CN1203189C - 大豆疫霉的检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明大豆疫霉phytophthora.sojae的检测试剂盒属于农作物防病治病及植物检疫范畴。根据大豆疫霉ITS基因序列设计出了一对特异寡聚核苷酸引物，试剂盒包括：1mL检测溶液包括：0.05mmol Tris.Cl、0.125mmol KCl、0.005mmolMgCl2、0.01mmoldNTPs、上、下游引物0.25mmol、0.1mgBSA、Taq DNA聚合酶100单位，加入超纯水制备成1mL检测溶液。以此引物为基础的大豆疫霉检测试剂盒具较强的特异性、灵敏性及稳定性，为大豆疫霉检测提供了快速、灵敏、特异的技术方法。图为大豆疫霉的特异PCR产物。
Description
(一)技术领域
本发明大豆疫霉的检测试剂盒及其检测方法，属于生物技术领域。专用于海关进出境大豆所带大豆疫霉(Phytophthora sojae)的高灵敏度快速检测，同时可用于田间大豆疫病的早期诊断和病菌的监测。
(二)背景技术
大豆疫霉根腐病是由大豆疫霉菌(Phytophothora sojae)引起的，是分布广泛、危害极严重的土传性病害。是我国对外公布的A1类进境植物检疫对象。该病1948年首次发现于美国的印第安那州，1955年公开报道后，在世界大豆主产国巴西、阿根廷、加拿大等15个国家先后发现该病。仅在1989至1991年的3年中，大豆疫病在美国中北部的12个州即造成279万吨的产量损失，经济价值高达5.6亿美元。
1989年北京农业大学沈崇尧等首次在我国东北地区发现了大豆疫霉病菌，目前已在北京、山东、吉林、内蒙古等地发现了疫霉根腐病。黑龙江省植保站1997、1998两年对黑龙江省大豆疫病发生情况进行普查，结果表明仅黑龙江省发病面积已超过30万公顷，占全省大豆播种面积的15％。该病已由初发生阶段向盛发生阶段转化，是一个急需解决的问题。
近年来，我国从美国等有大豆疫霉分布的国家进口商品大豆日趋增多，每年从境外进口大豆的数量几乎超过了国产大豆的总量，其中经常夹带一定量的土壤。由于大豆疫霉是典型的土传真菌病害，卵孢子能在土壤中长期生存，因此进境大豆夹带的土壤中极有可能携带大豆疫霉病菌。国内外大豆的频繁贸易增加了大豆疫病传播扩散的风险，这种严峻的形势要求应尽快建立一套快速灵敏的检测方法。
虽然有直接从土壤分离和检测大豆疫霉的报道，但实际上，由于种植大豆的土壤中也往往含有大量的腐霉等腐生真菌，能选择性地抑制多种腐霉菌的恶疫灵(hymexazo)也强烈抑制大豆疫霉，因而从土壤中直接分离和检测大豆疫霉极为困难，成功率较小；种子也可能是大豆疫霉传播的途径之一，但从干燥甚至稍微阴干的带病大豆种子中分离不到病原，或需经2个月的湿冷处理才能使病种子中的卵孢子萌发，不适合检疫检验；酶联免疫荧光(ELISA)虽已广泛地应用于疫霉病害的检测和诊断，但所用抗体缺乏种的特异性，甚至能和某些腐霉和霜霉菌发生交叉反应，检测到的病原也有可能是死的，也不适合检疫检验；采用土壤浸泡后用大豆幼苗、子叶或叶碟(leaf disc)诱集(baiting)的方法可有效地检测到土壤中活的大豆疫霉，也是目前海关检疫部门的主要检测手段，但这种生物学检测方法约需15-20天，而且灵敏度低，每克土壤需含有50个以上的卵孢子，因此难以适合外检和内检的需求。
近年来，利用PCR扩增病原菌核糖体基因某一特异分子片断(internaltranscribed spacer ITS转录间隔区)进行病原菌鉴定、检测及病害诊断为国际上广泛使用。Moukhanedov等(1994)应用PCR扩增ITS基因区段诊断番茄枯萎病；Tatiana Volossiouk等(1995)用大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)特异引物直接进行了土壤微生物的检测。由于这种方法快速、准确和简便的特点，越来越受到各国病理学家的高度重视。迄今为止，关于大豆疫霉的分子检测技术国内外尚未见报道。
(三)发明内容
技术问题 本发明的目的是解决现有技术中大豆疫霉的生物学检测方法所需周期长(15-20天)、灵敏度低(50-100卵孢子/克土)的问题，提供大豆疫霉的检测试剂盒及其检测方法，对大豆疫霉进行PCR检测，准确性高、灵敏性高。
技术方案
大豆疫霉的检测试剂盒，由以下成分组成：
大豆疫霉的特异引物序列
上游(18bp)：5′CTGGATCATGAGCCCACT 3′(Pso1)
下游(16bp)：5′GCAGCCCGAAGGCCAC 3′(Pso2)
试剂盒反应体系
1mL检测溶液包括：0.05mmol Tris.Cl、0.125mmol KCl、0.005mmol MgCl2、0.01mmoldNTPs、上、下游引物0.25mmol、0.1mgBSA、Taq DNA聚合酶100单位，加入超纯水制备成1mL检测溶液。保存期限为1年
上述大豆疫霉的检测试剂盒用于检测大豆疫霉的方法，包括：
1)土壤中卵孢子的富集：
取待检土壤样品20-100克，研碎，先后采用200目筛网去除较大土粒，然后经过400、500、800目筛网过滤，同时用3-10升水反复冲洗，从800目筛网上收集卵孢子，用1ml水悬浮。由于卵孢子不能透过800目筛网，这样处理可以达到使卵孢子富集的效果。
2)从微量卵孢子中提取DNA：
将用无菌水悬浮的卵孢子转移到1.5mL的离心管中，在12000r.min-1转速下离心5分钟，弃上清；
加入50μL CTAB buffer，研磨，再加入500μL CTAB buffer，水浴30分钟；
加入等体积氯仿抽提，在12000r.min-1转速下离心10分钟，吸取上清；
加入1/10体积的3M NaAc，2倍体积的无水冰乙醇，室温沉淀30分钟，12000r.min-1转速下离心10分钟，弃上清；
加1mL 70％(V/V)乙醇洗涤，12000r.min-1转速下离心10分钟，弃上清，晾干至无酒精味；
加10μL无菌双蒸水溶解，用于PCR扩增。
3)大豆疫霉的PCR检测
取1μL DNA溶液，加入9μL试剂盒溶液和15μL灭菌去离子水，总体积为25μL；
PCR扩增程序为94℃变性5分钟，94℃变性1分钟；58℃退火30秒；72℃延伸1分钟；35个循环，最后72℃延伸10分钟。
扩增产物的电泳检测：取10μL PCR扩增产物，在1％(重量/体积)的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压为50-100V，30分钟后在紫外光下检测结果。如果存在分子量约为330bp的DNA条带，则证明所检病原为大豆疫霉。
有益效果 本发明与现有技术相比，其优点和积极效果表现在：
(1)实用性好：用卵孢子富集的方法检测含卵孢子土壤具重要的实际应用价值。大豆疫霉随贸易往来最可能的传播途径是随大豆中的尘土传播，在贸易口岸中，检疫部门也正是通过检测口岸大豆尘土中是否存在卵孢子作为重要指标。但事实上，在贸易口岸中截获的“土壤”中，不可能含很多的卵孢子，因此海关目前所用的大豆叶碟法很难有效地进行检测。此外目前的方法由于需要将病原菌卵孢子萌发、诱捕、分离鉴定等过程，需要约15-20天的时间，根本无法满足海关检疫的需要。为了使我们的检测方法更具有实际应用价值，我们在检测方法上作了如下改进，随机取30-50g带菌土样。把土壤碾碎以后，先用200目筛网除去较大的颗粒，再过400目筛网，最后用500、800目筛网加水冲洗，由于卵孢子不能透过800目筛网，这样通过700目筛网达到了使卵孢子富集的效果，富集以后的土壤经过核酸抽取后直接进行PCR扩增，可在1天之内达到对大豆疫霉的检测。因此本方法大大提高了检测效率。
(2)准确性高：由于传统大豆疫霉检测技术只是根据形态特征来确定检疫对象，无法排除人为因素的干扰，很难区分形态相近种，检测准确性只有60-80％；而本发明根据大豆疫霉的核糖体基因转录间隔区(Internal TranscribedSpacer)的英文缩写为ITS(Genbank登录号)序列，同时包含保守与变异序列，利用Bioedit软件对这些DNA序列进行比较，选定的大豆疫霉特有的一段保守序列做特异引物。能根据变异序列设计特异性引物进行扩增比较，为病原菌的鉴定和检测提供了很好的靶位点。经过与大豆疫霉近似种以及其他不同植物病原菌的比较，该引物的准确率为100％。
(3)灵敏度高：传统大豆疫霉检测技术首先要进行卵孢子的萌发，释放游动孢子后再进行诱捕，由于大豆疫霉菌卵孢子萌发率只有10-30％，因此只有土壤中卵孢子量超过每克土50-100个时才有可能检出。本发明提供的大豆疫霉的特异引物检测方法及其高效准确的检测试剂盒，由于可以有效的富集卵孢子，而且.PCR扩增的高灵敏度，使得本研究的方法可以有效地从每克含有0.1-0.2个卵孢子的土壤中检测出卵孢子。
(四)说明书附图
图1大豆疫霉的特异PCR产物
以设计的大豆疫霉的特异引物对21个真菌菌株进行PCR检测，只在3个大豆疫霉菌株检测到扩增产物(1，2，6道)，其余菌株均无扩增产物。7道为阴性对照。
图2大豆感病组织的检测结果 以大豆感病组织的DNA为模板，利用特异引物进行PCR检测，可稳定的扩增出330bp的特异带
图3大豆疫霉游动孢子检测结果 以游动游动孢子的DNA为模板，利用特异引物进行PCR检测，可稳定地扩增出330bp的特异带。2道、4道分别为5个、4个卵孢子DNA做模板
具体实施方式
实施例1土壤样品中检测大豆疫霉
大豆疫霉检测试剂盒，包括以下成分：
大豆疫霉的特异引物序列
上游(18bp)：5′CTGGATCATGAGCCCACT 3′(Pso1)
下游(16bp)：5′GCAGCCCGAAGGCCAC 3′(Pso2)
试剂盒反应体系
1mL检测溶液包括：0.05mmol Tris.Cl、0.125mmol KCl、0.005mmol MgCl2、0.01mmoldNTPs、上、下游引物0.25mmol、0.1mgBSA、Taq DNA聚合酶100单位，加入超纯水制备成1mL检测溶液。该溶液储存于-20℃冰箱。保存期限为1年实例1从海关进境大豆带菌土样中检测大豆疫霉：
上述大豆疫霉检测试剂盒用于检测大豆疫霉的方法，包括：
1)土壤中卵孢子的富集：
取待检土壤样品20-100克，研碎，先后采用200目筛网去处较大土粒，然后经过400、500、800目筛网过滤，同时用3-10升水反复冲洗，从800目筛网上收集卵孢子，用1ml水悬浮。由于卵孢子不能透过800目筛网，这样处理可以达到使卵孢子富集的效果。
2)从微量卵孢子中提取DNA：
将用无菌水悬浮的卵孢子转移到1.5mL的离心管中，在12000r.min-1转速下离心5分钟，倒出液体；
加入50μL CTAB buffer，研磨，再加入500μL CTAB buffer，水浴30分钟；
加入等体积氯仿抽提，在12000r.min-1转速下离心10分钟，吸取上清；
加入1/10体积的3M NaAc，2倍体积的无水冰乙醇，室温沉淀30分钟，12000r.min-1转速下离心10分钟，倒干液体；
加1mL 70％(V/V)乙醇洗涤，12000r.min-1转速下离心10分钟，倒干液体，晾干至无酒精味；
加10μL无菌双蒸水溶解，用于PCR扩增。
3)大豆疫霉的PCR检测
取1μL DNA溶液，加入9μL试剂盒溶液和15μL灭菌去离子水，总体积为25μL；
PCR扩增程序为94℃变性5分钟，94℃变性1分钟；58℃退火30秒；72℃延伸1分钟；35个循环，最后72℃延伸10分钟。
扩增产物的电泳检测：取10μL PCR扩增产物，在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压为50-100V，30分钟后在紫外光下检测结果。如果存在分子量约为330bp的DNA条带，则证明所检病原为大豆疫霉。图1
实例2 从污染水中检测大豆疫霉的游动孢子
取大豆疫霉污染的灌溉水500mL，在6000g的离心力下离心20min，倒去上清液，沉淀的游动孢子用100uL水悬浮，转入1.5mL离心管，加入0.05g石英砂，涡旋震荡10sec，取1uL做游动孢子破碎液为模板可百分之百得到特异扩增产物。其中以2-3μl模板PCR模板，按照实施例1的方法进行基因扩增，可以扩增出大豆疫霉特有的片断。图2
注意的是：利用此法进行检测需注意最好上样前进行破碎，破碎液不宜长时间放置。此法检测灵敏度为每毫升污染水中含有0.1-1个游动孢子。
实例3 从发病大豆组织中鉴定大豆疫霉
将有水浸状病斑的大豆叶片或根茎部位用70％酒精消毒后，采用CTAB法或者碱裂解法提取DNA，吸取1uLDNA溶液，按实施例1的方法，进行PCR扩增，电泳检测扩增产物，如果为大豆疫霉侵染引起的疫病，则可见一条清晰的分子量为330bp的特异性条带，结果见图3。
Claims (2)
1、大豆疫霉检测试剂盒，由以下成分组成：
大豆疫霉的特异引物序列
上游：5′CTGGATCATGAGCCCACT 3′
下游：5′GCAGCCCGAAGGCCAC 3′
试剂盒反应体系
1mL检测溶液包括：0.05mmol Tris.Cl、0.125mmol KCl、0.005mmol MgCl2、0.01mmoldNTPs、上、下游引物0.25mmol、0.1mgBSA、Taq DNA聚合酶100单位，加入超纯水制备成1mL检测溶液。
2、权利要求1所述大豆疫霉检测试剂盒用于检测大豆疫霉的方法，包括：
1)土壤中卵孢子的富集：
取待检土壤样品20-100克，研碎，先后采用200目筛网去除较大土粒，然后经过400、500、800目筛网过滤，同时用3-10升水反复冲洗，从800目筛网上收集卵孢子，用1ml水悬浮；
2)从微量卵孢子中提取DNA：
将用无菌水悬浮的卵孢子转移到1.5mL的离心管中，在12000r.min-1转速下离心5分钟，弃上清；
加入50μL CTAB buffer，研磨，再加入500μL CTAB buffer，水浴30分钟；
加入等体积氯仿抽提，在12000r.min-1转速下离心10分钟，吸取上清；
加入1/10体积的3M NaAc，2倍体积的无水冰乙醇，室温沉淀30分钟，12000r.min-1转速下离心10分钟，弃上清；
加1mL 70％乙醇洗涤，12000r.min-1转速下离心10分钟，弃上清，晾干至无酒精味；
加10μL无菌双蒸水溶解，用于PCR扩增；
3)大豆疫霉的PCR检测
取1μL DNA溶液，加入9μL试剂盒溶液和15μL灭菌去离子水，总体积为25μL；
PCR扩增程序为94℃变性5分钟，94℃变性1分钟；58℃退火30秒；72℃延伸1分钟；35个循环，最后72℃延伸10分钟；
扩增产物的电泳检测：取10μL PCR扩增产物，在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压为50-100V，30分钟后在紫外光下检测结果：如果存在分子量约为330bp的DNA条带，则证明所检病原为大豆疫霉。
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