CN110093419A - 环状rna的应用、试剂盒和药物组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种环状RNA作为口腔鳞状细胞癌的诊断、治疗、预后靶点的应用和相应的试剂盒以及药物组合物及其应用。上述环状RNA的CircBase ID为以下的至少一种：hsa_circ_0093229、hsa_circ_0006208、hsa_circ_0006677、hsa_circ_0004491。用于口腔鳞状细胞癌的诊断和/或预后的试剂盒，包括定量检测上述环状RNA的试剂，本发明申请公开的环状RNA在口腔鳞状细胞癌患者癌和癌旁正常粘膜组织具有比较明显的表达差异，而目前用于口腔鳞癌的临床辅助诊断技术尚不完善，因此这些环状RNA具有作为口腔鳞状细胞癌的诊断、治疗、预后靶点的潜能。

Description

环状RNA的应用、试剂盒和药物组合物及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种环状RNA的应用、试剂盒和药物组合物及其应用。
背景技术
口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤之一，约占口腔颌面部恶性肿瘤的80％。口腔鳞状细胞癌(即口腔鳞癌)的发病率高，其在全身恶性肿瘤发病率的排名中可以排到第6位。口腔鳞癌的患病率也逐年增长，每年新发病患者人数竟高达600000例，而且患病人群趋于年轻化。毫无疑问，口腔鳞癌对人类健康和生命已经构成了严重威胁。虽然近年关于口腔鳞癌的研究日益增多，口腔鳞癌在临床治疗方面也有了显著的提高，但口腔鳞癌患者的5年生存率却没有明显的改善，近年来一直维持在63％左右，研究人员和一线工作者对于其致病机制尚不完全清楚，临床上也缺乏用于口腔鳞状细胞癌诊治的有效靶点。
在人体不同的组织器官中，研究人员发现了一类表达丰富的特殊非编码RNA，即环状RNA(circular RNA，circRNA)。环状RNA的表达量能够高于其线性异构体10倍左右。而且，在不同发育阶段，环状RNA常表现出特异性表达的特征。另一方面，因为环状RNA是封闭式环型结构，没有5′和3′端，所以不易被RNase R酶降解，相对于线性RNA能更稳定地存在于生物体中。这些特性表明环状RNA可能在维持人体正常功能中起着重要作用。因此，有必要针对口腔鳞癌中的circRNA进行研究，从中筛选出口腔鳞癌的特异性生物靶点以用于口腔鳞癌的早期诊断和预后评估。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题在于如何提供一种环状RNA作为口腔鳞状细胞癌的诊断、治疗、预后靶点的应用和相应的试剂盒以及药物组合物及其应用。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
环状RNA作为口腔鳞状细胞癌的诊断、治疗、预后靶点的应用，环状RNA的CircBaseID为以下的至少一种：
hsa_circ_0093229，具有如SEQ ID No：1所示的核苷酸序列；
hsa_circ_0006208，具有如SEQ ID No：2所示的核苷酸序列；
hsa_circ_0006677，具有如SEQ ID No：3所示的核苷酸序列；
hsa_circ_0004491，具有如SEQ ID No：4所示的核苷酸序列。
定量检测环状RNA的试剂在制备口腔鳞状细胞癌的诊断和/或预后的试剂盒中的应用，环状RNA的CircBase ID为以下的至少一种：
hsa_circ_0093229，具有如SEQ ID No：1所示的核苷酸序列；
hsa_circ_0006208，具有如SEQ ID No：2所示的核苷酸序列；
hsa_circ_0006677，具有如SEQ ID No：3所示的核苷酸序列；
hsa_circ_0004491，具有如SEQ ID No：4所示的核苷酸序列。
优选的，定量检测环状RNA的试剂包括扩增环状RNA的引物。
进一步优选的，扩增hsa_circ_0093229的引物包括：
F：5′-GCCCACTTGTAGAAGGTCCG-3′(SEQ ID No：5)，
R：5′-CTGGCAGGGAGGGCTCATTA-3′(SEQ ID No：6)；
扩增hsa_circ_0006208的引物包括：
F：5′-AGTCAACCTATGGAATCCAATCCC-3′(SEQ ID No：7)，
R：5′-GAGTGCCTGAAATGCTGGGT-3′(SEQ ID No：8)；
扩增hsa_circ_0006677的引物包括：
F：5′-TAGCAGAAGACCTGGAAGAACCA-3′(SEQ ID No：9)，
R：5′-TGGACACAGCCATTCTGCTTT-3′(SEQ ID No：10)；
扩增hsa_circ_0004491的引物包括：
F：5′-GGACCCCGAGGATCAGGAAAA-3′(SEQ ID No：11)，
R：5′-GCCTTGACAGACAGACAGCA-3′(SEQ ID No：12)。
一种口腔鳞状细胞癌的诊断和/或预后的试剂盒，包括定量检测环状RNA的试剂，环状RNA的CircBase ID为以下的至少一种：
hsa_circ_0093229，具有如SEQ ID No：1所示的核苷酸序列；
hsa_circ_0006208，具有如SEQ ID No：2所示的核苷酸序列；
hsa_circ_0006677，具有如SEQ ID No：3所示的核苷酸序列；
hsa_circ_0004491，具有如SEQ ID No：4所示的核苷酸序列。
优选的，试剂包括扩增上述至少一种环状RNA的引物。
进一步优选的，扩增hsa_circ_0093229的引物包括：
F：5′-GCCCACTTGTAGAAGGTCCG-3′(SEQ ID No：5)，
R：5′-CTGGCAGGGAGGGCTCATTA-3′(SEQ ID No：6)；
扩增hsa_circ_0006208的引物包括：
F：5′-AGTCAACCTATGGAATCCAATCCC-3′(SEQ ID No：7)，
R：5′-GAGTGCCTGAAATGCTGGGT-3′(SEQ ID No：8)；
扩增hsa_circ_0006677的引物包括：
F：5′-TAGCAGAAGACCTGGAAGAACCA-3′(SEQ ID No：9)，
R：5′-TGGACACAGCCATTCTGCTTT-3′(SEQ ID No：10)；
扩增hsa_circ_0004491的引物包括：
F：5′-GGACCCCGAGGATCAGGAAAA-3′(SEQ ID No：11)，
R：5′-GCCTTGACAGACAGACAGCA-3′(SEQ ID No：12)。
优选的，还包括RNA提取试剂和反转录反应体系。
进一步优选的，RNA提取试剂为TRIzol试剂。
优选的，试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒。
一种药物组合物，包括环状RNA、增加环状RNA的表达量的试剂、增加环状RNA的表达产物的活性的试剂中的至少一种，环状RNA的CircBase ID为以下的至少一种：
hsa_circ_0093229，具有如SEQ ID No：1所示的核苷酸序列；
hsa_circ_0006208，具有如SEQ ID No：2所示的核苷酸序列；
hsa_circ_0006677，具有如SEQ ID No：3所示的核苷酸序列；
hsa_circ_0004491，具有如SEQ ID No：4所示的核苷酸序列。
上述药物组合物在制备用于治疗口腔鳞状细胞癌的药物中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明申请公开的环状RNA在口腔鳞状细胞癌患者癌和癌旁正常粘膜组织具有比较明显的表达差异，而目前用于口腔鳞癌的临床辅助诊断技术尚不完善，因此这些环状RNA具有作为口腔鳞状细胞癌的诊断、治疗、预后靶点的潜能。
附图说明
图1是本发明的一个实施例的环状RNA表达谱。横坐标表示在癌旁正常组织中环状RNA表达水平，纵坐标表示癌组织中环状RNA表达水平。
图2是本发明的一个实施例的环状RNA的差异性表达结果图，图2中的A、B、C、D分别是通过qRT-PCR验证hsa_circ_0093229、hsa_circ_0006208、hsa_circ_0006677和hsa_circ_0004491在40对口腔鳞癌组织中的表达差异，采用配对t检验分析，***P<0.001，表示有统计学意义。
图3是本发明的一个实施例的环状RNA在40对口腔鳞癌中的ROC曲线图，图3中的A、B、C、D分别表示hsa_circ_0093229、hsa_circ_0006208、hsa_circ_0006677、hsa_circ_0004491基于OSCC组织和邻近的正常组织建立的ROC曲线。
图4是本发明的一个实施例的环状RNA的特征结构图，图4中的A、B、C、D分别表示hsa_circ_0093229、hsa_circ_0006208、hsa_circ_0006677、hsa_circ_0004491的结构图。
图5是本发明的一个实施例的细胞侵袭和迁移实验结果图，其中，图5中的A是细胞划痕实验的实验结果，B和C分别是细胞迁移实验和细胞侵袭实验的实验结果。
图6是本发明的一个实施例的Western Blot检测钙粘蛋白E和波形蛋白的表达水平差异结果图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。
1.材料与方法
1.1标本组织
遵照赫尔辛宣言及NIH使用临床标本规定，经北京大学深圳医院伦理委员会批准，患者完全知情同意并签署知情同意书后，收集自2015年6月-2016年10月就治于北京大学深圳医院口腔颌面外科40对有病理结果证实，经手术切除的口腔鳞癌患者癌和癌旁正常粘膜组织。所有患者术前未经放疗和化疗，年龄范围在29到78岁之间，中位年龄54岁。男女比例29：11，所有临床病理资料根据最新版WHO和UICC TNM分级，收集完整，见表1。
表1.本实施例的检测方法的参数
1.2主要试剂
TRIzol试剂(美国Thermo Fisher Scientific公司)；
氯仿、异丙醇和100％乙醇(广州华大公司)；
反转录试剂盒Primer Script RT Master Mix,Cat.#RR047A和荧光定量PCR试剂Premix Ex TaqTM II,Cat.#RR820L(日本TAKARA公司)；
荧光定量PCR仪(美国Roche公司)；
NanoDropND-2000核酸测定仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；
人OSCC细胞系(SCC-15、SCC-25和CAL-27)从武汉大学口腔医学院获得；
人口腔角质细胞HOK从中国科学院(上海)的细胞库藏中心获得；
Lipofectamine3000、DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Medium)、FBS(FetalBovine Serum)购于Gibco公司；
所用抗体购于Cell Signaling Technology公司。
1.3实验方法
1.3.1环状RNA提取与制备
利用TRIzol法，提取8对口腔鳞癌组织总RNA。用DNase I消除DNA并去除核糖体RNA，然后用Rnase R酶降解线性RNA，使大部分环状RNA富集。在得到的环状RNA中加入片段化缓冲液，使其打碎成短片段。以断裂后的环状RNA为模板，用六碱基随机引物合成cDNA第一链，并加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成cDNA第二链。加EB缓冲液洗脱后，利用QiaQuick PCR试剂盒纯化环状RNA。对环状RNA加测序接头、碱基A并经末端修复后，利用琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段，并对环状RNA进行PCR扩增，从而完成整个环状RNA文库制备工作，利用Illumina HiSeqTM 2500对构建好的文库进行测序。
1.3.2环状RNA鉴定与分析
对测序所得原始数据进行质控，以确保测序数据是否适用于后续分析。经过滤得到高质量数据，用比对软件将数据与参考基因组比对，统计数据在参考序列上匹配，将不匹配序列提交Find_circ软件，搜寻并鉴定出环状RNA，对环状RNA的来源、表达量及组间差异进行数据分析。使用Circbase数据库注释环状RNA。已被注释的定义为已存在的环状RNA，未被注释的定义为新发现的环状RNA。
1.3.3差异性环状RNA的qRT-PCR验证
对高通量测序检出的差异性环状RNA，进行40对口腔鳞状细胞癌标本验证。利用TRIzol法提取1μg总RNA，通过反转录试剂盒Prime Script RT Master Mix反转为20μl体系cDNA。以2μl cDNA为模板，加入1μl正、反向引物，通过Premix Ex TaqTM II试剂盒在罗氏荧光定量PCR仪上扩增。测定差异性环状RNA循环阈值Ct值，利用公式2–ΔΔCt计算癌和癌旁中的差异性环状RNA相对表达水平。实验重复三次，以β-actin作为内参，引物序列见表2。
表2.qRT-PCR引物序列
1.3.4细胞培养和转染
将SCC-15、SCC-25、CAL-27和HOK细胞置于培养基于37℃和5％CO2条件下培养，培养基由90％DMEM和10％FBS组成。
按照制造商提供的实验方案，利用Lipofectamine 3000将hsa_circ_0004491的siRNA(5′-CTATGGAAGCCTGGAGCCA-3′，SEQ ID No：15)和阴性对照siRNA转染入OSCC细胞。
1.3.5细胞划痕实验
将SCC-15和Cal-27细胞消化后接入6孔板。细胞融合后，用200μL无菌移液管尖端刮取细胞制造划痕。吸去培养液后用PBS洗涤3次，去除染色细胞，用无血清DMEM培养。用倒置显微镜观察迁移率。
1.3.6细胞迁移和侵袭实验
分别使用预涂有Transwell和Matrigel的Transwell小室(美国Corning公司)进行细胞迁移和侵袭实验。细胞侵袭实验以如下方式进行：将100μL的Matrigel基质胶(1mg/mL；美国Sigma-Aldrich公司)添加到24孔板中的Transwell室中。将2×104个转染细胞重新悬浮于100μL不含FBS的DMEM中并接种到上室，而将700μL含10％FBS的DMEM添加到下室。培养36小时后，去除上室细胞，下室细胞固定在4％多聚甲醛中。0.1％结晶紫染色，PBS洗涤干燥。图像采集采用倒置荧光显微镜，利用Image J软件对图像进行处理，并通过GraphPad软件进行分析。细胞迁移实验是以类似的方式进行的，区别在于没有基质胶涂层。
1.3.7免疫印迹实验
利用裂解液提取总蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳分离，并在纤维素膜上印迹。在4℃下与单克隆抗体杂交过夜后，用二级抗体在室温下免疫反应1小时。通过ECL试剂盒(密理博)进行发光检测，通过Image J软件分析。使用的主要抗体如下：抗钙粘蛋白E(1:1000)、抗波形蛋白(1:1000)和抗GAPDH(1:1000)。
1.3.8统计学分析
所有实验数据均采用GraphPad Prism软件进行分析，计量资料采用平均值±标准差表示。40对口腔癌标本中，差异性环状RNA表达水平比较采用配对t检验分析，P<0.05表示有统计学意义。
2.结果
2.1口腔鳞癌中环状RNA表达谱
高通量测序结果证明环状RNA在人类口腔鳞癌组织中大量存在。8对样本中检测出11942个环状RNA，通过Circbase和UCSC数据库进行比对分析，已注释1921个，新发现10021个。大部分环状RNA主要来源于编码蛋白的外显子区域，其次来源于内含子区域，以及外显子与内含子共同环化等。图1是本发明的一个实施例的环状RNA表达谱。如图1所示，横坐标表示在癌旁正常组织中环状RNA表达水平，纵坐标表示癌组织中环状RNA表达水平。所有环状RNA在口腔鳞癌与癌旁组织中的表达水平通过散点的形式在图1中表示。
2.2差异性表达的环状RNA
通过qRT-PCR法对高通量测序中差异性表达的环状RNA在40对口腔鳞癌患者的标本及癌旁组织中进行验证。图2是本发明的一个实施例的环状RNA的差异性表达结果图。如图2所示，配对t检验分析的结果表明，其中四个环状RNA在癌组织中有明显下调，且存在统计学差异，分别为hsa_circ_0093229(如图2中的A所示)、hsa_circ_0006208(如图2中的B所示)、hsa_circ_0006677(如图2中的C所示)和hsa_circ_0004491(如图2中的D所示)。图3是本发明的一个实施例的环状RNA在40对口腔鳞癌中的ROC曲线图。如图3所示，图3中的A、B、C、D分别表示hsa_circ_0093229、hsa_circ_0006208、hsa_circ_0006677、hsa_circ_0004491基于OSCC组织和邻近的正常组织建立的ROC曲线(即各图中y＝x上方的曲线)，它们的ROC曲线下面积分别为0.7895、0.7461、0.8221和0.7510，说明这4个环状RNA对口腔鳞癌具有一定诊断价值。
图4是本发明的一个实施例的环状RNA的特征结构图。如图4所示，图4中的A、B、C、D分别表示hsa_circ_0093229、hsa_circ_0006208、hsa_circ_0006677、hsa_circ_0004491的结构图。通过人类基因组数据库(http://www.ensembl.org)对上述四种环状RNA进行分析：
hsa_circ_0093229(核苷酸序列如SEQ ID No：1)位于chr10:17199439-17210916，来源于tRNA天冬氨酸甲基转移酶1(TRDMT1)基因，该基因别名为：DMNT2、DNMT2、PUMET、RNMT1和MHSAIIP，该环状RNA由6个外显子组成，其成环长度为713bp；
hsa_circ_0006208(核苷酸序列如SEQ ID No：2)位于chr11：108046972-108047817，来源于核蛋白组蛋白转录的共激活因子(NPAT)基因，别名为：E14、p220和E14/NPAT，该环状RNA由2个外显子组成，成环长度为226bp；
hsa_circ_0006677(核苷酸序列如SEQ ID No：3)位于chr1：67356836-67371058，来源于WDR78基因，别名为：DIC4，该环状RNA由3个外显子组成，成环长度为473bp；
hsa_circ_0004491(核苷酸序列如SEQ ID No：4)位于chr2：148730307-148739650，来源于ORC4基因，该环状RNA由4个外显子组成，成环长度为396bp。
2.3细胞迁移和侵袭实验
以实验组OSCC细胞转染hsa_circ_0004491的siRNA，阴性对照组OSCC细胞转染对照siRNA(Ctrl-si)，进行细胞划痕实验、细胞迁移和侵袭实验。OSCC细胞选用SCC-15和CAL-27细胞系。图5是本发明的一个实施例的细胞侵袭和迁移实验结果图。
图5中的A是细胞划痕实验的实验结果，实验过程中分别在0h、24h和36h测量划痕区域，A的左图是SCC-15细胞在0h和24h的对比结果，右图是CAL-27细胞在0h和36h的对比结果。如图所示，在SCC-15和CAL-27细胞中，相较于对照组，转染了hsa_circ_0004491siRNA的实验组都表现出了更强的划痕修复能力，这说明降低hsa_circ_0004491的表达量会促进癌细胞的迁移。
图5中的B和C分别是细胞迁移实验和细胞侵袭实验的实验结果，实验过程中，在36小时后进行细胞计数。如图5的B和C所示，转染了hsa_circ_0004491siRNA的实验组的SCC-15和CAL27两种细胞系的迁移和侵袭细胞数量都显著高于对照组，转染hsa_circ_0004491siRNA后，两种细胞的迁移和侵袭能力都明显变得更强，这也进一步说明了降低hsa_circ_0004491的表达量会促进癌细胞的迁移和侵袭。
2.4上皮-间充质转化(EMT)
图6是本发明的一个实施例的Western Blot检测钙粘蛋白E和波形蛋白的表达水平差异结果图，如图6所示，在SCC-15和CAL-27细胞中，转染了hsa_circ_0004491siRNA的实验组的钙粘蛋白E(E-cadherin)的表达水平相对于对照组均有所下降，而波形蛋白(Vimentin)的表达水平相对于对照组都表现出一定的上升。该结果表明，hsa_circ_0004491的表达下调与OSCC细胞的上皮-间充质转化存在着一定关系。
上述实验结果表明，本发明所公开的环状RNA会在口腔鳞癌的发生发展过程中起到重要的调控作用，这也为寻找口腔鳞癌的生物标志物和诊断/预后以及治疗的生物靶点提供新的方向。
显然，以上所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京大学深圳医院
<120> 环状RNA的应用、试剂盒和药物组合物及其应用
<130> 9
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 713
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ggcattacac tcgaagagtt tgacagatta tcttttgata tgattttaat gagccctccc 60
tgccagccat tcacaaggat tggccggcag ggtgatatga ctgattcaag gacgaatagc 120
ttcttacata ttctagatat tctcccaaga ttacaaaaat taccaaagta tattcttttg 180
gaaaatgtta aaggttttga agtatcttct acaagagacc tcttgataca aacaatagaa 240
aattgtggct ttcagtacca agagtttcta ttatctccaa cctctcttgg cattccaaat 300
tcaaggctac gatattttct tattgcaaag cttcagtcag agccattacc ctttcaagcc 360
cctggtcagg tactgatgga gttccccaaa attgaatctg tacatccaca aaaatatgca 420
atggatgtag aaaataaaat tcaagaaaag aacgttgaac caaatattag ctttgatggc 480
agcatacagt gttctggaaa agatgccatt ctttttaagc ttgaaactgc agaagaaatt 540
cacaggaaaa atcaacaaga tagtgatctc tctgtgaaaa tgctaaaaga ttttcttgaa 600
gatgacactg acgtgaacca gtatctttta ccaccaaagt cattgctgcg atatgctctt 660
ctgttagaca ttgttcagcc cacttgtaga aggtccgtgt gctttaccaa agg 713
<210> 2
<211> 226
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
agtgaaattc acatgtctga agaagctata caggacatat tggaacagac agaatcagac 60
ccagcatttc aggcactctt tgatctcttt gactatggca aaacaaagaa taataaaaat 120
atatcacaaa gtatttccag tcaacctatg gaatccaatc ccagtatagt cttagcagat 180
gaaactaatc tagcagttaa aggttctttt gaaacagaag aatctg 226
<210> 3
<211> 473
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
gaacaatgcc acacaaccaa agaagtctat tagctttttt gctacaatga aagcaacttc 60
agtgaaagga tatactggtg caaatcaaag cagaatggct gtgtccaaaa ccgtgcttat 120
tccacctgaa ctgaaaactg tagaaaaacc aaatcccaat ataaagacaa cacaggtatt 180
tgacataaat ggaactgatg ttactccccg acctctttac catccagatc cacttactgg 240
tacagcaaaa ccaagtaaac tcttgacatc acaagaagga tcacttggat cagaatttat 300
atcttcctat agcctttatc agaatacaat aaatcctagt acgttagggc agtttacaag 360
gtcagtttta ggaagcagta cagtttctaa gtcaagtgta tcagcaagtg aatcaatagc 420
agaagacctg gaagaaccat cctataaacg ggaaagattg actagtttca cag 473
<210> 4
<211> 396
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
gaagcctgga gccagaggac ttttggtggc tgaggcctta gctacctggc ttacacatta 60
aggaggacac agatttgctt gctgtctgtc tgtcaaggcc tggctcagct aaggacctgt 120
taacatttct agagaagaaa acagcattac catggatttg aatttgttga aatgagcagt 180
cgtaaatcaa agagtaacag cttaattcac acagagtgcc tttcacaggt acaaagaatt 240
ttacgtgaaa gattttgtcg tcagagtcca catagtaacc tatttggagt gcaagtacaa 300
tacaaacact taagtgagct gctgaaaaga actgctctcc atggagagag taactctgtc 360
cttattatcg gaccccgagg atcaggaaaa actatg 396
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcccacttgt agaaggtccg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctggcaggga gggctcatta 20
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
agtcaaccta tggaatccaa tccc 24
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gagtgcctga aatgctgggt 20
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tagcagaaga cctggaagaa cca 23
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tggacacagc cattctgctt t 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ggaccccgag gatcaggaaa a 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gccttgacag acagacagca 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
aaactggaac ggtgaaggtg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
agtggggtgg cttttaggat 20
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ctatggaagc ctggagcca 19

Claims (10)

1.环状RNA作为口腔鳞状细胞癌的诊断、治疗、预后靶点的应用，其特征在于，所述环状RNA的CircBase ID为以下的至少一种：
hsa_circ_0093229，具有如SEQ ID No：1所示的核苷酸序列；
hsa_circ_0006208，具有如SEQ ID No：2所示的核苷酸序列；
hsa_circ_0006677，具有如SEQ ID No：3所示的核苷酸序列；
hsa_circ_0004491，具有如SEQ ID No：4所示的核苷酸序列。
2.定量检测环状RNA的试剂在制备口腔鳞状细胞癌的诊断和/或预后的试剂盒中的应用，其特征在于，所述环状RNA的CircBase ID为以下的至少一种：
hsa_circ_0093229，具有如SEQ ID No：1所示的核苷酸序列；
hsa_circ_0006208，具有如SEQ ID No：2所示的核苷酸序列；
hsa_circ_0006677，具有如SEQ ID No：3所示的核苷酸序列；
hsa_circ_0004491，具有如SEQ ID No：4所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述定量检测环状RNA的试剂包括扩增所述环状RNA的引物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，
扩增所述hsa_circ_0093229的引物包括：
F：5′-GCCCACTTGTAGAAGGTCCG-3′(SEQ ID No：5)，
R：5′-CTGGCAGGGAGGGCTCATTA-3′(SEQ ID No：6)；
扩增所述hsa_circ_0006208的引物包括：
F：5′-AGTCAACCTATGGAATCCAATCCC-3′(SEQ ID No：7)，
R：5′-GAGTGCCTGAAATGCTGGGT-3′(SEQ ID No：8)；
扩增所述hsa_circ_0006677的引物包括：
F：5′-TAGCAGAAGACCTGGAAGAACCA-3′(SEQ ID No：9)，
R：5′-TGGACACAGCCATTCTGCTTT-3′(SEQ ID No：10)；
扩增所述hsa_circ_0004491的引物包括：
F：5′-GGACCCCGAGGATCAGGAAAA-3′(SEQ ID No：11)，
R：5′-GCCTTGACAGACAGACAGCA-3′(SEQ ID No：12)。
5.口腔鳞状细胞癌的诊断和/或预后的试剂盒，其特征在于，包括定量检测环状RNA的试剂，所述环状RNA的CircBase ID为以下的至少一种：
hsa_circ_0093229，具有如SEQ ID No：1所示的核苷酸序列；
hsa_circ_0006208，具有如SEQ ID No：2所示的核苷酸序列；
hsa_circ_0006677，具有如SEQ ID No：3所示的核苷酸序列；
hsa_circ_0004491，具有如SEQ ID No：4所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括扩增所述环状RNA的引物。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，
扩增所述hsa_circ_0093229的引物包括：
F：5′-GCCCACTTGTAGAAGGTCCG-3′(SEQ ID No：5)，
R：5′-CTGGCAGGGAGGGCTCATTA-3′(SEQ ID No：6)；
扩增所述hsa_circ_0006208的引物包括：
F：5′-AGTCAACCTATGGAATCCAATCCC-3′(SEQ ID No：7)，
R：5′-GAGTGCCTGAAATGCTGGGT-3′(SEQ ID No：8)；
扩增所述hsa_circ_0006677的引物包括：
F：5′-TAGCAGAAGACCTGGAAGAACCA-3′(SEQ ID No：9)，
R：5′-TGGACACAGCCATTCTGCTTT-3′(SEQ ID No：10)；
扩增所述hsa_circ_0004491的引物包括：
F：5′-GGACCCCGAGGATCAGGAAAA-3′(SEQ ID No：11)，
R：5′-GCCTTGACAGACAGACAGCA-3′(SEQ ID No：12)。
8.根据权利要求5-7任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包括RNA提取试剂和反转录反应体系。
9.药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括环状RNA、增加所述环状RNA的表达量的试剂、增加所述环状RNA的表达产物的活性的试剂中的至少一种，以及药物学上可接受的载体；所述环状RNA的CircBase ID为以下的至少一种：
hsa_circ_0093229，具有如SEQ ID No：1所示的核苷酸序列；
hsa_circ_0006208，具有如SEQ ID No：2所示的核苷酸序列；
hsa_circ_0006677，具有如SEQ ID No：3所示的核苷酸序列；
hsa_circ_0004491，具有如SEQ ID No：4所示的核苷酸序列。
10.权利要求9所述的药物组合物在制备用于治疗口腔鳞状细胞癌的药物中的应用。
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孙帅: "Hsacirc0112879对口腔鳞癌细胞生物学行为影响的实验研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》, 15 December 2018 (2018-12-15), pages 072 - 955 *
赵思语等: "口腔鳞状细胞癌组织中环状RNA的差异表达谱分析", 《口腔疾病防治》 *
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