瘤，非滋养细胞疾病、非生殖细胞也有辅助诊断意义。从检测角度上来说，目前临床上用于测定F-B-hCG的方法主要有放免法、ELISA法、化学发光法等。
过去以放免为代表的人绒毛膜促性腺激素β亚单位(F-β-hCG)测定试剂盒受方法学的限制，其灵敏度和抗干扰能力严重不足，存在很大的弊端，已基本上退出市场；酶联免疫法(ELISA)作为定性检测的方法，抗原、抗体的结合反应是在固相(ELISA板反应孔)表面进行的，其灵敏度、特异性均较好，且经济实惠，所以是应用得最广、最多的方法。化学发光法其灵敏度高，从化学角度和自动化程度看，化学发光法优于酶联免疫法。这些方法虽然都有很多优点，但在检测的灵敏度、特异性、稳定性、检测用时等方面还有待进一步提高。
发明内容
有鉴于此，本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足，提供一种特异性强，灵敏度高，获得检测结果的时间短，操作方式简便，检测结果稳定可靠的的游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)的测试试剂盒及其测试方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)测试试剂盒，该试剂盒由磁分离试剂，试剂R1，试剂R2，标准品，质控品，校准品，清洗浓缩液及发光底物组成，其中：磁分离试剂：标记有小鼠抗人F-β-hCG的单克隆抗体的纳米磁性微球，所述标记有小鼠抗人F-β-hCG的单克隆抗体的纳米磁性微球浓度为100μg/ml；试剂R1：含有碱性磷酸酶标记的F-β-hCG抗体，所述碱性磷酸酶标记的F-β-hCG抗体的浓度为0.2μg/ml；试剂R2：含有牛γ球蛋白质组分的缓冲液；标准品，质控品和校准品：含有一定量F-β-hCG抗原的小牛血清溶液，所述标准品的浓度为0(S0)、5(S1)、15(S2)、40(S3)、80(S4)、200(S5)mIU/ml，所述质控品浓度为10,80mIU/ml，所述校准品浓度为15,80μIU/ml；清洗浓缩液：含有Tween-20和Proclin-300的缓冲液；发光底物：金刚烷的衍生物IUMIPHOS530，所述金刚烷的衍生物IUMIPHOS530的浓度为10μg/ml。
一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)测试试剂盒，由下述体积分数组成：磁分离试剂5％-7％，试剂R15％-7％，试剂R25％-7％，标准品5％-7％，质控品1％-3％，校准品3％-6％，清洗浓缩液20％-40％，发光底物30％-50％。
优选地，一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒，由下述体积分数组成：磁分离试剂5％，试剂R15％，试剂R25％，校准品5％，质控品1％，校准品3％，清洗浓缩液26％，发光底物50％。
优选地，一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒，由下述体积分数组成：磁分离试剂6％，试剂R16％，试剂R26％，校准品6％，质控品2％，校准品4％，清洗浓缩液30％，发光底物40％。
优选地，一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒，由下述体积分数组成：磁分离试剂7％，试剂R17％，试剂R27％，校准品7％，质控品3％，校准品6％，清洗浓缩液33％，发光底物30％。
所述试剂盒中各组分按照如下制备方法制得：
第一步：磁分离试剂的制备过程
一、磁珠缓冲液配制操作规程：
(1)称取Tris4.58g和NaCl6.81g于1L容器中，称取0.96gTween-20于20ml容器中加适量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；
(2)用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；然后在1L容器中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；
(3)调节PH计测量其PH值；用4MHCl或4MNaOH调PH，测量其PH在7.95－8.05之间即符合要求；
(4)称取BSAV(牛血清白蛋白(第五组分))3g倒入上述1L容器中；
(5)最后定容至1000ml，测PH值，范围在7.95－8.05之间即符合要求，用0.2um滤器过滤即得；过滤完后贴好标签于2-8℃冷库贮存；
二、磁分离试剂的配制：
(1)将1.0mgDSS(辛二酸二琥珀酰亚胺)溶于50ulDMSO中，即浓度为20mg/mL；取2mgF-β-hCG抗体溶于PH9.5的0.1mol/LPB缓冲液中至总体积为1ml；
(2)计算DSS的投入量，按照以下公式计算：(抗体质量/16000)×10×368/CDSS)，其中CDSS指代DSS的物质的量浓度mol/L；
(3)用移液枪吸取相应体积的DSS加入到步骤1的抗体溶液中，置室温90min；
(4)将步骤3抗体溶液加入到Centricon-10浓缩管中,然后放入到sigma2-16k高速冷冻离心机中在3000g的离心力下浓缩约30min至体积为0.5ml；
(5)取0.5ml磁珠，所述的磁珠直径在0.9-1.5μm之间，加入5ml反应杯中，放入专用试管架，经磁铁吸附2分钟后吸取上清；
(6)每次加入1.5mlPH9.50.1mol/LPB，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；将步骤4获得的抗体溶液加入到磁珠中，混匀后室温反应4小时，保持混匀状态；
(7)加入0.3ml1mol/L的Tris溶液37℃15分钟，其中Tris的加样量为1mg抗体加0.15mlTris；
(8)每次加入1.5mlPH7.20.1mol/LPB清洗已经标记的磁珠，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；
(9)用100ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶，即为0.05％的F-β-hCG磁分离试剂；
(10)将步骤9获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1：2.3的比例混匀，即得本发明试剂盒中磁分离试剂；
第二步：试剂R1的制备过程
一、试剂R1稀释液配制操作规程：
(1)取Tris6.06g、NaCl13.0g、Zncl20.05g、Proclin-3000.2ml和MgCl20.05g于烧瓶中；然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；
(2)用4MHCl或4MNaOH调PH，测量使PH在7.35-7.45范围内；
(3)称取BSAV3g倒入上述烧瓶中；
(4)最后定容至1000ml，测PH值，范围在7.35-7.45之间即符合要求，用0.2um滤器过滤；过滤完后，贴好标签于2-8℃冷库贮存；
二、试剂R1的配制(碱性磷酸酶(ALP)与F-β-hCG单克隆抗体的偶联)
(1)取10mgALP加入5ml生理盐水中，加入到Centricon-10浓缩管中，3000rpm离心大约20分钟，浓缩至1毫升；
(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1MNaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟；
(3)将上述溶液装入透析袋中，用1mMPH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜；
(4)加20μl0.2MPH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化ALP的PH升高到9.0～9.5，然后立即加入2.5mgIgG抗体，在1ml0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时；
(5)加0.1ml新配的4mg/mlNaBH4液，混匀，再置4℃2小时；
(6)将上述液装入透析袋中，对0.15MPH7.4PBS透析，4℃过夜；
(7)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时；
(8)3000rpm离心半小时，弃上清；沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15MPH7.4的PBS中；
(9)将上述溶液装入透析袋中，对0.15MPH7.4的PB缓冲盐水透析约5个小时，去除铵离子后，10000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，加入体积1/100的1MMgcl2溶液4℃保存；收集到的碱性磷酸酶(ALP)与F-β-hCG单克隆抗体的偶联物用上述酶反应物稀释液以1：3000的体积比混合均匀，即得本发明试剂盒中试剂R1；
第三步：试剂R2的制备
试剂R2配制操作规程：
(1)称取Tris(三羟甲基氨基甲烷，分子式:(HOCH2)3CNH2)1.56g和NaCl4.23g于1L烧杯中；用移液器将Proclin-300量取0.2ml于少量纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；
(2)用量筒量取800ml纯化水于烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解；用4MHCL或4MNaOH调PH，测量其范围在7.35-7.45之间；
(3)称取牛γ球蛋白(IgG)1.8g于800ml纯化水的烧杯中；
(4)最后定容1000ml，完全溶解后，测PH值，范围在7.35-7.45之间即符合要求，用0.2um滤器过滤；过滤完后，贴好标签于2-8℃冷库贮存；
第四步：标准品、质控品和校准品的配制：
(1)游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)定量测定试剂盒F-β-hCG标准品原料配制成浓度点为0，5，15，40，80，200mIU/ml；质控品配制的浓度点为10，80mIU/ml，校准品的浓度点为15,80mIU/ml；
(2)充分混匀后，贴好标签于2-8℃冷库贮存；
第五步：清洗浓缩液配制操作规程：
(1)称取Tris12.54g和NaCl325.6g于1L容器中；
(2)称取5gTween-20于100ml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述容器中；
(3)用移液器将Proclin-300量取0.2ml于盛有10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；
(4)用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解；
(5)用4MHCL或4MNaOH调PH，测量其范围在7.35－7.45之间；
(6)最后定容1000ml，测PH值，范围在7.35-7.45之间即符合要求，完全溶解后用0.2um滤器过滤即得；过滤完后，贴好标签于2-8℃冷库贮存；
第六步：发光底物配制
发光底物配制操作规程：
(1)称取Tris2.35g、NaCl6.41g、Na2SO30.002g和Proclin-3000.2ml于1L烧杯中；
(2)用量筒量取800ml纯化水于烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解；用4MHCl或4MNaOH调PH，测量其范围在7.95-8.05之间；
(3)最后定容至1000ml，测PH值，范围在7.95-8.05之间即符合要求，用0.2um滤器过滤；过滤完后，加入250mlIUMIPHOS530，混匀后，贴好标签于2-8℃冷库贮存；
1.一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)的测试方法，包括下列步骤：
(1)使用前，需使用试剂盒内校准品(选)进行曲线校正，并用质控品进行质量控制，测试结果在质控范围内方可进行样本的检测；
(2)加F-β-hCG标准品、质控品、待测标本至对应试管底部；
(3)加试剂R1至每一试管中；
(4)加试剂R2至每一试管中；
(5)加磁分离试剂至每一试管中；
(6)用塑料薄膜覆盖试管，多管混匀器轻轻振荡试管架30秒后，置37℃水浴30分钟；
(7)试管连架放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀2分钟。缓慢的倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上，用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；
(8)清洗浓缩液用纯化水稀释7倍后，加稀释后的清洗液至每一试管中，置多管混匀器上轻轻振荡混匀30s；加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出；混匀要彻底；
(9)重复步骤6、7、6一遍；
(10)加发光底物溶液至试管中混匀3秒，迅速用准备好的发光检测仪进行检测。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，与现有技术相比，在出结果时间上较传统酶联免疫法少10-20分钟，同时抗体的用量降低了20％以上，在提高产品性能的同时，大大降低了产品成本。
(2)本发明公开了一种新的专用试剂R2，使得反应过程更加稳定可靠，具有更高的检测灵敏度和特异性，并达到了较佳的性能参数。
(3)试剂盒中的磁分离试剂，试剂R1，试剂R2，标准品，质控品，校准品，清洗浓缩液、稀释液以及发光底物的配比均是反应体系下的最优配方，给该试剂盒的使用有效期及检测性能提供了有力保障。
(4)本发明试剂盒的精确度、灵敏度以及稳定性均优于市场同类产品，并且成本低廉，操作简单，应用前景广阔。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1：
一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)测试试剂盒，该试剂盒由磁分离试剂，试剂R1，试剂R2，标准品，质控品，校准品，清洗浓缩液及发光底物组成，其中：磁分离试剂：标记有小鼠抗人F-β-hCG的单克隆抗体的纳米磁性微球，所述标记有小鼠抗人F-β-hCG的单克隆抗体的纳米磁性微球浓度为100μg/ml；试剂R1：含有碱性磷酸酶标记的F-β-hCG抗体，所述碱性磷酸酶标记的F-β-hCG抗体的浓度为0.2μg/ml；试剂R2：含有牛γ球蛋白质组分的缓冲液；标准品，质控品和校准品：含有一定量F-β-hCG抗原的小牛血清溶液，所述标准品的浓度为0(S0)、5(S1)、15(S2)、40(S3)、80(S4)、200(S5)mIU/ml，所述质控品浓度为10,80mIU/ml，所述校准品浓度为15,80mIU/ml；清洗浓缩液：含有Tween-20和Proclin-300的缓冲液；发光底物：金刚烷的衍生物IUMIPHOS530，所述金刚烷的衍生物IUMIPHOS530的浓度为10μg/ml；
本实施例游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)测试试剂盒，由下述体积分数组成：磁分离试剂5％，试剂R15％，试剂R25％，校准品5％，质控品1％，校准品3％，清洗浓缩液26％，发光底物50％。
本发明上述游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)测定试剂盒的制备方法，其具体步骤如下：
第一步：磁分离试剂的制备过程
一、磁珠缓冲液配制操作规程：配方见表1，以配制1L为例：
(1)称取Tris4.58g和NaCl6.81g于1L容器中，称取0.96gTween-20于20ml容器中加适量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；
(2)用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；然后在1L容器中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；
(3)调节PH计测量其PH值；用4MHCl或4MNaOH调PH，测量其PH在7.95－8.05之间即符合要求；
(4)称取BSAV(牛血清白蛋白(第五组分))3g倒入上述1L容器中；
(5)最后定容至1000ml，测PH值，范围在7.95－8.05之间即符合要求，用0.2um滤器过滤即得；过滤完后贴好标签于2-8℃冷库贮存；
磁珠缓冲液(表1)
二、磁分离试剂的配制
(1)将1.0mgDSS(辛二酸二琥珀酰亚胺)溶于50ulDMSO中，即浓度为20mg/mL；取2mgF-β-hCG抗体溶于PH9.5的0.1mol/LPB缓冲液中至总体积为1ml；
(2)计算DSS的投入量，按照以下公式计算：(抗体质量/16000)×10×368/CDSS)，其中CDSS指代DSS的物质的量浓度mol/L；
(3)用移液枪吸取相应体积的DSS加入到步骤1的抗体溶液中，置室温90min；
(4)将步骤3抗体溶液加入到Centricon-10浓缩管中,然后放入到sigma2-16k高速冷冻离心机中在3000g的离心力下浓缩约30min至体积为0.5ml；
(5)取0.5ml磁珠，所述的磁珠直径在0.9-1.5μm之间，加入5ml反应杯中，放入专用试管架，经磁铁吸附2分钟后吸取上清；
(6)每次加入1.5mlPH9.50.1mol/LPB，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；将步骤4获得的抗体溶液加入到磁珠中，混匀后室温反应4小时，保持混匀状态；
(7)加入0.3ml1mol/L的Tris溶液37℃15分钟，其中Tris的加样量为1mg抗体加0.15mlTris；
(8)每次加入1.5mlPH7.20.1mol/LPB清洗已经标记的磁珠，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；
(9)用100ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶，即为0.05％的F-β-hCG磁分离试剂；
(10)将步骤9获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1：2.3的比例混匀，即得本发明试剂盒中磁分离试剂；
第二步：试剂R1的制备过程
一、试剂R1稀释液配制操作规程：配方见表2，以配制1L为例：
(1)取Tris6.06g、NaCl13.0g、Zncl20.05g、Proclin-3000.2ml和MgCl20.05g于烧瓶中；然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；
(2)用4MHCl或4MNaOH调PH，测量使PH在7.35-7.45范围内；
(3)称取BSAV3g倒入上述烧瓶中；
(4)最后定容至1000ml，测PH值，范围在7.35-7.45之间即符合要求，用0.2um滤器过滤；过滤完后，贴好标签于2-8℃冷库贮存；
试剂R1稀释液(表2)
二、试剂R1的配制(碱性磷酸酶(ALP)标记的小鼠抗人F-β-hCG单克隆抗体)
(1)取10mgALP加入5ml生理盐水中，加入到Centricon-10浓缩管中，3000rpm离心大约20分钟，浓缩至1毫升；
(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1MNaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟；
(3)将上述溶液装入透析袋中，用1mMPH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜；
(4)加20μl0.2MPH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化ALP的PH升高到9.0～9.5，然后立即加入2.5mgIgG抗体，在1ml0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时；
(5)加0.1ml新配的4mg/mlNaBH4液，混匀，再置4℃2小时；
(6)将上述液装入透析袋中，对0.15MPH7.4PBS透析，4℃过夜；
(7)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时；
(8)3000rpm离心半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15MPH7.4的PBS中；
(9)将上述溶液装入透析袋中，对0.15MPH7.4的PB缓冲盐水透析约5个小时，去除铵离子后，10000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，加入体积1/100的1MMgcl2溶液4℃保存；收集到的碱性磷酸酶(ALP)与F-β-hCG单克隆抗体的偶联物用上述酶反应物稀释液以1：3000的体积比混合均匀，即得本发明试剂盒中试剂R1；
第三步：试剂R2的制备
试剂R2配制操作规程：配方见(表3)，以配制1L为例：
(1)称取Tris(三羟甲基氨基甲烷，分子式:(HOCH2)3CNH2)1.56g和NaCl4.23g于1L烧杯中；用移液器将Proclin-300量取0.2ml于少量纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；
(2)用量筒量取800ml纯化水于烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解；用4MHCL或4MNaOH调PH，测量其范围在7.35-7.45之间；
(3)称取牛γ球蛋白(IgG)1.8g于800ml纯化水的烧杯中；
(4)最后定容1000ml，完全溶解后，测PH值，范围在7.35-7.45之间即符合要求，用0.2um滤器过滤；过滤完后，贴好标签于2-8℃冷库贮存；
试剂R2的配制(表3)
第四步：标准品、质控品和校准品的配制：
(1)最高点：最高浓度点为X，目标点浓度为A,B,C,D,E,F，配制V体积的溶液时，需加入原料的体积为分别为：(表4)
浓度 加入标准品稀释液体积 加入X体积
A V-A*V/X A*V/X
B V-B*V/X B*V/X
C V-C*V/X C*V/X
D V-D*V/X D*V/X
E V-E*V/X E*V/X
F V-F*V/X F*V/X
(2)游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)定量测定试剂盒F-β-hCG标准品原料配制成浓度点为0，5，15，40，80，200mIU/ml；质控品配制的浓度点为10，80mIU/ml，校准品的浓度点为15,80mIU/ml；
(3)充分混匀后，贴好标签于2-8℃冷库贮存；
第五步：清洗浓缩液配制操作规程：配方见(表5)，以配制1L为例：
(1)称取Tris12.54g和NaCl325.6g于1L容器中；
(2)称取5gTween-20于100ml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述容器中；
(3)用移液器将Proclin-300量取0.2ml于盛有10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；
(4)用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解；
(5)用4MHCL或4MNaOH调PH，测量其范围在7.35－7.45之间；
(6)最后定容1000ml，测PH值，范围在7.35-7.45之间即符合要求，完全溶解后用0.2um滤器过滤即得；过滤完后，贴好标签于2-8℃冷库贮存；
清洗浓缩液的配制(表5)
第六步：发光底物配制操作规程：配方见(表6)，以配制1L为例：
(1)称取Tris2.35g、NaCl6.41g、Na2SO30.002g和Proclin-3000.2ml于1L烧杯中；
(2)用量筒量取800ml纯化水于烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解；用4MHCl或4MNaOH调PH，测量其范围在7.95-8.05之间；
(3)最后定容至1000ml，测PH值，范围在7.95-8.05之间即符合要求，用0.2um滤器过滤；过滤完后，加入250mlIUMIPHOS530，混匀后，贴好标签于2-8℃冷库贮存；
发光底物的配制(表6)
本发明一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)的测试方法(以100μl为例)，包括下列步骤：
(1)使用前，需使用试剂盒内5μl校准品(选)进行曲线校正，并用X(X<1μl)质控品进行质量控制，测试结果在质控范围内方可进行样本的检测；
(2)加5μlF-β-hCG标准品、(1-X)μl质控品、待测标本至对应试管底部；
(3)加试剂5μlR1至每一试管中；
(4)加试剂5μlR2至每一试管中；
(5)加5μl磁分离试剂至每一试管中；
(6)用塑料薄膜覆盖试管，多管混匀器轻轻振荡试管架30秒后，置37℃水浴30分钟；
(7)试管连架放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀2分钟。缓慢的倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上，用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；
(8)将26μl清洗浓缩液用纯化水稀释7倍后，加200μl稀释后的清洗液至每一试管中，置多管混匀器上轻轻振荡混匀30s；加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出。混匀要彻底；
(9)重复步骤6、7、6一遍；
(10)加50μl发光底物溶液至试管中混匀3秒，迅速用准备好的发光检测仪进行检测。
实施例2：
一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)测试试剂盒，该试剂盒由磁分离试剂，试剂R1，试剂R2，标准品，质控品，校准品，清洗浓缩液及发光底物组成，其中：磁分离试剂：标记有小鼠抗人F-β-hCG的单克隆抗体的纳米磁性微球，所述标记有小鼠抗人F-β-hCG的单克隆抗体的纳米磁性微球浓度为100μg/ml；试剂R1：含有碱性磷酸酶标记的F-β-hCG抗体，所述碱性磷酸酶标记的F-β-hCG抗体的浓度为0.2μg/ml；试剂R2：含有牛γ球蛋白质组分的缓冲液；标准品，质控品和校准品：含有一定量F-β-hCG抗原的小牛血清溶液，所述标准品的浓度为0(S0)、5(S1)、15(S2)、40(S3)、80(S4)、200(S5)mIU/ml，所述质控品浓度为10,80mIU/ml，所述校准品浓度为15,80mIU/ml；清洗浓缩液：含有Tween-20和Proclin-300的缓冲液；发光底物：金刚烷的衍生物IUMIPHOS530，所述金刚烷的衍生物IUMIPHOS530的浓度为10μg/ml；
本实施例一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)测试试剂盒，由下述体积分数组成的：磁分离试剂6％，试剂R16％，试剂R26％，校准品6％，质控品2％，校准品4％，清洗浓缩液30％，发光底物40％。
本发明一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)的测试方法(以100μl为例)，包括下列步骤：
(1)使用前，需使用试剂盒内6μl校准品(选)进行曲线校正，并用X(X<2μl)质控品进行质量控制，测试结果在质控范围内方可进行样本的检测。
(2)加6μlF-β-hCG标准品、(1-X)μl质控品、待测标本至对应试管底部；
(3)加试剂6μlR1至每一试管中；
(4)加试剂6μlR2至每一试管中；
(5)加6μl磁分离试剂至每一试管中；
(6)用塑料薄膜覆盖试管，多管混匀器轻轻振荡试管架30秒后，置37℃水浴30分钟；
(7)试管连架放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀2分钟。缓慢的倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上，用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；
(8)将30μl清洗浓缩液用纯化水稀释7倍后，加200μl稀释后的清洗液至每一试管中，置多管混匀器上轻轻振荡混匀30s；加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出。混匀要彻底；
(9)重复步骤6、7、6一遍；
(10)加40μl发光底物溶液至试管中混匀3秒，迅速用准备好的发光检测仪进行检测。
本实施例采用所述的试剂盒各组分的配制方法与实施例1相同。
实施例3：
一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)测试试剂盒，该试剂盒由磁分离试剂，试剂R1，试剂R2，标准品，质控品，校准品，清洗浓缩液及发光底物组成，其中：磁分离试剂：标记有小鼠抗人F-β-hCG的单克隆抗体的纳米磁性微球，所述标记有小鼠抗人F-β-hCG的单克隆抗体的纳米磁性微球浓度为100μg/ml；试剂R1：含有碱性磷酸酶标记的F-β-hCG抗体，所述碱性磷酸酶标记的F-β-hCG抗体的浓度为0.2μg/ml；试剂R2：含有牛γ球蛋白质组分的缓冲液；标准品，质控品和校准品：含有一定量F-β-hCG抗原的小牛血清溶液，所述标准品的浓度为0(S0)、5(S1)、15(S2)、40(S3)、80(S4)、200(S5)mIU/ml，所述质控品浓度为10,80mIU/ml，所述校准品浓度为15,80mIU/ml；清洗浓缩液：含有Tween-20和Proclin-300的缓冲液；发光底物：金刚烷的衍生物IUMIPHOS530，所述金刚烷的衍生物IUMIPHOS530的浓度为10μg/ml；
本实施例一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)测试试剂盒，由下述体积分数组成的：磁分离试剂7％，试剂R17％，试剂R27％，校准品7％，质控品3％，校准品6％，清洗浓缩液33％，发光底物30％；
本发明一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)的测试方法(以100μl为例)，包括下列步骤：
(1)使用前，需使用试剂盒内6μl校准品(选)进行曲线校正，并用X(X<3μl)质控品进行质量控制，测试结果在质控范围内方可进行样本的检测。
(2)加7<1μlF-β-hCG标准品、(1-X)μl质控品、待测标本至对应试管底部；
(3)加试剂7μlR1至每一试管中；
(4)加试剂7μlR2至每一试管中；
(5)加7μl磁分离试剂至每一试管中；
(6)用塑料薄膜覆盖试管，多管混匀器轻轻振荡试管架30秒后，置37℃水浴30分钟；
(7)试管连架放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀2分钟。缓慢的倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上，用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；
(8)将33μl清洗浓缩液用纯化水稀释7倍后，加200μl稀释后的清洗液至每一试管中，置多管混匀器上轻轻振荡混匀30s；加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出。混匀要彻底；
(9)重复步骤6、7、6一遍；
(10)加30μl发光底物溶液至试管中混匀3秒，迅速用准备好的发光检测仪进行检测。
本实施例采用所述的试剂盒各组分的配制方法与实施例1相同。
临床试验：
1、检测数据
为了确定本试剂盒的临床参考值，对1270份血清、血浆样本采用本试剂盒进行了检测，结果表明本试剂盒的参考值(参考范围)为：
孕周 样本数 浓度(mIU/ml)
14 120 4.8～65.6
15 140 6.2～52.7
16 200 5.4～43.8
17 250 4.2～37.0
18 200 3.6～29.9
19 120 3.5～23.9
20 120 2.7～21.9
21 120 2.2～18.5
2、本发明试剂盒性能指标
外观：试剂盒中的组分应澄清，应无沉淀和絮状物，磁分离试剂摇匀后，应为均匀悬浊液，无明显凝集；最低检出限：应不大于0.5mIU/ml；准确度：用纯品(外购于AMG公司)作回收实验，其回收率应在(85％～115％)范围内；重复性：用不同浓度的两个样本进行检测，各重复检测10次，其变异系数CV应不大于10％；线性范围：在0.5mIU/ml～200mIU/ml测量范围内，用logit-log数学模型拟合，剂量-反应曲线线性相关系数R≥0.9900；批间差：用三个批号试剂盒检测同一份样本，则三批试剂盒之间的批间变异系数CV应不大于15％；特异性：测定高浓度的交叉反应物质，结果如下：
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒，该试剂盒由磁分离试剂，试剂R1，试剂R2，标准品，质控品，校准品，清洗浓缩液及发光底物组成，其中：磁分离试剂：标记有小鼠抗人F-β-hCG的单克隆抗体的纳米磁性微球，所述标记有小鼠抗人F-β-hCG的单克隆抗体的纳米磁性微球浓度为100μg/ml；试剂R1：含有碱性磷酸酶标记的F-β-hCG抗体，所述碱性磷酸酶标记的F-β-hCG抗体的浓度为0.2μg/ml；试剂R2：含有牛γ球蛋白质组分的缓冲液；标准品，质控品和校准品：含有一定量F-β-hCG抗原的小牛血清溶液，所述标准品的浓度为0(S0)、5(S1)、15(S2)、40(S3)、80(S4)、200(S5)mIU/ml，所述质控品浓度为10,80mIU/ml，所述校准品浓度为15,80mIU/ml；清洗浓缩液：含有Tween-20和Proclin-300的缓冲液；发光底物：金刚烷的衍生物IUMIPHOS530，所述金刚烷的衍生物IUMIPHOS530的浓度为10μg/ml。
2.根据权利要求1所述的一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由下述体积分数组成的：磁分离试剂5％-7％，试剂R15％-7％，试剂R25％-7％，标准品5％-7％，质控品1％-3％，校准品3％-6％，清洗浓缩液20％-40％，发光底物30％-50％。
3.根据权利要求2所述的一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由下述体积分数组成的：磁分离试剂5％，试剂R15％，试剂R25％，校准品5％，质控品1％，校准品3％，清洗浓缩液26％，发光底物50％。
4.根据权利要求2所述的一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由下述体积分数组成的：磁分离试剂6％，试剂R16％，试剂R26％，校准品6％，质控品2％，校准品4％，清洗浓缩液30％，发光底物40％。
5.根据权利要求2所述的一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由下述体积分数组成的：磁分离试剂7％，试剂R17％，试剂R27％，校准品7％，质控品3％，校准品6％，清洗浓缩液33％，发光底物30％。
6.根据权利要求1-5任一所述的一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中各组分按照如下制备方法制得：
第一步：磁分离试剂的制备过程
一、磁珠缓冲液配制操作规程：
(1)称取Tris4.58g和NaCl6.81g于1L容器中，称取0.96gTween-20于20ml容器中加适量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；
(2)用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；然后在1L容器中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；
(3)调节PH计测量其PH值；用4MHCl或4MNaOH调PH，测量其PH在7.95－8.05之间即符合要求；
(4)称取BSAV(牛血清白蛋白(第五组分))3g倒入上述1L容器中；
(5)最后定容至1000ml，测PH值，范围在7.95－8.05之间即符合要求，用0.2um滤器过滤即得；过滤完后贴好标签于2-8℃冷库贮存；
二、磁分离试剂的配制：
(1)将1.0mgDSS(辛二酸二琥珀酰亚胺)溶于50ulDMSO中，即浓度为20mg/mL；取2mgF-β-hCG抗体溶于PH9.5的0.1mol/LPB缓冲液中至总体积为1ml；
(2)计算DSS的投入量，按照以下公式计算：(抗体质量/16000)×10×368/CDSS)，其中CDSS指代DSS的物质的量浓度mol/L；
(3)用移液枪吸取相应体积的DSS加入到步骤1的抗体溶液中，置室温90min；
(4)将步骤3抗体溶液加入到Centricon-10浓缩管中,然后放入到sigma2-16k高速冷冻离心机中在3000g的离心力下浓缩约30min至体积为0.5ml；
(5)取0.5ml磁珠，所述的磁珠直径在0.9-1.5μm之间，加入5ml反应杯中，放入专用试管架，经磁铁吸附2分钟后吸取上清；
(6)每次加入1.5mlPH9.50.1mol/LPB，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；将步骤4获得的抗体溶液加入到磁珠中，混匀后室温反应4小时，保持混匀状态；
(7)加入0.3ml1mol/L的Tris溶液37℃15分钟，其中Tris的加样量为1mg抗体加0.15mlTris；
(8)每次加入1.5mlPH7.20.1mol/LPB清洗已经标记的磁珠，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；
(9)用100ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶，即为0.05％的F-β-hCG磁分离试剂；
(10)将步骤9获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1：2.3的比例混匀，即得本发明试剂盒中磁分离试剂；
第二步：试剂R1的制备过程
一、试剂R1稀释液配制操作规程：
(1)取Tris6.06g、NaCl13.0g、Zncl20.05g、Proclin-3000.2ml和MgCl20.05g于烧瓶中；然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；
(2)用4MHCl或4MNaOH调PH，测量使PH在7.35-7.45范围内；
(3)称取BSAV3g倒入上述烧瓶中；
(4)最后定容至1000ml，测PH值，范围在7.35-7.45之间即符合要求，用0.2um滤器过滤；过滤完后，贴好标签于2-8℃冷库贮存；
二、试剂R1的配制(碱性磷酸酶(ALP)与F-β-hCG单克隆抗体的偶联)
(1)取10mgALP加入5ml生理盐水中，加入到Centricon-10浓缩管中，3000rpm离心大约20分钟，浓缩至1毫升；
(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1MNaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟；
(3)将上述溶液装入透析袋中，用1mMPH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜；
(4)加20μl0.2MPH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化ALP的PH升高到9.0～9.5，然后立即加入2.5mgIgG抗体，在1ml0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时；
(5)加0.1ml新配的4mg/mlNaBH4液，混匀，再置4℃2小时；
(6)将上述液装入透析袋中，对0.15MPH7.4PBS透析，4℃过夜；
(7)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时；
(8)3000rpm离心半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15MPH7.4的PBS中；
(9)将上述溶液装入透析袋中，对0.15MPH7.4的PB缓冲盐水透析约5个小时，去除铵离子后，10000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，加入体积1/100的1MMgcl2溶液4℃保存；收集到的碱性磷酸酶(ALP)与F-β-hCG单克隆抗体的偶联物用上述酶反应物稀释液以1：3000的体积比混合均匀，即得本发明试剂盒中试剂R1；
第三步：试剂R2的制备
试剂R2配制操作规程：
(1)称取Tris(三羟甲基氨基甲烷，分子式:(HOCH2)3CNH2)1.56g和NaCl4.23g于1L烧杯中；用移液器将Proclin-300量取0.2ml于少量纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；
(2)用量筒量取800ml纯化水于烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解；用4MHCL或4MNaOH调PH，测量其范围在7.35-7.45之间；
(3)称取牛γ球蛋白(IgG)1.8g于800ml纯化水的烧杯中；
(4)最后定容1000ml，完全溶解后，测PH值，范围在7.35-7.45之间即符合要求，用0.2um滤器过滤；过滤完后，贴好标签于2-8℃冷库贮存；
第四步：标准品、质控品和校准品的配制：
(1)游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)定量测定试剂盒F-β-hCG标准品原料配制成浓度点为0，5，15，40，80，200mIU/ml；质控品配制的浓度点为10，80mIU/ml，校准品的浓度点为15,80μIU/ml；
(2)充分混匀后，贴好标签于2-8℃冷库贮存；
第五步：清洗浓缩液配制操作规程：
(1)称取Tris12.54g和NaCl325.6g于1L容器中；
(2)称取5gTween-20于100ml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述容器中；
(3)用移液器将Proclin-300量取0.2ml于盛有10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；
(4)用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解；
(5)用4MHCL或4MNaOH调PH，测量其范围在7.35－7.45之间；
(6)最后定容1000ml，测PH值，范围在7.35-7.45之间即符合要求，完全溶解后用0.2um滤器过滤即得；过滤完后，贴好标签于2-8℃冷库贮存；
第六步：发光底物配制
发光底物配制操作规程：
(1)称取Tris2.35g、NaCl6.41g、Na2SO30.002g和Proclin-3000.2ml于1L烧杯中；
(2)用量筒量取800ml纯化水于烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解；用4MHCl或4MNaOH调PH，测量其范围在7.95-8.05之间；
(3)最后定容至1000ml，测PH值，范围在7.95-8.05之间即符合要求，用0.2um滤器过滤；过滤完后，加入250mlIUMIPHOS530，混匀后，贴好标签于2-8℃冷库贮存。
7.一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)的测试方法，包括下列步骤：
(1)使用前，需使用试剂盒内校准品(选)进行曲线校正，并用质控品进行质量控制，测试结果在质控范围内方可进行样本的检测；
(2)加F-β-hCG标准品、质控品、待测标本至对应试管底部；
(3)加试剂R1至每一试管中；
(4)加试剂R2至每一试管中；
(5)加磁分离试剂至每一试管中；
(6)用塑料薄膜覆盖试管，多管混匀器轻轻振荡试管架30秒后，置37℃水浴30分钟；
(7)试管连架放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀2分钟。缓慢的倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上，用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；
(8)清洗浓缩液用纯化水稀释7倍后，加稀释后的清洗液至每一试管中，置多管混匀器上轻轻振荡混匀30s；加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出，混匀要彻底；
(9)重复步骤6、7、6一遍；
(10)加发光底物溶液至试管中混匀3秒，迅速用准备好的发光检测仪进行检测。
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