JPH10248600A - 癌細胞の検出方法及び癌細胞検出用プライマ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 癌細胞の検出方法及び癌細胞検出用プライマ
を提供する。 【解決手段】 本発明に係る癌細胞高感度検出方法は、
(1)検体である血液又は他の体液等から有核細胞を回収
して全ｍＲＮＡを抽出し、そのｃＤＮＡを作製し、(2)
得られるｃＤＮＡに対し、癌細胞特有の遺伝子及びその
スプライシングアイソフォームである内部標準となる特
定の遺伝子の両者を増幅可能なプライマを用いて、逆転
写酵素（ＲＴ）と、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）との
組合せ（ＲＴ−ＰＣＲ法とする）により増幅し、(3)得
られたそれぞれの遺伝子の発現量を比較定量し、癌細胞
の存在の判別を行う方法である。また、本発明に係る癌
細胞高感度検出用プライマはスプライシングアイソフォ
ームの共通部分に相補的または該共通部分にハイブリダ
イズ可能な塩基配列からなるプライマである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、癌細胞の検出方法
及び癌細胞検出用プローブに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】癌細胞は原発巣から循環血液等による拡
散等により、血液やその他の体液中（例えば、尿、便、
肺の胸水、喀痰）に存在することが知られているが、早
期癌においてはその存在量は通常極めて少なく、係る血
液や体液を癌診断（特に早期癌）のための検体として用
いた癌細胞を検出するための極めて高感度でしかも高信
頼性のある検出方法は知られていない。また、バイオプ
シーで得られた組織片についても少数または形態変化の
少ない早期癌を検出することは困難である。

【０００３】一方、膜貫通型の糖蛋白質であるＣＤ４４
（従来Pgp-1、Hermes抗原、ECMRIII、In(Lu)-related a
ntigen等の名前で知られている）は、そのリガンドとし
てはヒアルロン酸、コラーゲン、フィブロネクチン、セ
ルグリシン等であって、細胞外マトリクスと細胞の接着
等の相互作用を媒介し、癌転移に直接関与するする接着
分子の１つとして知られている（松村保広、実験医学Vo
l.12、No.8、63〜70ページ「癌とＣＤ４４」）。

【０００４】さらに、ＣＤ４４の遺伝子の解析からＣＤ
４４遺伝子には少なくとも２０個のエクソンが存在し、
その中で１０個のエクソンが細胞外ドメインにおいて、
選択的スプライス機構によりバリエーションのあるタイ
プを構成するのに使用されることも解明されてきた。例
えばアイソフォームとしては、挿入エクソンを持たな
い、80kd〜90kdの分子量サイズの標準型ヒトＣＤ４４Ｈ
（上記の様々な名前で呼ばれていたhemopoietic type）
や、エクソンＶ６を含むＣＤ４４ＶやエクソンＶ８〜Ｖ
１０を含むＣＤ４４Ｒなどの変異型が知られている。こ
れらの変異型では糖鎖結合領域があるため、平均分子量
は110kd〜200kdの広い範囲に分布する。また、これら変
異型のＣＤ４４は癌の転移に深く関与すると考えられて
おり、例えば、ＣＤ４４Ｖはラット膵臓癌細胞株におい
て転移能を持つ細胞株にのみ発現が見られること（Salm
i.M等、J.Cell.Biol. 122巻431-442ページ、1993年）
が、ＣＤ４４Ｒ（Ｖ８〜Ｖ１０）が大腸癌組織に高発現
していることが知られている（佐谷等、Lancet 341、72
5-736、1993年）。

【０００５】また、微量遺伝子を検出するために開発さ
れたＲＴ−ＰＣＲ法は検体に含まれる細胞中の遺伝子の
発現の有無を測定することには非常に良い方法である。
しかし、この方法では発現量を定量することが不可能で
ある。そこで、定量ができるＲＴ−ＰＣＲ法として考案
されたのがコンペティティブＲＴ−ＰＣＲ法である（Pr
oc.Natl.Acad.Sci. USA, 87, 2725-2729, 1990)。この
方法はサンプルに一定量のコンペティターＲＮＡ（また
はＤＮＡ）を混ぜて行う方法である。すなわち、コンペ
ティターＲＮＡ（またはＤＮＡ）として、サンプル中の
目的ＲＮＡ（またはＤＮＡ）と同じプライマのアニーリ
ングサイトを持つものを作製し、それを段階的に希釈し
たものを分注したサンプル中に加えた後、ＰＣＲ増幅産
物の分離まで行い目的のＲＮＡ（またはＤＮＡ）由来の
ＰＣＲ産物と、コンペティターＲＮＡ由来のＰＣＲ産物
の量を比較する方法である。

【０００６】また、サンプル中の遺伝子の定量方法とし
てサンプルに含まれる目的とする遺伝子と異なる内部標
準遺伝子を、該目的とする遺伝子と、同時に、異なるプ
ライマを用いて増幅し、両者の増幅産物を比較する別の
方法も提唱されている（Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 87,
7160-7164, 1990)。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】上記のコンペティティ
ブＲＴ−ＰＣＲ法では測定の都度コンペティターＤＮＡ
（またはＲＮＡ）が必要となり、それらの準備や保管に
は多くの労力が必要である。また、サンプル中のＤＮＡ
（又はＲＮＡ）量、複数の分注されたサンプルに対する
ＰＣＲ条件等測定結果に誤差が生じる要因も多い。

【０００８】また、上記内部標準遺伝子を利用する方法
は、目的遺伝子及び内部標準遺伝子それぞれにプライマ
を用意する必要があり両者が同程度増幅されるようにす
るには条件設定に工夫を要する。

【０００９】そこで、本発明では、癌細胞を血液や体液
等の検体から検出する方法であって、癌細胞マーカ遺伝
子と内部標準遺伝子の両者を１組のプライマを用いて競
合的に増幅し、両者の増幅遺伝子の比較により癌細胞の
存在を判別するという簡便な癌細胞の検出方法及びその
プライマの提供を課題とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】以上の知見に基づき本発
明者等は鋭意研究を重ね、上記の血液やその他の体液
（喀痰、便等も含む）、組織切片等を検体とする、高感
度かつ信頼性の高い癌細胞検出方法及びその検出用プラ
イマを見出すことに成功し、本発明を完成するに至っ
た。

【００１１】より詳しくは、本発明に係る癌細胞高感度
検出方法は、(1)検体である血液又は他の体液から有核
細胞を回収して全ｍＲＮＡを抽出し、そのｃＤＮＡを作
製し、(2)得られるｃＤＮＡに対し、癌細胞特有の遺伝
子及びそのスプライシングアイソフォームである内部標
準となる特定の遺伝子の両者を増幅可能なプライマを用
いて、逆転写酵素（ＲＴ）を用いたポリメラーゼ鎖反応
（ＲＴ−ＰＣＲ法とする）により増幅し、(3)得られた
それぞれの遺伝子の発現量を比較定量し、癌細胞の存在
の判別を行う方法である。

【００１２】また、本発明に係る癌細胞高感度検出用プ
ライマはスプライシングアイソフォームの共通部分に相
補的部分または該共通部分にハイブリダイズ可能な塩基
配列からなるプライマである。ここで、前記ハイブリダ
イズの条件は、通常ＰＣＲで用いられる条件と同じであ
り、例えば実施例３の(3)で示される条件である。

【００１３】より詳しくは、本発明は、検体中の癌細胞
の検出方法であって、(1) 前記癌細胞に特異的に強発
現する遺伝子で、かつ前記遺伝子のスプライシングアイ
ソフォームが前記検体中の細胞の一部または全部に含ま
れる遺伝子を癌細胞マーカ遺伝子として選択し、(2)
前記選択された癌細胞マーカ遺伝子のスプライシングア
イソフォームであって、前記検体中の細胞の一部又は全
部に含まれ、かつ前記癌細胞では癌化によりその発現量
が減少するか、前記癌細胞マーカ遺伝子と比較して実質
的に発現量が同程度に維持されるスプライシングフォー
ムを内部標準遺伝子として選択し、(3) 前記癌細胞マ
ーカ遺伝子と、前記内部標準遺伝子との共通配列部分で
スプライシングにより変化する部分を挟む両側の各１箇
所のセンス鎖とアンチセンス鎖にハイブリダイズし、前
記スプライシングにより変化する部分を含む部分を増幅
する１組のポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）用プライマを
選択し、(4) 前記検体中のｍＲＮＡに基づくｃＤＮＡ
と、前記プライマとを用いたＰＣＲ反応により増幅され
た前記癌細胞マーカ遺伝子と前記内部標準遺伝子のＤＮ
Ａ断片の存在量比に基づき癌細胞を検出する方法を提供
するものである。

【００１４】さらに、本発明は、前記癌細胞マーカ遺伝
子が標準型ＣＤ４４Ｈ遺伝子に、エクソンＶ８、Ｖ９、
Ｖ１０が挿入されたＣＤ４４Ｒ１遺伝子であり、内部標
準遺伝子が標準型ＣＤ４４Ｈ遺伝子にエクソンＶ１０が
挿入されたＣＤ４４Ｒ２遺伝子であることを特徴とする
前記癌細胞の検出方法を提供するものである。

【００１５】さらに、本発明は、プライマの１つとし
て、ＣＤ４４のスプライシングサイトよりアミノ末端側
の定常部をコードするｃＤＮＡ配列中の３’末端を含む
配列部分の相補鎖にハイブリダイズするヌクレオチド鎖
に、さらにその３’末端にＡＴＡを付加したものを用い
る前記癌細胞の検出方法を提供するものである。

【００１６】さらに、本発明は、プライマの１つとし
て、ＣＤ４４のエクソンＶ１０の全部もしくは一部のア
ミノ酸配列またはエクソンＶ１０の全部もしくは一部と
さらにカルボキシル末端側定常部の少なくとも一部を含
む連続したアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡにハイブ
リダイズするヌクレオチド鎖を用いる前記癌検出方法を
提供するものである。

【００１７】また、本発明は、ＣＤ４４Ｒ１、およびＣ
Ｄ４４Ｒ２のＤＮＡ断片を増幅するプライマを提供する
ものである。

【００１８】また、本発明は、前記の癌細胞の検出方法
で使用できる下記の配列で表される１組のプライマを提
供するものである。

【００１９】 ５’−ＧＡＣＡＧＡＡＴＣＣＣＴＧＣＴＡＣＣＡＡＴＡ
−３’ ５’−ＡＴＧＴＧＴＣＴＴＧＧＴＣＴＣＣＴＧＡＴＡＡ
−３’。

【００２０】以下、本発明に係る方法及び、プライマに
ついて発明の実施の形態に即して詳しく説明する。

【００２１】

【発明の実施の形態】本発明に係る高感度癌細胞検出方
法は一般的には、検出されるべき癌細胞に特異的に多く
発現する癌細胞マーカを見出し、かつ検体中に存在する
細胞の大多数を構成する正常細胞に常に一定量発現す
る、前記癌細胞マーカ遺伝子のスプライシングアイソフ
ォームである遺伝子を内部標準遺伝子として見出し、主
として上記選択された２種類の遺伝子を、１組のプライ
マで同時にＲＴ−ＰＣＲ法により増幅し、上記増幅産物
の量を比較定量し、癌細胞の存在を判別する。

【００２２】ここで、検体に含まれる正常細胞が、前記
内部標準遺伝子のみならず、前記癌細胞マーカ遺伝子を
も同時に常に発現している場合にも、上記で得られる増
幅産物の量の比を算出し正常細胞のみの場合の比と比較
して判別することで簡便かつ高精度で癌細胞の存在判別
が可能となる。さらに、本発明の方法では、スプライシ
ングされる部分を挟む１組の前記ＲＴ−ＰＣＲ法用プラ
イマのみを用いて、２種類の遺伝子を同時に競合的に増
幅することが可能となる。従って、本発明の方法におい
てはＲＴ−ＰＣＲ法における増幅操作の不備から生じる
誤差が解消し、本発明に係る方法の信頼性は極めて高
い。

【００２３】増幅産物の量の比の算出方法は、得られる
増幅産物を電気泳動して染色し、癌細胞マーカ遺伝子の
増幅産物のバンドの濃度と内部標準遺伝子の増幅産物の
バンドの濃度をイメージスキャナ等に取込み数値化（数
値化するプログラムはＮＩＨimage1.60が使用可能）
し、両者の比を求める方法が挙げられる。また、放射性
同位元素を標識したヌクレオチドを加えてＰＣＲを行
い、増幅産物の放射線量により定量する等の方法も挙げ
られる。

【００２４】癌細胞の混入の判別規準については、あら
かじめ健常人と癌患者からそれぞれ得た検体（血液、胸
水、喀痰、尿、便、組織片等）を用いて本発明に係るＰ
ＣＲ法を行い増幅産物の比をそれぞれについて算出し、
判別用統計処理パラメータを求めておく。得られたパラ
メータを用いて、癌細胞存在不明の検体から得た比に基
づき、癌細胞の存在を統計的に判別可能となる。

【００２５】癌化に伴い変異を示す遺伝子は種々存在す
るが、本発明では増幅産物を分子量で識別できるスプラ
イシングバリアントを癌細胞マーカ遺伝子として選ぶこ
とができ、スプライシングにより遺伝子が挿入されるも
のでも削除されるものでもよい。

【００２６】より具体的には、本発明では後述する実施
例でＣＤ４４Ｒ１とＣＤ４４Ｒ２のそれぞれの遺伝子が
癌細胞マーカ遺伝子及び内部標準遺伝子として好ましく
使用可能であることを見出し、上記説明した方法でそれ
ぞれの発現量を検出し、それらの発現量の比Ｒ１／Ｒ２
から肺癌細胞、膀胱癌細胞の存在を判別した。

【００２７】（検体の種類）本発明に係る癌細胞高感度
検出方法を応用可能な検体の種類は特に制限されず、固
体検体でも、液体検体でもよく、適当な濃度（細胞数）
に希釈した血液、胸水、喀痰、尿、便、組織片等に好ま
しく使用され得る。かかる場合、あらかじめ健常人と癌
患者からそれぞれの検体を測定しておく必要がある。こ
の際、癌細胞存在の統計的判別のために必要な複数の検
体を測定し、統計用パラメータを算出しておく。

【００２８】（検出可能な癌の種類）本発明に係る方法
で判別可能な癌の種類は特に制限はない。すでに説明し
た特徴を有する２種類の遺伝子が利用可能ならば、係る
癌細胞は検出可能となる。特に、大腸癌、肺癌、乳癌、
肺偏平上皮癌、非小細胞肺癌、膀胱癌等の細胞は高感度
で検出可能である。

【００２９】（検出用プライマ）本発明に係る方法で使
用するＲＴ−ＰＣＲ法用プライマについてはスプライシ
ングアイソフォームのスプライシングされる部分を挟む
プライマであれば好ましく検出用プライマとなり得る。
さらに癌細胞マーカ遺伝子と内部標準遺伝子のみを増幅
するプライマを選択することが好ましいが、両遺伝子か
らの産物を分離できれば他の遺伝子も増幅するプライマ
も使用可能である。プライマの塩基配列の決定は本発明
の技術分野の当業者であれば容易に決定可能である。ま
た、プライマの塩基数は、通常は、１２塩基以上のもの
が使用されており理論的にもハイブリダイズの条件がス
トリンジェントであれば１６塩基以上のプライマが増幅
する遺伝子は唯一限定されうるものである。従って本発
明のプライマの塩基数の決定は本発明の技術分野の当業
者であれば容易に行え、塩基数の範囲は１２〜３０の範
囲であり、２０塩基程度のプライマが用いられることが
より好ましい。

【００３０】（検出感度）本発明に係る検出方法は、検
体中の特定の癌細胞マーカ遺伝子と内部標準遺伝子をＰ
ＣＲ法により増幅し、検出、定量するものである。ＰＣ
Ｒ法ではプライマの構造（プライマの遺伝子への結合効
率）または反応条件（温度、試薬、時間等）の僅かな変
動が指数関数的に増幅産物の生成量に大きく影響する。
従って、２つの遺伝子に対し異なるプライマを用いる場
合、または別の試料（同一の試料を分注して測定する場
合も含め）で測定する場合は両者が同程度に増幅されて
いるとは限らず、増幅産物量の定量比較結果が直ちに増
幅前の遺伝子を定量比較した結果と等価とはいえない。

【００３１】本発明においては、単一試料中に目的遺伝
子と内部標準遺伝子を含み、両遺伝子を同一のプライマ
で増幅するため、上記要因は２つの遺伝子に対し全く同
一となる。さらに、標準遺伝子は外部より添加するもの
でなく生体より採取時に検体に含まれるものを用いるた
め、標準遺伝子の添加量が測定結果に影響を与えること
もない。つまり、検体から全ｍＲＮＡを抽出してｃＤＮ
Ａを調製し目的遺伝子と標準遺伝子を同一のプライマで
増幅するため、ＰＣＲの反応条件の変動があっても両遺
伝子からの生産物は試料中の両遺伝子の存在比のみに依
存して競合的に増幅される。すなわち、少量の遺伝子の
み入手できない場合でもＰＣＲ反応で目的遺伝子を増幅
させてその量を評価することができる。

【００３２】癌マーカ遺伝子と内部標準遺伝子の増幅産
物の量比を調べるためには、具体的には両者を分離して
それぞれの量を測定する必要がある。分離及び計量につ
いては、既知の種々の方法が適用でき、目的に応じて最
適の手段を選択できる。スプライシングにより増幅産物
の分子量がかなり変化するものを内部標準遺伝子として
選択すれば、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等で
十分に分離可能である。分子量に大きな差がない場合に
おいても、両遺伝子からの増幅産物配列の異なる部分を
利用して、制限酵素による切断様式の違い（生成物の分
子量の違い）やそれぞれに特異的にハイブリダイズする
異なるプローブを用いることにより両者を識別すること
ができる。本発明で実施例で説明されるように、ＣＤ４
４Ｒ１およびＣＤ４４Ｒ２に共通のＲＴ−ＰＣＲプライ
マを用いて、ゲル電気泳動法により増幅産物を分離し、
染色後にデンシトメトリにて数量化する方法では、正常
細胞１０００個について１個の癌細胞が存在することが
判別可能であることが示され、正常細胞千個について１
個の癌細胞が存在しても判別可能であると考えられる。

【００３３】（ＣＤ４４による癌細胞高感度検出）さら
に、本発明の好ましい実施態様として、本発明に係る方
法をすでに説明したＣＤ４４に応用して、血液やその他
の体液を検体とした場合に肺癌を始めとする種々の癌細
胞の存在を早期に検出可能とする方法及びその方法に使
用する検出用プライマについて以下に説明する。

【００３４】まず、肺癌患者で高発現するＣＤ４４Ｒ１
（Ｖ８〜Ｖ１０が挿入されている）の検出に対する内部
標準遺伝子となるべきＣＤ４４のスプライシングアイソ
フォームを検索した結果、健常人の血液検体中の細胞に
はＣＤ４４の１つのスプライシングアイソフォームであ
るＣＤ４４Ｒ２（Ｖ１０が挿入）が存在することを見出
した。また同時に健常人の血液検体中の細胞にはＣＤ４
４Ｒ１も一定量発現しており、これらのスプライシング
アイソフォームの量比は実質的に一定であることを見出
した。なお、標準型ＣＤ４４Ｈは正常細胞、癌細胞とも
に多量に発現するため、標準遺伝子とするには好ましく
ない。

【００３５】さらに、癌細胞のＣＤ４４Ｒ１とＣＤ４４
Ｒ２の遺伝子を同様にＲＴ−ＰＣＲ法で増幅し、両者の
増幅量の相対比を定量した。癌細胞では、上記正常細胞
に比較して、これらの増幅量比（ＣＤ４４Ｒ１／ＣＤ４
４Ｒ２）が有意に増加していることを確認した。

【００３６】また、ＣＤ４４Ｒ１とＣＤ４４Ｒ２の挿入
遺伝子の塩基配列に基づき、これらの５’側の最初の３
塩基が同じであることに着目し、ＣＤ４４の５’側正常
領域の３’末端部分にＲ１、Ｒ２共通の３塩基を付加し
たプライマを調製した。このプライマを用いて、ＣＤ４
４Ｒ１、ＣＤ４４Ｒ２の両方を同じプライマで同時に
（競合的に）増幅することで、これら２種類以外のアイ
ソフォームは増幅されないため他のアイソフォーム及び
正常分子の発現が細胞内で変化しても全く影響を受け
ず、精度の良い検出が可能となった。この場合、検体中
の細胞内のＣＤ４４Ｒ２を内部標準遺伝子として利用す
るため、検体中の細胞数の変動による影響が少なく（検
体間の細胞数の変動による補正が不要）、また、ＣＤ４
４Ｒ１とＣＤ４４Ｒ２の遺伝子が競合的に増幅されるた
めにわずかな癌細胞を含む検体からもＣＤ４４Ｒ２に比
較してＣＤ４４Ｒ１を多く増幅できた。また、検体とし
て、実際の患者の胸水、尿を、癌細胞の有無を高感度で
検出できた。この場合の検出限界の見積は、１個の癌細
胞が１０００個の正常細胞中に存在するという非常に低
濃度のものである。これは、本発明を用いて早期癌の状
態においても癌細胞が高感度で検出可能となることを意
味する。

【００３７】なお、本明細書および図面において、塩基
やアミノ酸などの略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−Ｉ
ＵＢによる略号あるいは当該分野における慣用の略号を
使用した。

【００３８】（核酸） ＤＮＡ デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ 相補的ＤＮＡ ＲＮＡ リボ核酸 ｍＲＮＡ メッセンジャーＲＮＡ Ａ アデニン Ｃ シトシン Ｇ グアニン Ｔ チミン 以下、上記のＣＤ４４を用いた実施例についてついて詳
しく説明する。

【００３９】

【実施例】

（実施例１） 健常人末梢血細胞での検討 （１）ＤＮＡプライマの合成 ＤＮＡプライマはＤＮＡ合成機（モデル３９２、ＡＢＩ
社製）で合成した。合成したＤＮＡはマニュアルに従い
精製後滅菌蒸留水にて２０pmol/mlに調製した。

【００４０】（２）細胞の調製 健常人から末梢血を採取した。末梢血はＥＤＴＡ添加採
血管に５ｃｃ採血し、ファイコール・ペーク（ファルマ
シア製）を用いた比重遠心分離法にて、白血球有核細胞
を回収した。

【００４１】（３）ｍＲＮＡの調製 （２）で得た細胞からＲＮＡｚｏｌＢ（コスモバイオ社
製）にて全ＲＮＡを抽出した。その後、ＢＲＬ社製の逆
転写酵素（Moloney murine leukemia virus reverse tr
anscriptase)を用いてｃＤＮＡにした。このｃＤＮＡを
用いてＰＣＲを実施した。

【００４２】（４）ＰＣＲ反応 ＣＤ４４の定常領域にプライマを設定し、健常人の白血
球細胞由来のＣＤ４４のアイソフォームが存在するかど
うかについて検討した。すなわち、ＣＤ４４定常領域の
５’側のプライマＰ１は５’−ＴＣＣＣＡＧＡＣＧＡＡ
ＧＡＣＡＧＴＣＣＣＴＧＧＡＴ−３’を用い、ＣＤ４４
定常領域の３’側のアンチセンスプライマＰ２は５’−
ＣＡＣＴＧＧＧＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＴＣＴＴＧＧＴＣ
−３’を用いて定常ＣＤ４４を含む全ＣＤ４４遺伝子を
増幅した。なお、以下に示す反応条件にてＰＣＲ反応を
行った。

【００４３】 ｃＤＮＡ ５μｌ プライマＰ１ １μｌ プライマＰ２ １μｌ １０ＸＰＣＲ緩衝液 ２μｌ ｄＮＴＰ混合物 １μｌ Ampli-Taq（パーキンエルマー社） １μｌ ＤＤＷ ９μｌ 合計 ２０μｌ 反応は温度を上げた後に酵素が働くTaq start antibody
を用いたHot Start法で行った。条件は94℃30秒、５５
℃４５秒、７２℃６０秒を３０サイクル行い、最後に７
２℃１０分で伸張反応する方法を行った。

【００４４】（５）ついで、このＰＣＲ産物を８％のポ
リアクリルアミドゲルにて電気泳動し、その後銀エチジ
ウムブロミド染色にてＤＮＡを染色した。

【００４５】その結果、図１に示すように正常人では定
常ＣＤ４４であるＣＤ４４Ｈが強く染色されるに加え
て、約280bpのところに、アイソフォームの発現を認め
た。

【００４６】（６）ＤＮＡシークエンス この健常人で発現しているアイソフォームが何であるか
を調べるために、ＤＮＡシークエンスを行った。ＤＮＡ
シークエンスはＰＣＲ産物から２％アガロースゲル電気
泳動後、アイソフォームだけをゲルから抽出した。な
お、ＰＣＲ産物のゲルからの抽出は、GenecleanIIキッ
ト（バイオ101製、フナコシ取扱）を用いて実施した。
この抽出したＤＮＡ断片についてＴＡクローニングキッ
ト（インビトロゲン製、フナコシ取扱）を用いて、ベク
ターに組込んだ後、ユニバーサルプライマとリバースプ
ライマを用いてダイターミネーター法を用いて、ＡＢＩ
モデル３７３ＤＮＡシーケンサでシーケンスした。その
結果、健常人の細胞から増幅されるアイソフォームはＶ
１０のみ挿入されたＣＤ４４Ｒ２であることを決定し
た。これを模式的に図２に示した。

【００４７】（７）ＣＤ４４Ｒ１とＣＤ４４Ｒ２に共通
するプライマの作製 すでに報告されているＣＤ４４のｃＤＮＡ配列を調べる
とＣＤ４４Ｒ１、ＣＤ４４Ｒ２のスプライシングにより
挿入される部分の５’側の３塩基がＡＴＡと同一である
ことが分った。そこで、図３に示すようにＣＤ４４の定
常部（５’末端部）からＡＴＡまでカバーするプライマ
を作製した。もう一方のプライマはＣＤ４４定常部
（３’末端側）の５’末端部分とＶ１０の３’末端７塩
基を含む配列とした。この配列を以下に示す。すなわ
ち、５’側のプライマＰ３、５’−ＧＡＣＡＧＡＡＴＣ
ＣＣＴＧＣＴＡＣＣＡＡＴＡ−３’と、３’側のプライ
マＰ４、５’−ＡＴＧＴＧＴＣＴＴＧＧＴＣＴＣＣＴＧ
ＡＴＡＡ−３’である。このプライマのセットを用い
て、再度同じ健常人の末梢血白血球から調製したｃＤＮ
Ａを用いてＰＣＲを実施した。なお、以下に示す反応条
件にてＰＣＲ反応を行った。

【００４８】 ｃＤＮＡ ５μｌ プライマＰ３ １μｌ プライマＰ４ １μｌ １０ＸＰＣＲ緩衝液 ２μｌ ｄＮＴＰ混合物 １μｌ Ampli-Taq １μｌ ＤＤＷ ９μｌ 合計 ２０μｌ 反応は温度を上げた後に酵素が働くTaq start antibody
を用いたHot Start法で行った。条件は94℃30秒、５５
℃４５秒、７２℃６０秒を３０サイクル行い、最後に７
２℃１０分で伸張反応する方法を実施した。このＰＣＲ
サンプルを２％アガロースゲル電気泳動を行った後、エ
チジウムブロマイドで染色した。

【００４９】この結果を図４に示した。その結果健常人
の末梢血中の白血球細胞にもＣＤ４４Ｒ２のみならず、
ＣＤ４４Ｒ１も又わずかながら一定量存在することが示
さた。これらの量比を数値化することを試みた。

【００５０】（８）画像処理によるＣＤ４４Ｒ１／ＣＤ
４４Ｒ２の量比の数値化 ＣＤ４４Ｒ１／ＣＤ４４Ｒ２の量比を数値化するため
に、（７）で染色されたゲルをＣＣＤカメラで画像とし
てコンピュータに取り込んだ後、ＮＩＨimage1.60解析
ソフトを使用して数値化を行った。得られた数値（面積
比）からは、０．４と低い値であった。

【００５１】そこで健常人の末梢血由来の白血球細胞で
の値を評価するために、８人の健常人の末梢血の白血球
細胞に基づき測定した結果、個人差が少なくほぼ一定値
のＣＤ４４Ｒ１／ＣＤ４４Ｒ２値（平均０．３６、標準
偏差０．０３）となった（図５）。

【００５２】（実施例２）癌細胞での検討 （１）癌細胞の調製 さらに、モデル癌細胞として、大腸癌細胞株（ＨＴ２
９）を用いて同様のプライマによる増幅反応を実施し
た。この細胞を１０％牛胎児血清含有のＤＭＥ培地にて
細胞培養し、細胞数として１０⁶個まで培養した。その
後この細胞を遠心分離にて回収した。

【００５３】（２）ｍＲＮＡの調製 （１）で得られた細胞からＲＮＡｚｏｌＢ（コスモバイ
オ社製）にて全ＲＮＡを抽出した。その後、ＢＲＬ社製
の逆転写酵素を用いてｃＤＮＡにし、ｃＤＮＡに基づき
ＰＣＲ増幅を行った。

【００５４】（３）ＰＣＲ増幅反応 ５’側のプライマＰ３、５’−ＧＡＣＡＧＡＡＴＣＣＣ
ＴＧＣＴＡＣＣＡＡＴＡ−３’と、３’側のプライマＰ
４、５’−ＡＴＧＴＧＴＣＴＴＧＧＴＣＴＣＣＴＧＡＴ
ＡＡ−３’のセットを用いて、再度同じ健常人の末梢血
から調製したｃＤＮＡの時と同じ条件にてＰＣＲを行っ
た。

【００５５】 ｃＤＮＡ ５μｌ プライマＰ３ １μｌ プライマＰ４ １μｌ １０ＸＰＣＲ緩衝液 ２μｌ ｄＮＴＰ混合物 １μｌ Ampli-Taq １μｌ ＤＤＷ ９μｌ 合計 ２０μｌ 反応は温度を上げた後に酵素が働くTaq start antibody
を用いたHot Start法で行った。条件は94℃30秒、５５
℃４５秒、７２℃６０秒を３０サイクル行い、最後に７
２℃１０分で伸張反応する方法を実施した。この増幅産
物を２％アガロースゲル電気泳動を行った後、エチジウ
ムブロマイドで染色した。その結果この方法ではＨＴ２
９細胞でＣＤ４４Ｒ１がＣＤ４４Ｒ２と比較して多量に
検出されることが見い出された。

【００５６】（４）検出限界の検討 次にこれらの結果から、正常の白血球細胞が存在する体
液中にＣＤ４４Ｒ１を強発現している癌細胞が混入して
きた場合に、このＣＤ４４Ｒ１／ＣＤ４４Ｒ２の比の上
昇をもって臨床診断に使えないかを検討した。すなわ
ち、健常人の白血球細胞１０⁶個に対して何個の癌細胞
が混入していたとき癌細胞の混入を見分けられるかにつ
いて検討した。

【００５７】そこで、白血球細胞１０００個に対し、１
個の大腸菌細胞株（ＨＴ２９）をいれたもの、１００個
に１個癌細胞が存在するもの。１０個に１個癌細胞が存
在するサンプル、および１万個に１個、１０万個に１個
存在するサンプルを調製し、それぞれのサンプルについ
て（３）と同様にしてＣＤ４４Ｒ１とＣＤ４４Ｒ２の検
出を行った。その結果、図６に示すように１０００個の
正常細胞に対し癌細胞が１個存在するだけでも、ＣＤ４
４Ｒ１がＣＤ４４Ｒ２と比較して多量に検出することが
できることが判明した。すなわち、１０００個の正常細
胞に対し癌細胞が１個存在する場合、該癌細胞を検出す
ることが可能であることが判明した。

【００５８】（実施例３） 胸水からの細胞を用いたＣ
Ｄ４４Ｒ１／ＣＤ４４Ｒ２の測定 （１）細胞の調製 正常人および癌患者から胸水５ｃｃ〜１０ｃｃを採取し
た。この胸水を遠心分離し、有核細胞を回収した。

【００５９】（２）ｍＲＮＡの調製 （１）で得た細胞から酸、グアニジウムチオシアネート
／フェノール／クロロホルム抽出法（ＡＧＰＣ法）にて
全ＲＮＡを抽出した。その後、ＢＲＬ社製の逆転写酵素
（Moloney murine leukemia virus reverse transcript
ase）を用いてｃＤＮＡにした。このｃＤＮＡを用いて
ＰＣＲを行った。

【００６０】（３）ＰＣＲ反応 ５’側のプライマＰ３、５’−ＧＡＣＡＧＡＡＴＣＣＣ
ＴＧＣＴＡＣＣＡＡＴＡ−３’と、３’側のプライマＰ
４、５’−ＡＴＧＴＧＴＣＴＴＧＧＴＣＴＣＣＴＧＡＴ
ＡＡ−３’のセットを用いて、次の条件にてＰＣＲを行
った。

【００６１】 ｃＤＮＡ ５μｌ プライマＰ３ １μｌ プライマＰ４ １μｌ １０ＸＰＣＲ緩衝液 ２μｌ ｄＮＴＰ混合物 １μｌ Ampli-Taq １μｌ ＤＤＷ ９μｌ 合計 ２０μｌ 反応は温度を上げた後に酵素が働くTaq start antibody
を用いたHot Start法で行った。条件は94℃30秒、63℃3
0秒、７２℃３０秒を３３サイクル行い、最後に７２℃
１０分で伸張反応する方法を実施した。

【００６２】（４）画像解析 ついでこの増幅産物を２％アガロースゲルにて電気泳動
し、その後エチジウムブロミドにてＤＮＡを染色した。
この染色したゲルをＣＣＤカメラで画像として取り込ん
だ後、ＮＩＨimage1.60ソフト（NIHから入手可能。htt
p://rsb.info.nih.gov/nih-image/download.html）を使
用してＣＤ４４Ｒ１／ＣＤ４４Ｒ２の比率を解析した。

【００６３】その結果図７、および８に示すように正常
人ではＣＤ４４Ｒ１／ＣＤ４４Ｒ２比が０．２であるの
に対し、癌患者では４．２７と高い値を示すことが見出
された。

【００６４】（実施例４） 診断の検討 次に実際の診断目的にて穿刺吸引された胸水の細胞成分
からＣＤ４４Ｒ１／ＣＤ４４Ｒ２の比率を調べた。

【００６５】良性の胸水として結核性、細菌性の胸水を
用いた。悪性の胸水として、肺癌、胸部癌を用いた。細
胞の調製から画像処理までは上で記載した実施例３
（１）〜（４）までの方法に従い行った。

【００６６】その結果良性胸水ではＣＤ４４Ｒ２が多く
増幅されるが、癌性胸水では、約７０％の症例について
はＣＤ４４Ｒ１が多く増幅され、ＣＤ４４Ｒ１／ＣＤ４
４Ｒ２の値が１．５を越えていることが分った（図９、
１０）。また、電気泳動バンドより数値化したＣＤ４４
Ｒ１／ＣＤ４４Ｒ２比を表に示す。

【００６７】 表 競合ＲＴ−ＰＣＲ法による増幅産物 ＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝ ＣＤ４４Ｒ１／ＣＤ４４Ｒ２比 ≧１．５ ＜１．５ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 悪性胸水 ｎ＝２３ １６ ７ (NSCLC) 悪性胸水 ｎ＝２ １ １ (Breast Ca.) 良性胸水 ｎ＝２３ ０ ２３ ＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝ 表より明らかなように、癌性では１７／２５でＲ１／Ｒ
２が１．５を越えた。良性では１．５を超えた例は一例
もなかった。

【００６８】（実施例５） 尿からの細胞を用いたＣＤ
４４Ｒ１／ＣＤ４４Ｒ１の測定 （１） 細胞の調製 膀胱炎患者及び膀胱癌患者から尿５０ｃｃ〜１００ｃｃ
を採取した。この尿を遠心分離し、有核細胞を回収し
た。

【００６９】（２） ｍＲＮＡの調製 （１）で得た細胞から、酸、グアニジウムチオシアネー
ト／フェノール／クロロホルム抽出法（ＡＧＰＣ法）に
て全ＲＮＡを抽出した。その後、ＢＲＬ社製の逆転写酵
素(Moloney murine leukemia virus reverse transcrip
tase)を用いてｃＤＮＡとした。このｃＤＮＡを用いて
ＰＣＲを行った。

【００７０】５’側のプライマＰ３、５’−ＧＡＣＡＧ
ＡＡＴＣＣＣＴＧＣＴＡＣＣＡＡＴＡ−３’と、３’側
のプライマＰ４、５’−ＡＴＧＴＧＴＣＴＴＧＧＴＣＴ
ＣＣＴＧＡＴＡＡ−３’のセットを用いて、次の条件に
てＰＣＲを行った。

【００７１】 ｃＤＮＡ ５μｌ プライマＰ３ １μｌ プライマＰ４ １μｌ １０ＸＰＣＲ緩衝液 ２μｌ ｄＮＴＰ混合物 １μｌ Ampli-Taq １μｌ ＤＤＷ ９μｌ 合計 ２０μｌ 反応条件は94℃30秒、63℃30秒、７２℃３０秒を３３サ
イクル行い、最後に７２℃１０分で伸張反応する方法を
実施した。

【００７２】（４）画像解析 ついでこの増幅産物を２％アガロースゲルにて電気泳動
し、その後エチジウムブロミドにてＤＮＡを染色した。
結果を図１１に示す。この染色したゲルをＣＣＤカメラ
で画像として取り込んだ後、ＮＩＨimage1.60を使用し
てＣＤ４４Ｒ１／ＣＤ４４Ｒ２の比率を解析した。

【００７３】その結果尿中でも癌患者の尿サンプルから
はＣＤ４４Ｒ１／ＣＤ４４Ｒ２の比が１．５を超えるの
に対し、膀胱炎患者の尿サンプルからはＣＤ４４Ｒ１／
ＣＤ４４Ｒ２の比が１．５未満であることが判明した。

【００７４】

【発明の効果】本発明の癌細胞マーカー遺伝子及び該癌
細胞マーカー遺伝子とスプライシングフォームの関係に
ある内部標準遺伝子を１組のプライマにより同時にＰＣ
Ｒ法により増幅し、その発現量を比較する方法により、
血液や体液等に混入した極微量の癌細胞を検出すること
が可能となり、癌の早期診断へ使用することが可能とな
る。特にＣＤ４４Ｒ１とＣＤ４４Ｒ２の比、ＣＤ４４Ｒ
１／ＣＤ４４Ｒ２が１．５以上となる場合に、肺癌、乳
癌、膀胱癌に対する早期診断へ使用することが可能とな
る。

【００７５】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 TCCCAGACGA AGACAGTCCC TGGAT 25 配列番号：2 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 CACTGGGGTG GAATGTGTCT TGGTC 25 配列番号：3 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GACAGAATCC CTGCTACCAA TA 22 配列番号：4 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ATGTGTCTTG GTCTCCTGAT AA 22

【図面の簡単な説明】

【図１】健常人末梢血白血球細胞を検体として、プライ
マＰ１、Ｐ２を用いてＲＴ−ＰＣＲ法で増幅したＣＤ４
４のスプライシングアイソフォームを示す電気泳動写真
である。図中ＨＴ２９のバンドは癌細胞株を用いた陽性
コントロールを示す。

【図２】ＣＤ４４による、ＣＤ４４Ｈ（バリアントエク
ソンなし）、ＣＤ４４Ｒ１（バリアントエクソンＶ８、
Ｖ９、Ｖ１０を含む）およびＣＤ４４Ｒ２（バリアント
エクソンＶ１０を含む）の３種類の遺伝子のスプライシ
ングアイソフォームの配列を示すブロック図である。

【図３】ＣＤ４４Ｒ１およびＣＤ４４Ｒ２の遺伝子を増
幅する共通のプライマのアニーリングサイトを示す図で
ある。図中の塩基はＣＤ４４Ｒ１及びＣＤ４４Ｒ２の遺
伝子のセンス鎖の塩基である。

【図４】ＣＤ４４Ｒ１およびＣＤ４４Ｒ２を増幅する共
通のプライマＰ３，Ｐ４により増幅した産物を示す電気
泳動写真である。

【図５】図４の電気泳動バンドを数値化したグラフを示
す図である。

【図６】８人の健常人の末梢血の白血球細胞のＣＤ４４
Ｒ１およびＣＤ４４Ｒ２の産物の遺伝子増幅産物を示す
電気泳動写真である。

【図７】ＣＤ４４遺伝子を用いる本発明に係る方法の検
出限界を示す電気泳動写真である。図上部の数値は癌細
胞（ＨＴ２９）と健常人末梢血白血球（ＰＢＬ）の試料
中の細胞数を示す。

【図８】悪性胸水及び良性胸水を被検体として、増幅さ
れたＣＤ４４Ｒ１およびＣＤ４４Ｒ２の遺伝子増幅産物
を示す電気泳動写真である。

【図９】悪性及び良性の胸水のＣＤ４４Ｒ１およびＣＤ
４４Ｒ２のバンドを数値化してグラフに示した図であ
る。

【図１０】胸水を検体し、本発明に係る方法を用いてＣ
Ｄ４４Ｒ１遺伝子およびＣＤ４４Ｒ２遺伝子を増幅した
結果を示す電気泳動写真である。良性胸水として、結核
性（Ｔｂ）および細菌性（Bacterial）を用い、悪性胸
水として、肺癌性（Lung Ca.)および胸部癌性（Breast
Ca.)を用いた。

【図１１】尿を検体とし、本発明に係る方法を用いてＣ
Ｄ４４Ｒ１遺伝子およびＣＤ４４Ｒ２遺伝子を増幅した
結果を示す電気泳動写真である。良性の尿として膀胱炎
患者の尿を、悪性の尿として膀胱癌患者の尿を用いた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 岡本 勇 熊本県熊本市本庄二丁目２−１ 熊本大学 医学部 腫瘍医学講座内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 検体中の癌細胞の検出方法であって、
   (1) 前記癌細胞に特異的に強発現する遺伝子で、かつ
   前記遺伝子のスプライシングアイソフォームが前記検体
   中の細胞の一部または全部に含まれる遺伝子を癌細胞マ
   ーカ遺伝子として選択し、(2) 前記選択された癌細胞
   マーカ遺伝子のスプライシングアイソフォームであっ
   て、前記検体中の細胞の一部又は全部に含まれ、かつ前
   記癌細胞では癌化によりその発現量が減少するか、前記
   癌細胞マーカ遺伝子と比較して実質的に発現量が同程度
   に維持されるスプライシングフォームを内部標準遺伝子
   として選択し、(3) 前記癌細胞マーカ遺伝子と、前記
   内部標準遺伝子との共通配列部分でスプライシングによ
   り変化する部分を挟む両側の各１箇所のセンス鎖とアン
   チセンス鎖にハイブリダイズし、前記スプライシングに
   より変化する部分を含む部分を増幅する１組のポリメラ
   ーゼ鎖反応（ＰＣＲ）用プライマを選択し、(4) 前記
   検体中のｍＲＮＡに基づくｃＤＮＡと、前記プライマと
   を用いたＰＣＲ反応により増幅された前記癌細胞マーカ
   遺伝子と前記内部標準遺伝子のＤＮＡ断片の存在量比に
   基づき癌細胞を検出する方法。
2. 【請求項２】 前記癌細胞マーカ遺伝子が標準型ＣＤ４
   ４Ｈ遺伝子に、エクソンＶ８、Ｖ９、Ｖ１０が挿入され
   たＣＤ４４Ｒ１遺伝子であり、内部標準遺伝子が標準型
   ＣＤ４４Ｈ遺伝子にエクソンＶ１０が挿入されたＣＤ４
   ４Ｒ２遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の
   癌細胞の検出方法。
3. 【請求項３】 プライマの１つとして、ＣＤ４４のスプ
   ライシングサイトよりアミノ末端側の定常部をコードす
   るｃＤＮＡ配列中の３’末端を含む配列部分の相補鎖に
   ハイブリダイズするヌクレオチド鎖に、さらにその３’
   末端にＡＴＡを付加したものを用いる請求項２記載の癌
   細胞の検出方法。
4. 【請求項４】 プライマの１つとして、ＣＤ４４のエク
   ソンＶ１０の全部もしくは一部のアミノ酸配列またはエ
   クソンＶ１０の全部もしくは一部とさらにカルボキシル
   末端側定常部の少なくとも一部を含む連続したアミノ酸
   配列をコードするｃＤＮＡにハイブリダイズするヌクレ
   オチド鎖を用いる請求項２記載の癌検出方法。
5. 【請求項５】 請求項２、３または４のいずれか一項に
   記載の癌細胞の検出方法で使用できる下記の配列で表さ
   れる１組のプライマ。 ５’−ＧＡＣＡＧＡＡＴＣＣＣＴＧＣＴＡＣＣＡＡＴＡ
   −３’ ５’−ＡＴＧＴＧＴＣＴＴＧＧＴＣＴＣＣＴＧＡＴＡＡ
   −３’。