JP2020500002A - Dna塩基配列決定法 - Google Patents
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Abstract
DNA塩基配列決定法が開示される。本発明が提供する該DNA塩基配列決定法は、次のステップを順に備える、すなわち、(1)タグ配列を含む塩基配列が決定されるDNAを形成するように、該塩基配列が決定されるDNAの3’末端にタグ配列を付加し、前記タグ配列のヌクレオチド配列はシークエンスプライマーにおけるヌクレオチド配列の逆相補的であり、(2)5’末端二本鎖及び一本鎖主要部分を有する生成物を形成するように、前記タグ配列を含む前記塩基配列が決定されるDNAと前記シークエンスプライマーとを混合し、(3)ステップ(2)完了後、前記生成物とdATP、dCTP、dTTP及びdGTPとを別々に混合し、4つの系を取得し、それぞれの系をDNAポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイスに別々に添加し、電気信号を読み取る。実験は、本発明が提供する方法がDNA塩基配列決定を行い、重要な適用価値を有することを検証する。【選択図】図3
Description
本出願は、2016年8月31日に国家知識産権局に出願された、主題を「DNA配列決定法」とする中国特許出願第201610798113.X号の優先権を主張し、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関し、特にDNA塩基配列決定法に関する。
DNAは遺伝情報の担い手であり、DNAにおける4つの塩基対の特定の順序は遺伝情報の本質である。DNAにおける塩基対の特定の順序の決定は、DNA塩基配列決定と呼ばれ、生命の謎を明らかにし、遺伝プロセスを制御し、病気の診断を推進させ、医療技術を改善することにおいて、根本的な役割を有している。これまでのところ、連続する二世代の塩基配列決定技術の開発が成功しており、広く使用されている。ジデオキシチェーンターミネーション法に基づく第1世代の塩基配列決定技術は、遺伝の謎を明らかにするための人類にとっての扉を開けるとともに、遺伝子工学の重要な基盤を構築した。超並列合成に基づく第2世代の蛍光検出法は、第1世代の塩基配列決定技術を基礎としたPCR増幅及び蛍光検出を利用しており、塩基配列決定の効率を大幅に改善し、最初のヒトゲノム塩基配列決定の完了に大きく貢献している。先の二世代の塩基配列決定技術の相当な発展にもかかわらず、PCR増幅における時間の浪費及び高コスト、蛍光ラベル化及び検出プロセスにおける煩雑さ及び不安定性など、未だ多くの対処されるべき欠点がある。同時に、生命の本質における人間の理解の深まり、及び、医療分野における技術的手段の継続的進歩に伴い、個別の最適治療計画や分子診断が徐々に普及しており、これらはDNA塩基配列決定に対してより高度な要件を課す。そのため、どのようにしてDNA塩基配列決定を早く、正確に且つ低コストで行うかが、流行りの研究分野になっている。
現在、比較的十分に進展したDNA塩基配列決定技術は、ナノポア式の電気的試験プラットフォームに基づいている。商業的な試験器の試作品が現れてはいるが、DNAの移動速度を制御することの困難性、塩基配列決定信号の低分解能、及び塩基配列決定の不正確性などの種々の欠点のために、この方法に基づく塩基配列決定技術の進展が阻まれている。種々の新しいナノ材料の継続的な出現やマイクロナノプロセス技術の継続的な向上に伴い、単一分子の検出能力を備えたデバイスプラットフォームが急速に進展しており、DNA塩基配列決定の絶え間ない進歩のための継続的な動機及び機会を提供している。
従来技術の問題を解決するために、本発明の第1の態様は、DNAポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイスを提供し、該単一分子デバイスは、二次元ナノ材料単一分子デバイス、好ましくはグラフェン系単一分子デバイスであり、又は低次元ナノ材料単一分子デバイス、好ましくは一次元ナノ材料単一分子デバイスであり、より好ましくはシリコンナノワイヤ単一分子デバイスである。
本明細書で用いられる用語「単一分子デバイス」は、単一分子の変化に応答可能な従来技術における任意のデバイスであってもよい。すなわち、当業者は、対応する単一分子デバイスの変化を検出し又は観測することによって、分子が変化したかどうかを知ることができる。好ましくは、本発明は、DNAポリメラーゼに電極としてのグラフェン又はシリコンナノワイヤが結合した単一分子デバイスを利用する。単一分子デバイスの電流の変化を検出することによって、DNAポリメラーゼのコンフォメーションが変化したかどうかを知ることができる。
グラフェン系単一分子デバイス及びシリコンナノワイヤ単一分子デバイスの調製プロセスは、文献(Cao Y, Dong S, Liu S, He L, Gan L, Yu X, Steigerwald ML, Wu X, Liu Z, Guo X. Building high-throughput molecule junctions using indented graphene point contacts. Angew Chem Int Ed Engl. 2012 Dec 3; 51(49): 12228-32.)記載の方法を参照することができる。
本発明の第1の態様における好ましい一実施形態では、前記DNAポリメラーゼは、前記単一分子デバイスとの結合サイトを有しており、前記結合サイトを提供するアミノ酸残基が、前記DNAポリメラーゼのコンフォメーション変化領域に配されている。
本明細書で用いられるように、「前記結合サイトを提供するアミノ酸残基が、前記DNAポリメラーゼのコンフォメーション変化領域に配されている」ことは、前記DNAポリメラーゼがDNA合成中に一つのdNTPを受容するごとに、前記DNAポリメラーゼのコンフォメーションが特定の領域において変化することを意味する。前記単一分子デバイスとの前記DNAポリメラーゼの結合に基づいて、前記DNAポリメラーゼのコンフォメーションにおける変化が、前記単一分子デバイスにおける電流を変化させる。続いて起こるDNA塩基配列決定の感度を改善するために、前記DNAポリメラーゼのコンフォメーション変化領域に配された前記アミノ酸残基は、好ましくは前記単一分子デバイスに結合している。加えて、前記DNAポリメラーゼにおけるコンフォメーションの変化は、前記単一分子デバイスとの結合サイトを提供する前記アミノ酸残基の結合によって影響を受けない。
本発明の第1の態様における別の好ましい実施形態では、前記DNAポリメラーゼは、一つの結合サイトのみを介して、前記単一分子デバイスに結合している。好ましくは、前記結合サイトを提供する前記アミノ酸残基は、前記DNAポリメラーゼ中に一度だけ生じる。
本明細書で用いられるように、「前記DNAポリメラーゼは、一つの結合サイトのみを介して、前記単一分子デバイスに結合している」とは、一つのアミノ酸残基のみが、前記単一分子デバイスに結合していることを意味する。
本明細書で用いられるように、「結合サイトを提供する前記アミノ酸残基は、前記DNAポリメラーゼ中に一度だけ生じる」とは、ただ一つの結合サイトを確保するために、結合サイトを提供する前記アミノ酸残基を前記DNAポリメラーゼ中に一度だけ生じさせる必要があることを意味する。前記DNAポリメラーゼにおける前記結合サイトに加えて、他の位置において同一のアミノ酸又はアミノ酸配列がある場合、他の位置におけるアミノ酸又はアミノ酸配列が前記単一分子デバイスに結合することを防ぐために、修正又は変更が、他の位置におけるアミノ酸又はアミノ酸配列に必要となる。前記DNAポリメラーゼにおける単一の結合サイトに加えて、他の位置において同一のアミノ酸又はアミノ酸配列がない場合、修正又は変更は、他の位置におけるアミノ酸又はアミノ酸配列に必要とならない。該修正又は変更は、当業者の従来の知識に従って、前記DNAポリメラーゼの活性を変えずに又はコンフォメーションを変化させずに行われることを意味する。例えば、本発明の好ましい一実施形態では、配列番号1に示されるアミノ酸配列のN末端から907番目の位置におけるシステイン残基が、システイン残基以外の任意のアミノ酸残基、好ましくはセリン残基に置換されている。
本発明の文脈では、前記DNAポリメラーゼは、以下に限定されないが、E.coli DNAポリメラーゼI、II、III、IV若しくはV、又は、DNAポリメラーゼα、β、γ、δ若しくはε、好ましくはE.coli DNAポリメラーゼIである。好ましくは、E.coli DNAポリメラーゼIのアミノ酸配列は、配列番号1に示される。さらに好ましくは、E.coli DNAポリメラーゼIのヌクレオチド配列は、配列番号2に示される。
本発明の第1の態様におけるさらに好ましい別の実施形態では、前記DNAポリメラーゼは、
b1)配列番号3に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくはその機能変異体、又は、
b2)配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくはその機能変異体、
である。
b1)配列番号3に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくはその機能変異体、又は、
b2)配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくはその機能変異体、
である。
本明細書で用いられるように、用語「機能変異体」は、アミノ酸配列の一つ以上のアミノ酸残基の置換及び/又は欠失及び/又は付加によって取得されるタンパク質であって、その本来の生物活性、すなわち、DNA合成を案内する生物活性を維持しているタンパク質を示す。
本発明の第1の態様における好ましい一実施形態では、配列番号3に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の機能変異体は、配列番号3に示されるアミノ酸配列の一つ以上のアミノ酸残基の置換及び/又は欠失及び/又は付加によって得られる同じ機能を有するタンパク質である。
本発明の第1の態様における好ましい一実施形態では、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の機能変異体は、配列番号1に示されるアミノ酸配列におけるN末端から907番目の位置のシステイン残基の非システイン残基への置換、及び、配列番号1に示されるアミノ酸配列におけるN末端から790番目の位置のロイシン残基のシステイン残基への置換によって得られるタンパク質であり、好ましくは、配列番号1に示されるアミノ酸配列におけるN末端から907番目の位置のシステイン残基のセリン残基への置換、及び、配列番号1に示されるアミノ酸配列におけるN末端から790番目の位置のロイシン残基のシステイン残基への置換によって得られるタンパク質である。
本発明の第1の態様における好ましい一実施形態では、前記DNAポリメラーゼが前記単一分子デバイスに結合するとき、前記DNAポリメラーゼの前記結合サイトは、配列番号1に示されるアミノ酸配列のN末端から790番目の位置におけるシステインである。
前記DNAポリメラーゼは、該DNAポリメラーゼの活性及びコンフォメーションの変化が維持される限り、当業者に知られた任意の結合方法を使用して前記単一分子デバイスに結合され得る。
好ましくは、前記DNAポリメラーゼとグラフェン系単一分子デバイスとは、次のように結合され得る。すなわち、
(1)グラフェン系単一分子デバイスを調製し、
(2)前記グラフェン系単一分子デバイスとp−フェニレンジアミンとを混合して、アミノ基で修飾された末端を有するグラフェン電極を取得し、
(3)1,3,5−トリス(4−カルボニルフェニロキシ)ベンゼンとアミノ基で修飾された末端を有する前記グラフェン電極とを混合して、電気回路を取得し、
(4)前記電気回路とN−ヒドロキシスルホスクシンイミド(スルホ−NHS)ナトリウム塩とを混合して、スルホ−NHS活性化電気回路を取得し、
(5)前記スルホ−NHS活性化電気回路とN−(2−アミノエチル)マレイミド塩酸塩とを混合して、処理されたグラフェン系単一分子デバイスを取得し、
(6)前記処理されたグラフェン系単一分子デバイスと過剰量のDNAポリメラーゼとを混合し、DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを取得する。
(1)グラフェン系単一分子デバイスを調製し、
(2)前記グラフェン系単一分子デバイスとp−フェニレンジアミンとを混合して、アミノ基で修飾された末端を有するグラフェン電極を取得し、
(3)1,3,5−トリス(4−カルボニルフェニロキシ)ベンゼンとアミノ基で修飾された末端を有する前記グラフェン電極とを混合して、電気回路を取得し、
(4)前記電気回路とN−ヒドロキシスルホスクシンイミド(スルホ−NHS)ナトリウム塩とを混合して、スルホ−NHS活性化電気回路を取得し、
(5)前記スルホ−NHS活性化電気回路とN−(2−アミノエチル)マレイミド塩酸塩とを混合して、処理されたグラフェン系単一分子デバイスを取得し、
(6)前記処理されたグラフェン系単一分子デバイスと過剰量のDNAポリメラーゼとを混合し、DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを取得する。
好ましくは、前記DNAポリメラーゼとシリコンナノワイヤ単一分子デバイスとは、次のように結合され得る。すなわち、
(1)シリコンナノワイヤ単一分子デバイスを調製し、
(2)前記シリコンナノワイヤ単一分子デバイスとHF溶液とを混合して、エッチングされたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスを取得し、ここで、前記HF溶液は、40(質量)%NH4F水溶液7質量部と40(質量)%HF水溶液1質量部とを混合することによって取得され、具体的にはBeijing Chemical Works社の製品であり、
(3)前記エッチングされたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスと10−ウンデシン酸とを混合して、電気回路を取得し、
(4)ステップ(3)の前記電気回路とN−ヒドロキシスルホスクシンイミド(スルホ−NHS)ナトリウム塩とを混合して、スルホ−NHS活性化電気回路を取得し、
(5)ステップ(4)の前記スルホ−NHS活性化電気回路とN−(2−アミノエチル)マレイミド塩酸塩とを混合して、処理されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスを取得し、
(6)前記処理されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスと過剰量のDNAポリメラーゼとを混合し、DNAポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスを取得する。
(1)シリコンナノワイヤ単一分子デバイスを調製し、
(2)前記シリコンナノワイヤ単一分子デバイスとHF溶液とを混合して、エッチングされたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスを取得し、ここで、前記HF溶液は、40(質量)%NH4F水溶液7質量部と40(質量)%HF水溶液1質量部とを混合することによって取得され、具体的にはBeijing Chemical Works社の製品であり、
(3)前記エッチングされたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスと10−ウンデシン酸とを混合して、電気回路を取得し、
(4)ステップ(3)の前記電気回路とN−ヒドロキシスルホスクシンイミド(スルホ−NHS)ナトリウム塩とを混合して、スルホ−NHS活性化電気回路を取得し、
(5)ステップ(4)の前記スルホ−NHS活性化電気回路とN−(2−アミノエチル)マレイミド塩酸塩とを混合して、処理されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスを取得し、
(6)前記処理されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスと過剰量のDNAポリメラーゼとを混合し、DNAポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスを取得する。
本発明の第1の態様における特に好ましい実施形態では、前記DNAポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイスにおける該DNAポリメラーゼが、マイクロキャビティ内に含まれ、好ましくは、前記マイクロキャビティは、ポリジメチルシロキサンから作られる。
好ましくは、各DNAポリメラーゼが、一つのマイクロキャビティ内に含まれている。
本発明の第1の態様における特定の実施形態では、前記DNAポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイスは、使い捨て可能である。
本発明の第1の態様における別の特定の実施形態では、前記DNAポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイスは、再利用可能である。
本発明の第2の態様は、DNA塩基配列決定法を提供し、該DNA塩基配列決定法は、
(1)塩基配列が決定されるDNAとシークエンスプライマー及びdNTPとを混合して反応系を取得し、好ましくは、前記シークエンスプライマーと対をなす配列を前記塩基配列が決定されるDNAの3’末端に結合するステップ、
(2)ステップ(1)の前記反応系と請求項1乃至5いずれか1項に係るDNAポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイスとを混合するステップ、
(3)DNA合成中、経時的に、前記DNAポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイスにおけるソースドレイン間電流の電気信号を検出するステップ、
(4)前記電気信号を解析して配列結果を取得するステップ、を備える。
(1)塩基配列が決定されるDNAとシークエンスプライマー及びdNTPとを混合して反応系を取得し、好ましくは、前記シークエンスプライマーと対をなす配列を前記塩基配列が決定されるDNAの3’末端に結合するステップ、
(2)ステップ(1)の前記反応系と請求項1乃至5いずれか1項に係るDNAポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイスとを混合するステップ、
(3)DNA合成中、経時的に、前記DNAポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイスにおけるソースドレイン間電流の電気信号を検出するステップ、
(4)前記電気信号を解析して配列結果を取得するステップ、を備える。
本発明の第2の態様における好ましい実施形態では、ステップ(1)において、前記塩基配列が決定されるDNAは、一本鎖DNA又は二本鎖DNAであり、ここで、前記塩基配列が決定されるDNAが二本鎖DNAである場合、該二本鎖DNAは、初めに変性され、その後前記シークエンスプライマー及びdNTPと混合される。
本発明の第2の態様における別の好ましい実施形態では、ステップ(1)において、前記シークエンスプライマーのヌクレオチド配列に対する逆相補的ヌクレオチド配列を有するタグ配列が、前記塩基配列が決定されるDNAの3’末端に結合し、好ましくは、前記シークエンスプライマーのヌクレオチド配列は、配列番号4に示される配列であり、前記タグ配列のヌクレオチド配列は、配列番号4に示される配列の5’末端から51〜68番目の位置における配列である。
本発明の第2の態様におけるさらに別の好ましい実施形態では、ステップ(2)において、前記DNAポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイスにおける該DNAポリメラーゼは、マイクロキャビティ内に含まれ、好ましくは、該マイクロキャビティは、ポリジメチルシロキサンから作られ、ステップ(1)の前記反応系が、前記マイクロキャビティ内に加えられる。
本発明の第2の態様におけるさらに別の好ましい実施形態では、ステップ(4)が、
前記ソースドレイン間電流のピーク値を統計的に解析し、各ピーク値に対応する塩基に係る配列結果を取得すること、又は、
高電流状態に対応する高状態時間及び低電流状態に対応する低状態時間を統計的に解析し、平均低状態時間及び平均高状態時間を計算し、各平均低状態時間及び各平均高状態時間に対応する塩基に係る配列結果を取得すること、を備える。
前記ソースドレイン間電流のピーク値を統計的に解析し、各ピーク値に対応する塩基に係る配列結果を取得すること、又は、
高電流状態に対応する高状態時間及び低電流状態に対応する低状態時間を統計的に解析し、平均低状態時間及び平均高状態時間を計算し、各平均低状態時間及び各平均高状態時間に対応する塩基に係る配列結果を取得すること、を備える。
本発明の特定の一実施形態では、本発明の塩基配列決定法は、塩基配列が決定される次のDNA、すなわち、
5’-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3’、
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’、
5’-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3’、
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’、及び、
5’-TGCTAGCTGCTAATTGTCTCCATGTCATGTAGCTAGCTGTCACAGT-3’、
でそれぞれ行われる。
5’-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3’、
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’、
5’-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3’、
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’、及び、
5’-TGCTAGCTGCTAATTGTCTCCATGTCATGTAGCTAGCTGTCACAGT-3’、
でそれぞれ行われる。
塩基配列決定プロセスは、具体的には次のステップを含む。すなわち、
(1)タグ配列を前記塩基配列が決定されるDNAの3’末端に結合して、前記タグ配列を含む塩基配列が決定されるDNAを形成し、ここで、前記タグ配列は、シークエンスプライマーのヌクレオチド配列に対する逆相補的ヌクレオチド配列を有する、ステップ、
(2)前記タグ配列を含む前記塩基配列が決定されるDNAと前記シークエンスプライマーとを混合して、5’末端において二本鎖の形態であり且つ主要部分において一本鎖の形態である生成物を形成するステップ、
(3)ステップ(2)完了後、前記生成物とdATP、dCTP、dTTP及びdGTPそれぞれとを混合して4つの系を取得し、各系を前記DNAポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイスにそれぞれ添加して電気信号を読み取り、ここで、他の3つの系とは大きく異なる電気信号を有する前記系におけるdNTPは、a1)又はa2)であり、
a1)前記塩基配列が決定されるDNAの3’末端における第1のヌクレオチド、
a2)前記塩基配列が決定されるDNAの3’末端における第1のセグメントのヌクレオチドであり、前記第1のセグメントはN個のヌクレオチドからなり、Nは2以上の自然数である、ステップ、
(4)前のステップにおける他の3つの系とは大きく異なる電気信号を有する前記系の前記生成物と、dATP、dCTP、dTTP及びdGTPそれぞれとを混合して4つの系を取得し、各系を前記DNAポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイスにそれぞれ添加して電気信号を読み取り、ここで、他の3つの系とは大きく異なる電気信号を有する前記系におけるdNTPは、b1)又はb2)であり、
b1)前記塩基配列が決定されるDNAの3’末端における第2のヌクレオチド、
b2)前記塩基配列が決定されるDNAの3’末端における第2のセグメントのヌクレオチドであり、前記第2のセグメントはM個のヌクレオチドからなり、Mは2以上の自然数である、ステップ、
(5)前記塩基配列が決定されるDNAの配列結果が取得されるまで、ステップ(4)を繰り返すステップ、を含む。
(1)タグ配列を前記塩基配列が決定されるDNAの3’末端に結合して、前記タグ配列を含む塩基配列が決定されるDNAを形成し、ここで、前記タグ配列は、シークエンスプライマーのヌクレオチド配列に対する逆相補的ヌクレオチド配列を有する、ステップ、
(2)前記タグ配列を含む前記塩基配列が決定されるDNAと前記シークエンスプライマーとを混合して、5’末端において二本鎖の形態であり且つ主要部分において一本鎖の形態である生成物を形成するステップ、
(3)ステップ(2)完了後、前記生成物とdATP、dCTP、dTTP及びdGTPそれぞれとを混合して4つの系を取得し、各系を前記DNAポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイスにそれぞれ添加して電気信号を読み取り、ここで、他の3つの系とは大きく異なる電気信号を有する前記系におけるdNTPは、a1)又はa2)であり、
a1)前記塩基配列が決定されるDNAの3’末端における第1のヌクレオチド、
a2)前記塩基配列が決定されるDNAの3’末端における第1のセグメントのヌクレオチドであり、前記第1のセグメントはN個のヌクレオチドからなり、Nは2以上の自然数である、ステップ、
(4)前のステップにおける他の3つの系とは大きく異なる電気信号を有する前記系の前記生成物と、dATP、dCTP、dTTP及びdGTPそれぞれとを混合して4つの系を取得し、各系を前記DNAポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイスにそれぞれ添加して電気信号を読み取り、ここで、他の3つの系とは大きく異なる電気信号を有する前記系におけるdNTPは、b1)又はb2)であり、
b1)前記塩基配列が決定されるDNAの3’末端における第2のヌクレオチド、
b2)前記塩基配列が決定されるDNAの3’末端における第2のセグメントのヌクレオチドであり、前記第2のセグメントはM個のヌクレオチドからなり、Mは2以上の自然数である、ステップ、
(5)前記塩基配列が決定されるDNAの配列結果が取得されるまで、ステップ(4)を繰り返すステップ、を含む。
上記塩基配列決定プロセスでは、a2)において、Nは、好ましくは50である。
上記塩基配列決定プロセスでは、b2)において、Mは、好ましくは50である。
上記塩基配列決定プロセスでは、前記塩基配列が決定されるDNAは、一本鎖DNAである。前記塩基配列が決定されるDNAが二本鎖である場合、変性が最初に必要となり、その後前記シークエンスプライマーと混合される。
前記シークエンスプライマーのヌクレオチド配列は、好ましくは配列番号4に示される配列である。
前記タグ配列のヌクレオチド配列は、配列番号4に示される配列の5’末端から51〜68番目の位置における配列であってもよい。
本発明の第3の態様は、DNA塩基配列決定のためのキットを提供し、該キットは、DNAポリメラーゼと単一分子デバイスとを備え、前記単一分子デバイスは、二次元ナノ材料単一分子デバイス、好ましくはグラフェン系単一分子デバイス、又は、低次元ナノ材料単一分子デバイスであり、好ましくは一次元ナノ材料単一分子デバイスであり、より好ましくはシリコンナノワイヤ単一分子デバイスである。
本発明の第3の態様における好ましい一実施形態では、前記DNAポリメラーゼは、
b1)配列番号3に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくはその機能変異体、又は、
b2)配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくはその機能変異体、
である。
b1)配列番号3に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくはその機能変異体、又は、
b2)配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくはその機能変異体、
である。
本発明の第3の態様における別の好ましい実施形態では、前記DNAポリメラーゼ及び前記単一分子デバイスは、分離された区画に存在しており、使用される際にサイトに結合され、又は、前記DNAポリメラーゼは前記単一分子デバイスに結合され、好ましくは、前記DNAポリメラーゼは前記単一分子デバイスとの結合サイトを有し、前記結合サイトを提供するアミノ酸残基は前記DNAポリメラーゼのコンフォメーション変化領域内に配され、より好ましくは、前記DNAポリメラーゼは、マイクロキャビティ内に含まれている。
本発明の第3の態様におけるさらに別の好ましい実施形態では、前記キットは、シークエンスプライマー、dNTP及び/又は使用説明をさらに備えている。
本発明により提供される方法は、DNA塩基配列決定を行うために使用することができ、塩基配列決定結果は、DNA合成速度が先行文献(Tivoli J. Olsen, Yongki Choi, Patrick C. Sims, O. Tolga Gul, Brad L. Corso, Chengjun Dong, William A. Brown, Philip G. Collins and Gregory A. Weiss, Electronic Measurements of Single-Molecule Processing by DNA Polymerase I (Klenow Fragment) , Journal of the American Chemical Society 2013, 135, 7855-7860)において説明される内容に実質的に一致していることを示している。本発明によって提供されるDNA塩基配列決定法は、高い適用価値を有している。
本発明に係る、DNAポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイス、DNA塩基配列決定法及びキットは、DNA塩基配列決定に広く適用することができ、少なくとも次の利点を有している。すなわち、
本発明における塩基配列決定速度は、DNAポリメラーゼの本来的な反応速度に依るため、塩基配列決定速度が化学的塩基配列決定法の決定速度よりも早く、
第2世代の塩基配列決定が数百の塩基のみを検出し得る間に、数千の塩基を有するような非常に長い配列が、DNAポリメラーゼの本来的な連続性のために、一つの反応によって検出され得、
PCR増幅がないため、増幅により導入される塩基のエラーがなく、その結果、非常に高度な塩基配列決定の正確性及び分解能が達成される。
本発明における塩基配列決定速度は、DNAポリメラーゼの本来的な反応速度に依るため、塩基配列決定速度が化学的塩基配列決定法の決定速度よりも早く、
第2世代の塩基配列決定が数百の塩基のみを検出し得る間に、数千の塩基を有するような非常に長い配列が、DNAポリメラーゼの本来的な連続性のために、一つの反応によって検出され得、
PCR増幅がないため、増幅により導入される塩基のエラーがなく、その結果、非常に高度な塩基配列決定の正確性及び分解能が達成される。
本発明の対象、技術的手段及び利点をより明確に説明するために、以下、図面及び実施例を参照して本発明の詳細をさらに説明する。説明される実施例は、本発明の全ての実施例ではなく一部の実施例のみであることは明らかである。創作的な努力をすることなく、本発明の実施例に基づいて当業者によって取得される全ての他の実施例は、本発明の範囲に含まれる。
本発明が、特定の実施形態を参照してさらに詳細に説明される。実施例は本発明を説明するためにのみ与えられ、本発明の範囲を限定することは意図されない。
以下の実施例における実験方法は、別段の明示がない限り、本技術の従来的な方法である。
以下の実施例において使用される材料、試薬等は、別段の明示がない限り、商業的に入手可能である。
DTTバッファーは、pH7.8であり、50mM NaCl、10mM MgCl2及び1mM DTTを含む10mM Tris−HClバッファーである。
HF溶液は、40(質量)%NH4F水溶液7質量部と40(質量)%HF水溶液1質量部とを混合することによって取得される、Beijing Chemical Works社の製品である。
一本鎖DNA分子I:
(配列番号4に示されるような)5’-(C)50ACTGGCCGTCGTTTTACA-3’ 。
(配列番号4に示されるような)5’-(C)50ACTGGCCGTCGTTTTACA-3’ 。
一本鎖DNA分子II:
(配列番号5に示されるような)5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’。
(配列番号5に示されるような)5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’。
一本鎖DNA分子III:
(配列番号6に示されるような)5’-(A)50ACTGGCCGTCGTTTTACA-3’。
(配列番号6に示されるような)5’-(A)50ACTGGCCGTCGTTTTACA-3’。
一本鎖DNA分子IV:
(配列番号7に示されるような)5’-(G)50ACTGGCCGTCGTTTTACA-3’。
(配列番号7に示されるような)5’-(G)50ACTGGCCGTCGTTTTACA-3’。
一本鎖DNA分子V:
(配列番号8に示されるような)5’-(T)50ACTGGCCGTCGTTTTACA-3’。
(配列番号8に示されるような)5’-(T)50ACTGGCCGTCGTTTTACA-3’。
一本鎖DNA分子VI:
(配列番号9に示されるような)5’-TGCTAGCTGCTAATTGTCTCCATGTCATGTAGCTAGCTGTCACAGTACTGGCCGTCGTTTTACA-3’。
(配列番号9に示されるような)5’-TGCTAGCTGCTAATTGTCTCCATGTCATGTAGCTAGCTGTCACAGTACTGGCCGTCGTTTTACA-3’。
鋳型鎖Cは次のように調製する。一本鎖DNA分子I及び一本鎖DNA分子IIを人工的に合成する。その後、一本鎖DNA分子I10μL(一本鎖DNA分子Iの濃度は10μM)、一本鎖DNA分子II10μL(一本鎖DNA分子IIの濃度は10μM)、及びDTTバッファー980μLを混合し、70℃で1時間加熱し、室温まで自然に冷却し、(5’末端において二本鎖であり主要部分において一本鎖である形態の)鋳型鎖Cを取得する。鋳型鎖Cは、反応試験前において、3時間の調製を必要とする。
鋳型鎖Aは次のように調製する。一本鎖DNA分子III及び一本鎖DNA分子IIを人工的に合成する。その後、一本鎖DNA分子III10μL(一本鎖DNA分子の濃度は10μM)、一本鎖DNA分子II10μL(一本鎖DNA分子IIの濃度は10μM)、及びDTTバッファー980μLを混合し、70℃で1時間加熱し、室温まで自然に冷却し、(5’末端において二本鎖であり主要部分において一本鎖である形態の)鋳型鎖Aを取得する。鋳型鎖Aは、反応試験前において、3時間の調製を必要とする。
鋳型鎖Gは次のように調製する。一本鎖DNA分子IV及び一本鎖DNA分子IIを人工的に合成する。その後、一本鎖DNA分子IV10μL(一本鎖DNA分子IVの濃度は10μM)、一本鎖DNA分子II10μL(一本鎖DNA分子IIの濃度は10μM)、及びDTTバッファー980μLを混合し、70℃で1時間加熱し、室温まで自然に冷却し、(5’末端において二本鎖であり主要部分において一本鎖である形態の)鋳型鎖Gを取得する。鋳型鎖Gは、反応試験前において、3時間の調製を必要とする。
鋳型鎖Tは次のように調製する。一本鎖DNA分子V及び一本鎖DNA分子IIを人工的に合成する。その後、一本鎖DNA分子V10μL(一本鎖DNA分子Vの濃度は10μM)、一本鎖DNA分子II10μL(一本鎖DNA分子IIの濃度は10μM)、及びDTTバッファー980μLを混合し、70℃で1時間加熱し、室温まで自然に冷却し、(5’末端において二本鎖であり主要部分において一本鎖である形態の)鋳型鎖Tを取得する。鋳型鎖Tは、反応試験前において、3時間の調製を必要とする。
ランダム鎖は次のように調製する。一本鎖DNA分子VI及び一本鎖DNA分子IIを人工的に合成する。その後、一本鎖DNA分子VI10μL(一本鎖DNA分子VIの濃度は10μM)、一本鎖DNA分子II10μL(一本鎖DNA分子IIの濃度は10μM)、及びDTTバッファー980μLを混合し、70℃で1時間加熱し、室温まで自然に冷却し、(5’末端において二本鎖であり主要部分において一本鎖である形態の)ランダム鎖を取得する。ランダム鎖は、反応試験前において、3時間の調製を必要とする。
低分解能プローブステーションは、半導体パラメータメータ(Agilent社製、4155C)及びプローブステーション(Karl Suess社製、PM5)からなる。
高分解能プローブステーションは、二つのコアコンポーネントであるプリアンプ(Digital Instruments社製、DL1211)及びロックインアンプ(Zurich Instruments社製、HF2LI)からなる。
1,3,5−トリス(4−カルボニルフェニロキシ)ベンゼンは、Jinan Henghua Technology社の製品である。
dATP溶液は、DTTバッファーにdATPを溶解することによって取得する。dCTP溶液は、DTTバッファーにdCTPを溶解することによって取得する。dTTP溶液は、DTTバッファーにdTTPを溶解することによって取得する。dGTP溶液は、DTTバッファーにdGTPを溶解することによって取得する。dATP、dCTP、dTTP、及びdGTPは、全てBeijing SBS Genetech社の製品である。
[実施例1]DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを使用するDNA塩基配列決定
I.DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスの調製
1.グラフェン系単一分子デバイスの調製
グラフェン系単一分子デバイスの調製プロセスは、次の文献を参照することができる:Cao Y, Dong S, Liu S, He L, Gan L, Yu X, Steigerwald ML, Wu X, Liu Z, Guo X. Building high-throughput molecular junctions using indented graphene point contacts. Angew Chem Int Ed Engl. 2012 Dec 3; 51(49): 12228-32。グラフェン系単一分子デバイス上にナノギャップを有するグラフェン電極がある(以下、グラフェン電極として言及し、その構造式は図1(1)に示されている)。
I.DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスの調製
1.グラフェン系単一分子デバイスの調製
グラフェン系単一分子デバイスの調製プロセスは、次の文献を参照することができる:Cao Y, Dong S, Liu S, He L, Gan L, Yu X, Steigerwald ML, Wu X, Liu Z, Guo X. Building high-throughput molecular junctions using indented graphene point contacts. Angew Chem Int Ed Engl. 2012 Dec 3; 51(49): 12228-32。グラフェン系単一分子デバイス上にナノギャップを有するグラフェン電極がある(以下、グラフェン電極として言及し、その構造式は図1(1)に示されている)。
次のステップ2〜7は、文献:Yang Cao, Shaohua Dong, Song Liu, Li He, Lin Gan, Xiaoming Yu, Michael L. Steigerwald, Xiaosong Wu, Zhongfan Liu and Xuefeng Guo*, Building High-Throughput Molecular Junctions Using Indented Graphene Point Contacts, Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 12228; and Xuefeng Guo, Alon Gorodetsky, Jacqueline K. Barton, James Hone, Colin Nuckolls*, Conductivity of a single DNA duplex bridging a carbon nanotube gap, Nat. Nanotechnol.2008, 3, 163において報告された方法に従い行った。
2.アミノ基での末端修飾
ステップ1完了後、グラフェン系単一分子デバイスとp−フェニレンジアミン(図1(2)参照)とを混合し、アミノ基でグラフェン電極の末端を修飾した。アミノ基で修飾された末端を有するグラフェン電極の構造式は、図1(3)に示されている。
ステップ1完了後、グラフェン系単一分子デバイスとp−フェニレンジアミン(図1(2)参照)とを混合し、アミノ基でグラフェン電極の末端を修飾した。アミノ基で修飾された末端を有するグラフェン電極の構造式は、図1(3)に示されている。
3.電気回路の構成
ステップ2完了後、1,3,5−トリス(4−カルボニルフェニロキシ)ベンゼン(図1(4)参照)とアミノ基で修飾された末端を有するグラフェン電極とを混合し、電気回路を取得した。電気回路の電気特性を、低分解能プローブステーションを使用して検出した。結果を図2の左上パネルに示す。電気回路の部分構造式を図1(5)に示す。
ステップ2完了後、1,3,5−トリス(4−カルボニルフェニロキシ)ベンゼン(図1(4)参照)とアミノ基で修飾された末端を有するグラフェン電極とを混合し、電気回路を取得した。電気回路の電気特性を、低分解能プローブステーションを使用して検出した。結果を図2の左上パネルに示す。電気回路の部分構造式を図1(5)に示す。
4.スルホ−NHS活性化
ステップ3完了後、電気回路とN−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩(スルホ−NHS、図1(6)参照)とを混合し、スルホ−NHS活性化電気回路を取得した。スルホ−NHS活性化電気回路の電気特性を、低分解能プローブステーションを使用して検出した。結果を図2の右上パネルに示す。スルホ−NHS活性化電気回路の部分構造式を図1(7)に示す。
ステップ3完了後、電気回路とN−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩(スルホ−NHS、図1(6)参照)とを混合し、スルホ−NHS活性化電気回路を取得した。スルホ−NHS活性化電気回路の電気特性を、低分解能プローブステーションを使用して検出した。結果を図2の右上パネルに示す。スルホ−NHS活性化電気回路の部分構造式を図1(7)に示す。
5.処理されたグラフェン系単一分子デバイスの取得
ステップ4完了後、スルホ−NHS活性化電気回路とN−(2−アミノエチル)マレイミド塩酸塩(図1(8)参照)とを混合し、処理されたグラフェン系単一分子デバイスを取得した。処理されたグラフェン系単一分子デバイスの部分構造式を図1(9)に示す。処理されたグラフェン系単一分子デバイスの電気特性を、低分解能プローブステーションを使用して検出した。結果を図2の左下パネルに示す。
ステップ4完了後、スルホ−NHS活性化電気回路とN−(2−アミノエチル)マレイミド塩酸塩(図1(8)参照)とを混合し、処理されたグラフェン系単一分子デバイスを取得した。処理されたグラフェン系単一分子デバイスの部分構造式を図1(9)に示す。処理されたグラフェン系単一分子デバイスの電気特性を、低分解能プローブステーションを使用して検出した。結果を図2の左下パネルに示す。
図2(1)は、図1におけるデバイス5の伝導率を示し、カルボキシル基を有する分子デバイスの調製が成功したことを示している。図2(1)は、図1のデバイス7の伝導率を示し、活性エステルを有する分子デバイスの調製が成功したことを示している。図2(1)は、図1のデバイス9の伝導率を示し、マレイミドを有する分子デバイスの調製が成功したことを示している。図2(1)は、図1のデバイス11の伝導率を示し、DNAポリメラーゼによって修飾された分子デバイスの調製が成功したことを示している。
6.E.coli DNAポリメラーゼIの再構成
(1)再構成の原理
E.coli DNAポリメラーゼI(以下、DNAポリメラーゼIと言う)のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を、それぞれ、配列番号1及び配列番号2に示す。再構成DNAポリメラーゼIは、同時に次の特性を有することが必要となる。すなわち、再構成DNAポリメラーゼは、(1)DNAポリメラーゼIの生物活性、すなわち、DNAの合成を案内する生物活性を有し、(2)(続いて起こるDNA塩基配列決定の感度を改善するために)再構成DNAポリメラーゼIのコンフォメーション変化領域内に配される必要があるアミノ酸残基(ドナーアミノ酸残基と命名する)によって提供される一つの結合サイトのみを介して、処理されたグラフェン系単一分子デバイスに結合し得、(3)ドナーアミノ酸残基に対応するアミノ酸種と結合サイトを提供しないアミノ酸残基(ノンドナーアミノ酸残基と命名する)に対応するアミノ酸種とが異なる。
(1)再構成の原理
E.coli DNAポリメラーゼI(以下、DNAポリメラーゼIと言う)のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を、それぞれ、配列番号1及び配列番号2に示す。再構成DNAポリメラーゼIは、同時に次の特性を有することが必要となる。すなわち、再構成DNAポリメラーゼは、(1)DNAポリメラーゼIの生物活性、すなわち、DNAの合成を案内する生物活性を有し、(2)(続いて起こるDNA塩基配列決定の感度を改善するために)再構成DNAポリメラーゼIのコンフォメーション変化領域内に配される必要があるアミノ酸残基(ドナーアミノ酸残基と命名する)によって提供される一つの結合サイトのみを介して、処理されたグラフェン系単一分子デバイスに結合し得、(3)ドナーアミノ酸残基に対応するアミノ酸種と結合サイトを提供しないアミノ酸残基(ノンドナーアミノ酸残基と命名する)に対応するアミノ酸種とが異なる。
(2)再構成DNAポリメラーゼIの取得
再構成DNAポリメラーゼIを、文献(Tivoli J. Olsen, Yongki Choi, Patrick C. Sims, O. Tolga Gul, Brad L. Corso, Chengjun Dong, William A. Brown, Philip G. Collins and Gregory A. Weiss, Electronic Measurements of Single-Molecule Processing by DNA Polymerase I (Klenow Fragment), Journal of the American Chemical Society 2013, 135, 7855-7860)に報告された方法を使用した広範な実験によって取得した。再構成DNAポリメラーゼI(そのアミノ酸配列は配列番号3に示される)は、Sangon Biotech(Shanghai)社によって調製された。再構成DNAポリメラーゼIは、DNAポリメラーゼI(そのアミノ酸配列は配列番号1に示される)のN末端から907番目の位置のシステイン残基がセリン残基に置換され、且つ、DNAポリメラーゼIのN末端から790番目の位置のロイシン残基がシステイン残基に置換されたアミノ酸配列を有している。配列番号3のN末端から790番目の位置のアミノ酸残基は、コンフォメーション変化領域に配されている。
再構成DNAポリメラーゼIを、文献(Tivoli J. Olsen, Yongki Choi, Patrick C. Sims, O. Tolga Gul, Brad L. Corso, Chengjun Dong, William A. Brown, Philip G. Collins and Gregory A. Weiss, Electronic Measurements of Single-Molecule Processing by DNA Polymerase I (Klenow Fragment), Journal of the American Chemical Society 2013, 135, 7855-7860)に報告された方法を使用した広範な実験によって取得した。再構成DNAポリメラーゼI(そのアミノ酸配列は配列番号3に示される)は、Sangon Biotech(Shanghai)社によって調製された。再構成DNAポリメラーゼIは、DNAポリメラーゼI(そのアミノ酸配列は配列番号1に示される)のN末端から907番目の位置のシステイン残基がセリン残基に置換され、且つ、DNAポリメラーゼIのN末端から790番目の位置のロイシン残基がシステイン残基に置換されたアミノ酸配列を有している。配列番号3のN末端から790番目の位置のアミノ酸残基は、コンフォメーション変化領域に配されている。
7.DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスの調製
ステップ6完了後、処理されたグラフェン系単一分子デバイスと過剰量の再構成DNAポリメラーゼI(図1(10)参照)とを混合し、DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを取得した(図3の左パネル)。DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスの部分構造式を図1(11)に示す。DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスの電気特性を、低分解能プローブステーションを使用して検出した。結果を図2の右下パネルに示す。再構成DNAポリメラーゼIにおけるシステインが、処理されたグラフェン系単一分子デバイスと反応する反応式を図4に示す。
ステップ6完了後、処理されたグラフェン系単一分子デバイスと過剰量の再構成DNAポリメラーゼI(図1(10)参照)とを混合し、DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを取得した(図3の左パネル)。DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスの部分構造式を図1(11)に示す。DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスの電気特性を、低分解能プローブステーションを使用して検出した。結果を図2の右下パネルに示す。再構成DNAポリメラーゼIにおけるシステインが、処理されたグラフェン系単一分子デバイスと反応する反応式を図4に示す。
調製したDNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを、低分解能プローブステーション上に置き、伝導率を観察した。伝導率を有するグラフェン系単一分子デバイスを、次の実験のために選択した。具体的なステップは、文献:Tivoli J. Olsen, Yongki Choi, Patrick C. Sims, O. Tolga Gul, Brad L. Corso, Chengjun Dong, William A. Brown, Philip G. Collins and Gregory A. Weiss, Electronic Measurements of Single-Molecule Processing by DNA polymerase I (Klenow Fragment), Journal of the American Chemical Society 2013, 135, 7855-7860に報告された方法を参照する。
II.DNAポリメラーゼ修飾グラフェン系単一分子デバイスを使用する鋳型鎖CのDNA塩基配列決定
1.DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを採取し、再構成DNAポリメラーゼIを(ポリジメチルシロキサン(PDMS)から作られた)マイクロキャビティ40μLに含ませ、マイクロキャビティを含むグラフェン系単一分子デバイスを取得した。
1.DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを採取し、再構成DNAポリメラーゼIを(ポリジメチルシロキサン(PDMS)から作られた)マイクロキャビティ40μLに含ませ、マイクロキャビティを含むグラフェン系単一分子デバイスを取得した。
2.ステップ1完了後、マイクロキャビティを含むグラフェン系単一分子デバイスを、高分解能プローブステーション上に置き、反応試験のために5分間供試した(すなわち、経時的にソースドレイン間電流の変化を試験した)。実験結果を図5Aの左パネルに示す。その後、予備的なピーク統計を、MatLabソフトウェアを使用して行った。実験結果を図5Aの右パネルに示し、図5Aは、試料がないと、DNA合成の振動信号が観測されなかったことを示している。
3.ステップ1完了後、同じものを含むグラフェン系単一分子デバイスにおけるマイクロキャビティ内にDTTバッファー10μLを添加し、反応試験のために5分間供試した(すなわち、経時的にソースドレイン間電流の変化を試験した)。実験結果を図5Bの左パネルに示す。その後、予備的なピーク統計を、MatLabソフトウェアを使用して行った。実験結果を図5Bの右パネルに示し、図5Bは、試料がないと、DNA合成の振動信号が観測されなかったことを示している。
4.ステップ1完了後、同じものを含むグラフェン系単一分子デバイスにおけるマイクロキャビティ内に、DTTバッファー30μL中の100nMの鋳型鎖Cを添加し、反応試験のために5分間供試した(すなわち、経時的にソースドレイン間電流の変化を試験した)。実験結果を図5Cの左パネルに示す。その後、予備的なピーク統計を、MatLabソフトウェアを使用して行った。実験結果を図5Cの右パネルに示し、図5Cは、試料がないと、DNA合成の振動信号が観測されなかったことを示している。
5.ステップ1完了後、同じものを含むグラフェン系単一分子デバイスにおけるマイクロキャビティ内に、DTTバッファー30μL中の100nMの鋳型鎖C、dATP溶液(濃度5μM)5μL、dTTP溶液(濃度5μM)5μL、及びdCTP溶液(濃度5μM)5μLを添加し、反応試験のために10分間供試した(すなわち、経時的にソースドレイン間電流の変化を試験した)。実験結果を図5Dの左パネルに示す。その後、予備的なピーク統計を、MatLabソフトウェアを使用して行った。実験結果を図5Dの右パネルに示し、図5Dは、鋳型鎖、核酸分子、及びバッファーが存在し、塩基が適合していない場合、DNA合成の振動信号が観測されなかったことを示している。
6.ステップ1完了後、同じものを含むグラフェン系単一分子デバイスにおけるマイクロキャビティ内に、DTTバッファー30μL中の100nMの鋳型鎖C及びdGTP溶液(濃度5μM)5μLを添加し、DNA合成中の経時的なソースドレイン間電流の変化、すなわち、DNAポリメラーゼによって行われたDNA重合中の反応速度データを試験するために、10分間供試した。実験結果を図5Eの左パネルに示す。その後、予備的なピーク統計を、MatLabソフトウェアを使用して行った。実験結果を図5Eの右パネルに示し、図5Eは、鋳型鎖、核酸分子、及びバッファーが存在し、且つ、塩基が適合している場合、DNA合成の振動信号が観測されたことを示している。
これらの結果は、ステップ6の反応速度データが、他の比較対照の実験データと本質的に明らかに異なっており、すなわち、系中に鋳型鎖C及びそれに適合するデオキシヌクレオチドが存在するとき、系の反応速度データは、比較対照実験の他の4つのグループのデータと異なり得る。
7.ステップ6で取得した反応速度データを拡張し、Qubソフトウェアによって、対応する高電流状態(すなわち、高電流)及び低電流状態(すなわち、低電流)を選択した(図6A)。高電流状態に対応する高状態時間(τhi)及び低電流状態に対応する低状態時間(τlow)を統計的に解析した。実験結果をそれぞれ、図6B及び図6Cを示す。平均低状態時間及び平均高状態時間に従い、低状態の数を数えることによって、この系のDNA合成速度を計算すると、1秒あたり62.62dGTPヌクレオチドであり(表1参照)、これは、先行文献(Tivoli J. Olsen, Yongki Choi, Patrick C. Sims, O. Tolga Gul, Brad L. Corso, Chengjun Dong, William A. Brown, Philip G. Collins and Gregory A. Weiss, Electronic Measurements of Single-Molecule Processing by DNA Polymerase I (Klenow Fragment), Journal of the American Chemical Society 2013, 135, 7855-7860)で示された合成速度に実質的に一致している。本明細書で言及される平均は、単なる線形平均ではなく、指数分布に基づくポアソン平均であることに留意されたい。具体的な計算プロセスは、MatLabソフトウェアによって行われる。
III.DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを使用する鋳型鎖AのDNA塩基配列決定
1.本方法は、ステップII−1と同様である。
1.本方法は、ステップII−1と同様である。
2.本方法は、ステップII−2と同様である。反応速度試験の実験結果を図7Aの左パネルに示す。ピーク統計の実験結果を図7Aの右パネルに示し、図7は、試料がないと、DNA合成の振動信号が観測されなかったことを示している。
3.本方法は、ステップII−3と同様である。反応速度試験の実験結果を図7Bの左パネルに示す。ピーク統計の実験結果を図7Bの右パネルに示し、図7Bは、試料がないと、DNA合成の振動信号が観測されなかったことを示している。
4.本方法は、鋳型鎖Cが鋳型鎖Aに置換されることを除いて、ステップII−4と同様である。反応速度試験の実験結果を図7Cの左パネルに示す。ピーク統計の実験結果を図7Cに示し、図7Cは、鋳型鎖及びバッファーが存在し、且つ、試料のがないと、DNA合成の振動信号が観測されなかったことを示している。
5.ステップ1完了後、同じものを含むグラフェン系単一分子デバイスのマイクロキャビティ内に、DTTバッファー30μL中の100nMの鋳型鎖A、dATP溶液(濃度5μM)5μL、dGTP溶液(濃度5μM)5μL、及びdCTP溶液(濃度5μM)5μLを添加し、反応速度試験のために10分間供試した(すなわち、経時的にソースドレイン間電流の変化を試験した)。実験結果を図7Dの左パネルに示す。その後、予備的なピーク統計を、MatLabソフトウェアを使用して行った。実験結果を図7Dの右パネルに示し、図7Dは、鋳型鎖、核酸分子、及びバッファーが存在し、塩基が適合していない場合、DNA合成の振動信号が観測されなかったことを示している。
6.ステップ1完了後、同じものを含むグラフェン系単一分子デバイスのマイクロキャビティ内に、DTTバッファー30μL中の100nMの鋳型鎖A及びdTTP溶液(濃度5μM)5μLを添加し、10分間供試し、DNA合成中の経時的にソースドレイン間電流の変化、すなわち、DNAポリメラーゼによって行われたDNA重合中の反応速度データを試験した。実験結果を図7Eの左パネルに示す。その後、予備的なピーク統計を、MatLabソフトウェアを使用して行った。実験結果を図7Eの右パネルに示し、図7Eは、鋳型鎖、核酸分子、及びバッファーが存在し、且つ、塩基が適合している場合、DNA合成の振動信号が観測されたことを示している。
これらの結果は、ステップ6の反応速度データが、他の比較対照の実験データと明らかに本質的に異なっており、すなわち、系中に鋳型鎖A及びそれに整合するデオキシヌクレオチドが存在するとき、系の反応速度データは、比較対照実験の他の4つのグループのデータと異なり得る。
7.ステップII−7の方法に従い、高電流状態に対応する高状態時間(τhi)及び低電流状態に対応する低状態時間(τlow)を統計的に解析した。実験結果を図8に示す(左パネルは低状態時間を示し、右パネルは高状態時間を示す)。平均低状態時間及び平均高状態時間に従い、この系のDNA合成速度を計算すると、1秒あたり156.25dTTPヌクレオチドであり(表1参照)、これは、先行文献(Tivoli J. Olsen, Yongki Choi, Patrick C. Sims, O. Tolga Gul, Brad L. Corso, Chengjun Dong, William A. Brown, Philip G. Collins and Gregory A. Weiss, Electronic Measurements of Single-Molecule Processing by DNA Polymerase I (Klenow Fragment), Journal of the American Chemical Society 2013, 135, 7855-7860)で示された合成速度に実質的に一致している。
IV.DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを使用する鋳型鎖GのDNA塩基配列決定
1.本方法は、ステップII−1と同様である。
1.本方法は、ステップII−1と同様である。
2.本方法は、ステップII−2と同様である。反応速度試験の実験結果を図9Aの左パネルに示す。ピーク統計の実験結果を図9Aの右パネルに示し、図9Aは、試料がないと、DNA合成の振動信号が観測されなかったことを示している。
3.本方法は、ステップII−3と同様である。反応速度試験の実験結果を図9Bの左パネルに示す。ピーク統計の実験結果を図9Bの右パネルに示し、図9Bは、バッファーのみが存在し、且つ、試料がないと、DNA合成の振動信号が観測されなかったことを示している。
4.本方法は、鋳型鎖Cが鋳型鎖Gに置換されることを除いて、ステップII−4と同様である。反応速度試験の実験結果を図9Cの左パネルに示す。ピーク統計の実験結果を図9Cに示し、図9Cは、鋳型鎖及びバッファーが存在し、且つ、試料がないと、DNA合成の振動信号が観測されなかったことを示している。
5.ステップ1完了後、同じものを含むグラフェン系単一分子デバイスのマイクロキャビティ内に、100nM鋳型鎖Gを含むDTTバッファー30μL、dATP溶液(濃度5μM)5μL、dGTP溶液(濃度5μM)5μL、及びdTTP溶液(濃度5μM)5μLを添加し、反応速度試験のために10分間供試した(すなわち、経時的にソースドレイン間電流の変化を試験した)。実験結果を図9Dの左パネルに示す。その後、予備的なピーク統計を、MatLabソフトウェアを使用して行った。実験結果を図9Dの右パネルに示し、図9Dは、鋳型鎖、核酸分子、及びバッファーが存在するが、塩基が適合していない場合、DNA合成の振動信号が観測されなかったことを示している。
6.ステップ1完了後、同じものを含むグラフェン系単一分子デバイスのマイクロキャビティ内に、100nM鋳型鎖Gを含むDTTバッファー30μL及びdCTP溶液(濃度5μM)5μLを添加し、10分間供試し、DNA合成中の経時的にソースドレイン間電流の変化、すなわち、DNAポリメラーゼによって行われたDNA重合中の反応速度データを試験した。実験結果を図9Eの左パネルに示す。その後、予備的なピーク統計を、MatLabソフトウェアを使用して行った。実験結果を図9Eの右パネルに示し、図9Eは、鋳型鎖、核酸分子、及びバッファーが存在し、且つ、塩基が適合している場合、DNA合成の振動信号が観測されたことを示している。
これらの結果は、ステップ6の反応速度データが、他の比較対照の実験データと明らかに本質的に異なっており、すなわち、系中に鋳型鎖G及びそれに適合するデオキシヌクレオチドが存在するとき、系の反応速度データは、比較対照実験の他の4つのグループのデータと異なり得る。
7.ステップII−7の方法に従い、高電流状態に対応する高状態時間(τhi)及び低電流状態に対応する低状態時間(τlow)を統計的に解析した。実験結果を図10に示す(左パネルは低状態時間を示し、右パネルは高状態時間を示す)。平均低状態時間及び平均高状態時間に従い、この系のDNA合成速度を計算すると、1秒あたり143.99dCTPヌクレオチドであり(表1参照)、これは、先行文献(Tivoli J. Olsen, Yongki Choi, Patrick C. Sims, O. Tolga Gul, Brad L. Corso, Chengjun Dong, William A. Brown, Philip G. Collins and Gregory A. Weiss, Electronic Measurements of Single-Molecule Processing by DNA Polymerase I (Klenow Fragment), Journal of the American Chemical Society 2013, 135, 7855-7860)で示された合成速度に実質的に一致している。
V.DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを使用する鋳型鎖TのDNA塩基配列決定
1.本方法は、ステップII−1と同様である。
1.本方法は、ステップII−1と同様である。
2.本方法は、ステップII−2と同様である。反応速度試験の実験結果を図11Aの左パネルに示す。ピーク統計の実験結果を図11Aの右パネルに示し、図11Aは、試料がないと、DNA合成の振動信号が観測されなかったことを示している。
3.本方法は、ステップII−3と同様である。反応速度試験の実験結果を図11Bの左パネルに示す。ピーク統計の実験結果を図11Bの右パネルに示し、図11Bは、バッファーのみが存在し、且つ、試料がないと、DNA合成の振動信号が観測されなかったことを示している。
4.本方法は、鋳型鎖Cが鋳型鎖Tに置換されることを除いて、ステップII−4と同様である。反応速度試験の実験結果を図11Cの左パネルに示す。ピーク統計の実験結果を図11Cに示し、図11Cは、鋳型鎖及びバッファーが存在し、且つ、試料がないと、DNA合成の振動信号が観測されなかったことを示している。
5.ステップ1完了後、同じものを含むグラフェン系単一分子デバイスのマイクロキャビティ内に、DTTバッファー30μL中の100nMの鋳型鎖T、dCTP溶液(濃度5μM)5μL、dGTP溶液(濃度5μM)5μL、及びdTTP溶液(濃度5μM)5μLを添加し、反応速度試験のために10分間供試した(すなわち、経時的にソースドレイン間電流の変化を試験した)。実験結果を図11Dの左パネルに示す。その後、予備的なピーク統計を、MatLabソフトウェアを使用して行った。実験結果を図11Dの右パネルに示し、図11Dは、鋳型鎖、核酸分子、及びバッファーが存在するが、塩基が適合していない場合、DNA合成の振動信号が観測されなかったことを示している。
6.ステップ1完了後、同じものを含むグラフェン系単一分子デバイスのマイクロキャビティ内に、DTTバッファー30μL中の100nMの鋳型鎖T及びdATP溶液(濃度5μM)5μLを添加し、10分間供試し、DNA合成中の経時的にソースドレイン間電流の変化、すなわち、DNAポリメラーゼによって行われたDNA重合中の反応速度データを試験した。実験結果を図11Eの左パネルに示す。その後、予備的なピーク統計を、MatLabソフトウェアを使用して行った。実験結果を図11Eの右パネルに示し、図11Eは、鋳型鎖、核酸分子、及びバッファーが存在し、且つ、塩基が適合している場合、DNA合成の振動信号が観測されたことを示している。
これらの結果は、ステップ6の反応速度データが、他の比較対照の実験データと明らかに本質的に異なっており、すなわち、系中に鋳型鎖T及びそれに適合するデオキシヌクレオチドが存在するとき、系の反応速度データは、比較対照実験の他の4つのグループのデータと異なり得る。
7.ステップII−7の方法に従い、高電流状態に対応する高状態時間(τhi)及び低電流状態に対応する低状態時間(τlow)を統計的に解析した。実験結果を図12に示す(左パネルは低状態時間を示し、右パネルは高状態時間を示す)。平均低状態時間及び平均高状態時間に従い、この系のDNA合成速度を計算すると、1秒あたり232.83dCTPヌクレオチドであり(表1参照)、これは、先行文献(Tivoli J. Olsen, Yongki Choi, Patrick C. Sims, O. Tolga Gul, Brad L. Corso, Chengjun Dong, William A. Brown, Philip G. Collins and Gregory A. Weiss, Electronic Measurements of Single-Molecule Processing by DNA Polymerase I (Klenow Fragment), Journal of the American Chemical Society 2013, 135, 7855-7860)で示された合成速度に実質的に一致している。
VI.DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを使用するランダム配列のDNA塩基配列決定
ステップ1完了後、同じものを含むグラフェン系単一分子デバイスのマイクロキャビティ内に、DTTバッファー30μL中の100nMのランダム鎖(配列番号9)及び(濃度5μMのdATP、dGTP、dCTP及びdTTPを含む)溶液5μLを添加し、DNAポリメラーゼによって行われたDNA合成中の経時的なソースドレイン間電流の変化、すなわち、DNAポリメラーゼによって行われたDNA重合中の反応速度データを試験するために、10分間供試した。実験結果を図13に示し、図13は、4つの異なる振動信号を示している。その後、予備的なピーク統計を、MatLabソフトウェアを使用して行った。実験結果を図13の表に示す。この表及び表1のデータから、異なる電流に対応する塩基を決定することができ、それによって、電流の変化に従いDNA配列が決定される。このため、DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスは、DNA塩基配列決定を行うことに使用することができる。
ステップ1完了後、同じものを含むグラフェン系単一分子デバイスのマイクロキャビティ内に、DTTバッファー30μL中の100nMのランダム鎖(配列番号9)及び(濃度5μMのdATP、dGTP、dCTP及びdTTPを含む)溶液5μLを添加し、DNAポリメラーゼによって行われたDNA合成中の経時的なソースドレイン間電流の変化、すなわち、DNAポリメラーゼによって行われたDNA重合中の反応速度データを試験するために、10分間供試した。実験結果を図13に示し、図13は、4つの異なる振動信号を示している。その後、予備的なピーク統計を、MatLabソフトウェアを使用して行った。実験結果を図13の表に示す。この表及び表1のデータから、異なる電流に対応する塩基を決定することができ、それによって、電流の変化に従いDNA配列が決定される。このため、DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスは、DNA塩基配列決定を行うことに使用することができる。
[実施例2]DNAポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスを使用するDNA塩基配列決定
I.DNAポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスの調製
1.シリコンナノワイヤ単一分子デバイスの調製
シリコンナノワイヤ単一分子デバイスの調製は、次の文献を参照することができる:Cao Y, Dong S, Liu S, He L, Gan L, Yu X, Steigerwald ML, Wu X, Liu Z, Guo X. Building high-throughput molecular junctions using indented graphene point contacts. Angew Chem Int Ed Engl. 2012 Dec 3; 51(49): 12228-32。シリコンナノワイヤ単一分子デバイス上にナノギャップを有するシリコンナノワイヤ電極がある(以下、シリコンナノワイヤ電極として言及する)。
I.DNAポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスの調製
1.シリコンナノワイヤ単一分子デバイスの調製
シリコンナノワイヤ単一分子デバイスの調製は、次の文献を参照することができる:Cao Y, Dong S, Liu S, He L, Gan L, Yu X, Steigerwald ML, Wu X, Liu Z, Guo X. Building high-throughput molecular junctions using indented graphene point contacts. Angew Chem Int Ed Engl. 2012 Dec 3; 51(49): 12228-32。シリコンナノワイヤ単一分子デバイス上にナノギャップを有するシリコンナノワイヤ電極がある(以下、シリコンナノワイヤ電極として言及する)。
次のステップ2〜7は、文献(Gen He, Jie Li, Haina Ci, Chuanmin Qi*, and Xuefeng Guo*, Direct measurement of single-molecule DNA hybridization dynamics with single-base resolution, Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 9036)において報告された方法に従い行った。
2.エッチング
ステップ1完了後、シリコンナノワイヤ単一分子デバイスとHF溶液とを混合し、エッチングされたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスを取得した。エッチングされたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスの部分構造の模式図を図14(1)に示す。
ステップ1完了後、シリコンナノワイヤ単一分子デバイスとHF溶液とを混合し、エッチングされたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスを取得した。エッチングされたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスの部分構造の模式図を図14(1)に示す。
3.電気回路の構成
ステップ2完了後、エッチングされたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスと10−ウンデシン酸(図14(2)参照)とを混合し、電気回路を取得した。電気回路の部分構造の模式図を図14(3)に示す。
ステップ2完了後、エッチングされたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスと10−ウンデシン酸(図14(2)参照)とを混合し、電気回路を取得した。電気回路の部分構造の模式図を図14(3)に示す。
4.スルホ−NHS活性化
ステップ3完了後、電気回路とN−ヒドロキシスルホスクシシンイミド(スルホ−NHS、図14(4)参照)とを混合し、スルホ−NHS活性化電気回路を取得した。スルホ−NHS活性化電気回路の部分構造式を図14(5)に示す。
ステップ3完了後、電気回路とN−ヒドロキシスルホスクシシンイミド(スルホ−NHS、図14(4)参照)とを混合し、スルホ−NHS活性化電気回路を取得した。スルホ−NHS活性化電気回路の部分構造式を図14(5)に示す。
5.処理されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスの取得
ステップ4完了後、スルホ−NHS活性化電気回路とN−(2−アミノエチル)マレイミド塩酸塩(図14(6)参照)とを混合し、処理されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスを取得した。処理されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスの部分構造式を図14(7)に示す。
ステップ4完了後、スルホ−NHS活性化電気回路とN−(2−アミノエチル)マレイミド塩酸塩(図14(6)参照)とを混合し、処理されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスを取得した。処理されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスの部分構造式を図14(7)に示す。
6.E.coliDNAポリメラーゼIの再構成
本方法は、実施例1のステップI−6と同様である。
本方法は、実施例1のステップI−6と同様である。
7.DNAポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスの調製
ステップ6完了後、処理されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスと過剰量の再構成DNAポリメラーゼI(図7(8)参照)とを混合した(図3の右パネル参照)。DNAポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスの部分構造の模式図を図7(7)に示す。
ステップ6完了後、処理されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスと過剰量の再構成DNAポリメラーゼI(図7(8)参照)とを混合した(図3の右パネル参照)。DNAポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスの部分構造の模式図を図7(7)に示す。
調製したDNAポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスを、低分解能プローブステーション上に置き、伝導率を観測した。伝導率を有するDNAポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスを、次の実験に使用した。
II.DNAポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスを使用する鋳型鎖CのDNA塩基配列決定
他のステップは変更せず実施例1のステップIIに従い、DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスをDNAポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスに置き換えた。この系において取得されたDNA合成速度は、1秒あたり65.30dGTPヌクレオチドであり、これは、DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを使用する鋳型鎖CのDNA塩基配列決定の結果と大きくは異なっていない。
他のステップは変更せず実施例1のステップIIに従い、DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスをDNAポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスに置き換えた。この系において取得されたDNA合成速度は、1秒あたり65.30dGTPヌクレオチドであり、これは、DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを使用する鋳型鎖CのDNA塩基配列決定の結果と大きくは異なっていない。
III.DNAポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスを使用する鋳型鎖AのDNA塩基配列決定
他のステップは変更せず実施例1のステップIIIに従い、DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスをDNAポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスに置き換えた。この系において取得されたDNA合成速度は、1秒あたり117.27dTTPヌクレオチドであり、これは、DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを使用する鋳型鎖CのDNA塩基配列決定の結果と大きくは異なっていない。
他のステップは変更せず実施例1のステップIIIに従い、DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスをDNAポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスに置き換えた。この系において取得されたDNA合成速度は、1秒あたり117.27dTTPヌクレオチドであり、これは、DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを使用する鋳型鎖CのDNA塩基配列決定の結果と大きくは異なっていない。
IV.DNAポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスを使用する鋳型鎖GのDNA塩基配列決定
他のステップは変更せず実施例1のステップIVに従い、DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスをDNAポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスに置き換えた。この系において取得されたDNA合成速度は、1秒あたり154.51dCTPヌクレオチドであり、これは、DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを使用する鋳型鎖GのDNA塩基配列決定の結果と大きく異なっていない。
他のステップは変更せず実施例1のステップIVに従い、DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスをDNAポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスに置き換えた。この系において取得されたDNA合成速度は、1秒あたり154.51dCTPヌクレオチドであり、これは、DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを使用する鋳型鎖GのDNA塩基配列決定の結果と大きく異なっていない。
V.DNAポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスを使用する鋳型鎖TのDNA塩基配列決定
他のステップは変更せず実施例1のステップIVに従い、DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスをDNAポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスに置き換えた。測定されたDNA合成の振動信号は、DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスの測定と一致している。この系において取得されたDNA合成速度は、1秒あたり234.60dATPヌクレオチドであり、これは、DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを使用する鋳型鎖TのDNA塩基配列決定の結果と大きく異なっていない。
他のステップは変更せず実施例1のステップIVに従い、DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスをDNAポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスに置き換えた。測定されたDNA合成の振動信号は、DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスの測定と一致している。この系において取得されたDNA合成速度は、1秒あたり234.60dATPヌクレオチドであり、これは、DNAポリメラーゼによって修飾されたグラフェン系単一分子デバイスを使用する鋳型鎖TのDNA塩基配列決定の結果と大きく異なっていない。
従って、DNAポリメラーゼによって修飾されたシリコンナノワイヤ単一分子デバイスは、DNA塩基配列決定を行うことに使用することができる。
Claims (15)
- DNAポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイスであって、該単一分子デバイスは、二次元ナノ材料単一分子デバイス、好ましくはグラフェン系単一分子デバイスであるか、又は、低次元ナノ材料単一分子デバイス、好ましくは一次元ナノ材料単一分子デバイスであり、より好ましくはシリコンナノワイヤ単一分子デバイスである、DNAポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイス。
- 前記DNAポリメラーゼは、前記単一分子デバイスとの結合サイトを有し、前記結合サイトを提供するアミノ酸残基が、前記DNAポリメラーゼのコンフォメーション変化領域に配されている、請求項1に記載のDNAポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイス。
- 前記DNAポリメラーゼは、一つの結合サイトのみを介して前記単一分子デバイスに結合され、好ましくは、前記結合サイトを提供する前記アミノ酸残基は、前記DNAポリメラーゼ中に一度だけ生じる、請求項1又は2に記載のDNAポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイス。
- 前記DNAポリメラーゼが、
b1)配列番号3に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくはその機能変異体、又は、
b2)配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくはその機能変異体
である、請求項1乃至3いずれか1項に記載のDNAポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイス。 - 前記結合サイトを提供する前記アミノ酸残基は、配列番号1に示されるアミノ酸配列のN末端から790番目の位置におけるシステイン残基である、請求項4に記載のDNAポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイス。
- DNAポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイスにおける該DNAポリメラーゼが、マイクロキャビティ内に含まれ、好ましくは、前記マイクロキャビティは、ポリジメチルシロキサンから作られている、請求項1乃至5いずれか1項に記載のDNAポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイス。
- (1)塩基配列が決定されるDNAとシークエンスプライマー及びdNTPとを混合して反応系を取得し、
(2)ステップ(1)の反応系と請求項1乃至6いずれか1項に記載のDNAポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイスとを接触させ、
(3)DNA合成中、経時的に、DNAポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイスにおけるソースドレイン間電流の電気信号を検出し、
(4)前記電気信号を解析し、配列結果を得ること、
を備えたDNA塩基配列決定法。 - ステップ(1)において、前記塩基配列が決定されるDNAは、一本鎖DNA又は二本鎖DNAであり、且つ、
前記塩基配列が決定されるDNAが二本鎖DNAである場合、前記二本鎖DNAは、初めに変性され、その後前記シークエンスプライマー及びdNTPと混合される、請求項7に記載のDNA塩基配列決定法。 - ステップ(1)において、前記シークエンスプライマーのヌクレオチド配列に対する逆相補的ヌクレオチド配列を有するタグ配列が、前記塩基配列が決定されるDNAの3’末端に結合され、好ましくは、前記シークエンスプライマーのヌクレオチド配列は、配列番号4に示される配列であり、前記タグ配列のヌクレオチド配列は、配列番号4に示される配列の5’末端から51〜68番目の位置における配列である、請求項7又は8に記載のDNA塩基配列決定法。
- ステップ(2)において、DNAポリメラーゼによって修飾された単一分子デバイスにおける該DNAポリメラーゼは、マイクロキャビティ内に含まれ、好ましくは、前記マイクロキャビティは、ポリジメチルシロキサンから作られ、ステップ(1)における反応系が、前記マイクロキャビティ内に加えられる、請求項7乃至9いずれか1項に記載のDNA塩基配列決定法。
- ステップ(4)が、
前記ソースドレイン間電流のピーク値を統計的に解析し、各ピーク値に対応する塩基に係る配列結果を取得すること、又は、
高電流状態に対応する高状態時間及び低電流状態に対応する低状態時間を統計的に解析し、平均低状態時間及び平均高状態時間を計算し、各平均低状態時間及び平均高状態時間に対応する塩基に係る配列結果を取得すること、
を備えた、請求項7乃至10いずれか1項に記載のDNA塩基配列決定法。 - DNAポリメラーゼと単一分子デバイスとを備えるDNA塩基配列決定のためのキットであって、
前記単一分子デバイスは、二次元ナノ材料単一分子デバイス、好ましくはグラフェン系単一分子デバイスであるか、又は、低次元ナノ材料単一分子デバイス、好ましくは一次元ナノ材料単一分子デバイスであり、より好ましくはシリコンナノワイヤ単一分子デバイスである、キット。 - 前記DNAポリメラーゼが、
b1)配列番号3に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくはその機能変異体、又は、
b2)配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくはその機能変異体
である、請求項12に記載のキット。 - 前記DNAポリメラーゼ及び前記単一分子デバイスは、分離された区画に存在しており、使用される際にサイトが結合され、又は、前記DNAポリメラーゼは前記単一分子デバイスに結合され、好ましくは、前記DNAポリメラーゼは前記単一分子デバイスとの結合サイトを有し、前記結合サイトを提供するアミノ酸残基は前記DNAポリメラーゼのコンフォメーション変化領域に配され、より好ましくは、前記DNAポリメラーゼは、マイクロキャビティ内に含まれている、請求項12又は13に記載のキット。
- シークエンスプライマー、dNTP及び/又は使用説明をさらに備えている、請求項12乃至14いずれか1項に記載のキット。
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