CN108220433A - 乳腺癌标志物及其应用 - Google Patents

乳腺癌标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及作为乳腺癌标志物的circRNA及其用途，所述circRNA选自circTADA2A‑E6、circTADA2A‑E5/E6、circNOL10、circNSUN2、circCSRNP2、circFAM125B、circCDC27和circABCC1。本发明还涉及用于乳腺癌诊断、预后和治疗的试剂盒、微阵列、药物以及相关的方法和用途。

Description

乳腺癌标志物及其应用
技术领域
本发明涉及乳腺癌诊断、预后和治疗的组合物、方法和用途。具体 而言，本发明涉及与乳腺癌诊断、预后和治疗的circRNA分子、与之相 关的乳腺癌诊断、预后和治疗的试剂盒和微阵列、以及相关的方法和用 途。
背景技术
乳腺癌是一种常见的恶性肿瘤，在全球女性癌症发病率中位居第一。 近年来，中国的乳腺癌发病率和死亡率逐年上升，严重危及了中国女性 的健康。从分子改变与临床相关的角度来看，乳腺癌是一种复杂而多样 的疾病，应当被认为是一类分子水平各不相同的肿瘤。现今临床上乳腺 癌至少有4种分子亚型：Luminal A(ER+PR+Her2-)、Luminal B(ER+PR- Her2-)、Her2(ER-PR-和Her2+)和TNBC(ER-PR-和Her2-)。现如今， 生物标志物的检测也开始用于乳腺癌的预后和辅助化疗如21基因标记 (21-gene signature)(Oncotype DX)和欧洲普通70基因检测MammaPrint (European common 70-gene detectionMammaPrint)。因此，发现，鉴定并 对乳腺癌的生物标志物进行分组的研究是必须和重要的。
环状RNA(circRNA)据认为是由线性pre-mRNA非经典剪接成环状 形式所致。circRNA在进化上保守，在秀丽线虫(C.elegans)、斑马鱼、 果蝇、小鼠以及人类中circRNA结构稳定且丰度高。某些circRNA的丰 度高达其线性对应物的200倍。circRNA被确定是主要由外显子或内含 子产生的稳定结构，并且通过反向剪接(back splicing)或套索内含子(lariat intron)差异产生(differentially generated)，然后形成既无5’帽也无3’尾的共价闭合环结构。外显子circRNA在细胞中非常稳定，相比之下mRNA 的平均半衰期为10h，大多数种类的外显子circRNA半衰期超过48h。 外显子circRNA和内含子circRNA在调控基因表达中皆起作用。最近的 研究表明：circRNA可能通过以下几种方式发挥其生物学功能，如积极 参与pre-mRNA剪接、通过与蛋白结合影响基因表达、通过表观遗传调 控miRNA的海绵(epigenetic miRNA sponges)、RNA转运者、以及促进 其母体mRNA转录。迄今为止，超过10,000种人类circRNA已被发现， 广泛分布且多样化地存在于人类，通常具有组织特异性和发育期特异性， 与分子生物学和分子肿瘤学密切相关。
环状RNA(circRNA)作为广泛分布且多样化的、具有巨大调控效能 的内源非编码RNA，已有研究证明circRNA在若干类型的疾病(诸如动 脉粥样硬化和神经系统病症)的发生中发挥着重要作用。最近几年， circRNA在癌症中所起的作用和功能成为癌症研究领域的新焦点。 circRNA的独特特征不断地被揭示和发现，将扩展对癌症的认识，尤其 在癌症发生和癌的恶性发展方面。在人类癌症如食管癌、CRC和胃癌中 circRNA表达异常。circITCH在食管鳞状细胞癌中通过与miRNA如 miR-7、miR-17和miR-214相互作用显示出抗肿瘤功能。Ahmed等人通 过Ingenuity IPA工具试剂盒(QIAGEN Redwood City,www.qiagen.com/ingenuity)富集RNA发现了在乳腺癌或卵巢癌中差异表 达的312种circRNA。
文献报道，circRNA的总体特征是种类繁多且数量庞大、分布广泛、 较强的进化保守性、组织特异性、极高的稳定性和高丰度表达。circRNA 这种独特的优势，使之成为可用于疾病诊断、预后和预测治疗反应的新 生物标志物。首先，circRNAs被证明为果蝇属的衰老生物标志物。在胃 癌和肝细胞癌(HCC)中，circRNA发现可作为新的癌症生物标志物。最近Kalari研究小组通过对TCGA库中大量样本的乳腺癌circRNA测序 (circ-Seq)进行分析后，鉴定出新的具有乳腺癌特异性的circRNA，并且 还分类出对应不同乳腺癌亚型的独特circRNA组：三阴性(TNBC)、雌激 素受体阳性(ER+)和HER2阳性(HER2+)，从此可看出circRNA有可能是 用于乳腺癌诊断的新生物标志物。此外，circRNA在人类体液如血浆、 唾液和外泌体(exosomes)中可检测到，表明circRNA在临床上应用于癌 症诊断的可能更大。
发明内容
本发明人对乳腺癌患者原发性肿瘤样本中的circRNA表达进行了研 究，鉴定出可用作乳腺癌标志物或乳腺癌靶标的circRNA。
按照本发明的第一方面，提供用作乳腺癌标志物(例如诊断或预后标 志物)或乳腺癌靶标的circRNA，所述circRNA选自以下的一种或更多种： circTADA2A-E6、circTADA2A-E5/E6、circNOL10、circNSUN2、 circCSRNP2、circFAM125B、circCDC27和circABCC1。
按照本发明的第二方面，提供用于检测第一方面所述的circRNA的 试剂和/或微阵列在制备用于乳腺癌诊断或预后的试剂盒中的用途。
按照本发明的第三方面，提供用于检测第一方面所述的circRNA的 特异性探针在制备用于乳腺癌诊断或预后的微阵列中的用途。
按照本发明的第四方面，提供一种乳腺癌诊断和/或预后的试剂盒， 其包含用于测量根据第一方面1所述的circRNA表达水平的试剂或微阵 列。
按照本发明的第五方面，提供一种诊断受试者是否患有乳腺癌或处 于发生乳腺癌风险、或者对乳腺癌进行预后的方法，其包括测量测试样 本中第一方面所述的circRNA的表达水平。所述方法可以其包括：
从获自受试者的测试样本逆转录RNA，获得逆转录产物；
检测第一方面所述的circRNA的表达水平；和
将测试样本的所述circRNA表达水平与作为对照的正常乳腺组织的 所述circRNA表达水平相比较，
其中测试样本的所述circRNA表达水平低于对照样本的所述 circRNA表达水平，预示着受试者患有乳腺癌或处于发生乳腺癌风险， 或者预示着乳腺癌预后不良。
按照本发明的第六方面，circTADA2A-E6、提高circTADA2A-E6表 达水平的药剂和/或表达circTADA2A-E6的核酸在制备抑制或治疗乳腺 癌的药物中的用途。
按照本发明的第七方面，提供一种用于鉴定乳腺癌抑制剂的方法， 所述方法包括鉴定提高乳腺癌细胞中circRNA的表达水平的物质。所述 circRNA优选为circTADA2A-E6和/或circNOL10。
按照本发明的第八方面，提供用第七方面所述的方法鉴定的乳腺癌 抑制剂。
按照本发明的第九方面，提供第八方面所述的抑制剂在制备用于抑 制或治疗乳腺癌的药物中的用途。
按照本发明的第十方面，提供一种用于抑制或治疗乳腺癌的药物组 合物，其包含circRNA、提高circRNA表达水平的药剂、表达circRNA 的核酸和/或第八方面所述的乳腺癌抑制剂，所述药物组合物任选还含有 用于抑制或治疗乳腺癌的其他药剂。所述circRNA优选为 circTADA2A-E6和/或circNOL10。
按照本发明的第十一方面，提供一种用于抑制或治疗乳腺癌的方法， 其包括给有需要的患者施用抑制治疗有效量的circRNA、提高circRNA 表达水平的药剂、表达circRNA的核酸和/或第八方面所述的乳腺癌抑制 剂，任选施用用于抑制或治疗乳腺癌的其他药剂。所述circRNA优选为circTADA2A-E6和/或circNOL10。
对于如上所述的用途、微阵列、试剂盒、方法、组合物或抑制剂， 其中所述的乳腺癌可以选自Luminal A和B、HER2+和三阴亚型乳腺癌， 更优选为三阴亚型乳腺癌。
附图说明
图1.人正常乳腺组织和乳腺癌组织中环状RNA的概况分析。(a)散 点图.X轴：正常乳腺组织(标准化的)，Y轴：TNBC组织(标准化的)。 绿色线代表倍数变化。顶部绿色线之上和底部绿色线之下的circRNA表 示两组样本之间circRNA表达水平变化超过1.5倍。(b)火山图.X轴：log2 (变化倍数)，Y轴：-log10(P值)。垂直绿色线对应于1.5倍上调和下调， 水平绿色线表示p值为0.05。图中的红点表示具有统计学意义的差异表 达的circRNA。(c)正常乳腺组织和乳腺癌组织(Luminal A和TNBC亚型) 之间的circRNA概况比较。(d)乳腺癌组织和人正常乳腺组织之间差异表 达的circRNA的聚类热图(clustered heatmap)，行表示circRNA，列表示 组织样本。根据Pearson相关，对circRNA进行分类。数值表示各组换 算为log10的平均SRPBM。(e)在乳腺癌中差异表达的215种circRNA 和它们在乳腺癌中的靶标miRNA的网络。该网络由212种上调的 circRNA(红色节点)、93种下调的circRNA(黄色节点)及它们的靶标 miRNA(蓝色节点)组成。(f)8种所选circRNA的微阵列数据和qRT-PCR 结果之间的比较。
图2.两种circTADA2A的表达水平和这两种circTADA2A对 TNBC的预后性和预测性价值。(a-b)相比于正常乳腺组织(n＝16)，以下 不同乳腺癌亚型中circTADA2A-E6(a)和circTADA2A-E5/E6(b)的表达 水平通过qRT-PCR来进行验证：LA(n＝25)、LB(n＝21)、Her-2(n＝17) 和TNBC(n＝115)。*P<0.05,**P<0.01。(c-d)乳腺癌细胞系和无限增殖化 乳腺细胞系MCF-10A中circTADA2A-E6(c)和circTADA2A-E5/E6(d)表 达通过qRT-PCR分析。(e-f)分别在TNBC(n＝115)、LA(n＝25)、LB(n＝21) 和Her-2(n＝17)中circTADA2A-E6和circTADA2A-E5/E6之ROC分析的 AUC。(g-h)circTADA2A-E6和circTADA2A-E5/E6表达与无病生存期 (disease-free survival,DFS)(h)和总生存期(overall survival,OS)(g)的相关 性。n＝107,115位患者中的8位(6.96％)在首次手术后失访。
图3.circTADA2A-E6的过表达抑制乳腺癌细胞增殖、集落形成、 侵袭。(a)慢病毒circTADA2A-E6表达载体plvx-CMV-circTADA2A- E6-EF1-ZsGreen-Puro的构建。(b)在MCF-7和MDA-MB-231细胞中用 circTADA2A-E6载体或对照载体转染后，通过qRT-PCR分析异位circTADA2A-E6表达。(c)具有异位circTADA2A-E6表达的MCF-7和 MDA-MB-231细胞的CCK-8测定和增殖率。(d)过表达circTADA2A-E6 的MCF-7和MDA-MB-231细胞的克隆形成测定。代表性图示于左侧， 转化灶/孔的定量示于右侧。误差条表示三个独立实验的平均值±SD。(e) 过表达circTADA2A-E6的MCF-7和MDA-MB-231细胞划痕试验的代表 性图像。(f)用Boyden小室研究异位circTADA2A-E6表达对细胞侵袭的 影响。细胞穿透的形态学比较示于左侧，而穿透细胞的定量示于右侧。 误差条表示三个独立实验的平均值±SD。*p<0.05,**p<0.01。(g)E-cad 和波形蛋白的蛋白质水平通过过表达circTADA2A-E6的MCF-7和 MDA-MB-231细胞的蛋白质印迹进行评价。图中，“vector control”为载 体对照。
图4.circTADA2A沉默促进乳腺癌细胞增殖、克隆形成、迁移和侵 袭。(a)特异性结合至circTADA2A-E6反向剪接接点的siRNA的示意图 和靶标序列。(b)用两种circTADA2A-E6siRNA转染细胞后circTADA2A- E6RNA表达的qRT-PCR分析。(c)通过CCK-8测定，评价circTADA2A-E6 siRNA对MCF-7和MDA-MB-231细胞细胞增殖的影响。(d)对用两种circTADA2A-E6siRNA转染的MCF-7和MDA-MB-231细胞的集落形成 测定。代表性图示于左侧，转化灶/孔的定量示于右侧。误差条表示平均 值±SD。数据代表三个独立实验。(e)用Boyden小室研究circTADA2A-E6 siRNA表达对细胞侵袭的影响。细胞穿透的形态学比较示于左侧，而穿 透细胞数的定量示于右侧。(f)被两种circTADA2A-E6siRNA转染的 MCF-7和MDA-MB-231细胞的伤口愈合试验。代表性图像示于左侧， 对细胞迁移的定量示于右侧。(g)用MCF-7和MDA-MB-231细胞，在用 两种circTADA2A-E6siRNA转染之后，通过蛋白质印迹评价E-cad和波 形蛋白(Vimentin)的蛋白质水平。
图5.circNL10的表达水平以及circNL10的预后性和预测性价值。 (a)实时荧光定量PCR分析不同分子分型乳腺癌组织与正常乳腺组织中 circNOL10的表达水平：LA(n＝25),LB(n＝21),Her-2(n＝17)以及TNBC (n＝115)，正常(Normal)(n＝16).*P<0.05,**P<0.01。(b)实时荧光定量PCR 分析乳腺癌细胞系以及类正常乳腺细胞MCF-10A中circNOL10的表达 水平。(c).ROC曲线分析—circNOL10在不同分子分型乳腺癌中的曲线 下面积。(d)circNOL10的表达水平与DFS和OS的关系。参与分析的病 例数为107例(115例病例中有8例在手术后失访，失访率为6.96％)。
具体实施方式
在描述本发明方法和组合物之前，应当理解，本发明并不局限于所 述的特定方法或组合物，因此当然可能会有所不同。还应当理解的是， 本文所使用的术语仅用于描述特定的实施方案，并非限制性的。描述实 施例是为本领域的普通技术人员提供如何制造和使用本发明的完整的 公开内容和描述，并非旨在限制发明人视为其发明的范围，也并非旨在表示下面的实验是进行的全部或仅有的实验。已经努力确保所用数字(例 如数量、温度等)的准确度，但一些实验误差和偏差应该予以考虑。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有如由本发 明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。现在描述一些潜在 的和优选的方法和材料，尽管类似或等同于本文描述的任何方法和材料 可以用于实施或测试本发明。本文提及的所有出版物在此通过引用并入， 以公开和描述与所引用的出版物有关的方法和/或材料。可以理解的是， 存在矛盾的情况下，以本公开内容取代所引用的出版物中的任何公开内 容。
如在阅读本公开内容时对本领域技术人员显而易见的，每个本文所 述和说明的单独的实施方案具有分立的组件和特征，其可容易地与其他 若干实施方案中的特征分离或结合，而不脱离本发明的范围或实质。可 以按所列举事件的顺序或逻辑上可能的任何其他顺序实施任何列举的 方法。
除非另外说明，否则本文和所附权利要求中所用的“一个(种)”意指 “一个(种)或多个(种)”。
当提供数值范围时，应当理解，该范围的上限和下限之间的每个中 间值(至下限单位的十分之一)也被具体地公开，除非上下文另有明确说 明。在所述范围中的任何所述值或中间值之间的各个较小的范围以及在 所述范围内的其他所述值或中间值包含在本发明之内。这些较小范围的 上限和下限可独立地包含在该范围内或排除在该范围之外，并且服从于 所述范围中任何所特定地排除的，其中上下限中任一个或两个或无一个 包含在所述较小范围内的每个范围也包含在本发明内。当所述范围包含 一个或两个界限，除去任一或两个那些包含在内的界限的范围也包含在 本发明中。
“治疗剂”是可用于治疗疾病的原子、分子或化合物。治疗剂的实例 包括抗体、抗体片段、肽、药物、毒素、酶、核酸酶、激素、免疫调节 剂、环状RNA、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、螯合剂、硼化合 物、光敏剂、染料和放射性同位素。
“环状RNA”或“circRNA”意指一类新型的非编码RNA,广泛且多样 地存在于哺乳动物细胞中，具有调控基因表达作用的内源性RNA分子, 主要由外显子转录本及内含子经非线性反向剪接，其首尾通过共价键形 成闭合的环，表现出与线性RNA不同的特性。
本发明提供以下技术方案：
1.circRNA作为乳腺癌标志物的用途，其中所述circRNA选自以 下的一种或更多种：circTADA2A-E6、circTADA2A-E5/E6、circNOL10、 circNSUN2、circCSRNP2、circFAM125B、circCDC27和circABCC1，优 选选自以下的一种或更多种：circTADA2A-E6、circTADA2A-E5/E6和 circNOL10。
2.用于检测上述1中所述的circRNA的试剂和/或微阵列在制备用 于乳腺癌诊断的试剂盒中的用途，所述试剂优选包括特异性探针。
3.用于检测上述1中所述的circRNA的特异性探针在制备用于乳腺 癌诊断的微阵列中的用途。
4.乳腺癌诊断用的试剂盒，其包含用于测量根据上述1所述的 circRNA水平的试剂或微阵列，所述试剂优选包括特异性探针。
5.一种诊断受试者是否患有乳腺癌或处于发生乳腺癌风险的方法， 其包括测量测试样本中根据上述1所述的circRNA的水平，所述方法优 选包括：
从获自受试者的测试样本逆转录RNA，获得逆转录产物；
测量根据上述1所述的circRNA的水平；和
将测试样本的所述circRNA水平与作为对照的正常乳腺组织的所述circRNA水平相比较，
其中测试样本的所述circRNA水平低于对照样本的所述circRNA水 平，预示着受试者患有乳腺癌或处于发生乳腺癌风险。
6.根据上述5所述的方法，其中步骤(2)包括将所述逆转录产物与所 述circRNA特异性探针或用于检测所述circRNA的微阵列杂交。
7.根据上述5所述的方法，所述方法包括通过qRT-PCR测量所述 circRNA的水平。
8.根据上述1所述的circRNA作为乳腺癌预后标志物的用途。
9.用于测量circTADA2A-E6和/或circNOL10水平的试剂或微阵列 在制备乳腺癌预后用的试剂盒中的用途，所述试剂优选包括特异性探针。
10.circTADA2A-E6和/或circNOL10的特异性探针在制备乳腺癌预 后用的微阵列中的用途。
11.用于乳腺癌预后的试剂盒，其包含用于检测circTADA2A-E6和 /或circNOL10的试剂和/或微阵列，所述试剂优选包括特异性探针。
12.一种用于乳腺癌患者预后的方法，其包括测量测试样本中 circTADA2A-E6和/或circNOL10的水平，所述方法优选包括：
(1)从获自受试者的测试样本逆转录RNA，以获得逆转录产物；
(2)检测circTADA2A-E6和/或circNOL10的水平；和
(3)将测试样本的所述circTADA2A-E6和/或circNOL10水平与作 为对照的正常乳腺组织的所述circTADA2A-E6和/或circNOL10水平相 比较，
其中测试样本的所述circTADA2A-E6和/或circNOL10水平低于对 照样本的所述circTADA2A-E6和/或circNOL10水平，预示着所述乳腺 癌预后较差。
13.根据上述12所述的方法，其中步骤(2)包括将所述逆转录产物与 所述circTADA2A-E6和/或circNOL10的特异性探针或用于检测所述 circTADA2A-E6和/或circNOL10的微阵列杂交。
14.根据上述12所述的方法，所述方法包括通过qRT-PCR测量所 述circTADA2A-E6和/或circNOL10的水平。
15.circTADA2A-E6和/或circNOL10、提高circTADA2A-E6和/或 circNOL10水平的药剂和/或表达circTADA2A-E6和/或circNOL10的核 酸在制备抑制或治疗乳腺癌的药物中的用途。
16.一种用于鉴定乳腺癌抑制剂的方法，所述方法包括鉴定提高乳 腺癌细胞中circTADA2A-E6和/或circNOL10的水平的物质。
17.用根据上述16所述的方法鉴定的乳腺癌抑制剂。
18.根据上述17所述的抑制剂在制备用于抑制或治疗乳腺癌的药 物中的用途。
19.一种用于抑制或治疗乳腺癌的药物组合物，其包含 circTADA2A-E6、提高circTADA2A-E6水平的药剂、表达circTADA2A-E6 的核酸和/或根据上述17所述的乳腺癌抑制剂，所述药物组合物任选还 含有用于抑制或治疗乳腺癌的其他药剂。
20.一种用于抑制或治疗乳腺癌的方法，其包括给有需要的患者施 用抑制治疗有效量的circTADA2A-E6、提高circTADA2A-E6水平的药 剂、表达circTADA2A-E6的核酸和/或根据上述17所述的乳腺癌抑制剂， 任选施用用于抑制或治疗乳腺癌的其他药剂。
21.根据上述1-20中任一项的用途、微阵列、试剂盒、方法、组合 物或抑制剂，其中所述乳腺癌选自Luminal A和B、HER2+和三阴亚型 乳腺癌，更优选为三阴亚型乳腺癌。
实施例
下面参考附图和以下具体实施例，进一步描述本发明。应当理解， 本发明并不限于这些具体的实施例。
材料和方法
临床人群和样本采集
从中国汕头大学医学院附属肿瘤医院2009年6月至2015年12月 之间的乳腺癌手术样本，采集了总共121个乳腺癌组织(LA,n＝25,LB n＝21,Her-2,n＝17,TNBC,n＝58)和16个正常乳腺组织。分别从中国浙江 省肿瘤医院和临沂人民医院采集了另外57个TNBC。汕头大学医学院、 浙江省肿瘤医院和临沂人民医院的医学伦理委员批准了该方案，并且参与者在手术之前签署了书面知情同意书。
所有的新鲜肿瘤组织样本被立即保存在 RNA稳定溶液 ( RNA Stabilization Solution,Invitrogen,Beijing,China)中。为 了让该溶液充分渗透所述组织，将组织保持在4℃过夜，然后取出清上 清液，将其转移至-80℃以长期储存。从距离癌边缘5cm处取对应的相 邻非肿瘤组织，经有经验的病理学家评估，该组织不含明显的肿瘤细胞。 根据国际抗癌联合会(International Union Against Cancer)的肿瘤-淋巴结- 转移(TNM)分期系统，对肿瘤进行分期。按照美国国家综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network(NCCN))肿瘤学临床实践指南 (V.1.2011)，对组织学分级进行评估。对正常乳腺组织进行H&E染色并 由病理学家来验证。
circRNA微阵列杂交
样本制备和微阵列杂交基于Arraystar标准方案(Arraystar Inc.)进行。 简言之，总RNA用RNA酶(Epicentre,Inc.)消化，除去线性RNA并富集 环状RNA。然后，对所富集的环状RNA进行扩增，用随机引发法将其 转录为荧光cRNA(Arraystar Super RNA LabelingKit；Arraystar)。经标记 的cRNA用RNeasy Mini Kit(Qiagen)纯化。用NanoDrop ND-1000测定 标记cRNA的浓度和比活(pmol Cy3/μgcRNA)。将标记的cRNA杂交到 Arraystar HumancircRNA Array(8x15K,Arraystar)上。洗涤玻片后，阵列 用Agilent Scanner G2505C扫描。
circRNA微阵列数据分析
用Agilent Feature Extraction软件(version 11.0.1.1)提取数据。用R软 件包进行一系列数据处理，包括分位数标准化(quantile normalization)。 根据倍数变化截止值(FC>＝1.5)和具有统计学意义的P值(p值<＝0.05)， 选择差异表达的circRNA。应用基于TargetScan42和miRanda43的 Arraystar自制计算机程序，预测circRNA的miRNA靶标和circRNA-miRNA相互作用。为集中所靶向的miRNA概况，用miRNA 支持载体回归(mirSVR)算法，对所预测的miRNA靶标的功效进行计分 和排序(rank)。相应地，对于每种circRNA，鉴定出mirSVR计分最高的 5种miRNA，来建立“前5”circRNA-miRNA网络(1种circRNA与5种miRNA相连)。
用qRT-PCR验证候选circRNA
用Trizol试剂(Life Technologies,Carlsbad,USA)，按照厂商的说明， 从乳腺癌组织和正常乳腺组织提取组织总RNA。RNA样本的纯度和浓 度用NanoDrop ND-1000(ThermoFisher Scientific,Wilmington,DE)测定。 通过在变性琼脂糖凝胶上电泳评价RNA完整性。制备RNA并将其储存 于-80℃以供验证实验用。
用 II First Strand cDNASynthesis Kit(Geneseed,China)，由 总RNA制备cDNA。qRT-PCR中所用的引物被设计为汇聚性引物 (convergentprimer)，用以探测环接点(circular junction)并跨越反向剪接接 点。从数据库“circinteractome”(https://circinteractome.irp.nia.nih.gov/)获取3种circRNA的序列。数据用ΔCt法分析。所有引物皆由Generay Biotech合成。所有的结果皆以三个独立实验的平均值±SD表示。
按照TargetScan(http://www.targetscan.org/)联合miRanda(http://www.microrna.org/)分析，将经验证的候选circRNA用作种子，来富集 circRNA-miRNA-基因网络。应用Cytoscape(http://www.cytoscape.org/) 建立circTADA2A的circRNA–miRNA–mRNA相互作用网络。所述网络 中预测的基因功能用GO和KEGG路径分析进行注释。通过Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery(DAVID；http:// www.david.abcc.ncifcrf.gov/)，鉴定出由Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)、Biocarta和Reactome(http://www.genome.jp/kegg/)限 定的生物学路径。
检测推定的miRNA结合位点
circRNA中推定miRNA结合位点的FASTA文件由miRBase release 20.0(http://www.mirbase.org/)获取。仅考虑成熟miRNA用于种子分析。 将所述miRNA与circRNA进行比对。miRNA的推定靶位点是基因组中 代表成熟miRNA序列的核苷酸2-7的反向互补物的长6个核苷酸的序 列。
用于mRNA和circRNA的cDNA合成和qRT-PCR
使用 II First Strand cDNA Synthesis Kit(Geneseed,China)，按照所供应的方案由总RNA合成cDNA。用基于 Green法的 ABI Prism 7500序列检测系统(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)， 测量环状RNA的相对基因表达。qPCRCt值用厂商的软件自动计算。用 Human-ACTB作为内标对照。具体而言，使用退火至circRNA远末端的 发散性引物(divergent primer)测定circRNA丰度。使用测序引物，直接对 PCR产物进行Sanger测序。
用于miRNA的cDNA合成和qRT-PCR
为了定量测定成熟miRNA的量，用Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis(Takara,China)对成熟miRNA进行逆转录，使用Mir-X miRNA qRT-PCR SYBR Kit，在ABIPrism 7500序列检测系统(Applied Biosystems, Foster City,CA,USA)上，用小核U6B(RNU6B)RNA作为内标对照，进 行PCR扩增。用2-ΔΔCt法进行相对定量。
circTADA2A载体的构建
为了对circRNA进行概述，合成circTADA2A-E6的(基因组区)成熟序 列，将其克隆到pLCDH-ciR-copGFP-Puro(Geneseed,Guangzhou,China) 中。且通过测序进行验证。
circTADA2A siRNA干扰
circTADA2A的siRNA由Ribobio(Guangzhou,China)设计和合成，靶 向circTADA2A序列的接合区(junction region)。siRNA靶序列如下：
1：5’-CCATTTCACTGCAGGATGT-3’；
2：5’-CACTGCAGGATGTAGCCAA-3’；
3：5’-TTCCATTTCACTGCAGGAT-3’。
寡核苷酸转染
miRNA模拟物和抑制剂由Ribobio(Guangzhou,China)合成。细胞用LipofectamineTM 3000(invitrogen,USA)转染。
蛋白质印迹分析
蛋白质提取和蛋白质印迹按照先前所述方法进行。
增殖、细胞周期、凋亡和细胞侵袭测定、体外肿瘤发生测定
增殖测定(CCK-8).用CCK-8试剂盒(Doindo,Japan)测试MCF-7和MDA-MB-231细胞的增殖。将经转染的约1x103细胞/孔一式三份在96孔 板中孵育。24、48、72、96小时时，向各孔加入CCK-8试剂，于37℃孵 育1.5h。用自动微量滴定板读板仪(Synergy4；BioTek,Winooski,VT,USA) 测量450nm光密度。
细胞迁移侵袭测定(Transwell invasion assay).分别用细胞培养物插入 物(8μM孔径；BD)和matrigel侵袭小室(BD)进行侵袭测定。将经转染的细 胞血清饥饿24h，将无血清培养基中的1×104MDA-MB-231细胞或2×104 MCF-7细胞接种到上室中。分别在20小时(MDA-MB-231)或48小时 (MCF-7)时用4％多聚甲醛固定细胞，以进行侵袭测定，然后用0.1％结晶 紫染色。每个测定一式三份进行。由两位调查人员对各孔中3个视野的 细胞数进行计数。
集落形成测定.对于集落形成测定，将100个MDA-MB-231细胞或200 个MCF-7细胞一式三份铺板于12孔板中，让其生长至出现可见集落。集 落用4％多聚甲醛固定，用0.1％结晶紫染色，然后计数。
统计学分析
所有统计学数据用Statistical Product and Service Solutions SPSSsoftware 16.0(SPSS,Chicago,IL)、GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software, LaJolla,CA)和SigmaPlot 10.0(SigmaPlot Software,La Jolla,CA)进行分 析。乳腺癌组织和正常乳腺组织之间的circRNA水平差异用t检验对成对 数据来测定。通过单因素方差分析(ANOVA)，对circRNA水平和临床病 理学因素之间的关联进行进一步分析。建立受试者工作特征(ROC)曲线 以评估其诊断价值。circRNA的截止值用SigmaPlot 12.3分析。实验再现性通过Pearson相关检验(Pearson correlation test)来确定。所有实验一式三 份进行。数据以平均值±SEM表示(除非另有说明)，用双侧Student t检验 进行统计学分析。P＜0.05被认为有统计学意义。
实施例1.在乳腺癌中差异表达的circRNA的筛选及验证
高通量circRNA芯片测序有助于鉴别乳腺癌和正常乳腺组织之间差 异表达的circRNA。通过芯片技术分析8个乳腺癌组织(TNBC,n＝4, luminal A,n＝4)和三个正常乳腺组织的circRNA的差异表达，得到了乳 腺癌与正常组织的差异表达谱。散点图展示了两组之间差异表达的环状 RNA，差异倍数达到1.5倍以上；火山图展示了两组之间具有统计学意 义的差异表达的环状RNA。与正常乳腺组织相比，在乳腺癌中发现总共 140种上调和95种下调的环状转录物(图1c)，而且该表达谱数据与其它 研究一致，表明circRNA大多数来自含基因区域的外显子和内含子。值 得注意的是，对于原发性肿瘤和正常乳腺组织，circRNA显示出不同的 表达簇(图1d)。这些circRNA与其靶标miRNA之间的相互作用可以通过软件按照互补miRNA匹配序列在理论上进行预测。预测总共465种 miRNA可能会与circRNA结合。通过Cytoscape软件绘制完整的 circRNA-miRNA相互作用网络图(图1e)。所有这些数据表明：乳腺癌中 存在种类繁多的差异表达的circRNA，可能可用于疾病的筛选和诊断。
通过circRNA微阵列筛选在乳腺癌TNBC组织中差异表达的 circRNA，筛选出在下调表达差异倍数在1.5倍以上的8种circRNA。结 果示于表1。
表1.通过circRNA微阵列筛选在乳腺癌TNBC组织中差异表达的circRNA
荧光定量PCR证实三阴性乳腺癌组织中差异表达的circRNA
选择上述8种下调的circRNA(见表1)，又通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR)在178例乳腺组织中进一步证实了这些差异表达的circRNA。 8种circRNA的长度范围为158nt至843nt，所有这8种circRNA都为 外显子剪接，针对环状RNA转录物的环化位点设计了外显子两端向外 的引物(outward-facing primer)，以区别于基因编码的线性产物。接下来， 用随机六聚体引物将circRNA逆转录成cDNA，用反向引物扩增产生预 期的环状特异性RNA产物。最后，对扩增产物进行测序，证实了环状 RNA环化位点序列与来自CircBase具有剪接点的环状RNA序列完全一 致。最后，我们使用发散性引物组(divergent primer set)，以测定三阴型 乳腺癌组织和正常乳腺组织样本中的circRNA表达水平(n＝16)。所有这 些circRNA的差异表达都得到了证实，这证明环状RNA芯片数据的精 确性(参见图1f)。
实施例2.两种circTADA2A的表达水平和这两种circTADA2A对 TNBC的预后性和预测性价值
两种在乳腺癌组织中下调的环状RNA
首先鉴定了circTADA2A-E6和circTADA2A-E5/E6两种circRNA在 不同分子分型乳腺癌组织中的表达，这两种circRNA均起源于TADA2A 基因。如图2c和2d所示，qRT-PCR分析显示：这两种circTADA2A在 BC组织中的表达水平显著低于正常乳腺组织的水平，为：circTADA2A-E6，LA>TNBC>Her-2>LB；circTADA2A-E5/E6，LB> TNBC>Her-2>LA(所有组别,p<0.01)。我们发现与MCF-10(一个非致瘤 的上皮细胞株)相比，10株乳腺癌细胞株中的circTADA2A-E6(参见图2c) 和circTADA2A-E5/E6(参见图2d)的表达水平较低。
两种circTADA2A的表达与临床病例特征之间的关联
为了研究circTADA2A-E6和circTADA2A-E5/E6的表达和临床参数 之间的潜在关联，我们分析了TNM(肿瘤大小、淋巴结转移以及远处转 移)状况，结果显示肿瘤circTADA2A-E6表达水平降低与淋巴结转移更 多(p＝0.012)和高临床分期(p＝0.022)显著相关(图2e和图2f)，但是 circTADA2A-E5/E6与TNM分期没有明显的相关关系。这些结果提示： circTADA2A-E6表达下调与TNBC的侵袭性特征之间有关联。
结果概述于表2和表3中。
表2.临床病理学因素和TNBC组织(n＝115)中circTADA2A-E6表达之间的关联
AJCC,American Joint Committee on Cancer
#,4.35％患者信息丢失
##,9.56％患者信息丢失
*p<0.05
表3.临床病理学因素和TNBC组织(n＝115)中circTADA2A-E5/E6表达之间的关联
AJCC,American Joint Committee on Cancer
#,4.35％患者信息丢失
##,9.56％患者信息丢失
*p<0.05
circTADA2A-E6和circTADA2A-E5/E6的表达在乳腺癌中的诊断 价值
为了评估两种circTADA2A能否用作三阴型(n＝115)乳腺癌的诊断指 标，使用总共16个正常乳腺组织作为对照制作了ROC曲线。在TNBC 与正常组相比的ROC曲线中，circTADA2A-E6和circTADA2A-E5/E6 的曲线下面积分别为0.8554(95％CI＝0.9089-1.016,P<0.0001,图2e)和 0.9366(95％CI＝0.9089-1.016,P<0.001,图2f)。另外，发现：circTADA2A-E6和circTADA2A-E5/E6在LA(n＝25)、LB(n＝21)和Her-2 (n＝17)中circTADA2A-E6和circTADA2A-E5/E6中的所有曲线下面积皆 高于0.84(图2e/f)。这些结果提示：两种circTADA2A可作为乳腺癌的 潜在诊断性生物标志物。
circTADA2A-E6和circTADA2A-E5/E6用于预测乳腺癌风险的评 估
在评价circTADA2A-E6和circTADA2A-E5/E6的表达在乳腺癌中的 预后价值之前，对115例TNBC病人进行了单因素和多因素Cox比例风 险回归分析(Cox proportionalhazards regression analysis)。结果表明TNM 分期和肿瘤大小是与TNBC病人的总生存期(overall survival,OS)和无病 生存期(disease-free survival,DFS)相关的两个独立因素(结果未显示)。重 要的是，发现：circTADA2A-E6低表达组的10年总生存期显著短于circTADA2A-E6高表达组(图2h,p＝0.0179)，circTADA2A-E6低表达组的 10年DFS显著短于circTADA2A-E6高表达组的10年DFS(图2g)，p 值为0.0715。然而，circTADA2A-E5/E6表达与TNBC病人的OS(图2h) 和DFS(图2g)并不显著相关。这些分析数据提示：circTADA2A-E6是乳腺癌进展的潜在预测性生物标志物。
实施例3.circTADA2A-E6的过表达或沉默抑制或增强乳腺癌细胞增殖、 集落形成、侵袭
circTADA2A-E6抑制细胞增殖和侵袭
构建了circTADA2A高表达载体以及用于敲减的siRNA干扰序列 (图3a和图4a)。CCK-8测定结果显示：高表达circTADA2A可以降低细 胞的增殖能力(p<0.05,图3c)，而干扰circTADA2A，细胞增殖能力增 强(p<0.05,图4c)。划痕愈合实验表明：高表达circTADA2A可以降低 细胞的划痕愈合能力(图3e)，而敲减可以促进细胞的划痕愈合能力(图4f)。 克隆形成实验结果表明：circTADA2A-E6过表达细胞中克隆形成能力降 低(图3d)，而在circTADA2A-E6敲减细胞中克隆形成能力增加(图4d)。 此外，侵袭实验结果显示：细胞侵袭率在circTADA2A-E6过表达细胞中 细胞侵袭率降低3.5倍(图3f)，在circTADA2A-E6敲减细胞中增加至2.88 倍(图4e)。另外，circTADA2A-E6在MDA-MB-231细胞中过表达显著 增加了上皮细胞标记E-钙粘蛋白(E-cadherin)的表达(图3g)，而E-Cad的 表达在circTADA2A-E6敲减细胞中则是降低的(图4g)。相比之下，间充 质标记波形蛋白(mesenchymal markervimentin)的表达在MDA-MB-231 circTADA2A-E6过表达细胞中降低(图3g)，在circTADA2A-E6敲减细胞 中增加(图4g)。综合而言，这些结果表明：circTADA2A-E6在乳腺癌细 胞中发挥抑癌的作用，与临床病理结果在很大程度上是一致的，这就是 说circTADA2A-E表达水平与肿瘤发生发展相关。
实施例4.circNOL10的表达水平和circNOL10对TNBC的预后性和预测 性价值
用与实施例3类似的方法，对circNOL10的表达和临床参数之间的 潜在关联进行了分析。
qRT-PCR证实circNOL10在三阴性乳腺癌组织中明显下调
通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测circNOL10在乳腺癌组织中 的表达。在此过程中，我们针对环状RNA转录物的环化位点设计了发 散型引物(outward-facing primer)，以区别于基因编码的线性产物。接下 来，我们用随机六聚体引物将circRNA逆转录成cDNA，用反向引物扩 增产生预期的环状特异性RNA产物。最后，对扩增产物进行测序，证 实了环状RNA环化位点序列与来自CircBase具有剪接点的环状RNA序 列完全一致。最后，通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)在178例乳腺组 织(TNBC＝115,LA＝25,LB＝17,Her2＝21)中进一步证实了circNOL10乳 腺癌组织中下调(图5a)。circNOL10在BC组织中的表达水平显著低于 正常乳腺组织的水平，为：TNBC>LA>Her-2>LB。我们发现与 MCF-10(一个非致瘤的上皮细胞株)相比，10株乳腺癌细胞株中的 circNOL10也是下调的(参见图5b)。
circNOL10的表达与临床病例特征之间的关联
为了研究circNOL10的表达和临床参数之间的潜在关联，我们分析 了TNM(肿瘤大小、淋巴结转移以及远处转移)状况，结果显示肿瘤 circNOL10表达水平降低与淋巴结转移更多(p＝032)和高临床分期 (p＝0.018)显著相关(表4)。这些结果提示：circNOL10表达下调与TNBC 的侵袭性特征之间有关联。
表4.临床病理学因素和TNBC组织(n＝115)中circNOL10表达之间的关联
circNOL10的表达在乳腺癌中的诊断价值
为了评估circNOL10能否用作三阴型(n＝115)乳腺癌的诊断指标，我 们使用总共16个正常乳腺组织作为对照制作了ROC曲线。在TNBC与 正常组相比的ROC曲线中，circNOL10曲线下面积分别为0.9212。另外， 我们发现：circNOL10在LA(n＝25)、LB(n＝21)和Her-2(n＝17)中的曲线 下面积分别是0.9275、0.7619和0.9154(图5c)。这些结果提示：circNOL10 可作为乳腺癌的潜在诊断性生物标志物。
circNOL10用于预测乳腺癌风险的评估
circNOL10的生存分析结果显示circNOL10低表达组的10年总生存 期显著短于circTADA2A-E6高表达组(图5d),p＝0.027，低表达组的10 年DFS显著短于circTADA2A-E6高表达组的10年DFS(图5d)，p值为 0.032。这些分析数据提示：circNOL10可能是乳腺癌进展的潜在预测性 生物标志物。
随着近年来深度测序(deep sequencing)和微阵列技术的快速发展，越 来越多的证据证明哺乳动物基因组可编码circRNA，这些circRNA普遍 被转录并且在各种各样的生物过程中发挥重要的功能性作用。本发明人 通过对乳腺肿瘤(n＝8)和正常乳腺组织样本(n＝3)的circRNA微阵列数据 的分析中，发现：与正常乳腺组织相比，在乳腺癌中发现总共140种上 调和95种下调的环状RNA。通过q-RT-PCR在178例乳腺癌患者样本 中确证8种circRNA下调。进一步的研究发现，某些circRNA为新的潜 在的TNBC预后性和预测性生物标志物，作为一种内源性RNA与 miRNA竞争性调控miRNA的靶基因，从而产生抑瘤效应。这些发现为 未来circRNA应用于乳腺癌的诊断和治疗提供了理论和临床依据。
***
根据本公开内容，不需要过度实验即可实施本发明的实施方案。尽 管已经就优选实施方案描述了本发明，但本领域技术人员应显而易见， 在不背离本发明的理念、精神和范围的情况下可以对本文中所描述的试 剂盒、药物组合物、用途和方法以及方法中的步骤或步骤顺序加以变化。 对本领域技术人员显而易见的等同的替代和修改都在由所附权利要求 所限定的本发明精神、范围和理念之内。

Claims (10)

1.circRNA作为乳腺癌标志物的用途，其中所述circRNA选自以下的一种或更多种：circTADA2A-E6、circTADA2A-E5/E6、circNOL10、circNSUN2、circCSRNP2、circFAM125B、circCDC27和circABCC1，优选选自以下的一种或更多种：circTADA2A-E6、circTADA2A-E5/E6和circNOL10。
2.用于检测根据权利要求1中所述的circRNA的试剂和/或微阵列在制备用于乳腺癌诊断或预后的试剂盒中的用途，所述试剂优选包括特异性探针。
3.用于检测权利要求1中所述的circRNA的特异性探针在制备用于乳腺癌诊断或预后的微阵列中的用途。
4.乳腺癌诊断或预后用的试剂盒，其包含用于测量根据权利要求1所述的circRNA水平的试剂或微阵列，所述试剂优选包括特异性探针。
5.一种诊断受试者是否患有乳腺癌或处于发生乳腺癌风险、或者对乳腺癌进行预后的方法，其包括测量测试样本中根据权利要求1所述的circRNA的水平。
6.根据权利要求1所述的circRNA作为乳腺癌诊断或预后标志物的用途。
7.用于鉴定乳腺癌抑制剂的方法，所述方法包括鉴定提高乳腺癌细胞中circTADA2A-E6和/或circNOL10的水平的物质。
8.用根据权利要求7所述的方法鉴定的乳腺癌抑制剂。
9.根据权利要求8所述的抑制剂在制备用于抑制或治疗乳腺癌的药物中的用途。
10.用于抑制或治疗乳腺癌的药物组合物，其包含circTADA2A-E6、提高circTADA2A-E6水平的药剂、表达circTADA2A-E6的核酸和/或根据权利要求8所述的乳腺癌抑制剂，所述药物组合物任选含有用于抑制或治疗乳腺癌的其他药剂。
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