CN111926118A - 一种可同时检测艾滋病毒1、2型病毒以及人类t淋巴细胞白血病病毒1、2型的检测方法 - Google Patents

一种可同时检测艾滋病毒1、2型病毒以及人类t淋巴细胞白血病病毒1、2型的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可同时检测艾滋病毒1、2型病毒以及人类T淋巴细胞白血病病毒1、2型的检测方法，包括以下步骤：首先从网络的基因数据库中，分别取得艾滋病毒1、2型病毒、人类T淋巴细胞白血病1、2型的基因序列；根据上述的基因序列设计各型病毒的引物和探针；使用RNA提取试剂将各型病毒的RNA提取后，将提取的各型病毒的RNA反转录为互补DNA模板；加入上述设计的各型病毒的引物和探针，进行聚合酶连锁反应放大增幅；根据各型病毒探针上所带的荧光物质的不同，如果检测结果为阳性，则检测人员可以根据聚合酶连锁反应所产生的荧光波长判断所检测到的病毒是四种病毒中的哪一种。该方法操作简单，可同时检测多种病毒。

Description

一种可同时检测艾滋病毒1、2型病毒以及人类T淋巴细胞白血 病病毒1、2型的检测方法
技术领域：
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种可同时检测艾滋病毒1、2型病毒以及人类T淋巴细胞白血病病毒1、2型的检测方法。
背景技术：
细胞产品根据细胞来源可分为自体细胞治疗与异体细胞治疗，自体细胞治疗指的是将病人的细胞从人体内抽取出来，经过纯化或修饰后培养再注射回病人自己身上，例如2019年美国FDA批准的Maci疗法或是诺华的Kymriah、凯特的Yescarta之类的CAR-T治疗都是属于自体细胞治疗；而异体细胞治疗则是将捐献者的细胞从人体内抽取出来，经过纯化或修饰后培养再注射回接受者的体内，例如日本JCR制药公司的异体间充质干细胞产品Temcell或是AllogeneTherapeutics公司正在发展的CAR-T疗法。异体细胞疗法相较异体细胞疗法虽然有比较广的应用性与成药性但是风险也相对比较大，除了免疫排斥的风险还有捐献者与接受者间的疾病传染风险，因此，各国药监单位对于异体细胞疗法类的产品都规定有其病毒筛检项目。
基本上，各国的病毒筛检项目都是依造潜在的风险来设立，其中体液传染的病毒尤其受到药监单位的关注。艾滋病是一种危害性极大的体液传染病，由感染艾滋病病毒引起，艾滋病病毒是一种能攻击人体免疫系统的病毒，它把人体免疫系统中最重要的CD4T淋巴细胞作为主要攻击目标，大量破坏该细胞，使人体丧失免疫功能，因此，人体易于感染各种疾病，并可发生恶性肿瘤，病死率较高。人类T淋巴细胞白血病病毒，则是20世纪70年代后期发现的第一个人类逆转录病毒，有1型和2型之分，分别是引起T细胞白血病和毛细胞白血病的病原体，也可通过体液传染。由于这两种病毒借由异体细胞疗法传播的可能性较高且危害较大，几乎目前各国的药监单位均将其列为异体细胞疗法产品的必检项目。
目前发展异体细胞疗法的药企一般均是以反转录PCR的方式对这些病毒进行检测，每个检测需要5×106个细胞，检测4个病毒就是2×107个细胞，由于细胞的体外培养不易，这个数量的细胞对于异体细胞疗法来说是很沉重的，因此，研究一种可同时检测多种病毒的检测方法是至关重要的。
发明内容：
本发明要解决的技术问题是，针对现有技术的不足，提供一种可同时检测艾滋病毒1、2型病毒以及人类T淋巴细胞白血病病毒1、2型的检测方法，该方法使用带有四种不同荧光物质的病毒探针在同一个聚合酶连锁反应中，在5×106个细胞中同时检测艾滋病毒1、2型病毒与人类T淋巴细胞白血病病毒1、2型四种病毒。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种可同时检测艾滋病毒1、2型病毒以及人类T淋巴细胞白血病病毒1、2型的检测方法，包括以下步骤：
(1)首先从网络的基因数据库中，分别取得艾滋病毒1、2型病毒、人类T淋巴细胞白血病1、2型的基因序列；
(2)根据上述的基因序列设计各型病毒的引物和探针；
(3)使用RNA提取试剂将各型病毒的RNA提取后，将提取的各型病毒的RNA反转录为互补DNA模板；加入上述设计的各型病毒的引物和探针，进行聚合酶连锁反应放大增幅；
(4)根据各型病毒探针上所带的荧光物质的不同，如果检测结果为阳性，则检测人员根据聚合酶连锁反应所产生的荧光波长判断所检测到的病毒是四种病毒中的哪一种。
作为上述技术方案的优选，步骤(2)中，所述各型病毒的引物和探针序列分别为：
HIV-1：
上游引物：5'-AGT RGG GGGACAYCARGC AGCHATGCARAT-3'；
下游引物：5'-TAC TAG TAG TTC CTG CTATRT CAC TTC C-3'；
探针：5'-FAM-ATC AAT GAR GAR GCT GCA GAA TGG GA-BHQ1-3'；
HIV-2：
上游引物：5'-TAG TCG CCG CCT GGT CA-3'；
下游引物：5'-TTC CTG CCG CCC TTACT-3'；
探针：5'-HEX-ACC CTG GTC TGT TAG-BHQ1-3'；
HTLV-1：
上游引物：5'-CCG CCAATCACT CATAC AAC C-3'；
下游引物：5'-AGC TGG TAGAGG TACATG CAGAC-3'；
探针：5'-NED-CCA CCC TTG GGCAGC ACC TCC-BHQ2-3'；
HTLV-2：
上游引物：5'-TATACAAAATGT TCC TACACA CAG-3'；
下游引物：5'-GAT GGA GTGATAGGG GAGAAG-3'；
探针：5'-Cy5-CCACCC TTG GGCAGCACC TCC-BHQ3-3'。
作为上述技术方案的优选，步骤(3)中，所述聚合酶连锁反应的条件为：95℃，20秒；然后95℃，15秒、62℃，30秒进行40个循环；最后以4℃停止反应。
由于采用上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
本发明设计了四组引子，搭配四条带有不同荧光物质的探针，各组引子与探针针对不同的病毒设计。利用引子组与探针的搭配，可以针对艾滋病毒1、2型病毒与人类T淋巴细胞白血病病毒1、2型等四种病毒同时进行检测，借由qPCR反应所产生的荧光波长就可以将艾滋病毒1、2型病毒与人类T淋巴细胞白血病病毒1、2型等四种病毒进行区分，达到一次反应检测四种病毒的效果，同时有效降低待测物的消耗量。
具体实施方式：
下面通过实施例对本发明进一步说明，实施例只用于解释本发明，不会对本发明构成任何的限定。
实施例1
以加入分别带有艾滋病毒1、2型病毒与人类T淋巴细胞白血病病毒1、2型四种病毒基因片段的质粒模拟病毒污染，分别加入到293细胞中模拟被病毒污染的细胞治疗产品制成293细胞悬浮液作为测试组，另外以无菌水作为阴性对照组，测试组加入质粒量为100拷贝/10微升，阴性对照组加入10微升无菌水，分别命名为293-HIV-1、293-HIV-2、293-HTLV-1、293-HTLV-2和293。
取含有5×106个293细胞的上述制备的五种293细胞悬浮液，分别以TRIzol试剂提取RNA，RNA在50μl TE缓冲液中洗脱，并储存在-80℃等待使用。取5μlRNA、10μlTRIzol试剂、50pmol引子、50pmol探针，混合后以不含RNase的纯水稀释至40μl。PCR反应的具体过程为：先以50℃，5分钟将病毒序列反转录后，再以95℃，20秒把反转录酶去活化，将互补DNA(cDNA)和RNA分开，温度为95℃，15秒、62℃，30秒下进行40个循环，最后以ABI 7500实时定量聚合酶连锁反应机器确认是否有病毒存在的信号。
Figure BDA0002643140740000051
从上述测试结果可以看出，293-HIV-1只有艾滋病毒1型病毒讯号呈现阳性，其他三种病毒讯号为阴性、293-HIV-2只有艾滋病毒2型病毒讯号呈现阳性，其他三种病毒讯号为阴性、293-HTLV-1只有人类T淋巴细胞白血病病毒1型讯号呈现阳性，其他三种病毒讯号为阴性、293-HTLV-2只有人类T淋巴细胞白血病病毒2型讯号呈现阳性，其他三种病毒讯号为阴性、293所有病毒讯号均为阴性；测试结果精确。
虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本发明的许多其他形式和改变对本领域技术人员而言是显而易见的。应理解所附权利要求和本发明通常涵盖本发明真实精神和范围内的所有这些明显的形式和改变。

Claims (3)

1.一种可同时检测艾滋病毒1、2型病毒以及人类T淋巴细胞白血病病毒1、2型的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)首先从网络的基因数据库中，分别取得艾滋病毒1、2型病毒、人类T淋巴细胞白血病1、2型的基因序列；
(2)根据上述的基因序列设计各型病毒的引物和探针；
(3)使用RNA提取试剂将各型病毒的RNA提取后，将提取的各型病毒的RNA反转录为互补DNA模板；加入上述设计的各型病毒的引物和探针，进行聚合酶连锁反应放大增幅；
(4)根据各型病毒探针上所带的荧光物质的不同，如果检测结果为阳性，则检测人员根据聚合酶连锁反应所产生的荧光波长判断所检测到的病毒是四种病毒中的哪一种。
2.根据权利要求1所述的一种可同时检测艾滋病毒1、2型病毒以及人类T淋巴细胞白血病病毒1、2型的检测方法，其特征在于：步骤(2)中，所述各型病毒的引物和探针序列分别为：
HIV-1：
上游引物：5'-AGT RGG GGGACAYCARGC AGCHATGCARAT-3'；
下游引物：5'-TAC TAG TAG TTC CTG CTATRT CAC TTC C-3'；
探针：5'-FAM-ATC AAT GAR GAR GCT GCA GAA TGG GA-BHQ1-3'；
HIV-2：
上游引物：5'-TAG TCG CCG CCT GGT CA-3'；
下游引物：5'-TTC CTG CCG CCC TTACT-3'；
探针：5'-HEX-ACC CTG GTC TGT TAG-BHQ1-3'；
HTLV-1：
上游引物：5'-CCG CCAATCACT CATACAAC C-3'；
下游引物：5'-AGC TGG TAGAGG TACATG CAGAC-3'；
探针：5'-NED-CCACCC TTG GGCAGCACC TCC-BHQ2-3'；
HTLV-2：
上游引物：5'-TATACAAAATGT TCC TACACA CAG-3'；
下游引物：5'-GAT GGA GTGATAGGG GAGAAG-3'；
探针：5'-Cy5-CCACCC TTG GGCAGCACC TCC-BHQ3-3'。
3.根据权利要求1所述的一种可同时检测艾滋病毒1、2型病毒以及人类T淋巴细胞白血病病毒1、2型的检测方法，其特征在于：步骤(3)中，所述聚合酶连锁反应的条件为：95℃，20秒；然后95℃，15秒、62℃，30秒进行40个循环；最后以4℃停止反应。
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