CN117327818A

CN117327818A - 一种基于微滴数字PCR技术的快速检测双歧杆菌Bi-07的引物探针组合及方法

Info

Publication number: CN117327818A
Application number: CN202311403905.9A
Authority: CN
Inventors: 王娉; 陈颖; 赵晓美; 姬庆龙; 赵勇胜; 杨海荣
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2023-10-27
Filing date: 2023-10-27
Publication date: 2024-01-02

Abstract

本发明涉及一种用于检测双歧杆菌Bi‑07的引物对及探针。本发明还涉及用于测定双歧杆菌Bi‑07的微滴数字PCR检测方法，所述方法包括使用针对双歧杆菌Bi‑07检测的特异性寡核苷酸引物及探针。本发明还涉及用于双歧杆菌Bi‑07的微滴数字PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括特异性寡核苷酸引物及探针。使用本发明的微滴数字PCR检测方法，能够简单、快速、特异且灵敏地检测双歧杆菌Bi‑07。

Description

一种基于微滴数字PCR技术的快速检测双歧杆菌Bi-07的引物探针组合及方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于高特异、高灵敏度的快速检测双歧杆菌Bi-07的寡核苷酸引物和探针以及包含所述引物对和探针的微滴数字PCR检测试剂盒，用于测定双歧杆菌Bi-07的微滴数字PCR检测方法，以及所述引物对和探针或试剂盒在快速检测双歧杆菌Bi-07中的应用。

背景技术

双歧杆菌作为常见的益生菌，具有较好的胃肠道耐受能力，且可以在肠道内黏附并定殖，在商业益生菌产品中很常见，菌种来源于健康人体，双歧杆菌Bi-07（Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bi-07）已经是国家卫计委公布的《可用于婴幼儿食品的菌种名单》中的一员，目前已广泛应用于乳品以及婴幼儿食品中。双歧杆菌多存在于健康母乳喂养的婴儿肠道内，与婴儿免疫系统的健康发育存在关联，作为最早定殖于人体肠道的一类微生物，在调节肠道菌群平衡和促进肠道正常发育等方面具有重要作用，体外研究表明，双歧杆菌Bi-07对低pH条件极其耐受，并能在十二指肠中胆汁浓度下存活。益生菌为“对宿主有益的活性的微生物”，而调节肠道屏障是益生菌常见的功能特性之一。益生菌的功能具有菌株特异性，在菌株水平对益生菌精准鉴定是评价其安全性评价、功能性的重要基础，然而双歧杆菌种类较多，表型及理化特性相似，很难在菌株水平对其进行快速鉴定与区分，传统的鉴定方法主要以生化鉴定为主，其步骤繁琐，检验周期长，区分能力较差，难以快速准确的鉴定出双歧杆菌Bi-07。因此需要建立一种快速、准确地能够在菌株水平双歧杆菌Bi-07进行鉴定的方法，以满足以双歧杆菌Bi-07为有效菌株的益生菌产品的鉴定的准确性与时效性。本发明基于以数字PCR为基础的分子生物学技术，以双歧杆菌Bi-07的核酸为检测基础，选取双歧杆菌Bi-07特异性基因序列为靶基因设计引物及探针，利用数字PCR法检测双歧杆菌Bi-07。建立的微滴数字PCR检测方法，能够实现对双歧杆菌Bi-07在菌株水平的快速、精准的检测。

发明内容

本发明的一个目的在于，提供快速检测双歧杆菌Bi-07的特异性寡核苷酸引物及探针。

本发明的另一个目的在于，提供快速测定双歧杆菌Bi-07的微滴数字PCR检测方法。

本发明提供双歧杆菌Bi-07的特异性寡核苷酸引物和探针在检测双歧杆菌Bi-07的应用。

针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明以双歧杆菌Bi-07的核酸为检测基础，根据双歧杆菌Bi-07的特异基因ABCtransporter C-terminal domain-containing protein（ CP003498.1序列起始位置为1-2022）序列为靶基因设计引物及探针，利用数字PCR法检测双歧杆菌Bi-07。

在一个实施方案中，本发明提供用于通过微滴数字PCR方法检测双歧杆菌Bi-07的寡核苷酸引物对及探针，所述引物对及探针是根据双歧杆菌Bi-07的特异基因ABCtransporter C-terminal domain-containing protein序列中保守性强的区域而设计的。

在一个实施方案中，所使用的引物对序列为：

Bi-07-F：AACACCTGAAGAACCGTTGGG

Bi-07-R：GTTCGTCTTCAAGGTACACTT

探针序列为：

Bi-07-P：TACAGCGCGTACATGCTGCAGCG。

在一个实施方式中，所述探针为Taqman探针。

在一个实施方式中，在探针的3’端连接有荧光淬灭基团，5’端连接有荧光报告基团。

在本发明，所述荧光淬灭基团可以为本领域通常使用的荧光淬灭基团，例如BHQ3、BHQ1、BHQ2或TAMRA等；所述荧光报告基团可以为本领域通常使用的荧光报告基团，例如FAM、HEX或VIC等。

在一个实施方式中，在探针的5’端连接有VIC，3’端连接有BHQ1。

一方面，本发明提供了用于通过微滴数字PCR方法检测双歧杆菌Bi-07的试剂盒，其中，所述试剂盒包括本发明的引物对和探针。

另一方面，本发明提供了通过微滴数字PCR方法检测双歧杆菌Bi-07的方法，所述方法包括使用本发明的引物对和探针或者本发明的试剂盒。

在一个实施方式中，所述数字PCR反应条件为：95°C预变性30 s; 95°C 15 s、60°C退火及延伸60 s，共进行40个循环；98°C加热10 min使酶失去活性；4°C保存。

在一个实施方式中，所述检测方法包括步骤：

(a) 微滴数字PCR体系配置；

(b) 提供微滴数字PCR反应的条件；

(c) 使用本发明的引物对和探针或试剂盒，通过微滴数字PCR方法进行核酸扩增反应和检测扩增产物。

数字PCR是一种基于单分子扩增以及原始反应分割的一种PCR扩增手段。数字PCR通过将原始的反应体系进行有限的大量分割，将参与扩增的组分和体系中的模板分配到单个的反应小体系中。通过PCR的扩增,当小的反应体系中存在有目标分子时，会产生扩増产物并释放荧光信号，反之，当体系中不存在目标分子时，该小反应体系为阴性。数字PCR技术作为一种新型的分子扩増方法,与实时荧光PCR相比，稳定性好，灵敏度更高。可实现对低丰度的基因组样品的精准检测。因此数字PCR可作为定性检测的一种有效的高灵敏度的检测手段。

本发明的数字PCR检测方法为微滴式数字PCR，该技术是基于油包水原理，将含有核酸分子的反应体系生成数万至数百万个微滴，经PCR扩增后，采用微滴分析仪对每个微滴进行检测，确定阳性微滴。本发明的方法巧妙地运用了PCR技术的核酸高效扩增、核酸杂交的特异性和荧光检测技术的快速和敏感性，具有很高的灵敏度、稳定性和重复性。使用本发明的微滴数字PCR检测方法，其简单、快速、特异且灵敏的特点适合用于双歧杆菌Bi-07的检测。

附图说明

图1是显示微滴数字PCR特异性扩增双歧杆菌Bi-07的结果；

图2是灵敏度检测结果，双歧杆菌Bi-07的检测灵敏度分别为模板浓度20×10^-7 μg/mL。

具体实施方式

通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于以下实施例。

实施例1

本实施例通过如下实验对双歧杆菌Bi-07的引物和探针进行了特异性验证。

所使用的主要检测仪器：

微量移液器(10 µL、100 µL、1000 µL，Eppendorf)、Electronic Pipette移液器（RAININ），离心机(5804R，Eppendorf)，核酸蛋白分析仪(DU640，Beckman)，微滴数字PCR仪器（Bio-rad）等。

检测用主要试剂：

脑心浸液肉汤（BHI）（北京陆桥技术股份有限公司），Droplet Generation Oilfor Probes（Bio-rad），ddPCR^TMSupermix for probes（Bio-rad），引物探针由生工生物工程股份有限公司合成。

为确保所设计引物及探针的菌株水平的特异性，本发明人使用了15株与双歧杆菌Bi-07亲缘关系较近的菌株作为非靶标菌株，其中包含4株双歧杆菌和其他11株不同种的乳酸菌作为非靶标菌株。

检测主要步骤。

（1）体系配置

微滴数字PCR扩增体系：Bio-Rad数字PCR平台反应体系总体积为20 µL，包括ddPCR^TMSupermix for probes10 µL、上下游引物各1.8 µL及探针0.5 µL、模板质粒DNA2 µL和ddH₂O 3.9 µL。

（2）检测用的引物对及探针

所使用的引物对序列为：

Bi-07-F：AACACCTGAAGAACCGTTGGG

Bi-07-R：GTTCGTCTTCAAGGTACACTT

探针序列为：

Bi-07-P：VIC-TACAGCGCGTACATGCTGCAGCG-BHQ1。

（3）微滴生成

使用RAININ Electronic Pipette移液器调至20 µL将（1）中所述的反应体系转移至Droplet Generator Cartridge(微滴生成卡)的Sample排孔中，并在oil排孔中加入70 µL的Droplet Generation Oil for Probes(微滴生成专用油)，加样过程中尽量避免产生气泡。完成后将微滴生成卡转移至QX200^TM Droplet Generator(微滴生成仪)中自动完成微滴的生成。

（4）微滴的PCR扩增

使用RAININ Electronic Pipette移液器调至40 µL将（3）中生成的微滴转移至96孔板中并在PX1^TM PCR Plate Sealer(热封膜仪)完成封膜后，转移至T100^TMThermalCycler中进行PCR扩增，反映参数为：95°C预变性30 s; 95°C 15 s、60°C 退火及延伸60 s，共进行40个循环；98°C加热10 min使酶失去活性；4°C保存。

（5）微滴荧光信号的读取

将（4）中的96孔板取出，置于QX200^TM Droplet Reader进行微滴的读取计数，分析热点图确定荧光阈值来计算阳性微滴数和阴性微滴数。

如图1所示，实验结果显示空白对照有极少量扩增，说明体系没有受到污染，且每个样品生成的微滴数量符合泊松分布计算的需要。阴性对照有极少量的扩增，表明该微滴数字PCR体系的引物及探针特异性良好，可以用于后续的实验。本方案建立的微滴数字PCR方法仅能够特异性扩增双歧杆菌Bi-07。

通过调整引物探针比例添加量建立的体系实验数据经微滴荧光值聚类分析后，最终确定体系的退火温度60°C，此时本体系扩增目的基因的阳性微滴和阴性微滴荧光平均差值相近且较大；在以上反应条件下，反应体系的荧光报告值高，阴性微滴和阳性微滴微滴荧光值集聚在同一值附近；阳性微滴和阴性微滴平均差值两两之间都比较大；微滴生成数量达到微滴数字PCR实验要求。

实施例 2

本发明的发明人通过如下步骤对体系灵敏度和重复性进行实验。

将DNA模板制成浓度为20 μg/mL的预混液后，按预混液、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9共10个梯度进行稀释，并在已经优化筛选出的微滴数字PCR反应体系中扩增，详细步骤同实施案例1。此外为了考察优化体系的稳定性，设置3组平行试验。同时为了评价人员操作对实验结果造成的差异，进行人员间的重复试验。

扩增结果如图2所示，使用已确定的最优体系参数进行灵敏度实验，实验结果表明本反应体系的荧光报告值高，阴性微滴和阳性微滴微滴荧光值集聚在同一值附近并且区分明显，微滴生成数量达到实验要求，经泊松分布计算并消除空白气溶胶污染得到Bi-07的检测灵敏度为模板浓度20×10^-7 μg/mL，相较于实时荧光PCR反应检测限提升了3个数量级，大大提高了反应的效率和灵敏度。经过两次以上的实验并更换实验人员后，得到的实验结果与预期一致，重现性好。

Claims

1.用于微滴数字PCR方法检测双歧杆菌Bi-07的核酸引物对及探针

其中所述引物对选自以下引物对：

Bi-07-F：AACACCTGAAGAACCGTTGGG

Bi-07-R：GTTCGTCTTCAAGGTACACTT

探针序列为：

Bi-07-P：VIC-TACAGCGCGTACATGCTGCAGCG-BHQ1。

2.根据权利要求1所述的寡核苷酸引物对及探针，其中所述数字PCR方法为微滴数字PCR法。

3.权利要求1所述的引物对和探针，其中，在探针的3’末端连接有荧光淬灭基团，5’末端连接有荧光报告基团。

4.权利要求3所述的引物对和探针，其中，所述荧光淬灭基团为BHQ、BHQ1、BHQ2或TAMRA，所述荧光报告基团为FAM、HEX或VIC。

5.用于通过微滴数字PCR方法检测双歧杆菌Bi-07的试剂盒，其中所述试剂盒包括权利要求1-4任一项所述的引物对和探针。

6.通过微滴数字PCR方法检测双歧杆菌Bi-07的方法，所述方法包括使用权利要求1-4任一项所述的引物对和探针或者权利要求5中所述的试剂盒，所述方法不用于疾病诊断和治疗目的。

7.权利要求6所述的方法，包括：

(a) 提供微滴数字PCR反应的条件；

(b) 使用权利要求1-4任一项所述的引物对和探针或权利要求5中所述的试剂盒，通过微滴数字PCR方法进行核酸扩增反应和检测扩增产物。

8.权利要求1-4任一项所述的引物和探针或者权利要求5中所述的试剂盒在检测双歧杆菌Bi-07的应用，所述应用不用于疾病诊断和治疗目的。