CN103397089A - 一种用于染色体数目异常快速检测的半特异性扩增引物组、方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于染色体数目异常快速检测的半特异性扩增引物组、试剂盒及方法。本发明中涉及两组扩增引物。本发明中试剂盒由以下组成：10*PCR缓冲液；ddH2O；dNTP混合液；PlatinumPfxDNA聚合酶(2.5U/μl)；扩增引物1引物对，均25μM/μl；扩增引物2；纯化buffer(QIAGENMinElutePCRPurificationKit)。本发明的另一个目的在于提供一种利用半特异性扩增引物组快速鉴定染色体数目异常的方法。利用本发明，可以快速检测出染色体数目异常。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及生物技术和医学，具体涉及一组针对基因组长散在元件（Long Interspersed Elements，LINE）进行半特异性扩增的引物，及以该引物组为核心的快速构建DNA测序文库的方法,同时涉及一种染色体数目异常检测的试剂盒与方法。
背景技术
上世纪70年代中期Frederick Sanger发明了Sanger双脱氧链终止法（Chain Termination Method）[1]，使得直接检测DNA序列成为了可能。其通过一个聚合酶连锁反应（PCR）来完成测序过程。通过随机加入ddATP、ddGTP、ddCTP和ddTTP四种双脱氧核糖核苷酸使得PCR扩增出不同长度的片段，通过对片段末端双脱氧核糖核苷酸种类的检测从而检测出原DNA样品的序列。该方法经过不断的改进与完善，逐渐成为了当时主流的测序方法，即第一代测序技术。然而传统的第一代测序方法存在着通量小、周期长、成本高等诸多缺陷，已经不能满足研究以及应用的需要。随着科学水平的发展，DNA测序技术也有了质的变革。以Roche/454FLX、Illumina/HisSeq以及Applied BiosystemSOLID system三大平台为代表的第二代测序技术得到了充分的发展。第二代测序技术的核心思想是边合成边测序，并且通过不同的手段检测末端的标记来确定DNA序列。DNA测序的费用越来越低，测序通量越来越高，测序速度越来越快。以Illumina/HisSeq为例，Genome Analyzer的通量由最开始的50 M序列到后期改进后提高到300M序列，而目前最为成熟的HisSeq 2000 每次运行的通量可达300G，而人的基因组的碱基含量约为3G。换句话说，即便每个人测100G的数据，HisSeq 2000运行一次也可以检测3个人的全基因组序列。
随着成本的降低，通量的提高以及测序技术指标的提升，测序技术已从单纯应用于研究开始越来越多地应用于实际，尤其是应用于临床医学领域。单基因病的检测，染色体数目异常检测等，个体化用药指导等等均是在高通量测序的基础上加以实现的。如对于慢性骨髓白血病非常有疗效的甲磺酸（Gleevec）就是通过检测测序并根据其所含信息被人们所发现的[2]。这些大多是针对出生后个体而言，对于胎儿相关疾病的筛查也有了长足进步。这一方面取决于孕妇外周血中胎儿游离DNA的存在[3]，另一方面取决于高通量测序技术的发展。以检测孕妇外周血中游离DNA序列为核心，开发出了多种无创筛查胎儿疾病的方法，如鉴定RH血型、染色体拷贝数异常、大片段的染色体结构异常等[4-5]。
目前临床上应用测序技术检测疾病的过程主要分为三部分：样品获得及文库制备、测序、数据分析三个部分。具体而言，样品主要为病人外周血或其他组织材料；文库制备则主要包含DNA提取，修补平末端，3’端加A，与3’端带有T的接头连接，以及PCR扩增形成文库；测序则是指将建好的测序文库在第二代测序仪上进行测序的过程；最后得到的测序序列通过比对以及其他各种生物学模型分析，得出结论。
长散在元件（Long Interspersed Elements，LINE）是在真核细胞基因组中大量存在的一组元件。人类基因组中约有17%为LINEs。该元件的核苷酸序列具有非常高的相似性，并且在基因组各个染色体上均有大量的拷贝存在。因此一对特定的引物可以将大部分LINE扩增出来[6-7]。为了进一步降低成本，提高通量以及检测精确度，我们根据LINE元件多拷贝性以及广泛分布在各个染色体上的特点发明了一种利用测序技术检测大范围的染色体数目异常的方法。该方法不仅适用于出生后个体的大范围染色体结构变异以及染色体数目异常检测，同时也可以实现胎儿无创的染色体数目异常检测。具体而言，我们通过遍历整个人类基因组的参考序列，寻找到LINEs序列，针对LINEs区域设计探针，通过两步PCR完成DNA富集以及文库构建的过程，并且通过后续的生物信息学分析，检测整个染色体水平的数目异常。由于是检测部分基因组信息，因此在相同通量下，对目的区域可以有更深的测序深度，无论是对个体DNA而言还是对孕妇外周血中游离的胎儿DNA而言都可以更精确、简便地检测染色体异常。
参考文献
[1]. Sanger, F. and A.R. Coulson, A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol, 1975. 94(3): p. 441-8.
[2]. Druker, B.J., Imatinib alone and in combination for chronic myeloid leukemia. Semin Hematol, 2003. 40(1): p. 50-8.
[3]. Lo, Y.M., et al., Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet, 1997. 350(9076): p. 485-7.
[4]. Lun, F.M., et al., Noninvasive prenatal diagnosis of monogenic diseases by digital size selection and relative mutation dosage on DNA in maternal plasma. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008. 105(50): p. 19920-5.
[5]. Fan, H.C. and S.R. Quake, Sensitivity of noninvasive prenatal detection of fetal aneuploidy from maternal plasma using shotgun sequencing is limited only by counting statistics. PLoS One, 2010. 5(5): p. e10439.
[6]. Cordaux R, Batzer MA, The impact of retrotransposons on human genome evolution. Nature Reviews Genetics 10, 691-703 (October 2009)
[7]. AS Yang, MRH Estécio, A simple method for estimating global DNA methylation using bisulfite PCR of repetitive DNA elements. Nucl. Acids Res. (2004) 32 (3): e38。
发明内容
本发明的首要目的是提供一组可以用于染色体数目异常检测的半特异性扩增引物。
本发明的另一个目的在于提供一种利用半特异性扩增引物组快速鉴定染色体数目异常的方法。
本发明的又一个目的在于提供一种含有半特异性扩增引物组的试剂盒。
本发明立足于生物信息学的最新进展，以人类基因组中的长散在元件替代全基因组进行检测分析。将长散在元件内的SNP位点信息重定位到染色体上。通过比对查询长散在元件序列及区域内SNP位点情况，设计并验证了如下两组引物：
1、长散在元件序列扩增引物
正向引物1a：
5’-GGCTATAAACGCAGGCCACTCNNNNNNNNNNNNNNNNNGGGAGGGGAACATCACAC-3’
正向引物1b：
5’-GGCTATAAACGCAGGCCACTCBDVHBDVHBDVHBDVHBDVHGGGAGGGGAACATCACAC-3’
反向引物1：
5’-TCTGAGGAATCAGCAATGCAGCGATCATGGTGGTTTGCTGCA-3’
其中N、B、D、V、H为简并碱基
2、文库构建引物
正向引物2：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGGCTATAAACGCAGGCCACTC-3’
反向引物2：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNTCTGAGGAATCAGCAATGCAGCGAT-3’
其中NNNNNNNN为特定碱基，为样本的标签序序列，不同样本标签序列不同。用于对不同样本加入标签以便于后续分析。
本发明的染色体数目异常的检测方法包括以下步骤：
A.对现场采集的样本进行常规DNA抽提，得到的DNA为待检测样品
B.利用第一组PCR引物，扩增目标序列
第一轮PCR引物
正向引物 1a ：
5’-GGCTATAAACGCAGGCCACTCNNNNNNNNNNNNNNNNNGGGAGGGGAACATCACAC-3’
或正向引物 1b：
5’-GGCTATAAACGCAGGCCACTCBDVHBDVHBDVHBDVHBDVHGGGAGGGGAACATCACAC-3’
反向引物1：
5’-TCTGAGGAATCAGCAATGCAGCGATCATGGTGGTTTGCTGCA-3’
C.QIAGEN MinElute PCR Purification Kit洗脱第一轮扩增引物洗脱纯化第一轮扩增产物
D.利用第二组PCR引物，对不同样本选取不同index标签进行第二轮PCR
第二轮PCR引物
正向引物2：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGGCTATAAACGCAGGCCACTC-3’
反向引物2：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNTCTGAGGAATCAGCAATGCAGCGAT-3’
E.QIAGEN MinElute PCR Purification Kit洗脱纯化第二轮扩增产物
F.通过real time PCR 确定两轮PCR产物含量
G.对测序文库进行测序，并通过比对等生物信息学的常规方法对测序结果进行分析，通过student t检验的T值判断判断染色体是否具有数目异常
其中，所述PCR扩增条件为：
第一轮PCR：94℃预变性2分钟，然后进入循环94℃变性10s，55℃退火两分钟，72℃延伸两分钟，进行3个循环
第二轮PCR：94℃预变性2分钟，然后进入循环98℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸15s，进行12个循环，最后72℃延伸5分钟
PCR产物通过real time PCR确定含量即可。
本发明快速构建测序文库的试剂盒包含组分及含量如下：
溶液A：MgSO4（25 mM/μl）；
溶液B：dNTP混合液（5 mM/μl）；
溶液C：Platinum Pfx DNA 聚合酶(2.5 U/μl)；
溶液D：含扩增引物1正向引物中的一对。均为25 μM/μl
正向引物 1a
5’-GGCTATAAACGCAGGCCACTCNNNNNNNNNNNNNNNNNGGGAGGGGAACATCACAC-3’
正向引物 1b
5’-GGCTATAAACGCAGGCCACTCBDVHBDVHBDVHBDVHBDVHGGGAGGGGAACATCACAC-3’
反向引物1
5’-TCTGAGGAATCAGCAATGCAGCGATCATGGTGGTTTGCTGCA-3’
溶液E：含扩增引物2
正向引物2
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGGCTATAAACGCAGGCCACTC-3’
反向引物2
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNTCTGAGGAATCAGCAATGCAGCGAT-3’
溶液F：纯化试剂盒 QIAGEN MinElute PCR Purification Kit
溶液G：ddH2O
反向引物2中N为特定碱基，用于对不同的样本加上不同的标签。
本发明的半特异性扩增引物可以对人类基因组进行部分扩增，使得研究分析中的背景更小，从而研究基因组染色体缺陷更加简单快速。
本发明的染色体数目异常的检测方法具有以下优点：
1、相对于3G位点的全基因组检测，半特异性扩增的区域不到1M个位点，因此在相同的测序数据量的情况下，本发明具有更高的测序深度，平均测序深度为全基因组测序的3千倍，由于测序深度的提高，因此大大降低了后期数据分析过程中的背景噪音
2、建库时间更短，提高了检测的周期。建库由传统的6-8个小时缩短为3-4个小时
3、建库成本相对于传统建库过程而言，降低了50%左右
4、本发明的方法可以通过不同的标签同时对多个样本进行分析
本发明文库构建试剂盒可以快速的完成测序文库的构建过程。
附图说明
图1为第一轮PCR后预期扩增目的片段分布图。
图2为两轮PCR建库后Agilent 2100 生物分析仪质量检测分布图，由图可知在第二轮PCR后大部分片段在240-260 bp左右。在241 bp处存在一个峰，物质的量浓度为1.5 ng/μl，摩尔浓度为8.4 nmol/l；在259 bp处存在一个峰，物质的量浓度为1.09 ng/μl，摩尔浓度为5.8 nmol/l；Lower marker 片段大小为15 bp，物质的量浓度为4.20 ng/μl，摩尔浓度为424.2 nmol/l；Upper Marker 片段大小为1500 bp，物质的量浓度为2.10 ng/μl，摩尔浓度为2.1 nmol/l。
图3为两轮PCR建库后文库凝胶电泳图,Marker为DL2000。由图可知在250-300 bp处有一个明显的条带与Agilent 2100 生物分析仪检测结果一致。
图4为统计结果图。正常样本的T值均在3以内，而异常样本相应染色体上的T值则均在3以上。图中其中T表示三体，Chr表示正常二倍体。
图5为孕妇外周血检测胎儿染色体异常统计结果图。其中T21表示为21三体，Chr21表示正常的21二倍体。
图6为引物对的设计结构图。其中区域A为嫁接引物接头，区域B为非特异扩增区域，区域C为特异扩增区域,区域D为连接序列，区域E为样本标签序列。
具体实施方式
下面结合一些具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施范例仅用于进一步说明本发明，并不用于限制本发明的范围。任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施范例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例 1 LINEs区域引物的的获得
本专利设计了一组特别的引物，该引物在PCR退火的时候可以结合到一系列基因组上的LINEs区域。同时保证了一定的特异SNP位点多态性的存在,可以用来定位某一个扩增片段在原基因组中的相对位置。
通过www.repeatmasker.org提供的Repeat Library，提取所有LINEs的区域，并且在全基因组中通过BWA算法，在提取的LINEs区域内搜索长度在130 bp-180 bp长度的片段，该片段要满足以下条件：该片段区域内的SNP位点个数包含10-20个。接后续手动逐一筛选，我们选取了其中一个区域作为实施例。并设计了一对引物如下：
正向引物1a
5’-GGCTATAAACGCAGGCCACTCNNNNNNNNNNNNNNNNNGGGAGGGGAACATCACAC-3’
或正向引物1b
5’-GGCTATAAACGCAGGCCACTCBDVHBDVHBDVHBDVHBDVHGGGAGGGGAACATCACAC-3’
反向引物1
5’-TCTGAGGAATCAGCAATGCAGCGATCATGGTGGTTTGCTGCA-3’
引物对的设计结构为：B、D、V、H及N为简并碱基。
正向引物中5’端引物序列GGCTATAAACGCAGGCCACTC与反向引物5’端引物序列TCTGAGGAATCAGCAATGCAGCGAT用于第二轮PCR扩增以及与测序引物连接。
根据以上扩增产物以及测序flowcell的嫁接引物，设计了建库引物如下：
正向引物2
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGGCTATAAACGCAGGCCACTC-3’
反向引物2
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNTCTGAGGAATCAGCAATGCAGCGAT-3’
其中NNNNNNNN为特定碱基，为样本的标签序序列，不同样本标签序列不同。用于对不同样本加入标签以便于后续分析。
引物对的设计结构如图6所示，区域A为嫁接引物接头，区域B为非特异扩增区域，区域C为特异扩增区域，区域D为连接序列，区域E为样本标签序列。
应注意实施例1中所列引物仅为此方法中的一个应用的结果，凡与本发明的精神和原则之内，对引物的任何修改、替换、 改进等，及通过本思路获得的特异区域引物均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例 2 染色体数目异常的检测方法
本发明的检测方法可以用于，但是不限于成人13三体、18三体、21三体等染色体数目异常，还可通过对孕妇外周血分析，无创检测胎儿的染色体数目异常。
1、 样品DNA的提取：
在本实施例中，总共抽取了8个母体血液样品（样品编号分别为：S_042、S_053、S_055、S_058、S_064、S_066、S_071、S_078）。每个样本各抽取外周血5 ml，经两次4℃高速离心后得到了去除了血细胞的血浆样品。对血浆样品使用Qiagen公司生产的DNA抽提试剂盒提取，也可以使用其他常规DNA提取方法提取。
2、 文库构建：
目的片段扩增：选取正向引物1b及反向引物1进行目的片段扩增。将上步产物13.2 μl与本发明试剂盒溶液A、B、C、D、G 配成50 μl PCR反应体系（10*PCR缓冲溶液 5 μl，Platinum Pfx DNA 聚合酶(2.5 U/μl) 0.8 μl，dNTP (10 mM) 2 μl，MgSO4 (50 mM) 2 μl,扩增引物对1（本实施例使用正向引物1b与反向引物1）各1 μl，ddH2O 25 μl，模板DNA 13.2 μl）。通过PCR仪进行第一轮DNA扩增，程序为：94℃预变性2分钟，然后进入循环94℃变性10s，55℃退火两分钟，72℃延伸两分钟，进行3个循环。
洗脱纯化：QIAGEN MinElute PCR Purification Kit洗脱第一轮扩增产物。将纯化产物稀释到20μl溶液A中。
建库PCR扩增：将上述产物与溶液A、B、C、E、G 配成50 μl PCR反应体（10*PCR缓冲溶液 5 μl，Platinum Pfx DNA 聚合酶 0.8 μl，dNTP (10 mM) 2 μl，MgSO4 (50 mM) 2 μl, 扩增引物对2（正向引物2及反向引物2）各1 μl，ddH2O 18.2 μl，模板DNA 10 μl）。通过PCR仪进行第二轮DNA扩增，程序为：94℃预变性2分钟，然后进入循环94℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸15s，进行12个循环，最后72℃延伸5分钟。
再次洗脱纯化：将第二轮扩增产物用QIAGEN MinElute PCR Purification Kit纯化。将纯化产物洗脱到20 μl溶液A中，完成文库构建工作。
取1 μl 文库，通过Agilent 2100 生物分析仪评估文库构建质量。
3、 上样与测序。
Illumina的cBot仪器将测序文库中DNA分子制成DNA簇，生成的DNA簇在Illumina Hiseq2000测序仪上进行37个循环的双端测序。
4、 结果分析。
在得到测序结果后，通过测序序列上的特异位点，将测序序列进行hg19比对，比对到基因组特定区域上。通过唯一比对的序列所在位置可以确定DNA片段位于几号染色体。
通过对比对结果进行统计分析计算并确定待测染色体的拷贝数。对于每个样本计算每条染色体上的覆盖度。每条染色体上的覆盖度为覆盖到该染色体上的UR数目除以该样本全部的UR数目。
Read：利用二代测序技术得到的具有一定长度的DNA序列。
UR：Unique Read，唯一比对到基因组上一个位置的Read。
计算每条染色体上的覆盖度，并选取12、22号染色体作为对照，表1中列出了每个样本中12、21、22号染色体的覆盖度。
通过计算每个样本的T值来判断每一条染色体的拷贝数。其中T值的计算公式为：
其中
为实际T值，x为样本覆盖度，μ为平均值，
为方差，n-1为样本自由度。
表2中列出了每个样本中12、17、21、22号染色体的T值。
正常情况下，T值的绝对值小于3为正常实验误差，当T值得绝对值大于3时，认为误差为样本误差，即该样本的该条染色体拷贝数存在异常。如表2所示，样本S_053和S_058的第21号染色体的T值分别为7.48和5.24，均大于分界值3，可以判断这两个样本均为21三体（羊膜穿刺结果均确诊为21号染色体3体）。
实施例3 试剂盒的制备
以实施例1得到的第一轮特异性扩增引物：
正向引物1a：
5’-GGCTATAAACGCAGGCCACTCNNNNNNNNNNNNNNNNNGGGAGGGGAACATCACAC-3’
或正向引物1b：
5’-GGCTATAAACGCAGGCCACTCBDVHBDVHBDVHBDVHBDVHGGGAGGGGAACATCACAC-3’
反向引物1：
5’-TCTGAGGAATCAGCAATGCAGCGATCATGGTGGTTTGCTGCA-3’
引物对的设计结构为如图6所示。
以实施例1得到的用于测序文库制备所设计的引物：
正向引物2：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGGCTATAAACGCAGGCCACTC-3’
反向引物2：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNTCTGAGGAATCAGCAATGCAGCGAT-3’
其中，两组引物对中的B、D、V、H及N为简并碱基。反向引物2中NNNNNNNN为特定碱基，为样本的标签序序列，不同样本标签序列不同。用于对不同样本加入标签以便于后续分。
如图6所示，其中区域a与b为嫁接引物接头，区域5为样本标签序列，区域1与4为连接序列，区域2为可变区域，区域3为特异扩增区域。
试剂盒采用以下常规PCR中的常用试剂：
dNTPs混合液；
10*PCR缓冲液；
ddH2O；
Platinum Pfx DNA 聚合酶(2.5 U/μl)；
纯化buffer(QIAGEN MinElute PCR Purification Kit)。
其中，10*PCR缓冲液组成如下：
250 mM TrisHCl；
100 mM (NH4)2SO4；
100 mM KCl；
1.5% Triton X-100；
20 mM MgCl2；
pH9.0
将上述试剂按照一定比例配置A、B、C、D、E、F六种溶液其相应组分与编号如下：
溶液A：反应缓冲液（10*PCR反应缓冲也，ddH2O）；
溶液B：dNTP混合液；
溶液C：Platinum Pfx DNA 聚合酶(2.5 U/μl)；
溶液D：扩增引物1正向引物中的一对。均为25 μM/μl；
溶液E：扩增引物2(根据样本不同，标签不同)；
溶液F：纯化试剂盒 QIAGEN MinElute PCR Purification Kit。
构建文库时，先利用溶液ABCDG进行第一轮PCR扩增，50 ul体系（10*PCR缓冲溶液 5 μl，Platinum Pfx DNA 聚合酶(2.5 U/μl) 0.8 μl，dNTP (10 mM) 2 μl，MgSO4 (50 mM) 2 μl，扩增引物对1 各1 μl，ddH2O 25 μl，模板DNA 13.2 μl），利用溶液F洗脱第一轮PCR过程中残留引物，在利用溶液ABCEG进行第二轮PCR扩增，50 ul体系（10*PCR缓冲溶液 5 μl，Platinum Pfx DNA 聚合酶 0.8μl，dNTP (10 mM) 2 μl，MgSO4 (50 mM) 2 μl，扩增引物对2 各1 μl，ddH2O 18.2 μl，模板DNA 10 μl）。反应体系分别按照上述PCR热循环程序进行扩增即可。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说， 本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (28)
1.一种用于染色体数目异常快速检测的半特异性扩增引物组，其特征在于：
（1）第一轮扩增中选取正向引物1a 或正向引物1b为正向引物，选取反向引物1为反向引物；
正向引物1a：
5’-GGCTATAAACGCAGGCCACTCNNNNNNNNNNNNNNNNNGGGAGGGGAACATCACAC-3’
正向引物1b：
5’-GGCTATAAACGCAGGCCACTCBDVHBDVHBDVHBDVHBDVHGGGAGGGGAACATCACAC-3’
反向引物1：
5’-TCTGAGGAATCAGCAATGCAGCGATCATGGTGGTTTGCTGCA-3’
其中N、B、D、V、H为简并碱基
（2）第二轮扩增中选取正向引物2与反向引物2
正向引物2：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGGCTATAAACGCAGGCCACTC-3’
反向引物2：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNTCTGAGGAATCAGCAATGCAGCGAT-3’
其中NNNNNNNN为特定碱基，为样本的标签序序列，不同样本标签序列不同。
2.如权利要求1所述的引物组，其特征在于，其中第一轮引物组用于初步富集扩增模版DNA并加入连接序列。
3.如权利要求1所述的引物组，其特征在于，第一轮扩增正向引物中连接序列为GGCTATAAACGCAGGCCACTC。
4.如权利要求2所述的引物组,其特征在于,第一轮扩增中正向引物1a中NNNNNNNNNNNNNNNNNGGGAGGGGAACATCACAC为目的片段扩增区域。
5.如权利要求4所述的引物组，其特征在于,第一轮扩增中正向引物1a中特异性序列为GGGAGGGGAACATCACAC，非特异性扩增序列为NNNNNNNNNNNNNNNNN。
6.如权利要求2所述的引物组，其特征在于，第一轮扩增中正向引物1b中BDVHBDVHBDVHBDVHBDVHGGGAGGGGAACATCACAC为目的片段扩增区域。
7.如权利要求6所述的引物组，其特征在于，第一轮扩增中正向引物1b中GGGAGGGGAACATCACAC为特异性序列，非特异性扩增序列为BDVHBDVHBDVHBDVHBDVH。
8.如权利要求1所述的引物组，其特征在于，第一轮扩增中反向引物中连接序列为TCTGAGGAATCAGCAATGCAGCGAT。
9.如权利要求1所述的引物组，其特征在于，第一轮扩增中反向引物中目的片段特异性扩增区域为CATGGTGGTTTGCTGCA。
10.如权利要求1所述的引物组,其特征在于,第二轮扩增引物为文库建构引物。
11.如权利要求1所述的引物组,其特征在于,正向引物2中AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC为嫁接引物接头。
12.如权利要求1所述的引物组,其特征在于,正向引物2中GGCTATAAACGCAGGCCACTC为连接序列。
13.如权利要求1所述的引物组,其特征在于,反向引物2中CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT为嫁接引物接头。
14.如权利要求1所述的引物组，其特征在于，反向引物2中NNNNNNNN为样本标签序列。
15.如权利要求1所述的引物组,其特征在于,反向引物2中TCTGAGGAATCAGCAATGCAGCGAT为连接序列。
16.如权利要求1所述的引物组，其特征在于，两轮扩增中的B、D、V、H及N为简并碱基。
17.一种用于快速检测染色体数目异常的方法，其特征在于，该检测方法包括以下步骤：
A.对现场采集的样本进行常规DNA抽提，得到的DNA为待检测样品；对血浆样品可以经两次4℃高速离心后得到去除了血细胞的血浆样品
B.利用第一组PCR引物，扩增目标序列；
第一轮PCR引物
正向引物1a：
5’-GGCTATAAACGCAGGCCACTCNNNNNNNNNNNNNNNNNGGGAGGGGAACATCACAC-3’
或正向引物1b：
5’-GGCTATAAACGCAGGCCACTCBDVHBDVHBDVHBDVHBDVHGGGAGGGGAACATCACAC-3’
反向引物1:
5’-TCTGAGGAATCAGCAATGCAGCGATCATGGTGGTTTGCTGCA-3’
C.洗脱纯化第一轮扩增产物；
D.利用第二组PCR引物，对不同样本选取不同index标签进行第二轮PCR；
第二轮PCR引物
正向引物2:
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGGCTATAAACGCAGGCCACTC-3’
反向引物2:
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNTCTGAGGAATCAGCAATGCAGCGAT-3’
E.洗脱纯化第二轮扩增产物；
F.通过real time PCR 确定两轮PCR产物含量；
G.对测序文库进行测序，并通过比对等生物信息学常规方法对测序结果进行分析，通过计算每条染色体上的覆盖度计算Student t检验的T值并根据T值判断染色体数目是否异常。
18.如权利要求17所述的方法,其特征在于，步骤B、D所述PCR扩增条件分别为：
第一轮PCR：94℃预变性2分钟，然后进入循环94℃变性10s，55℃退火两分钟，72℃延伸两分钟，进行3个循环；
第二轮PCR：94℃预变性2分钟，然后进入循环94℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸15s，进行12个循环，最后72℃延伸5分钟。
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述B、D步骤中扩增体系分别如下：
第一轮PCR扩增：50 ul体系（10*PCR缓冲溶液 5 μl，Platinum Pfx DNA 聚合酶(2.5 U/μl) 0.8 μl，dNTP (10 mM) 2 μl，MgSO4 (50 mM) 2 μl,扩增引物对1 各1 μl，ddH2O 25 μl，模板DNA 13.2 μl）；
第二轮PCR扩增：50 ul体系（（10*PCR缓冲溶液 5 μl，Platinum Pfx DNA 聚合酶 0.8 μl，dNTP (10 mM) 2 μl，MgSO4 (50 mM) 2 μl, 扩增引物对1 各1 μl，ddH2O 33.2 μl，模板DNA 5 μl）。
20.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述C、E步骤中扩增产物用QIAGEN MinElute PCR Purification Kit洗脱。
21.如权利要求17所述方法，其特征在于，步骤G中，覆盖度的计算方法是每条染色体上的覆盖度为覆盖到该染色体上的UR数目除以该样本全部的UR数目；UR为唯一比对到基因组上一个位置的Read。
22.如权利要求17所述方法，其特征在于，步骤G中，Student t检验中T值的计算公式为： 
其中
为实际T值，x为样本覆盖度，μ为平均值，
为方差，n-1为样本自由度。
23.如权利要求17所述的方法，其特征在于，步骤A中DNA样本包括人体血液、尿液、羊水、唾液、大便等组织材料。
24.如权利要求23所述的DNA样本，其特征在于，人体血液包括孕妇外周血。
25.如权利要求17所述的方法,其特征在于，上述方法可用于染色体数目异常检测。
26.如权利要求25所述的方法,其特征在于，其检测的染色体数目异常范围包括主要有染色体13、18、21、X、Y。
27.如权利要求26所述的方法,其特征在于，上述方法可以用于无创产前的胎儿的染色体数目异常检测。
28.一种用于快速检测染色体数目异常的试剂盒，其特征在于包括以下成分：
溶液A：MgSO4（25 mM/μl）；
溶液B：dNTP混合液（5 mM/μl）；
溶液C：Platinum Pfx DNA 聚合酶(2.5 U/μl)；
溶液D：含扩增引物1正向引物中的一对，均为25 μM/μl；
正向引物 1a：
5’-GGCTATAAACGCAGGCCACTCNNNNNNNNNNNNNNNNNGGGAGGGGAACATCACAC-3’
正向引物 1b：
5’-GGCTATAAACGCAGGCCACTCBDVHBDVHBDVHBDVHBDVHGGGAGGGGAACATCACAC-3’
反向引物1：
5’-TCTGAGGAATCAGCAATGCAGCGATCATGGTGGTTTGCTGCA-3’；
其中N、B、D、V、H为简并碱基
溶液E：含扩增引物2
正向引物2：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGGCTATAAACGCAGGCCACTC-3’
反向引物2：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNTCTGAGGAATCAGCAATGCAGCGAT-3’
其中NNNNNNNN为特定碱基，为样本的标签序序列，不同样本标签序列不同
溶液F：ddH2O。
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