TWI464177B - 用於檢測德克酵母菌菌株的核酸分子、檢驗套組、生物晶片以及方法 - Google Patents

Description

用於檢測德克酵母菌菌株的核酸分子、檢驗套組、生物晶片以及方法

本發明是有關於用於檢測德克酵母菌菌株(Dekkera strains)的核酸分子。本發明亦有關於使用該等核酸分子來檢測存在於一樣品中的德克酵母菌菌株的檢驗套組(diagnostic kit)、生物晶片(biochip)以及方法。

德克酵母菌屬物種(Dekkera spp.)[在無性生殖階段(asexual reproductive stage)時亦被稱為酒香酵母菌屬物種(Brettanomyces spp.)]是一群酵母菌科(Saccharomycetaceae)的單細胞真菌，它們通常存在於下列的飲料當中：(1)酒精飲料(alcoholic beverages)：例如，葡萄酒(wine)、啤酒(beer)、蘋果酒(cider)、康普茶(kombucha)以及龍舌蘭酒(tequila)等；以及(2)軟性飲料(soft drinks)[亦被稱為碳酸飲料(carbonated drinks)]：例如，蘇打水(soda water)以及檸檬汽水(lemonade)等。目前常見的會污染酒精飲料(特別是葡萄酒以及啤酒)的德克酵母菌屬物種包括：異常德克酵母菌(Dekkera anomala )、布魯塞爾德克酵母菌(Dekkera bruxellensis )、班圖德克酵母菌(Dekkera custersiana )以及Dekkera naardenensis 。

德克酵母菌屬物種是屬於腐敗酵母菌(spoilage yeasts)，受到此類酵母菌污染的飲料會產生裂變(deterioration)而影響品質。例如，在紅酒的製備過程(例如酒精發酵)中若受到德克酵母菌屬物種的污染，會使得紅酒因為德克酵母菌屬 物種所生成的揮發性酚類(volatile phenols)[諸如4-乙苯酚(4-ethylphenol)以及4-乙基癒創木酚(4-ethylguaiacol)]以及揮發性脂肪酸(volatile fatty acid)[諸如乙酸(acetic acid)、異戊酸(isovaleric acid)、2-甲基丁酸(2-methylbutyric acid)以及異丁酸(isobutyric acid)]而具有混濁性(turbidity)以及不良風味(off-flavor)。

此外，德克酵母菌屬物種的代謝活性亦會促進生物胺(biogenic amine)[諸如精胺(agmatine)、2-苯乙基胺(2-phenylethylamine)、組織胺(histamine)、乙醇胺(ethanolamine)以及甲胺(methylamine)]的生成，因此當人類個體[特別是帶有胺不耐症(amine intolerance)的患者]飲用受到德克酵母菌屬物種污染的飲料時，會產生非所欲的毒物學效應(toxicological effects)以及生理效應(physiological effects)[例如血管收縮作用(vasoconstrictor action)]。

由於德克酵母菌屬物種會嚴重地造成製酒業與食品業的經濟損失並且威脅到人類的健康，因此，如何早期且快速地檢測出這些德克酵母菌屬物種即成為本技術領域中的研究人員關注與研究的重點。

為了克服傳統的菌株培養與菌學特徵鑑定[例如：芽管測試(germ tube test)、CHROMagar測試(CHROMagar test)、API鑑定系統、Vitek酵母菌生化卡鑑定系統(Vitek yeast biochemical card identification system)以及生理或生化特徵鑑定等]在操作過程上較為繁複且耗時之缺點，目前有許多分子生物學方法已被應用於檢測德克酵母菌屬物種，這些 方法包括：螢光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)、聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)、限制片段長度多型性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)、變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)、即時定量聚合酶鏈反應(Real time quantitative PCR)、巢式聚合酶鏈反應(nested PCR)、環媒介等溫擴增反應(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、DNA探針分析法(DNA probe method)以及生物晶片(biochip)等。

近年來，生物晶片技術的發展已逐漸受到重視並且已被廣泛地應用於各種病原菌(pathogen)的檢測、癌症的分類、新藥的研發以及基因的定序與鑑定等等。生物晶片的優點包括：體積小、分析結果的可信度與精確性較高、分析速度快，以及使用較少的樣品與試劑即可獲得整體性的實驗數據。生物晶片依據其功能性可被區分為下面四大類：(1)基因晶片(gene chip)，亦被稱為微陣列晶片(microarray chip)；(2)微流體晶片(microfluidic chip)：(3)蛋白質晶片(protein chip)；以及(4)晶片實驗室(Lab-on-a-chip)。

一般而言，在酵母菌的基因組DNA序列中會包含有高度守恆(highly conserved)與高度變異(highly variable)的DNA序列，它們可供用於屬-特異性(genus-specific)、物種-特異性(species-specific)或菌株-特異性(strain-specific)的檢測或鑑定。已有研究顯示，26S rDNA以及18S-5.8S-26S rDNA的內部轉錄間隔區域(internal transcribed spacer region,ITS region)在德克酵母菌屬物種當中具有高度變異性，因而可以被用來作為德克酵母菌屬物種的物種-特異性檢測之標的基因(target gene)(H.Stenderet al .(2001),Applied and Environmental Microbiology ,67：938-941；C.Röderet al .(2007),Federation of European Microbiological Societies ,7：1013-1026；C.M.Egli and T.H.Kling(2001),American Journal of Enology and Viticulture ,52：241-247)。

β-微管蛋白(β-tubulin)大量存在於真核細胞中並且是微管(microtubule)的主要成份。已知β-微管蛋白基因是一種含有種系訊息(phylogenetic information)的內控基因(house-keeping gene)，並且可被用來作為一種用於分析深層的種系發生(deep-level phylogenies)以及複雜的物種群體之理想標記。例如，在C.H.Huanget al. (2009),Antonie van Leeuwenhoek ,95：135-142中，C.H.Huang等人使用一組通用引子對(universal primer)β tub3/β tub4r來擴增出嚴格意義之酵母菌群菌株(Saccharomyces sensu stricto complex strains)[包括下面7種物種：貝酵母菌(Saccharomyces bayanus )、啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae )、巴斯德酵母菌(Saccharomyces pastorianus )、奇異酵母菌(Saccharomyces paradoxus )、庫德里阿兹威酵母菌(Saccharomyces kudriavzevii )、Saccharomyces cariocanus 以及Saccharomyces mikatae ]的部分β-微管蛋白基因(partialβ -tubulin gene)，接著將所得到的部分β-微管蛋白基因拿來進行定序分析以及限制片段長度多型性分析(restriction fragment length polymorphism,RFLP)。經由實驗結果證實，與26S rDNA相較之下，β-微管蛋白基因可提供較高的種系分辨率(phylogenetic resolution)，並且物種-特異性的限制圖譜(restriction profiles)可藉由使用限制酶Tsp 509I來切割β-微管蛋白基因片段而被獲得。因此，β-微管蛋白基因可被用來作為一種用於鑑定以及分類嚴格意義之酵母菌群菌株的種系標記(phylogenetic marker)。

熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)是一種細胞因應環境的壓力所產生的保護性蛋白質，它廣泛地存在於真核與原核細胞中並且依據分子量的大小可被區分為下面六個家族HSP10、HSP40、HSP60、HSP70、HSP90以及HSP100。在大部分的酵母菌中，HSP70家族又可被區分為下面三種亞家族：SSA、SSB以及SSZ。例如，在啤酒酵母菌中，HSP70家族的成員包括：(1)典型的SSA1、SSA2、SSA3與SSA4蛋白質，它們具有高度的同源性(highly homologous)，其中SSA1與SSA2蛋白質會持續地被表現，而SSA3與SSA4蛋白質是當存在於一環境壓力下時才會被誘導表現；以及(2)核糖體-相關(ribosome-associated)的SSB1、SSB2與SSZ1蛋白質。

雖然已存在有上述的文獻報導，就申請人所知，迄今尚無任何文獻或專利前案曾經揭示β-微管蛋白基因或hsp70 基因可被應用在德克酵母菌屬物種的物種鑑定(species identification)上。因此，於本發明中，申請人選用β-微管蛋白基因以及hsp70 基因來作為標的基因，並分別 從中篩選出對於德克酵母菌屬物種(特別是異常德克酵母菌、布魯塞爾德克酵母菌、班圖德克酵母菌以及Dekkera naardenensis )具有高度專一性與靈敏度的核酸分子以供快速檢測或鑑定之用。

發明概要

於是，在第一個方面，本發明提供一種用於檢測一德克酵母菌菌株的核酸分子試劑，其包含有下列的至少一者：(1)一用於檢測德克酵母菌屬物種的菌株的核酸分子，其具有一選自於如序列辨識編號：19以及序列辨識編號：20所示的核苷酸序列；(2)一用於檢測異常德克酵母菌菌株的核酸分子，其具有一選自於如序列辨識編號：21以及序列辨識編號：22所示的核苷酸序列；(3)一用於檢測布魯塞爾德克酵母菌菌株的核酸分子，其具有一選自於如序列辨識編號：23以及序列辨識編號：24所示的核苷酸序列；(4)一用於檢測Dekkera naardenensis 菌株的核酸分子，其具有一選自於如序列辨識編號：25、序列辨識編號：26、序列辨識編號：36以及序列辨識編號：37所示的核苷酸序列；(5)一用於檢測班圖德克酵母菌菌株的核酸分子，其具有一選自於如序列辨識編號：34以及序列辨識編號：35所示的核苷酸序列；以及 (6)一用於檢測布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21517的核酸分子，其具有一選自於如序列辨識編號：38以及序列辨識編號：39所示的核苷酸序列。

上述的核酸分子對於所欲偵測的標的菌種皆具有高度的專一性(specificity)以及靈敏度(sensitivity)，因而可供用來檢測存在於一樣品中的德克酵母菌菌株。因此，在第二個方面，本發明提供一種用於檢測一樣品中是否存在有一德克酵母菌菌株的方法，其包括：令該樣品進行一種使用至少一組引子對的DNA擴增反應，其中該至少一組引子對是選自於由下列所構成的群組：(1)一用於檢測德克酵母菌屬物種的菌株的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：19所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：20所示的核苷酸序列之反向引子；(2)一用於檢測異常德克酵母菌菌株的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：21所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：22所示的核苷酸序列之反向引子；(3)一用於檢測布魯塞爾德克酵母菌菌株的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：23所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：24所示的核苷酸序列之反向引子；(4)一用於檢測Dekkera naardenensis 菌株的引子對，其包含： (a)一具有一如序列辨識編號：25所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：26所示的核苷酸序列之反向引子；或者(b)一具有一如序列辨識編號：36所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：37所示的核苷酸序列之反向引子；(5)一用於檢測班圖德克酵母菌菌株的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：34所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：35所示的核苷酸序列之反向引子；以及(6)一用於檢測布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21517的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：38所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：39所示的核苷酸序列之反向引子；以及檢測是否有一藉由使用該至少一組引子對而被擴增出的DNA片段，其中該DNA片段之存在表示有一對應於該至少一組引子對的德克酵母菌菌株之存在。

依據本發明的核酸分子亦被預期可作為探針。因此，在第三個方面，本發明提供一種用於檢測一樣品中是否存在有一德克酵母菌菌株的方法，其包括：令該樣品進行一種使用至少一個探針的雜交反應，其中該至少一個探針所具有的核苷酸序列以及所對應的德克酵母菌菌株是如上面對於該等核酸分子所界定者；以及檢測是否有一藉由使用該至少一個探針來進行雜交反 應而被形成的雜交物，其中該雜交物之存在表示有一對應於該至少一個探針的德克酵母菌菌株之存在。

在第四個方面，本發明提供一種用於檢測一德克酵母菌菌株的檢驗套組，其包含有至少一個如上所述的核酸分子試劑。

在第五個方面，本發明提供一種用於檢測一德克酵母菌菌株的生物晶片，其包含有一如上所述的核酸分子試劑。

本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯。

發明的詳細說明

要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。

為了本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：術語“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及術語“包括(comprises)”具有一對應的意義。

除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。為表清楚，下面的界定被使用於本文中。

如本文中所用的，“核酸”、“核酸序列”或“核苷酸序列” 等術語意指呈單股或雙股形式的去氧核糖核苷酸序列或核糖核苷酸序列，且當中包含有已知的天然存在的核苷酸(naturally occurring nucleotides)或人造化學仿效物(aritificial chemical mimics)。如本文中所用的，“核酸”此術語可與“基因”、“DNA”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“聚核苷酸”交換使用。

如本文中所用的，術語“核酸片段”與“DNA片段”可被互換地使用，並且意指一種DNA聚合物(DNA polymer)，該DNA聚合物是呈一獨立節段(separate segment)的形式或者是作為一較大的DNA建構物(DNA construct)的一組分(component)，其可以是衍生自經分離的DNA(isolated DNA)或是藉由本技術領域中所熟知的方法而被化學地或酵素地合成。

除非另有指明，一核酸序列除了於本文中所揭示的特定序列外，亦涵蓋其互補序列(complementary sequences)，以及它們的守恆性類似物(conservative analogs)、相關的自然存在的結構變異體和/或合成的非天然存在的類似物。

如本文中所用的，“雜交(hybridization)”與“黏合(annealing)”等術語可被相互交換使用，並且意指2個單股核苷酸序列藉由依據華特生-克里克規則(Watson-Crick rules)而經由它們的嘌呤(purine)和/或嘧啶(pyrimidine)鹼基之氫鍵結(hydrogen bonding)來彼此序列專一性地結合，藉此而形成一雜交物(hybrid)。該雜交物是一個具有穩定的核酸結構的雙螺旋核酸複合物(duplex nucleic acid complex)，其包括 RNA：RNA、RNA：DNA或DNA：DNA雙螺旋分子。

傳統上，在檢測會引起飲料裂變的德克酵母菌菌株時大多是使用菌株培養與菌學特徵鑑定等方法，但是這些檢測方法具有操作過程較為繁複、耗時以及不精確等的缺點。因此，如何能快速且精確地檢測出存在於飲料中的德克酵母菌菌株，已成為製酒業與食品業努力的目標。分子生物學方法[諸如，聚合酶鏈反應(PCR)以及生物晶片技術等]具有速度快、分析結果的可信度與精確性高等之優點，因此，申請人致力於研發這方面的快速檢測方法。

一般而言，在酵母菌的基因組DNA序列中會包含有高度守恆(highly conserved)與高度變異(highly variable)的DNA序列，它們可供用於屬-特異性(genus-specific)、物種-特異性(species-specific)或菌株-特異性(strain-specific)的檢測或鑑定。因此，於本發明中，申請人選用β-微管蛋白基因以及hsp70 基因來作為標的基因，並嘗試設計出對於德克酵母菌屬物種(特別是異常德克酵母菌、布魯塞爾德克酵母菌、班圖德克酵母菌以及Dekkera naardenensis )具有高度專一性與靈敏度的核酸分子以供快速檢測或鑑定之用。

由於德克酵母菌屬物種的基因組(genome)迄今尚未被完全地定序，因而無法得知德克酵母菌屬物種的β-微管蛋白基因以及hsp70 基因的核苷酸序列與位置。於是，申請人依據C.H.Huanget al .(2009),Antonie van Leeuwenhoek ,95：135-142當中的研究結果，將貝酵母菌BCRC 21816、21818與21964、啤酒酵母菌BCRC 20270以及巴斯德酵母 菌BCRC 21420、21423與21971拿來作為對照菌株(control strains)，並將60種購自於台灣的食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center,BCRC)的酵母菌菌株(含有9種德克酵母菌菌株)拿來作為試驗菌株(test strains)，繼而分別使用該7種對照菌株以及該60種試驗菌株的基因組DNA作為模版(template)，並選用在C.H.Huanget al. (2009),Antonie van Leeuwenhoek ,95：135-142當中所揭示的一組簡併性引子對(degenerate primer pair)β tub3引子(序列辨識編號：1)與β tub4r引子(序列辨識編號：2)來進行聚合酶鏈反應(PCR)。之後，將所得到的PCR產物拿來進行定序分析，藉此而得到該7種對照菌株以及該60種試驗菌株的PCR產物的核苷酸序列。

接著，該7種對照菌株的PCR產物的核苷酸序列是使用NCBI網站所提供的BLASTN軟體來進行比對分析，而所得到的結果證實：藉由使用簡併性引子對β tub3/β tub4r可以從該7種對照菌株的基因組DNA中擴增出部分β-微管蛋白基因。之後，使用ClustalX 1.81軟體以及BioEdit軟體來對該7種對照菌株與該60種試驗菌株的PCR產物的核苷酸序列進行多重序列比對分析(multiple sequence alignment analysis)以及系統發生分析(phylogenetic analysis)。而所得到的分析結果顯示：該7種對照菌株與該60種試驗菌株的PCR產物的核苷酸序列具有顯著的同源性(significant homology)，這表示該60種試驗菌株的部分β-微管蛋白基 因亦可藉由簡併性引子對β tub3/β tub4r而被擴增出來。

接著，申請人從該9種德克酵母菌菌株的部分β-微管蛋白基因當中分別挑選出具有高度守恆性(high conservativeness)的區域以及具有高度變異性(high variability)的區域，然後依據高度守恆性的區域來設計出多組針對德克酵母菌屬物種的簡併性引子對，以及依據高度變異性的區域來設計出多組分別針對異常德克酵母菌、布魯塞爾德克酵母菌與Dekkera naardenensis 的引子對。之後，該等引子對利用NCBI網站所提供的BLASTN軟體而被拿來與NCBI網站的資料庫中的所有酵母菌以及細菌的基因序列以及該7種對照菌株以及該60種試驗菌株的部分β-微管蛋白基因的核苷酸序列進行比對分析，藉此而篩選出對於德克酵母菌屬物種的菌株具有屬-特異性的簡併性引子對DekkeF/DekkeR，以及分別對於異常德克酵母菌、布魯塞爾德克酵母菌與Dekkera naardenensis 具有物種-特異性的引子對DanoF/DanoR、DbruxF/DbruxR與Dnaa1F/Dnaa1R。有關上述的1組屬-特異性引子對以及3組物種-特異性引子對所具有的核苷酸序列分別被彙整於表2以及表3中。

另一方面，為了設計出針對德克酵母菌菌株的hsp70 基因的引子對，申請人依據NCBI登錄編號NM_001178151.1[啤酒酵母菌S288c的SSA1 基因的完整編碼序列(complete coding sequence)]當中所示的核苷酸序列以及在其他5種酵母菌菌株中與啤酒酵母菌的hsp70 基因家族的典型成員(包括SSA1 、SSA2 、SSA3 以及SSA4 基因)具有高度相似性的核 苷酸序列，其中包括：NCBI登錄編號FO082049.1[嗜山梨醇畢赤酵母菌(Pichia sorbitophila )CBS 7064的染色體K的完整序列]當中的Piso0_003783 基因以及NCBI登錄編號XM_446529.1[光滑假絲酵母菌CBS 138的一假定蛋白質(hypothetical protein)的部分編碼序列]、NCBI登錄編號XM_453252.1[乳酸克魯維斯酵母菌(Kluyveromyces lactis )NRRL Y-1140的一假定蛋白質的部分編碼序列]、NCBI登錄編號XM_002494945.1(魯氏接合酵母菌CBS 732的一假定蛋白質的完整編碼序列)與NCBI登錄編號XM_003682136.1(戴爾布有孢圓酵母菌CBS 1146的一假定蛋白質的完整編碼序列)當中所示的核苷酸序列，而從中尋找出具有高度守恆性的區域並且據此來設計出一組簡併性引子對hsp70F引子(序列辨識編號：27)與hsp70R引子(序列辨識編號：28)。接著，申請人將啤酒酵母菌BCRC 20262與20577拿來作為對照菌株，並將65種購自於BCRC的酵母菌菌株(含有9種德克酵母菌菌株)拿來作為試驗菌株，繼而分別以該2種對照菌株以及該65種試驗菌株的基因組DNA作為模版，並使用簡併性引子對hsp70F/hsp70R來進行聚合酶鏈反應。之後，將所得到的PCR產物拿來進行定序分析，藉此而得到該2種對照菌株以及該65種試驗菌株的PCR產物的核苷酸序列。

接著，該2種對照菌株的PCR產物的核苷酸序列是使用NCBI網站所提供的BLASTN軟體來進行比對分析，而所得到的結果證實：藉由使用簡併性引子對hsp70F/hsp70R 可以從該2種對照菌株的基因組DNA中擴增出部分hsp70 基因。之後，使用ClustalX 1.81軟體以及BioEdit軟體來對該2種對照菌株與該65種試驗菌株的PCR產物的核苷酸序列進行多重序列比對分析以及系統發生分析。而所得到的分析結果顯示：該2種對照菌株與該65種試驗菌株的PCR產物的核苷酸序列具有顯著的同源性，這表示該65種試驗菌株的部分hsp70 基因亦可藉由簡併性引子對hsp70F/hsp70R而被擴增出來。

接著，申請人從該9種德克酵母菌菌株的部分hsp70 基因當中挑選出具有高度變異性的區域，並據此來設計出多組分別針對班圖德克酵母菌與Dekkera naardenensis 的引子對。此外，申請人從該5種布魯塞爾德克酵母菌菌株的部分hsp70 基因當中挑選出具有高度變異性的區域，並據此來設計出多組分別針對布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21517的引子對。之後，該等引子對利用NCBI網站所提供的BLASTN軟體而被拿來與NCBI網站的資料庫中的所有酵母菌以及細菌的基因序列以及該2種對照菌株與該65種試驗菌株的部分hsp70 基因的核苷酸序列進行比對分析，藉此而篩選出分別對於班圖德克酵母菌與Dekkera naardenensis 具有物種-特異性的引子對DcussF/DcussR與Dnaa2F/Dnaa2R，以及對於布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21517具有菌株-特異性的引子對BcusiF/BcusiR。有關上述的2組物種-特異性引子對以及1組菌株-特異性引子對所具有的核苷酸序列分別被彙整於表5以及表6中。

為了評估依據本發明的引子對在德克酵母菌菌株檢測上的專一性(specificity)以及靈敏度(sensitivity)，申請人以67種購自於BCRC的酵母菌菌株(含有9種德克酵母菌菌株)以及15種細菌菌株的基因組DNA作為模版，並分別使用依據上述所設計出的1組屬-特異性引子對、5組物種-特異性引子對以及1組菌株-特異性引子對來進行PCR反應。所得到的PCR擴增產物在藉由瓊脂糖凝膠電泳分析後發現：依據本發明的引子對對於所欲偵測的標的德克酵母菌菌株皆具有高度的專一性以及靈敏度。

此外，為了評估依據本發明的引子對對於啤酒中的病原菌的檢測專一性以及靈敏度，申請人從一市售啤酒中分離出24株待測菌株，其中包括6株乳桿菌屬物種(Lactobacillus spp.)的菌株、1株德克酵母菌屬物種的菌株以及17株啤酒酵母菌菌株。之後，以各個待測菌株的基因組DNA作為模版，並分別使用依據上述所設計出的1組屬-特異性引子對、5組物種-特異性引子對以及1組菌株-特異性引子對來進行PCR反應。所得到的PCR擴增產物在藉由瓊脂糖凝膠電泳分析後發現：當使用引子對DekkeF/DekkeR來進行PCR時，只有該德克酵母菌屬物種的菌株有得到一大小約為776 bp的PCR擴增產物；當使用引子對DanoF/DanoR來進行PCR時，只有該德克酵母菌屬物種的菌株有得到一大小約為391~397 bp的PCR擴增產物；而當使用其他的引子對來進行PCR時，該24株待測菌株皆無得到PCR產物。接著，將該德克酵母菌屬物種的菌株所得到 的具有一大小約為776 bp的PCR擴增產物拿來進行定序與序列比對分析後發現，該PCR擴增產物的核苷酸序列與異常德克酵母菌BCRC 21512以及BCRC 21515的部分β-微管蛋白基因的核苷酸序列分別具有100%與97.9%的序列相似性。這個結果顯示：依據本發明的引子對對於所欲偵測的標的菌種具有高度的專一性(specificity)以及靈敏度(sensitivity)，因而可以檢測出存在於食品樣品中的異常德克酵母菌菌株。

基於以上所述，依據本發明的引子對被預期可供用於快速地檢測存在於一樣品中的德克酵母菌菌株。於是，本發明提供一種用於檢測一德克酵母菌菌株的核酸分子試劑，其包含有下列的至少一者：(1)一用於檢測德克酵母菌屬物種的菌株的核酸分子，其具有一選自於如序列辨識編號：19以及序列辨識編號：20所示的核苷酸序列；(2)一用於檢測異常德克酵母菌菌株的核酸分子，其具有一選自於如序列辨識編號：21以及序列辨識編號：22所示的核苷酸序列；(3)一用於檢測布魯塞爾德克酵母菌菌株的核酸分子，其具有一選自於如序列辨識編號：23以及序列辨識編號：24所示的核苷酸序列；(4)一用於檢測Dekkera naardenensis 菌株的核酸分子，其具有一選自於如序列辨識編號：25、序列辨識編號：26、序列辨識編號：36以及序列辨識編號： 37所示的核苷酸序列；(5)一用於檢測班圖德克酵母菌菌株的核酸分子，其具有一選自於如序列辨識編號：34以及序列辨識編號：35所示的核苷酸序列；以及(6)一用於檢測布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21517的核酸分子，其具有一選自於如序列辨識編號：38以及序列辨識編號：39所示的核苷酸序列。

依據本發明的核酸分子可進一步使用一具有本技藝中的通常技術者所熟知的標準技術而被附接或結合至一個可偵測的標記(detectable label)以容許檢測或定量該等德克酵母菌菌株。適用於本發明之可偵測的標記包括，但不限於：半抗原標記(hapten labels)，例如，生物素(biotin)以及地高辛(digoxigenin,Dig)；化學螢光標記(chemiluminescent labels)；螢光標記(fluorescent labels)，例如，螢光素(fluorescein)、玫塊紅(rhodamine)、FAM、TET、HEX、JOE、TAMA、NTB、TAMRA、ROX、VIC、NED、雅基馬黃(Yakima Yellow)、BHQI、BHQ2、BHQ3、Iowa Black FQ、Iowa Black RQ、DABCYL、DABSYL、ElleQuencher、Eclipse Dark Quencher、甲基紅(Methyl Red)、德州紅(Texas Red)、孔雀綠(malachite green)、分散藍3(DisperseBlue3)、Bodipy 493/503、花青基苷(cyanin,Cy)染料[諸如，Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5與Cy7]、AlexaFluor染料[諸如，AlexaFluor 488、532、546、555、568、594、610、647以及680]、PromoFluor染料[諸如，PromoFluor 488、555、 590、633、647以及680]以及LC-Red染料[諸如，LC-Red610、640、670以及705]；酵素標記；放射性標記(例如，³² P)；顆粒標記(particle labels)，例如，金膠體(gold colloids)以及量子點(quantum dot)；以及比色標記(colorimetric labels)，例如，染劑以及有色的玻璃或塑膠珠粒(colored glass or plastic beads)。

依據本發明的核酸分子亦可被使用作為探針，並且在它們的5’端和/或3’端上可加入或刪除至少一個核苷酸殘基，而使其所具有的長度是落在大約15至30個核苷酸殘基之範圍內。此外，在該等核酸分子的5’端和/或3’端上可加入至少一個胸苷(thymidine)以使得它們在被點佈(spotted)於生物晶片的表面上時可具有較佳的固定性(immobilization)，並且增強它們在進行雜交反應時所獲得的偵測訊號。而這些都是熟習此項技術者所詳知且慣用的技術。較佳地，在該等探針的5’端和/或3’端上所加入之胸苷的數目是落在大約10至35個的範圍內。

本發明亦提供一種用於檢測一樣品中是否存在有一德克酵母菌菌株的方法，其包括：令該樣品進行一種使用至少一組引子對的DNA擴增反應，其中該至少一組引子對是選自於由下列所構成的群組：(1)一用於檢測德克酵母菌屬物種的菌株的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：19所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：20所示的核苷酸序列之反向引子； (2)一用於檢測異常德克酵母菌菌株的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：21所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：22所示的核苷酸序列之反向引子；(3)一用於檢測布魯塞爾德克酵母菌菌株的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：23所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：24所示的核苷酸序列之反向引子；(4)一用於檢測Dekkera naardenensis 菌株的引子對，其包含：(a)一具有一如序列辨識編號：25所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：26所示的核苷酸序列之反向引子；或者(b)一具有一如序列辨識編號：36所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：37所示的核苷酸序列之反向引子；(5)一用於檢測班圖德克酵母菌菌株的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：34所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：35所示的核苷酸序列之反向引子；以及(6)一用於檢測布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21517的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：38所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：39所示的核苷酸序列之反向引子；以及 檢測是否有一藉由使用該至少一組引子對而被擴增出的DNA片段，其中該DNA片段之存在表示有一對應於該至少一組引子對的德克酵母菌菌株之存在。

依據本發明，在進行該DNA擴增反應之前，從該樣品中萃取出總基因組DNA以作為模版。

依據本發明，該DNA擴增反應可藉由使用下列方法學之至少一者而被進行：聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)、反轉錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)、即時定量聚合酶鏈反應(Real time quantitative PCR)、巢式PCR(nested PCR)、熱啟動PCR(hot-start PCR)、原位PCR(in-situ PCR)、簡併性寡核苷酸引子PCR(degenerate oligonucleotide primer PCR,DOP PCR)、微PCR(micro PCR)、多重聚合酶鏈反應(multiplex polymerase chain reaction)、以限制片段長度多型性核酸序列為主之擴增反應(restriction fragments length polymorphism nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)、轉錄-調節的擴增反應(transcription-mediated amplification,TMA)、環媒介等溫擴增反應(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)以及滾環擴增反應(rolling circle amplification,RCA)。有關這些方法學的操作條件的設定是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，該DNA擴增反應可以在一選自於由下列所構成的群組中的生物晶片上被進行：微流體晶片(例如，樣品前處理晶片、反應型晶片以及分析型晶片)以及晶片實 驗室。

依據本發明，該DNA片段的檢測可以藉由一種使用一探針的雜交反應而被進行。較佳地，該探針具有一選自於由下列所構成的群組中的核苷酸序列：序列辨識編號：19、序列辨識編號：20、序列辨識編號：21、序列辨識編號：22、序列辨識編號：23、序列辨識編號：24、序列辨識編號：25、序列辨識編號：26、序列辨識編號：34、序列辨識編號：35、序列辨識編號：36、序列辨識編號：37、序列辨識編號：38以及序列辨識編號：39。

依據本發明，該雜交反應可以在一選自於由下列所構成的群組中的生物晶片上被進行：基因晶片、微流體晶片(例如，樣品前處理晶片、反應型晶片以及分析型晶片)以及晶片實驗室。

依據本發明，該樣品可以選自於下列所構成的群組：酒精飲料以及軟性飲料。

較佳地，該樣品是一酒精飲料，它包括，但不限於：葡萄酒(wine)、啤酒(beer)、蘋果酒(cider)、康普茶(kombucha)以及龍舌蘭酒(tequila)。在本發明的一個較佳具體例中，該酒精飲料是啤酒。

較佳地，該樣品是一軟性飲料，它包括，但不限於：蘇打水(soda water)以及檸檬汽水(lemonade)。

依據本發明的核酸分子可被使用作為探針並直接被拿來與上述樣品進行雜交反應。因此，本發明進一步提供一種用於檢測一樣品中是否存在有一德克酵母菌菌株的方法， 其包括：令該樣品進行一種使用至少一個探針的雜交反應，其中該至少一個探針所具有的核苷酸序列以及所對應的德克酵母菌菌株是如上面對於該等核酸分子所界定者；以及檢測是否有一藉由使用該至少一個探針來進行雜交反應而被形成的雜交物，其中該雜交物之存在表示有一對應於該至少一個探針的德克酵母菌菌株之存在。

可瞭解到的是，該雜交反應的操作條件會進一步隨著所使用的儀器設備、該樣品的種類與預處理的方式以及所使用的反應內容物的用量比例等因素而被變動，以便達致最佳的檢測效果。而這些操作條件的選擇是熟習此項技藝者能例行性地自行決定的。

依據本發明，該雜交反應可以在一選自於由下列所構成的群組中的生物晶片上被進行：基因晶片、微流體晶片(例如，樣品前處理晶片、反應型晶片以及分析型晶片)以及晶片實驗室。

依據本發明的核酸分子可被應用於製備一種用於檢測一德克酵母菌菌株的檢驗套組。而除了該等核酸分子之外，該檢驗套組可進一步包含一用於監控DNA擴增產物的核酸染劑。較佳地，該核酸染劑是選自於下列所構成的群組：溴化乙錠(ethidium bromide,EtBr)、SYBR GREEN I、SYBR GREEN II、SYBR Orange、SYBR Gold、碘化丙錠(Propidium Iodide,PI)、SYTOX Blue以及SYPRO Ruby。

依據本發明的核酸分子亦被預期可供應用於生物晶片， 俾以快速地檢測存在於一樣品中的德克酵母菌菌株。

較佳實施例之詳細說明

本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。

實施例 實驗材料：

1.在下面實施例中所使用的酵母菌菌株(yeast strains)是購自於台灣的食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center,BCRC)(300新竹市食品路331號，台灣)，這些菌株包括：(1)德克酵母菌屬物種(Dekkera spp.)：異常德克酵母菌(Dekkera anomala )BCRC 21512與21515[它們的同物異名(synonyms)分別為異常酒香酵母菌(Brettanomyces anomalus )BCRC 21512與克勞森酒香酵母菌(Brettanomyces claussenii )BCRC 21515]、布魯塞爾德克酵母菌(Dekkera bruxellensis )BCRC 21414、21517、21518、21519與21440[它們的同物異名分別為布魯塞爾酒香酵母菌(Brettanomyces bruxellensis )BCRC 21414、卡斯酒香酵母菌(Brettanomyces custersii )BCRC 21517、間型酒香酵母菌(Brettanomyces intermedius )BCRC 21518、郎比 可酒香酵母菌(Brettanomyces lambicus )BCRC 21519與間型德克酵母菌(Dekkera intermedia )BCRC 21440]、班圖德克酵母菌(Dekkera custersiana )BCRC 21516，以及Dekkera naardenensis BCRC 21520；(2)酵母菌屬物種(Saccharomyces spp.)：貝酵母菌(Saccharomyces bayanus )BCRC 21816、21818、21964、21966與22425、啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae )BCRC 20262、20270、20577、21678、21827與22050、巴斯德酵母菌(Saccharomyces pastorianus )BCRC 21420、21421、21422、21423、21584、21585、21588與21971、庫德里阿兹威酵母菌(Saccharomyces kudriavzevii )BCRC 22966與23160、Saccharomyces mikatae BCRC 22967與23149、奇異酵母菌(Saccharomyces paradoxus )BCRC 22587與23147、糖化酵母菌(Saccharomyces diastaticus )BCRC 20490與21662、Saccharomyces dairenensis BCRC 20456，以及克魯維酵母菌(Saccharomyces kluyveri )BCRC 21977；(3)Kazachstania 屬物種(Kazachstania spp.)：Kazachstania barnettii BCRC 22812、Kazachstania humaiicus BCRC 22970，以及Kazachstania naganishii BCRC 22969；(4)Naumovia castellii BCRC 22586； (5)畢赤酵母菌屬物種(Pichia spp.)：亞膜畢赤酵母菌(Pichia subpelliculosa )BCRC 20480以及膜醭畢赤酵母(Pichia membranaefaciens )BCRC 21399與21292；(6)裂殖酵母屬物種(Schizosaccharomyces spp.)：粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe )BCRC 21461與23006以及八孢裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces octosporus )BCRC 20585；(7)魯氏接合酵母菌(Zygosaccharomyces rouxii )BCRC 21868與22631；(8)克勒克酵母菌屬物種(Kloeckera spp.)：檸檬克勒克酵母菌(Kloeckera apiculata )BCRC 20539、爪哇克勒克酵母(Kloeckera javanica )BCRC 21513以及非洲克勒克酵母菌(Kloeckera africana )BCRC 22076；(9)假絲酵母菌屬物種(Candida spp.)：產朊假絲酵母菌(Candida utilis )BCRC 20260、博伊丁假絲酵母菌(Candida boidinii )BCRC 20464以及光滑假絲酵母菌(Candida glabrata )BCRC 20477；(10)有孢圓酵母菌屬物種(Torulaspora spp.)：戴爾布有孢圓酵母菌(Torulaspora delbrueckii )BCRC 20868、球有孢圓酵母菌(Torulaspora globosa )BCRC 21534，以及Torulaspora pretoriensis BCRC 21750；(11)Handenula ofunaensis BCRC 22598；以及(12)紅酵母屬物種(Rhodotorula spp.)：黏紅酵母菌 (Rhodotorula glutinis )BCRC 20576、21418與22360、Rhodotorula dairenensis BCRC 21485、小紅酵母菌(Rhodotorula minuta )BCRC 22040、黏質紅酵母菌(Rhoaotorula mucilaginosa )BCRC 22242，以及Rhodotorula araucariae BCRC 22370。

2.在下面實施例中所使用的細菌菌株(bacterial strains)是分別購自於台灣的食品工業發展研究所(FIRDI)的生物資源保存及研究中心(BCRC)、美國類型培養物收集中心(American Type Culture Collection,ATCC)以及美國紐約市衛生署(The City of New York Department of Health,U.S.A)，這些菌株包括：

(1)乳桿菌屬物種(Lactobacillus spp.)：嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus )BCRC 10695、短乳桿菌(Lactobacillus brevis )BCRC 12187、乳酪乳桿菌(Lactobacillus casei )BCRC 14080、戴白氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbruckii subsp bulgaricus )BCRC 10696、發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum )BCRC 10360、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum )BCRC 10069、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri )BCRC 14625、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus )BCRC 10940、唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius )BCRC 12574，以及沙克乳桿菌(Lactobacillus sakei )BCRC 14622；以及

(2)沙門桿菌屬物種(Salmonella spp.)：鼠傷寒沙門桿菌 (Salmonella typhimurium )ATCC 14028以及購自於美國紐約市衛生署的腸炎沙門桿菌(Salmonella enteritidis )、哈達爾沙門桿菌(Salmonella hadar )、嬰兒型沙門桿菌(Salmonella infantis )與維爾肖沙門桿菌(Salmonella virchow )。

3.在下面實施例中所使用的YPD肉湯培養基(YPD broth)[含有10 g/L酵母菌萃取物(yeast extract)、20 g/L蛋白腖(peptone)以及20 g/L右旋糖(dextrose)]、通用啤酒瓊脂培養基(Universal Beer Agar medium,UBA medium)、通用啤酒肉湯培養基(Universal Beer Broth,UBB)以及平板計數培養基(Plate Count Agar,PCA)是購自於Difco(Difco Laboratories,Detroit,Michigan U.S.A)。

4.在下面實施例中所使用的引子對是由生工科技公司(台北，台灣)所合成。

一般實驗方法：

1.基因組DNA的萃取(extraction of genomic DNA)：酵母菌菌株以及細菌菌株的基因組DNA的萃取皆是使用血液與組織基因組DNA Miniprep系統(Blood and Tissue Genomic DNA Miniprep System,VIOGENE)來進行。首先，將1 mL的酵母菌或細菌培養物置於一微量離心管中，繼而以13,000 rpm來進行離心歷時3分鐘。在倒除上澄液之後，以1 mL無菌水來清洗沉澱物(pellets)共計2次。之後，加入160 μL無菌水以充分懸浮菌體，繼而加入20 μL溶菌酶(lysozyme)(20 mg/mL)以及20 μL溶壁酶(lyticase)(100 mg/mL)並於37℃下反應歷時3小時。接著，加入200 μL EX緩衝液(EX buffer)以及15 μL蛋白酶K(proteinase K)(10 mg/mL)並予以震盪混合，由此所形成的混合物被置於60℃水浴下反應歷時3小時。之後，將該混合物置於70℃水浴下歷時30分鐘俾以讓蛋白酶K失去活性，繼而加入200 μL絕對酒精並予以輕微地震盪混合歷時數秒。接著，將一B/T基因組DNA Mini管柱(B/T Genomic DNA Mini Column)放入至一個收集管(collection tube)中，並將所有混合物移至該管柱中，繼而以13,000 rpm來進行離心歷時2分鐘。在移除洗出物(eluate)之後，將該管柱放回該收集管內並將500 μL WS緩衝液(WS buffer)加入至該管柱中，繼而以13,000 rpm來進行離心歷時2分鐘。最後，將該管柱放入至一個新的微量離心管中，繼而將100 μL無菌水(被預熱至70℃)加入至該管柱的中心處並靜置歷時5分鐘，然後以13,000 rpm來進行離心歷時3分鐘以洗提出菌株的基因組DNA。由此而得到的基因組DNA被儲存於-20℃下備用。

實施例1. 針對德克酵母菌屬物種(Dekkera spp.)的β-微管蛋白(β-tubulin)基因的引子對(primer pairs)的設計 A、針對德克酵母菌菌株的β-微管蛋白基因之定序分析

在本實驗中，申請人選用β-微管蛋白基因作為標的基因並嘗試設計出針對德克酵母菌屬物種的專一性引子對。由於德克酵母菌屬物種的基因組(genome)迄今尚未被完全地定序，因此為了選殖出德克酵母菌屬物種的β-微管蛋白基 因，申請人依據C.H.Huanget al .(2009),Antonie van Leeuwenhoek ,95：135-142當中的研究結果，將在上面“實驗材料”的第1項當中所述的貝酵母菌BCRC 21816、21818與21964、啤酒酵母菌BCRC 20270以及巴斯德酵母菌BCRC 21420、21423與21971拿來作為對照菌株(control strains)，而將其他的60種菌株拿來作為試驗菌株(test strains)，並選用在C.H.Huanget al. (2009),Antonie van Leeuwenhoek ,95：135-142當中所揭示的一組具有下面所示核苷酸序列的簡併性引子對(degenerate primer pair)β tub3引子與β tub4r引子來進行實驗。

β tub3引子 5’-tgggcyaagggtyaytayac-3’(序列辨識編號：1)β tub4r引子 5’-gcctcagtraaytccatytcrtccat-3’(序列辨識編號：2)其中符號r代表g或a；以及符號y代表t/u或c。

首先，將該7種對照菌株以及該60種試驗菌株分別接種至YPD肉湯培養基中，並於一恆溫震盪培養箱(24℃、350 rpm)內進行培養歷時3天。接著，分別取1 mL的酵母菌培養物並且依照上面“一般實驗方法”的第1項「基因組DNA的萃取」當中所述的方法來進行基因組DNA的萃取。然後，分別以所得到的各個酵母菌菌株的基因組DNA作為模板(template)，並使用簡併性引子對β tub3/β tub4r來進行使用下面表1中所示的反應條件之聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction,PCR)。

於完成PCR後，藉由2%瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis)來對所得到的PCR反應溶液進行分析，而實驗結果發現：該7種對照菌株以及該60種試驗菌株皆有得到一大小約900 bp的PCR產物。接著，各個PCR產物是委託捷恩麥克生物科技有限公司(GMbiolab Co,Ltd.)來進行定序分析，藉此而得到該7種對照菌株以及該60種試驗菌株的PCR產物的核苷酸序列，其中該7種對照菌株，亦即貝酵母菌BCRC 21816、21818與21964、啤酒酵母菌BCRC 20270以及巴斯德酵母菌BCRC 21420、21423與21971，分別具有一如序列辨識編號：3至9所示的核苷酸序列。

接著，該7種對照菌株的PCR產物的核苷酸序列是使用NCBI網站所提供的BLASTN軟體來進行比對分析，而所得到的結果證實：藉由使用簡併性引子對β tub3/β tub4r可以從該7種對照菌株的基因組DNA中擴增出部分β-微管蛋 白基因。之後，使用ClustalX 1.81軟體以及BioEdit軟體來對該7種對照菌株與該60種試驗菌株的PCR產物的核苷酸序列進行多重序列比對分析(multiple sequence alignment analysis)以及系統發生分析(phylogenetic analysis)。而多重序列比對分析以及系統發生分析的結果顯示：該7種對照菌株與該60種試驗菌株的PCR產物的核苷酸序列具有顯著的同源性(significant homology)，這表示該60種試驗菌株的部分β-微管蛋白基因亦可藉由簡併性引子對β tub3/β tub4r而被擴增出來，而其中異常德克酵母菌BCRC 21512與21515、布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21414、21517、21518、21519與21440、班圖德克酵母菌BCRC 21516以及Dekkera naardenensis BCRC 21520這9種德克酵母菌菌株的部分β-微管蛋白基因分別具有一如序列辨識編號：10至18所示的核苷酸序列。

B、德克酵母菌屬的屬-特異性引子對(genus-specific primer pair)以及物種-特異性引子對(species-specific primer pair)的設計

依據在上面第A項當中所得到的序列分析結果，申請人從該9種德克酵母菌菌株的部分β-微管蛋白基因當中挑選出具有高度守恆性(high conservativeness)的區域，並據此來設計出多組針對德克酵母菌屬物種的簡併性引子對。此外，申請人從該9種德克酵母菌菌株的部分β-微管蛋白基因當中挑選出具有高度變異性(high variability)的區域，並據此來設計出多組分別針對異常德克酵母菌、布魯塞爾德 克酵母菌與Dekkera naardenensis 的引子對。

之後，該等引子對利用NCBI網站所提供的BLASTN軟體而被拿來與NCBI網站的資料庫中的所有酵母菌以及細菌的基因序列以及在上面第A項當中所得到的該7種對照菌株以及該60種試驗菌株的部分β-微管蛋白基因的核苷酸序列進行比對分析，藉此而篩選出對於德克酵母菌屬物種的菌株具有屬-特異性的簡併性引子對DekkeF/DekkeR，以及分別對於異常德克酵母菌、布魯塞爾德克酵母菌與Dekkera naardenensis 具有物種-特異性的引子對DanoF/DanoR、DbruxF/DbruxR與Dnaa1F/Dnaa1R來供後續實驗之用。

為表清楚，依據本發明的1組屬-特異性引子對DekkeF/DekkeR的相關資訊(包括：核苷酸序列、針對各種德克酵母菌所擴增出的PCR產物大小以及對應於各種德克酵母菌的標的基因的所在位置等)已被整合於下面表2中。而依據本發明的3組物種-特異性引子對DanoF/DanoR、DbruxF/DbruxR以及Dnaa1F/Dnaa1R的相關資訊(包括：核苷酸序列、所擴增出的PCR產物大小以及對應於標的基因的所在位置等)已被整合於下面表3中。

實施例2. 針對德克酵母菌屬物種的hsp70 基因的引子對的設計 A、針對德克酵母菌菌株的hsp70 基因之定序分析

在本實驗中，申請人選用hsp70 基因作為標的基因並嘗試設計出針對德克酵母菌屬物種的專一性引子對。由於啤酒酵母菌的hsp70 基因家族的成員已被完全地定序，為了選殖出德克酵母菌屬物種的部分hsp70 基因(partial hsp70 gene)，申請人依據NCBI登錄編號NM_001178151.1[啤酒酵母菌S288c的SSA1 基因的完整編碼序列(complete coding sequence)]當中所示的核苷酸序列以及在其他5種酵母菌菌株中與啤酒酵母菌的hsp70 基因家族的典型成員(包括SSA1 、SSA2 、SSA3 以及SSA4 基因)具有高度相似性的核苷酸序列，其中包括：NCBI登錄編號FO082049.1[嗜山梨醇畢赤酵母菌(Pichia sorbitopkila )CBS 7064的染色體K的完整序列]當中的Piso0_003783 基因以及NCBI登錄編號XM_446529.1[光滑假絲酵母菌CBS 138的一假定蛋白質(hypothetical protein)的部分編碼序列]、NCBI登錄編號XM_453252.1[乳酸克魯維斯酵母菌(Kluyveromyces lactis )NRRL Y-1140的一假定蛋白質的部分編碼序列]、NCBI登錄編號XM_002494945.1(魯氏接合酵母菌CBS 732的一假定蛋白質的完整編碼序列)與NCBI登錄編號XM_003682136.1(戴爾布有孢圓酵母菌CBS 1146的一假定蛋白質的完整編碼序列)當中所示的核苷酸序列，而從中尋找出具有高度守恆性的區域並且據此來設計出一組具有下面所示核苷酸序列 的簡併性引子對hsp70F引子與hsp70R引子。

hsp70F引子 5’-agacargcyacyaargatgc-3’(序列辨識編號：27)hsp70R引子 5’-caanacacctggttggtt-3’(序列辨識編號：28)其中符號r代表g或a；符號y代表t/u或c；以及符號n代表a、g、c或t/u。

之後，在上面“實驗材料”的第1項當中所述的啤酒酵母菌BCRC 20262與20577被拿來作為對照菌株，而其他的65種菌株被拿來作為試驗菌株，該等菌株分別被接種至YPD肉湯培養基中，並於一恆溫震盪培養箱(24℃、350 rpm)內進行培養歷時3天。接著，分別取1 mL的酵母菌培養物並且依照上面“一般實驗方法”的第1項「基因組DNA的萃取」當中所述的方法來進行基因組DNA的萃取。然後，分別以所得到的各個酵母菌菌株的基因組DNA作為模板，並使用簡併性引子對hsp70F/hsp70R來進行使用下面表4中所示的反應條件之聚合酶連鎖反應。

於完成PCR後，藉由2%瓊脂糖凝膠電泳來對所得到的PCR反應溶液進行分析，而實驗結果發現：該2種對照菌株以及該65種試驗菌株皆有得到一大小約815 bp的PCR產物。接著，各個PCR產物是委託捷恩麥克生物科技有限公司來進行定序分析，藉此而得到該2種對照菌株以及該65種試驗菌株的PCR產物的核苷酸序列，其中該2種對照菌株，亦即啤酒酵母菌BCRC 20262與20577，分別具有一如序列辨識編號：29至30所示的核苷酸序列。

接著，該2種對照菌株的PCR產物的核苷酸序列是使用NCBI網站所提供的BLASTN軟體來進行比對分析，而所得到的結果證實：藉由使用簡併性引子對hsp70F/hsp70R可以從該2種對照菌株的基因組DNA中擴增出部分hsp70 基因。之後，使用ClustalX 1.81軟體以及BioEdit軟體來對該2種對照菌株與該65種試驗菌株的PCR產物的核苷酸序列進行多重序列比對分析以及系統發生分析。而多重序列 比對分析以及系統發生分析的結果顯示：該2種對照菌株與該65種試驗菌株的PCR產物的核苷酸序列具有顯著的同源性，這表示該65種試驗菌株的部分hsp70 基因亦可藉由簡併性引子對hsp70F/hsp70R而被擴增出來，而其中班圖德克酵母菌BCRC 21516、Dekkera naardenensis BCRC 21520以及布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21517分別具有一如序列辨識編號：31至33所示的核苷酸序列。

B、德克酵母菌屬的物種-特異性引子對以及菌株-特異性引子對(strain-specific primer pair)的設計

依據在上面第A項當中所得到的序列分析結果，申請人從該9種德克酵母菌菌株的部分hsp70 基因當中挑選出具有高度變異性的區域，並據此來設計出多組分別針對班圖德克酵母菌與Dekkera naardenensis 的引子對。此外，申請人從該5種布魯塞爾德克酵母菌菌株的部分hsp70 基因當中挑選出具有高度變異性的區域，並據此來設計出多組分別針對布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21517的引子對。

之後，該等引子對利用NCBI網站所提供的BLASTN軟體而被拿來與NCBI網站的資料庫中的所有酵母菌以及細菌的基因序列以及在上面第A項當中所得到的該2種對照菌株以及該65種試驗菌株的部分hsp70 基因的核苷酸序列進行比對分析，藉此而篩選出分別對於班圖德克酵母菌與Dekkera naardenensis 具有物種-特異性的引子對DcussF/DcussR與Dnaa2F/Dnaa2R，以及對於布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21517具有菌株-特異性的引子對 BcusiF/BcusiR來供後續實驗之用。

為表清楚，依據本發明的2組物種-特異性引子對DcussF/DcussR以及Dnaa2F/Dnaa2R的相關資訊(包括：核苷酸序列、所擴增出的PCR產物大小以及對應於標的基因的所在位置等)已被整合於下面表5中。而依據本發明的1組菌株-特異性引子對DcusiF/DcusiR的相關資訊(包括：核苷酸序列、所擴增出的PCR產物大小以及對應於標的基因的所在位置等)已被整合於下面表6中。

實施例3. 本發明的引子對在德克酵母菌屬物種檢測上的專一性(specificity)以及靈敏度(sensitivity)的分析

為了評估在上面實施例1以及2當中針對德克酵母菌菌株所設計出的1組屬-特異性引子對DekkeF/DekkeR、5組物種-特異性引子對DanoF/DanoR、DbruxF/DbruxR、DcussF/DcussR、Dnaa1F/Dnaa1R、Dnaa2F/Dnaa2R以及1組菌株-特異性引子對DcusiF/DcusiR的專一性以及靈敏度，下面的實驗被進行。

A、引子對的專一性試驗：

首先，將上面“實驗材料”的第1項當中所述的67種酵母菌菌株分別接種至YPD肉湯培養基中，並於一恆溫振盪培養箱(24℃、350 rpm)內進行培養過夜。另外，將上面“實驗材料”的第2項當中所述的15種細菌菌株分別接種至YPD肉湯培養基中，並於一恆溫振盪培養箱(24℃、350 rpm)內進行培養過夜。

接著，對所形成的酵母菌培養物以及細菌培養物分別各取1 mL並且依照上面“一般實驗方法”的第1項「基因組DNA的萃取」當中所述的方法來進行基因組DNA的萃取。然後，以所得到的各個酵母菌或細菌菌株的基因組DNA作為模版，並分別使用屬-特異性引子對DekkeF/DekkeR、物種-特異性引子對DanoF/DanoR、DbruxF/DbruxR、DcussF/DcussR、Dnaa1F/Dnaa1R、Dnaa2F/Dnaa2R以及菌株-特異性引子對DcusiF/DcusiR來進行PCR，而PCR的反應條件與操作條件分別被顯示於下面表7以及表8中。

於完成PCR之後，藉由2%瓊脂糖凝膠電泳來確認是否有得到一如表2、表3、表5以及表6中所示之既定大小的PCR產物。

B、引子對的靈敏度試驗：

為瞭解本發明所揭示的1組屬-特異性引子對、5組物種-特異性引子對以及1組菌株-特異性引子對在德克酵母菌菌株檢測上的靈敏度，異常德克酵母菌BCRC 21512與21515、布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21414、21517、21518、21519與21440、班圖德克酵母菌BCRC 21516以及Dekkera naardenensis BCRC 21520被拿來進行下面的實驗。首先，將這9種德克酵母菌菌株分別接種至YPD肉湯培養基中，並於一恆溫振盪培養箱(24℃、350 rpm)內進行培養歷時8~10小時。所形成的德克酵母菌培養物以YPD肉湯培養基予以調整至一為10⁹ CFU/mL(以平板計數培養基來進行菌數計數)的濃度，並以之作為原液(stock)來進行10倍連續稀釋(10-fold serial dilution)，藉此而得到具有不同濃度(10⁸ 、10⁷ 、10⁶ 、10⁵ 、10⁴ 、10³ 、10² 、10¹ 以及10⁰ CFU/mL)的稀釋菌液。之後，對各個含有不同德克酵母菌濃度的稀釋菌液分別取1 mL並且依照上面“一般實驗方法”的第1項「基因組DNA的萃取」當中所述的方法來進行基因組DNA的萃取。

另外，對依據上述方式所得到的含有不同德克酵母菌濃度的稀釋菌液各取1 mL並分別添加至5 mL通用啤酒肉湯培養基中，繼而置於一恆溫振盪培養箱(24℃、350 rpm)內進行增殖培養(enrichment culturing)歷時3~4小時。之後，對各個經增殖培養的含有不同德克酵母菌濃度的稀釋菌液分別取1 mL並且依照上面“一般實驗方法”的第1項「基因組DNA的萃取」當中所述的方法來進行基因組DNA的萃 取。

依據上面所得到的各個未經增殖以及經增殖培養的德克酵母菌菌株的基因組DNA被拿來作為模版，並分別使用屬-特異性引子對DekkeF/DekkeR、物種-特異性引子對DanoF/DanoR、DbruxF/DbruxR、DcussF/DcussR、Dnaa1F/Dnaa1R、Dnaa2F/Dnaa2R以及菌株-特異性引子對DcusiF/DcusiR來進行PCR，而PCR的反應條件與操作條件分別是如上面表7以及表8中所示者。

於完成PCR之後，藉由2%瓊脂糖凝膠電泳來確認是否有得到一如表2、表3、表5以及表6中所示之既定大小的PCR產物。

結果： A、引子對的專一性試驗：

經由瓊脂糖凝膠電泳分析結果發現，當以不同的酵母菌或細菌菌株的基因組DNA作為模版並使用引子對DekkeF/DekkeR來進行PCR時，只有德克酵母菌屬物種(亦即異常德克酵母菌BCRC 21512與21515、布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21414、21517、21518、21519與21440、班圖德克酵母菌BCRC 21516以及Dekkera naardenensis BCRC 21520)有得到一大小約為776~778 bp的PCR擴增產物；當使用引子對DanoF/DanoR來進行PCR時，只有異常德克酵母菌BCRC 21512與21515分別有得到一大小約為391以及397 bp的PCR擴增產物；當使用引子對DbruxF/DbruxR來進行PCR時，只有布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21414、 21517、21518、21519與21440分別有得到一大小約為244 bp的PCR擴增產物；當使用引子對DcussF/DcussR來進行PCR時，只有班圖德克酵母菌BCRC 21516有得到一大小約為376 bp的PCR擴增產物；當使用引子對Dnaa1F/Dnaa1R來進行PCR時，只有Dekkera naardenensis BCRC 21520有得到一大小約為301 bp的PCR擴增產物；當使用引子對Dnaa2F/Dnaa2R來進行PCR時，只有Dekkera naardenensis BCRC 21520有得到一大小約為369 bp的PCR擴增產物；以及當使用引子對DcusiF/DcusiR來進行PCR時，只有布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21517有得到一大小約為223 bp的PCR擴增產物。

這個實驗結果顯示：依據本發明之針對德克酵母菌屬的屬-特異性引子對DekkeF/DekkeR、針對異常德克酵母菌的物種-特異性引子對DanoF/DanoR、針對布魯塞爾德克酵母菌的物種-特異性引子對DbruxF/DbruxR、針對班圖德克酵母菌的物種-特異性引子對DcussF/DcussR、針對Dekkera naardenensis 的物種-特異性引子對Dnaa1F/Dnaa1R與Dnaa2F/Dnaa2R以及針對布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21517的菌株-特異性引子對DcusiF/DcusiR對於所欲檢測的標的酵母菌菌株皆具有專一性。

B、引子對的靈敏度試驗：

下面表9顯示依據本發明的1組屬-特異性引子對、5組物種-特異性引子對以及1組菌株-特異性引子對的靈敏度試驗結果。從表9可見，引子對DekkeF/DekkeR、 DanoF/DanoR、DbruxF/DbruxR、DcussF/DcussR、Dnaa1F/Dnaa1R、Dnaa2F/Dnaa2R以及DcusiF/DcusiR對於未經增殖培養的德克酵母菌菌株的檢測靈敏度可以達到10² ~10⁵ CFU/mL，而對於經增殖培養的德克酵母菌菌株的檢測靈敏度可以達到10⁰ CFU/mL。

這個實驗結果顯示：依據本發明之針對德克酵母菌屬的屬-特異性引子對DekkeF/DekkeR、針對異常德克酵母菌的物種-特異性引子對DanoF/DanoR、針對布魯塞爾德克酵母菌的物種-特異性引子對DbruxF/DbruxR、針對班圖德克酵母菌的物種-特異性引子對DcussF/DcussR、針對Dekkera naardenensis 的物種-特異性引子對Dnaa1F/Dnaa1R與Dnaa2F/Dnaa2R以及針對布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21517的菌株-特異性引子對DcusiF/DcusiR對於所欲檢測的標的酵母菌菌株皆具有高靈敏度。

實施例4. 本發明的引子對對於啤酒中的德克酵母菌菌株的檢測能力之評估

為了評估依據本發明所設計出的1組屬-特異性引子對、5組物種-特異性引子對以及1組菌株-特異性引子對對於存在於啤酒中的德克酵母菌菌株的檢測效用，下面的實驗被 進行。

A、菌株的分離與初步分析：

首先，將一市售啤酒以一孔徑為0.45 μm的濾膜(filter membrane)(購自於台灣莎多利斯有限公司)來進行過濾，接著將該濾膜放置於一通用啤酒瓊脂培養基上，繼而於一恆溫培養箱(24℃)內進行培養過夜。之後，從在該通用啤酒瓊脂培養基上所形成的菌落(colonies)中挑選24個菌落作為待測菌株(亦即待測菌株1至24)，繼而將該等待測菌株分別接種至通用啤酒肉湯培養基中，並於一恆溫振盪培養箱(24℃、350 rpm)內進行培養過夜。接著，對所形成的各個培養物分別取1 mL並且依照上面“一般實驗方法”的第1項「基因組DNA的萃取」當中所述的方法來進行基因組DNA的萃取。然後，以所得到的各個待測菌株的基因組DNA作為模版，並分別使用上面實施例1當中所述的簡併性引子對β tub3/β tub4r來進行PCR，而PCR的反應條件是如上面表1中所示者。

於完成PCR之後，所得到的PCR產物是委託捷恩麥克生物科技有限公司來進行定序，繼而使用NCBI網站所提供的BLASTN軟體來進行序列分析。經由序列比對的結果發現：待測菌株1至6是屬於乳桿菌屬物種(Lactobacillus spp.)，待測菌株7是屬於德克酵母菌屬物種，而待測菌株8至24是啤酒酵母菌。

B、本發明的引子對的檢測：

依據上面第A項所得到的各個待測菌株的基因組DNA 被拿來作為模版，並分別使用屬-特異性引子對DekkeF/DekkeR、物種-特異性引子對DanoF/DanoR、DbruxF/DbruxR、DcussF/DcussR、Dnaa1F/Dnaa1R、Dnaa2F/Dnaa2R以及菌株-特異性引子對DcusiF/DcusiR來進行PCR，而PCR的反應條件與操作條件分別是如上面表7以及表8中所示者。

於完成PCR之後，藉由2%瓊脂糖凝膠電泳來確認是否有得到一如表2、表3、表5以及表6中所示之既定大小的PCR產物。而經由瓊脂糖凝膠電泳分析結果發現，當以待測菌株1至24的基因組DNA作為模版並使用引子對DekkeF/DekkeR來進行PCR時，只有待測菌株7有得到一大小約為776 bp的PCR擴增產物；當使用引子對DanoF/DanoR來進行PCR時，只有待測菌株7有得到一大小約為391~397 bp的PCR擴增產物；而當使用其他的引子對來進行PCR時，待測菌株1至24皆無得到PCR產物。

之後，該得自於待測菌株7的PCR擴增產物(大小約為776 bp)是委託捷恩麥克生物科技有限公司來進行定序，繼而使用ClustalX軟體而將該PCR擴增產物的核苷酸序列拿來與在上面實施例1的第A項當中所得到的異常德克酵母菌BCRC 21512以及BCRC 21515的部分β-微管蛋白基因的核苷酸序列(序列辨識編號：10以及11)進行比對分析。而分析結果發現：待測菌株7的PCR擴增產物的核苷酸序列與異常德克酵母菌BCRC 21512以及BCRC 21515的部分β-微管蛋白基因的核苷酸序列分別具有100%與97.9%的序 列相似性。申請人據此而推論：該市售啤酒已受到異常德克酵母菌的汙染。

綜合以上的實驗結果，申請人認為依據本發明的屬-特異性引子對DekkeF/DekkeR、物種-特異性引子對DanoF/DanoR、DbruxF/DbruxR、DcussF/DcussR、Dnaa1F/Dnaa1R與Dnaa2F/Dnaa2R以及菌株-特異性引子對DcusiF/DcusiR對於所欲偵測的標的酵母菌菌株具有高度的靈敏度與專一性，因而可供應用於檢測存在於食品樣品中的德克酵母菌菌株。

於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。

雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。

<110> 弘光科技大學

<120> 用於檢測德克酵母菌菌株的核酸分子、檢驗套組、生物晶片以及方法

<130> 用於檢測德克酵母菌菌株的核酸分子

<160> 39

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於擴增酵母菌菌株的部分β-微管蛋白基因的簡併性前向引子

<400> 1

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於擴增酵母菌菌株的部分β-微管蛋白基因的簡併性反向引子

<400> 2

<210> 3

<211> 906

<212> DNA

<213> 貝酵母菌

<400> 3

<210> 4

<211> 909

<212> DNA

<213> 貝酵母菌

<400> 4

<210> 5

<211> 908

<212> DNA

<213> 貝酵母菌

<400> 5

<210> 6

<211> 910

<212> DNA

<213> 啤酒酵母菌

<400> 6

<210> 7

<211> 904

<212> DNA

<213> 巴斯德酵母菌

<400> 7

<210> 8

<211> 905

<212> DNA

<213> 巴斯德酵母菌

<400> 8

<210> 9

<211> 906

<212> DNA

<213> 巴斯德酵母菌

<400> 9

<210> 10

<211> 910

<212> DNA

<213> 異常德克酵母菌

<400> 10

<210> 11

<211> 915

<212> DNA

<213> 異常德克酵母菌

<400> 11

<210> 12

<211> 909

<212> DNA

<213> 布魯塞爾德克酵母菌

<400> 12

<210> 13

<211> 907

<212> DNA

<213> 布魯塞爾德克酵母菌

<400> 13

<210> 14

<211> 908

<212> DNA

<213> 布魯塞爾德克酵母菌

<400> 14

<210> 15

<211> 912

<212> DNA

<213> 布魯塞爾德克酵母菌

<400> 15

<210> 16

<211> 907

<212> DNA

<213> 布魯塞爾德克酵母菌

<400> 16

<210> 17

<211> 908

<212> DNA

<213> 班圖德克酵母菌

<400> 17

<210> 18

<211> 908

<212> DNA

<213> Dekkera naardenensis

<400> 18

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測德克酵母菌屬物種的DekkeF引子

<400> 19

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測德克酵母菌屬物種的DekkeR引子

<400> 20

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測異常德克酵母菌的DanoF引子

<400> 21

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測異常德克酵母菌的DanoR引子

<400> 22

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測布魯塞爾德克酵母菌的DbruxF引子

<400> 23

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測布魯塞爾德克酵母菌的DbruxR引子

<400> 24

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測Dekkera naardenensis的Dnaa1F引子

<400> 25

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測Dekkera naardenensis的Dnaa1R引子

<400> 26

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於擴增酵母菌菌株的部分hsp70基因的簡併性前向引子

<400> 27

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於擴增酵母菌菌株的部分hsp70基因的簡併性反向引子

<220>

<221> misc_特徵

<222> (4)..(4)

<223> n代表a、g、c或t/u

<400> 28

<210> 29

<211> 813

<212> DNA

<213> 啤酒酵母菌

<400> 29

<210> 30

<211> 840

<212> DNA

<213> 啤酒酵母菌

<400> 30

<210> 31

<211> 841

<212> DNA

<213> 班圖德克酵母菌

<400> 31

<210> 32

<211> 835

<212> DNA

<213> Dekkera naardenensis

<400> 32

<210> 33

<211> 838

<212> DNA

<213> 布魯塞爾德克酵母菌

<400> 33

<210> 34

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測班圖德克酵母菌的DcussF引子

<400> 34

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測班圖德克酵母菌的DcussR引子

<400> 35

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測Dekkera naardenensis的Dnaa2F引子

<400> 36

<210> 37

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測Dekkera naardenensis的Dnaa2R引子

<400> 37

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21517的DcusiF引子

<400> 38

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於檢測布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21517的DcusiR引子

<400> 39

Claims (11)

1. 一種用於檢測一德克酵母菌菌株的核酸分子試劑，其包含有下列引子對的至少一者：(1)一用於檢測Dekkera naardenensis 菌株的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：36所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：37所示的核苷酸序列之反向引子；(2)一用於檢測班圖德克酵母菌菌株的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：34所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：35所示的核苷酸序列之反向引子；以及(3)一用於檢測布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21517的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：38所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：39所示的核苷酸序列之反向引子。
2. 如申請專利範圍第1項的核酸分子試劑，其進一步包含有下列引子對的至少一者：(1)一用於檢測德克酵母菌屬物種的菌株的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：19所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：20所示的核苷酸序列之反向引子；(2)一用於檢測異常德克酵母菌菌株的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：21所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：22所示 的核苷酸序列之反向引子；(3)一用於檢測布魯塞爾德克酵母菌菌株的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：23所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：24所示的核苷酸序列之反向引子；以及(4)一用於檢測Dekkera naardenensis 菌株的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：25所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：26所示的核苷酸序列之反向引子。
3. 一種用於檢測一樣品中是否存在有一德克酵母菌菌株的方法，其包括：令該樣品進行一種使用一核酸分子試劑的DNA擴增反應，其中該核酸分子試劑包含有下列引子對的至少一者：(1)一用於檢測Dekkera naardenensis 菌株的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：36所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：37所示的核苷酸序列之反向引子；(2)一用於檢測班圖德克酵母菌菌株的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：34所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：35所示的核苷酸序列之反向引子；以及(3)一用於檢測布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21517的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：38所示的 核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：39所示的核苷酸序列之反向引子；以及檢測是否有一藉由使用該至少一組引子對而被擴增出的DNA片段，其中該DNA片段之存在表示有一對應於該至少一組引子對的德克酵母菌菌株之存在。
4. 如申請專利範圍第3項的方法，其中該核酸分子試劑進一步包含有下列引子對的至少一者：(1)一用於檢測德克酵母菌屬物種的菌株的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：19所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：20所示的核苷酸序列之反向引子；(2)一用於檢測異常德克酵母菌菌株的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：21所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：22所示的核苷酸序列之反向引子；(3)一用於檢測布魯塞爾德克酵母菌菌株的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：23所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：24所示的核苷酸序列之反向引子；以及(4)一用於檢測Dekkera naardenensis 菌株的引子對，其包含一具有一如序列辨識編號：25所示的核苷酸序列之前向引子，以及一具有一如序列辨識編號：26所示的核苷酸序列之反向引子。
5. 如申請專利範圍第3或4項的方法，其中該樣品是選自 於下列所構成的群組：酒精飲料以及軟性飲料。
6. 如申請專利範圍第3或4項的方法，其中在進行該DNA擴增反應之前，從該樣品中萃取出總基因組DNA以作為模版。
7. 如申請專利範圍第3或4項的方法，其中該DNA擴增反應是藉由使用下列方法學之至少一者而被進行：聚合酶鏈反應、反轉錄酶聚合酶鏈反應、即時定量聚合酶鏈反應、巢式PCR、熱啟動PCR、原位PCR、簡併性寡核苷酸引子PCR、微PCR、多重聚合酶鏈反應、以限制片段長度多型性核酸序列為主之擴增反應、轉錄-調節的擴增反應、環媒介等溫擴增反應以及滾環擴增反應。
8. 如申請專利範圍第4項的方法，其中該DNA片段的檢測是藉由一種使用一探針的雜交反應而被進行。
9. 如申請專利範圍第8項的方法，其中該探針具有一選自於由下列所構成的群組中的核苷酸序列：序列辨識編號：19、序列辨識編號：20、序列辨識編號：21、序列辨識編號：22、序列辨識編號：23、序列辨識編號：24、序列辨識編號：25、序列辨識編號：26、序列辨識編號：34、序列辨識編號：35、序列辨識編號：36、序列辨識編號：37、序列辨識編號：38以及序列辨識編號：39。
10. 如申請專利範圍第9項的方法，其中該雜交反應是在一選自於由下列所構成的群組中的生物晶片上被進行：基因晶片、微流體晶片以及晶片實驗室。
11. 一種用於檢測一德克酵母菌菌株的檢驗套組，其包含有一如申請專利範圍第1或2項的核酸分子試劑。