IT202000019045A1 - Metodo per la diagnosi in vitro del rischio di recidiva e/o metastasi nei pazienti con tumore della mammella triplo negativo e relativo kit - Google Patents

Metodo per la diagnosi in vitro del rischio di recidiva e/o metastasi nei pazienti con tumore della mammella triplo negativo e relativo kit Download PDF

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Giulia Fontemaggi
Giovanni Blandino
Mattia Forcato
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St Fisioterapici Ospitalieri Ifo
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Description

METODO PER LA DIAGNOSI IN VITRO DEL RISCHIO DI RECIDIVA E/O METASTASI NEI PAZIENTI CON TUMORE DELLA MAMMELLA
TRIPLO NEGATIVO E RELATIVO KIT
La presente invenzione riguarda un metodo per la diagnosi in vitro del rischio di recidiva e/o metastasi in pazienti con carcinoma mammario triplo negativo e relativo kit.
In particolare, la presente invenzione riguarda un metodo per la diagnosi in vitro del rischio di recidiva e/o metastasi nel carcinoma mammario triplo negativo rilevando RNA circolari come biomarcatori.
? noto che il carcinoma della mammella triplo negativo (TNBC), che rappresenta il 15% di tutti i tumori della mammella ed ? definito solo attraverso la mancanza di espressione del recettore degli estrogeni alfa (ER?), del recettore del progesterone (PR) e del recettore del fattore di crescita epidermico umano 2 (Her2), rimane uno dei gruppi pi? eterogenei di tumori della mammella, con il suo caratteristico comportamento clinico aggressivo (Sharma P., 2018). A causa dell'assenza di target terapeutici specifici e delle sue caratteristiche biologiche aggressive, i pazienti con TNBC spesso sperimentano un alto rischio di progressione della malattia e una scarsa sopravvivenza globale. ? importante sottolineare che il TNBC si presenta spesso con tumori di piccole dimensioni e linfonodi negativi (Sharma P., 2018). Da notare, anche in fase iniziale (T1?2N0?1M0), il TNBC ? caratterizzato da un alto tasso di recidive locali e sistemiche, con il 20-40% dei pazienti che sviluppa malattia metastatica. Attualmente, la chemioterapia continua ad essere il principale trattamento per il TNBC (Abdulkarim et a., 2011; Chen et al., 2017).
Il 70% dei TNBC sono classificati come tumori di tipo basale (BLBC) mediante analisi molecolari ad alta risoluzione. I BLBC generalmente sono tumori al seno tripli negativi e sono contrassegnati dalla presenza di citocheratina 5/6 e / o del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) e da mutazioni del gene TP53 (incidenza> 85%) (Badve et al., 2011).
Analogamente al TNBC, i pazienti con BLBC presentano scarsa sopravvivenza e notevole eterogeneit? molecolare e clinica (Badve et al., 2011). Approssimativamente, il 30-50% dei pazienti recidiva entro 3-5 anni, mentre i restanti pazienti hanno una buona sopravvivenza a lungo termine (Rakha et al., 2008).
? noto che la proteina ID4 ? caratterizzata dalla presenza di un dominio HLH (elica-ansa-elica) ed ? specificamente sovraespressa in TNBC e BLBC (Thike et al., 2016; Wen et al., 2012; Hu et al., 2006).
ID4 ? un membro della famiglia di proteine ID (Inibitori del Differenziamento) (Lasorella et al., 2014) e la sua espressione ? quasi esclusivamente localizzata all'interno del compartimento delle cellule basali della ghiandola mammaria. Funzionalmente, ID4 controlla il differenziamento luminale e l'autorinnovamento delle cellule staminali/progenitrici mammarie agendo come un regolatore negativo di diversi processi chiave coinvolti nella specificazione del destino luminale, vale a dire Notch signaling, BRCA1, ELF5, ER? e FOXA1 (Best et al., 2014; Junankar et al., 2015). ID4 ? uno dei geni espressi in maniera specifica nelle cellule basali (rispetto ai progenitori luminali e alle cellule luminali) di origine sia umana che murina (Baker et al., 2016). ? importante sottolineare che le cellule basali ID4-positive hanno dimostrato di avere un'attivit? staminale intrinseca nel contesto fisiologico dello sviluppo della ghiandola mammaria (Junankar et al., 2015).
Come accennato in precedenza, nel contesto del carcinoma mammario, un livello elevato di proteina ID4 ? specifico dei sottotipi TNBC e BLBC, dove il gene ID4 pu? essere amplificato e/o sovraespresso (Baker et al., 2016). ID4 ? richiesto per la proliferazione e la staminalit? delle linee cellulari BLBC in vitro e in vivo e contraddistingue un sottogruppo di TNBC / BLBC con prognosi sfavorevole (Thike et al., 2016, Baker et al., 2016; Donzelli et al., 2018; Pruszko et al., 2017).
Nel carcinoma mammario ID4 ? indotto trascrizionalmente dalle proteine p53 mutate che presentano guadagno di funzione e aumenta il potenziale angiogenico delle cellule di carcinoma mammario (BC) attraverso l'induzione post-trascrizionale delle citochine CXCL-1 (GRO-alfa) e IL-8. Di conseguenza, una densit? di microvasi significativamente pi? alta ? presente nei tumori che mostrano un'elevata espressione della proteina ID4, rispetto a quelli con ID4 basso (Fontemaggi et al., 2009, dell'Orso et al., 2010). Le mutazioni di TP53 sono molto frequenti nel BLBC (80% dei casi), con mutazioni missenso che si verificano in quasi la met? dei casi (40% dei pazienti). Da notare, la co-occorrenza tra l'alta espressione di ID4 e la presenza di TP53 mutato risulta significativa in entrambe le coorti TCGA e Metabric di BLBC (p <0,001 dal database cBioPortal).
Il legame funzionale tra la proteina ID4 e la p53 mutata ? stato recentemente ulteriormente evidenziato dall'identificazione, in cellule di carcinoma mammario, di un complesso ribonucleoproteico comprendente il fattore di splicing SRSF1, la proteina ID4, la proteina p53 mutata ed il lncRNA (long non-coding RNA) MALAT1, che ? responsabile del controllo dell'espressione delle isoforme di VEGF e dell'elevato potenziale angiogenico delle cellule di carcinoma mammario (Pruszko et al., 2017, 2018). L'abbondante lncRNA MALAT1 ("metastasisassociated lung adenocarcinoma transcript 1") a ritenzione nucleare ? stato associato a un fenotipo scarsamente differenziato e aggressivo dei carcinomi mammari (van Roosmalen et al., 2015, Arun et al., 2016). Questo lncRNA si localizza in punti nucleari, dove interagisce con un sottoinsieme di fattori di splicing e ne modula l'attivit?. ? stato dimostrato che MALAT1 interagisce con il pre-mRNA nascente e si localizza nella cromatina (Engreitz et al., 2014), essendo queste interazioni RNA-RNA mediate da fattori proteici.
? stato dimostrato che il fattore di splicing oncogenico SRSF1 collega MALAT1 alle proteine p53 mutata e ID4 nelle cellule di carcinoma mammario. Le proteine p53 mutata e ID4 consentono il reclutamento di MALAT1 sul pre-mRNA di VEGFA e la modulazione dell'espressione delle isoforme di VEGFA (Pruszko et al., 2017). Di conseguenza, le firme molecolari dipendenti da VEGFA si associano all'espressione di ID4 specificamente nei tumori BLBC che presentano mutazioni del gene TP53. Inoltre, ID4 e le firme molecolari dipendenti da VEGFA cooperano nella previsione della sopravvivenza in BLBC (Pruszko et al., 2017).
Prove recenti mostrano anche che l'espressione di ID4 nel carcinoma mammario porta alla modulazione paracrina di un pannello di geni correlati all'angiogenesi e di microRNA nei macrofagi associati al tumore (Donzelli et al., 2018; Donzelli et al., 2020). ? importante sottolineare che il VEGF secreto dalle cellule di carcinoma mammario ? necessario per l'attivazione di questo pannello angiogenico, evidenziando la rilevanza di ID4 nel dialogo incrociato tra cellule di carcinoma mammario e macrofagi. Inoltre, le espressioni proteiche di ID4 e del marcatore macrofagico CD68 sono significativamente associate in una serie di tumori mammari tripli negativi, e alti livelli di mRNA di ID4 predicono in modo robusto una scarsa sopravvivenza, in particolare nel sottogruppo di tumori che mostrano un'elevata infiltrazione di macrofagi (Donzelli et al., 2018 ).
Collettivamente, queste evidenze sperimentali indicano ID4 come un potente biomarcatore che distingue i pazienti con prognosi sfavorevole in TNBC e BLBC.
Tuttavia, il rilevamento della proteina ID4 ? possibile solo su campioni di tessuto tumorale FFPE ("formalinfixed paraffin-embedded"), quindi richiede una biopsia invasiva.
Alla luce di quanto sopra, ? quindi evidente la necessit? di fornire nuovi metodi diagnostici e biomarcatori per identificare i pazienti con prognosi sfavorevole in TNBC, che superino gli svantaggi dei metodi diagnostici noti.
In questo contesto, scopo della presente invenzione ? quello di fornire un metodo diagnostico in grado di classificare i pazienti TNBC ad alto rischio di recidiva e/o metastasi senza la necessit? di una biopsia invasiva.
Secondo la presente invenzione, ? stato ora sorprendentemente trovato che il complesso comprendente la proteina ID4, la proteina mutante p53 e il lncRNA MALAT1 ha la capacit? di indurre la produzione di RNA circolari (circRNA) nelle cellule di BLBC. Inoltre, secondo la presente invenzione, ? stato scoperto che le cellule cancerose possono secernere detti RNA circolari in vescicole chiamate esosomi.
Pertanto, gli RNA circolari dipendenti da ID4-mtp53-MALAT1 secondo la presente invenzione possono essere utilizzati vantaggiosamente come nuovi potenti indicatori diagnostici/prognostici di alto rischio di recidiva/metastasi nel TNBC. Pertanto, la presente invenzione riguarda un metodo diagnostico basato sulla rilevazione di circRNA dipendenti da ID4/p53 mutata in campioni di siero/plasma/esosomi di pazienti con TNBC al fine di identificare pazienti TNBC ad alto rischio di recidiva/metastasi.
Secondo i dati sperimentali riportati di seguito, ? stato eseguito un profilo di espressione di cellule di carcinoma mammario deprivate o meno dell'espressione di ID4 o p53 mutata o MALAT1 utilizzando gli array "Exon", che consentono l'identificazione di eventi di splicing. La maggior parte degli esoni che sono risultati comunemente influenzati dalla deprivazione dei tre fattori analizzati non erano stati precedentemente riportati in letteratura come coinvolti in eventi di splicing alternativo. Quindi, ? stato studiato se questi esoni fossero, al contrario, coinvolti in eventi di splicing non canonici, come quelli che generano molecole di RNA circolare. Attraverso l'uso di oligonucleotidi divergenti in analisi di RT-PCR sono stati analizzati 5 degli esoni identificati dagli array Exon e si ? scoperto sorprendentemente che erano in grado di generare prodotti di RNA circolare. L'esistenza di questi prodotti ? stata ulteriormente confermata utilizzando campioni di RNA trattati con l'enzima RNaseR, che degrada specificatamente gli RNA lineari. Inoltre, secondo la presente invenzione, questi RNA circolari sono stati anche sorprendentemente rilevati in vescicole extracellulari (esosomi) isolate da linee cellulari di carcinoma mammario.
La presente invenzione fornisce il vantaggio di un'efficace stratificazione del TNBC, attraverso la classificazione dei pazienti ad alto rischio di recidiva e/o metastasi, in particolare dei pazienti in fase iniziale, che consente l'identificazione del regime chemioterapico pi? appropriato ed eventualmente della necessit? o meno di radioterapia post-operatoria. Inoltre, un'efficace stratificazione dei pazienti attraverso i biomarcatori predittivi presentati nella presente invenzione ? cruciale per migliorare le opzioni di trattamento e la sopravvivenza del paziente.
Inoltre, gli RNA circolari secondo la presente invenzione rappresentano un bersaglio a valle di ID4, che ? secreto e rilevabile nel flusso sanguigno. Pertanto, a differenza di ID4, gli RNA circolari secondo la presente invenzione sono biomarcatori che possono essere rilevati con metodi non invasivi.
Gli RNA circolari sono molecole di RNA estremamente stabili perch?, a differenza delle forme di RNA lineare, non sono accessibili all'attivit? della maggior parte delle RNA esonucleasi. Ci? rende i circRNA potenziali biomarcatori estremamente interessanti. Questo potenziale ? ulteriormente confermato dal fatto che i circRNA sono rilevabili nei fluidi corporei, come sangue e saliva, che ? essenziale se devono essere utilizzati come biomarcatori non invasivi (Li et al., 2015; Memczak et al., 2015).
Gli RNA circolari (circRNA) sono una nuova classe emergente di RNA endogeni espressi abbondantemente dal trascrittoma eucariotico (Hsu e Coca-Prados, 1979; Memczak et al., 2013). Sono caratterizzati da una struttura a circolo chiuso covalentemente, che si traduce in molecole di RNA pi? stabili degli RNA lineari. I CircRNA hanno origine pi? frequentemente dalle regioni esoniche del genoma, rispetto alle regioni introniche. Tuttavia, i circRNA sono solitamente espressi a livelli inferiori rispetto ai geni ospiti. Funzionalmente, i circRNA hanno dimostrato di agire come impalcatura per complessi multiproteici, come spugna per proteine, come modulatori della trascrizione e dello splicing. Tuttavia, l'attivit? pi? ben caratterizzata ? la spugnatura dei microRNA (Hansen et al., 2013). Il codice circRNAs-microRNA, in particolare, sta emergendo per avere un grande impatto sulla regolazione dell'espressione genica nel cancro. Un numero crescente di studi indica che i circRNA svolgono un ruolo critico nelle malattie umane mostrando un grande potenziale come biomarcatori e bersagli terapeutici. Il ruolo emergente dei circRNA nelle vie di segnalazione oncogeniche apre una nuova prospettiva per la dissezione molecolare dettagliata della patogenesi del cancro, offrendo, allo stesso tempo, nuove opportunit? per progettare strategie terapeutiche innovative.
Forma pertanto oggetto specifico della presente invenzione un metodo per la diagnosi in vitro del rischio di recidiva e/o di metastasi in una paziente precedentemente diagnosticata con carcinoma mammario triplo negativo, detto metodo comprendendo misurare l'espressione, in un campione biologico, di uno, pi? di uno o tutti i seguenti RNA circolari:
LTBP2 circRNA di sequenza UGUGCCAACCCUCUGCUGGAGCUGACUACCCAGGAGGACUGCUGUGGCAGUGUGG GAGCCUUCUGGGGGGUGACUUUGUGUGCCCCAUGCCCACCCAGACCAG (SEQ ID NO:1) (detto circRNA LTBP2 avendo origine dall'esone del gene LTBP2 avente la sequenza di DNA corrispondente),
SKIV2L circRNA di sequenza GGCAUGGACUUUGCACCAAAAGAUUGUCCAACUCCAGCUCCUGGACUACUAAGCC UUAGCUGUAUGUUGGAGCCUCUGGAUUUGGGUGGGGGUGACGAGGAUGAGAAUGA GGCAGUGGGACAGCCAGGAGGUCCCAGAGGGGACACUGUUUCAGCCUCUCCCUGC AGUGCUCCCCUGGCCCGAGCAAGCAGCUUGGAAGACCUAGUGUUGAAGGAAGCGU CCACAGCUGUAUCCACCCCAGAGGCCCCAGAGCCUCCAUCUCAGGAGCAGUGGGC CAUCCCUGUGGACGCCACCUCCCCUGUUGGUGAUUUCUAUCGCCUCAUUCCCCAG CCAGCCUUCCAGUGGGCAUUUGAGCCAGAUGUGUUUCAGAAA (SEQ ID NO:2) (detto circRNA SKIV2L provenendo dall'esone del gene SKIV2L avente la sequenza di DNA corrispondente), PDGFRB circRNA di sequenza CUCCUGAGGCUGCCAGCAGCCAGCAGUGACUGCCCGCCCUAUCUGGGACCCAGGA UCGCUCUGUGAGCAACUUGGAGCCAGAGAGGAGAUCAACAAGGAGGAGGAGAGAG CCGGCCCCUCAGCCCUGCUGCCCAGCAGCAGCCUGUGCUCGCCCUGCCCAACGCA GACAGCCAGACCCAGGGCGGCCCCUCUGGCGGCUCUGCUCCUCCCGAAGGAUGCU UGGGGAGUGAGGCGAAGCUGGGCCGCUCCUCUCCCCUACAGCAGCCCCCUUCCUC CAUCCCUCUGUUCUCCUGAGCCUUCAGGAGCCUGCACCAGUCCUGCCUGUCCUUC UACUCAGCUGUUACCCACUCUGGGACCAGCAGUCUUUCUGAUAACUGGGAGAGGG CAGUAAGGAGGACUUCCUGGAGGGGGUGACUGUCCAGAGCCUGGAACUGUGCCCA CACCAGAAGCCAUCAGCAGCAAG (SEQ ID NO:3) (detto circRNA PDGFRB provenendo dall'esone del gene PDGFRB avente la sequenza di DNA corrispondente),
FGFR3 circRNA di sequenza AAGUCCCGGGCCCAGAGCCCGGCCAGCAGGAGCAGUUGGUCUUCGGCAGCGGGGA UGCUGUGGAGCUGAGCUGUCCCCCGCCCGGGGGUGGUCCCAUGGGGCCCACUGUC UGGGUCAAGGAUGGCACAGGGCUGGUGCCCUCGGAGCGUGUCCUGGUGGGGCCCC AGCGGCUGCAGGUGCUGAAUGCCUCCCACGAGGACUCCGGGGCCUACAGCUGCCG GCAGCGGCUCACGCAGCGCGUACUGUGCCACUUCAGUGUGCGGGUGACAG (SEQ ID NO:4) (detto circRNA FGFR3 provenendo dall'esone del gene FGFR3 avente la sequenza di DNA corrispondente), o hsa-circ-0076611 di sequenza UCCCUGUGGGCCUUGCUCAGAGCGGAGAAAGCAUUUGUUUGUACAAGAUCCGCAG ACGUGUAAAUGUUCCUGCAAAAACACAGACUCGCGUUGCAAGGCGAGGCAGCUUG AGUUAAACGAACGUACUUGCAG (SEQ ID NO:5) (detto hsa-circ-0076611 provenendo dall'esone 7 del gene VEGFA avente la sequenza di DNA corrispondente),
in cui la sovraespressione di uno, pi? di uno o tutti detti RNA circolari in detto campione biologico rispetto alla loro espressione in soggetti sani (controllo) indica un rischio di recidiva (ricaduta) e/o di metastasi.
Secondo la presente invenzione, detti pi? di uno RNA circolari possono essere scelti dal gruppo consistente in LTBP circRNA e SKIV2L circRNA; LTBP2 circRNA e PDGFRB circRNA; LTBP2 circRNA e FGFR3 circRNA; LTBP2 circRNA e hsa-circ-0076611; SKIV2L circRNA e PDGFRB circRNA; SKIV2L circRNA e FGFR3 circRNA; SKIV2L circRNA e hsa-circ-0076611; PDGFRB circRNA e FGFR3 circRNA; PDGFRB circRNA e hsa-circ-0076611; FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA e PDGFRB circRNA; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA e FGFR3 circRNA; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA e hsa-circ-0076611; LTBP2 circRNA, PDGFRB circRNA e FGFR3 circRNA; LTBP2 circRNA, PDGFRB circRNA e hsa-circ-0076611; LTBP2 circRNA, FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611; SKIV2L circRNA, PDGFRB circRNA e FGFR3 circRNA; SKIV2L circRNA, PDGFRB circRNA e hsa-circ-0076611; SKIV2L circRNA, FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611; PDGFRB circRNA, FGFR3 circRNA e hsacirc-0076611; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA, PDGFRB circRNA e FGFR3 circRNA; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA, PDGFRB circRNA e hsa-circ-0076611; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA, FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611; LTBP2 circRNA, PDGFRB circRNA, FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611; SKIV2L circRNA, PDGFRB circRNA, FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611. .
Secondo la presente invenzione, detto campione biologico pu? essere una biopsia liquida, come un campione di sangue, un campione di siero, un campione di plasma o un campione di esosomi, in cui detto campione di esosomi contiene esosomi che possono essere isolati dal sangue, ad esempio dal siero o dal plasma.
Il metodo della presente invenzione pu? essere eseguito mediante Real Time PCR, Droplet Digital PCR, Microarray, Metodi di ibridazione dell'RNA come Northern Blot o Dot Blot, RNA Next Generation Sequencing.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione ? l'uso di uno, pi? di uno o tutti i seguenti RNA circolari:
LTBP2 circRNA di sequenza SEQ ID NO:1, SKIV2L circRNA di sequenza SEQ ID NO:2, PDGFRB circRNA di sequenza SEQ ID NO:3, FGFR3 circRNA di sequenza SEQ ID NO:4 o hsa-circ-0076611 di sequenza SEQ ID NO:5, come biomarcatori per la diagnosi in vitro del rischio di recidiva e/o di metastasi in una paziente precedentemente diagnosticata con carcinoma mammario triplo negativo.
Come menzionato sopra, detti pi? di un RNA circolare possono essere scelti dal gruppo consistente in LTBP circRNA e SKIV2L circRNA; LTBP2 circRNA e PDGFRB circRNA; LTBP2 circRNA e FGFR3 circRNA; LTBP2 circRNA e hsa-circ-0076611; SKIV2L circRNA e PDGFRB circRNA; SKIV2L circRNA e FGFR3 circRNA; SKIV2L circRNA e hsa-circ-0076611; PDGFRB circRNA e FGFR3 circRNA; PDGFRB circRNA e hsa-circ-0076611; FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA e PDGFRB circRNA; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA e FGFR3 circRNA; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA e hsa-circ-0076611; LTBP2 circRNA, PDGFRB circRNA e FGFR3 circRNA; LTBP2 circRNA, PDGFRB circRNA e hsacirc-0076611; LTBP2 circRNA, FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611; SKIV2L circRNA, PDGFRB circRNA e FGFR3 circRNA; SKIV2L circRNA, PDGFRB circRNA e hsa-circ-0076611; SKIV2L circRNA, FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611; PDGFRB circRNA, FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA, PDGFRB circRNA e FGFR3 circRNA; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA, PDGFRB circRNA e hsa-circ-0076611; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA, FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611; LTBP2 circRNA, PDGFRB circRNA, FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611; SKIV2L circRNA, PDGFRB circRNA, FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611.
La presente invenzione riguarda anche un kit per la diagnosi in vitro del rischio di recidiva e/o di metastasi in una paziente precedentemente diagnosticata con carcinoma mammario triplo negativo, detto kit comprendendo oligonucleotidi (primer) e/o sonde per la rilevazione di uno, pi? di uno o tutti i seguenti RNA circolari: LTBP2 circRNA della sequenza SEQ ID NO:1, SKIV2L circRNA della sequenza SEQ ID NO:2, PDGFRB circRNA della sequenza SEQ ID NO:3, FGFR3 circRNA della sequenza SEQ ID NO:4 o hsa- circ-0076611 della sequenza SEQ ID NO:5.
Secondo il kit della presente invenzione, detti pi? di un RNA circolare possono essere scelti dal gruppo consistente in LTBP circRNA e SKIV2L circRNA; LTBP2 circRNA e PDGFRB circRNA; LTBP2 circRNA e FGFR3 circRNA; LTBP2 circRNA e hsa-circ-0076611; SKIV2L circRNA e PDGFRB circRNA; SKIV2L circRNA e FGFR3 circRNA; SKIV2L circRNA e hsa-circ-0076611; PDGFRB circRNA e FGFR3 circRNA; PDGFRB circRNA e hsa-circ-0076611; FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA e PDGFRB circRNA; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA e FGFR3 circRNA; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA e hsa-circ-0076611; LTBP2 circRNA, PDGFRB circRNA e FGFR3 circRNA; LTBP2 circRNA, PDGFRB circRNA e hsa-circ-0076611; LTBP2 circRNA, FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611; SKIV2L circRNA, PDGFRB circRNA e FGFR3 circRNA; SKIV2L circRNA, PDGFRB circRNA e hsa-circ-0076611; SKIV2L circRNA, FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611; PDGFRB circRNA, FGFR3 circRNA e hsacirc-0076611; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA, PDGFRB circRNA e FGFR3 circRNA; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA, PDGFRB circRNA e hsa-circ-0076611; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA, FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611; LTBP2 circRNA, PDGFRB circRNA, FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611; SKIV2L circRNA, PDGFRB circRNA, FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611.
Gli oligonucleotidi che possono essere compresi nel kit della presente invenzione per la rilevazione di detti uno o pi? RNA circolari possono essere:
oligonucleotide senso: 5'-GGGGGTGACTTTGTGTGC-3' (SEQ ID NO:6)
oligonucleotide antisenso: 5'-GCAGTCCTCCTGGGTAGTCA-3' (SEQ ID NO:7)
per identificare LTBP2 circRNA;
oligonucleotide senso: 5'-TGATAACTGGGAGAGGGCAG-3' (SEQ ID NO:8)
oligonucleotide antisenso: 5'-GGCTCTCTCCTCCTCCTTGT-3' (SEQ ID NO:9)
per identificare PDGFRB circRNA; oligonucleotide senso: 5'-CAGCTTGGAAGACCTAGTGTTG-3' ((SEQ ID NO:10)
oligonucleotide antisenso: 5'-TCCAGAGGCTCCAACATACA-3' (SEQ ID NO:11)
per identificare SKIV2L circRNA; oligonucleotide senso: 5'-ACTTCAGTGTGCGGGTGAC-3' (SEQ ID NO:12)
oligonucleotide antisenso: 5'-GAAGACCAACTGCTCCTGCT-3' (SEQ ID NO:13)
per identificare FGFR3 circRNA;
oligonucleotide senso: 5'-CGCAGACGTGTAAATGTTCCT-3'(SEQ ID NO:14)
oligonucleotide antisenso: 5'-AGGAACATTTACACGTCTGCG-3' (SEQ ID NO:15)
per identificare hsa-circ-0076611; oligonucleotide senso: 5'-AAACACAGACTCGCGTTGC-3' (SEQ ID NO:16)
oligonucleotide antisenso: 5'-CAAATGCTTTCTCCGCTCTG-3' (SEQ ID NO:17)
per identificare hsa-circ-0076611.
Il kit secondo la presente invenzione pu? inoltre comprendere la sonda AACGTACTTGCAGTCCCTGT (SEQ ID NO:18) quando i primer sono SEQ ID NO:16 e SEQ ID NO:17.
? un ulteriore oggetto della presente invenzione un RNA circolare scelto dal gruppo costituito da LTBP2 circRNA della sequenza SEQ ID NO:1, SKIV2L circRNA della sequenza SEQ ID NO:2, PDGFRB circRNA della sequenza SEQ ID NO:3 o FGFR3 circRNA della sequenza SEQ ID NO:4.
La presente invenzione concerne anche un inibitore dell'RNA circolare hsa-circ-0076611 della sequenza SEQ ID NO:5 per l?uso nel trattamento del carcinoma mammario triplo negativo. In particolare, detto inibitore pu? essere un oligonucleotide antisenso, come 5?-CAGGGACTGCAAGTAC-3? (SEQ ID NO:19).
La presente invenzione verr? ora descritta in modo illustrativo, ma non limitativo, secondo la modalit? pi? adatta, con particolare riferimento agli esempi e ai disegni allegati, dove:
La Figura 1 mostra che le proteine ID4 e p53 mutata controllano eventi di splicing comuni nelle cellule di carcinoma mammario. L'analisi mediante "Arrays" esonici delle linee cellulari di carcinoma mammario SKBR3 e MDA-MB-468, che esprimono endogenamente le proteine p53 mutate indicate, interferite o meno per l'espressione di ID4, p53 mutata o MALAT1, rivela una serie di eventi di splicing comunemente regolati dai tre fattori analizzati. Il cut-off dell'indice di splicing (SI) ? stato impostato a 1,4 per le SKBR3 ed a 1,0 per le MDA-MB-468;
La Figura 2 mostra che prodotti di RNA circolare sono formati da esoni controllati da ID4 / p53 mutata in cellule di carcinoma mammario. A. Modulazione dell'espressione dei geni SKIV2L, FGFR3, RBM15 e ITGB5, risultati modulati tramite analisi di "arrays" esonici, convalidata da RT-qPCR utilizzando oligonucleotidi convergenti in replicati biologici aggiuntivi di cellule MDA-MB-468 interferite per ID4, p53 mutata o entrambe, mediante trasfezione di siRNA. B-F. Analisi di RT-PCR degli esoni corrispondenti ai geni LTBP2, SKIV2L, PDGFRB e FGFR3, risultati modulati nelle analisi di "arrays" esonici, effettuata utilizzando oligonucleotidi divergenti, per valutare la formazione di prodotti di RNA circolare, utilizzando RNA trattati con RNaseR. GAPDH ? stato analizzato come controllo sull'RNA totale non sottoposto a trattamento con RnaseR;
La Figura 3 mostra che un circRNA ha origine dal gene VEGFA. L'analisi di RT-PCR eseguita utilizzando oligonucleotidi divergenti sull'esone 7 di VEGFA, seguito dal sequenziamento di Sanger del prodotto di PCR, rivela l'esistenza di un RNA circolarizzato che racchiude l'esone 7 di VEGFA (circ-0076611) in cellule di carcinoma mammario MDA-MB-468, la cui espressione dipende dalle proteine ID4 e p53 mutata;
La Figura 4 mostra che l'espressione di circ-0076611 ? controllata da ID4 e da p53 mutata nelle cellule di carcinoma mammario. A. Schema raffigurante il saggio TaqMan utilizzato per quantificare l'espressione di circ-0076611, comprendente oligonucleotidi divergenti sull'esone 7 di VEGFA e una sonda TaqMan che copre la giunzione 5'-3' del circRNA. B. Schema che descrive l'approccio sperimentale adottato per valutare la specificit? del saggio TaqMan utilizzato per quantificare circ-0076611. C. Valutazione dell'espressione di GAPDH, VEGF165 (VEGF-lineare) e circ-0076611 (VEGF-circ), tramite RT-qPCR nelle condizioni sperimentali indicate in (B). R: RNaseR; H: RNaseH. D. Analisi di RT-qPCR dell'espressione di circ-0076611 nelle linee cellulari di carcinoma mammario indicate, interferite o meno per l'espressione di ID4 o p53 mutata, mediante trasfezione di siRNA;
La Figura 5 mostra che circ-0076611 ? espresso in linee cellulari e tessuti di carcinoma mammario. Espressione di circ-0076611 (A), VEGF121 (B) e VEGF165 (C) valutata mediante RT-qPCR in un pannello di linee cellulari di carcinoma mammario, normalizzata sull'espressione di GAPDH. D) Espressione di circ-0076611 valutata mediante RT-qPCR nelle sfere tumorali (Sph) e nella controparte aderente (Adh) dalle linee cellulari indicate. E) Espressione di circ-0076611 (grafico, a sinistra) e di lncRNA MALAT1 (gel, a destra) valutati rispettivamente mediante RT-qPCR e RT-PCR in frazioni nucleari e citoplasmatiche da cellule MDA-MB-468. F) Espressione di circ-0076611 valutata mediante RT-qPCR nelle cellule coltivate aderenti indicate (Adh) e negli esosomi derivati da queste linee cellulari (Exo). G) Espressione di circ-0076611 valutata mediante RT-qPCR in campioni tumorali e peritumorali di pazienti con carcinoma mammario, normalizzata rispetto all'espressione di RNU2;
La Figura 6 mostra che circ-0076611 interagisce con i membri del gruppo miR-15/107. A. Alcuni dei miRNA appartenenti al gruppo miR-15/107 sono predetti interagire con circ-0076611 attraverso analisi bioinformatica (http://rna.informatik.unifreiburg.de/IntaRNA). L'energia ? espressa in kcal / mol. B-D. Interazione dei membri del gruppo miR-15/107 selezionati indicati e circ-0076611 valutata tramite analisi di ChIRP in cellule MDA-MB-468. L'RNA ? stato recuperato utilizzando oligonucleotidi biotinilati complementari alla giunzione 5'-3' di circ-0076611 (indicata come G2) o con oligonucleotidi biotinilati LacZ di controllo. E. Espressione di circ-0076611 valutata mediante RT-qPCR su RNA recuperato nel saggio di ChIRP; e
La Figura 7 mostra che circ-0076611 controlla la proliferazione delle cellule di carcinoma mammario. A-B) Espressione delle isoforme circ-0076611, VEGF121A, VEGF121B, VEGF165A e VEGF165B valutate mediante RT-qPCR in cellule di cancro al seno MDA-MB-468 trasfettate con gli oligonucleotidi GapmeR indicati. C-D) Curva di crescita (C) e saggio di formazione di colonie (D) di cellule MDA-MB-468 trasfettate con un oligonucleotide LNA GapmeR per interferire l'espressione di circ-0076611 (G2), un controllo LNA GapmeR G2 recante 5 nucleotidi mutati (G2mut) o un controllo negativo LNA GapmeR (NC1). E) Espressione della ciclina E1 (CCNE1), valutata mediante Western blot in cellule MDA-MB-468 trasfettate come in (B).
ESEMPIO 1: Identificazione e uso diagnostico di RNA circolari secondo la presente invenzione.
MATERIALI E METODI
Colture cellulari
Tutte le linee cellulari sono state coltivate a 37?C, 5% di CO2. Le linee cellulari SK-BR-3 (ATCC? HTB-30?), HCC70 (ATCC? CRL2315?), HCC1954 (ATCC? CRL2338?), MDA-MB-231 (ATCC? HTB-26), HCC1395 (ATCC? SC-CRL-2324) e HCC1143 (ATCC? CRL-2321) sono state mantenute in un mezzo RPMI contenente il 10% di siero bovino fetale inattivato al calore (FBS, Gibco) e penicillina / streptomicina.
Le cellule MCF 10A (ATCC? CRL-10317) sono state mantenute in DMEM F12 integrato con siero di cavallo al 5% pi? 0,01 mg / ml di insulina, 0,5 ug / ml di idrocortisone e 20 ng / ml di EGF. Le MDA-MB-468 (ATCC? HTB-132) sono state mantenute in DMEM ad alto contenuto di glucosio, contenente il 10% di FBS e penicillina / streptomicina. Le Hs578T (ATCC? HTB-126) sono state mantenute in DMEM contenente il 10% di FBS, 0,01 mg / ml di insulina e penicillina / streptomicina. Le Ovcar-3 (ATCC? HTB-161) sono state mantenute in un mezzo RPMI contenente il 20% di siero bovino fetale inattivato al calore (FBS, Gibco), 0,01 mg / mL di insulina e penicillina / streptomicina.
Il reagente RNAiMax (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ? stato utilizzato per trasfettare siRNA per ID4 o p53 (come gi? riportato in Pruszko et al., 2017) e oligonucleotidi GapmeR antisenso LNA<TM >(QIAGEN). Le sequenze per gli oligo GapmeR sono G2 (5'-CAGGGACTGCAAGTAC-3 '(SEQ ID NO: 19), G2MUT (5'-CAGGTCAGCCAAGTAC-3' (SEQ ID NO: 20). Pre-miRNA Negative Control (# AM17110, Ambion) e i precursori Pre-miRNA per i membri del gruppo miR-107 (MirVana, Ambion) sono stati trasfettati alla concentrazione finale di 5 nM utilizzando Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) secondo le istruzioni del produttore.
Preparazione di estratti nucleari e citoplasmatici Le cellule sono state lisate in tampone ipotonico (50 mM HEPES; 150 mM NaCl; 2 mM EDTA; 10 mM MgCl2, 10 mM KCL; 0,5% Nonidet P-40; DTT fresco 2,5 mM e inibitori della proteasi freschi) per 15 minuti in ghiaccio, seguito da 5 minuti di centrifugazione a 0,1 g. I supernatanti sono stati rimossi e utilizzati come frazione citosolica mentre il pellet (corrispondente ai nuclei) ? stato risospeso in tampone contenente SDS al 2% (Tris-Hcl 25 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 3 mM, glicerolo 7%). Gli estratti sono stati sottoposti ad estrazione di RNA con TRIzol (invitrogen). L'espressione di lncRNA MALAT1, arricchita nel nucleo, ? stata utilizzata come marker dopo il frazionamento. Ibridizzazione ed analisi di "Arrays" esonici Il profilo di espressione mediante microarray ? stato eseguito sulla piattaforma Agilent utilizzando il kit di marcatura WT Quick Amp, su vetrini SurePrint G3 Human Exon 2x400K. Il profilo dell'espressione genica dagli array Agilent ? stato estratto dal software Agilent Feature Extraction. Valori inferiori a 1 sono stati considerati al di sotto della soglia di rilevamento. I segnali sono stati sottoposti a normalizzazione quantile e trasformati in log2. La modulazione genica ? stata valutata utilizzando un test di permutazione e un T-test accoppiato. ? stata inclusa anche una procedura di falsa scoperta per confronti multipli. Per identificare geni con splicing differenziale tra campioni trattati e di controllo ? stato calcolato l'indice di splicing (SI) come descritto nel manuale GeneSpring. In breve, l'indice di splicing per ogni sonda in ogni gene ? stato calcolato come la differenza tra i valori normalizzati della sonda genica normalizzata tra il campione trattato e il campione di controllo. La significativit? statistica ? stata calcolata con un t-test. Infine, un singolo valore SI ? stato assegnato a ciascun gene prendendo il valore SI pi? alto delle sonde associate a quel gene. Un valore di cut-off di 1.0 per MDA-MB-468 e 1.4 per SKBR3 ? stato applicato per identificare i geni con splicing differenziale.
Analisi delle sequenze di consenso per proteine leganti l'RNA
Per valutare se gli esoni alterati dopo l'interference di p53 mutata o ID4 presentassero un arricchimento per le sequenze consenso di proteine leganti l'RNA note, sono state considerate le regioni genomiche contenenti le estremit? degli esoni pi? / meno 40 bp a monte e a valle, sulla base della localizzazione del motivo di legame di SRSF1 riportato da Sanford JR et al., (Genome Research 2009). Esoni scelti casualmente dagli stessi geni sono stati usati come controlli per le analisi di arricchimento. L'analisi dell'arricchimento dei motivi ? stata eseguita con Homer (Heinz S. et al., Mol Cell 2010) utilizzando l'intero set di motivi di legame dell'RNA riportati da Ray et al., (A compendium of RNA-binding motifs for decoding gene regulation, Nature, 2013) e quindi ricercando anche la presenza di motivi per SRSF1.
Isolamento dell'RNA e RT-PCR
L'RNA ? stato isolato con il reagente TRIzol (ThermoFisher Scientific) e la sua concentrazione ? stata misurata utilizzando un NanoDrop 2000 (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE, USA). 2 ?g di RNA totale sono stati utilizzati in una reazione di retrotrascrizione seguita dall'analisi di qPCR. La retrotrascrizione ? stata eseguita con SuperScript ? IV VILO ? Master Mix (Invitrogen), seguendo le istruzioni del produttore ma eseguendo la reazione di retrotrascrizione a 65?C. La PCR ? stata eseguita sullo strumento ABI 2020. La qPCR ? stata eseguita su uno strumento QuantStudio5 Fast Sequence Detection Systems (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Gli oligonucleotidi utilizzati per le analisi di PCR sono elencati nella Tabella 1 di seguito. I valori di espressione degli mRNA sono stati calcolati con il metodo ??Ct e normalizzati rispetto ai geni di controllo indicati.
Isolamento dell'RNA dagli esosomi
Gli esosomi sono stati isolati dal terreno condizionato di cellule MDA-MB-468 e OVCAR3 coltivate con siero bovino fetale depleto di esosomi (Euroclone, Cat. N?ECS8001). In particolare, sono stati utilizzati 5 ml di terreno condizionato per 24 ore per isolare gli esosomi utilizzando il kit di isolamento ExoQuick-TC ULTRA EV (SBI, System Biosciences) seguendo le istruzioni del produttore. L'estrazione dell'RNA totale dagli esosomi ? stata eseguita utilizzando il reagente TRIzol (ThermoFisher Scientific) seguendo le istruzioni del produttore. Sono stati aggiunti 0,5 ?g di glicogeno (ThermoFisher Scientific) per migliorare il recupero dell'RNA durante la fase di precipitazione. La concentrazione di RNA ? stata misurata utilizzando un NanoDrop 2000 (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE, USA) e 200 ng di RNA totale da esosomi sono stati utilizzati per la trascrizione inversa utilizzando SuperScript ? IV VILO ? Master Mix (Invitrogen), seguendo le istruzioni del produttore ma eseguendo la retrotrascrizione a 65 ? C. 1 ?l di cDNA ? stato utilizzato in PCR ed in qPCR per analizzare l'espressione dei circRNA.
Analisi dell'espressione dell'RNA circolare
Per l'analisi degli RNA circolari sono stati utilizzati oligonucleotidi divergenti disegnati sugli esoni la cui espressione ? risultata modulata negli "arrays" esonici. La specificit? del rilevamento dei circRNA ? stata inoltre assicurata trattando i campioni di RNA con l'enzima RNaseR, che degrada specificamente le forme di RNA lineare, prima della retrotrascrizione. In dettaglio, 10U dell'enzima RNaseR (Epicentre, Lucigen, Cat. N ? RNR07250) sono state incubate con RNA totale (2-5 ?g) e tampone per RNaseR 1X in una reazione da 20 ?L per 50 min a 37?C in un thermomixer. Dopo la digestione, l'RNA ? stato purificato utilizzando le colonne RNA Clean & Concentrator TM-5 (Zymo Research, Cat. N ? R1015) ed eluito in 8?L di acqua priva di RNasi, seguendo le istruzioni del produttore. La concentrazione dell'RNA purificato ? stata misurata utilizzando un NanoDrop 2000 (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE, USA). 200 ng di RNA purificato sono stati sottoposti a retrotrascrizione in una reazione di 20 ?l utilizzando SuperScript ? IV VILO ? Master Mix (ThermoFisher Scientific), seguendo le istruzioni del produttore ma eseguendo la reazione di retrotrascrizione a 65 ? C. Durante la retrotrascrizione ? sempre stato incluso un campione di controllo negativo contenente l'RNA stampo e una master mix senza enzima (fornito con il kit).
1 ?l di cDNA ? stato utilizzato per analizzare l'espressione del circRNA in PCR e qPCR.
Le analisi di PCR sono state eseguite in una reazione di 20 ?L utilizzando AmpliTaq Gold ? 360 Master Mix (ThermoFisher Scientific, Cat. N ? 4398886) seguendo le istruzioni del produttore, utilizzando 10pmol di ciascun oligonucleotide. La PCR ? stata eseguita sullo strumento ABI 2020 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) utilizzando 58?C / 30 sec. come condizione di ibridizzazione e 72?C / 30 sec. come condizione di estensione. Gli oligonucleotidi utilizzati nella PCR per i vari circRNA analizzati sono inclusi nella Tabella 1 di seguito (indicati come div_F e div_R). I prodotti della PCR sono stati valutati dopo 38 cicli di PCR su un gel di agarosio al 3% (p / v). Per l'analisi di qPCR di circVEGF (hsa-circ-0076611), come oligonucleotidi sono stati utilizzati div_F2 / div_R2 e una sonda TaqMan che copre la giunzione 5'-3' (vedere la Tabella 1 sotto). Sono state impostate reazioni da 15 ?l utilizzando la Luna? Universal qPCR Master Mix (New England Biolabs, Cat. N ? BM3003E), 10pmol di ciascun primer e 5pmol della sonda TaqMan. La qPCR ? stata eseguita su QuantStudio5 Fast Sequence Detection Systems (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA).
Per l'analisi di qPCR di circVEGF (hsa-circ-0076611) in campioni di carcinoma mammario e nella loro controparte peritumorale ? stata eseguita una preamplificazione lineare di circVEGF utilizzando gli oligonucleotidi divF e divR utilizzando AmpliTaq Gold ? 360 Master Mix (come descritto sopra per gli altri circRNA) e successivamente 1 ?L di questa reazione ? stato utilizzato per eseguire la qPCR con il saggio TaqMan descritto sopra.
Tutti gli oligonucleotidi e la sonda TaqMan sono stati acquistati da IdT (Integrated DNA Technologies) se non specificato diversamente.
La tabella 1 mostra i primer utilizzati nella PCR per i vari circRNA analizzati (indicati come div_F e div_R).
Tabella 1
Analisi di circVEGF mediante ibridazione in situ Per l'analisi tramite ibridazione in situ di circVEGF ? stata applicata la tecnologia BaseScope (Biotechne s.r.l.), seguendo le istruzioni del produttore. Per rilevare circVEGF ? stata utilizzata la sonda BaseScope? Probe -BA-Hs-VEGFA-E7-circRNA (Cat. N? 724521), situata sulla giunzione Esone7 / Esone7_1715 / 1584 del trascritto che origina dal gene vascular endotelial growth factor A (VEGFA), variante 1, Homo sapiens.
Analisi dell'espressione dei microRNA
La retrotrascrizione dei miRNA e la quantificazione mediante qPCR dell'espressione dei miRNA sono state eseguite, rispettivamente, mediante saggio TaqMan MicroRNA RT e saggio TaqMan MiRNA? (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), secondo il protocollo del produttore. RNU44 e RNU48 sono stati utilizzati come controlli endogeni per standardizzare l'espressione dei miRNA. Tutte le reazioni sono state eseguite in duplicato.
Campioni di carcinoma mammario
Sono stati analizzati campioni di tessuto tumorale e peritumorale (adiacente).
La raccolta di tumori da pazienti con carcinoma mammario ? stata esaminata e approvata dal comitato etico dell'Istituto Nazionale Tumori Regina Elena (IFO1270/19) e il consenso informato scritto per l'uso di campioni di tessuto per lo studio ? stato ottenuto da tutti i pazienti.
ChIRP (isolamento della cromatina mediante purificazione dell'RNA)
I saggi di ChIRP sono stati eseguito come descritto (Chu et al., 2011). Per ogni condizione sono state utilizzate 20 milioni di cellule. Gli oligonucleotidi biotinilati diretti verso circ-0076611 e, come controllo, verso LacZ, sono elencati nella Tabella 2. Gli oligonucleotidi biotinilati sono stati recuperati utilizzando Dynabeads? MyOne ? streptavidina C1 (Invitrogen). Dopo le fasi di lavaggio, l'intero materiale recuperato ? stato utilizzato per la purificazione dell'RNA con TRIzol. L'RNA ? stato risospeso in 20 ?l e 4 ?l sono stati utilizzati per la retrotrascrizione utilizzando SuperScript? IV VILO? Master Mix (Invitrogen) per controllare l'arricchimento per circ-0076611, mentre 1 ?l ? stato utilizzato per verificare la presenza di microRNA come descritto sopra.
La tabella 2 mostra le sequenze oligonucleotidiche utilizzate per il silenziamento (GapmeR) e il recupero (ChIRP) di circVEGF.
Tabella 2
Saggi di proliferazione / formazione di colonie Per i saggi di proliferazione, 3x10<5 >cellule MDA-MB-468 sono state trasfettate con oligonucleotidi GapmeR, come descritto sopra, piastrate in piastre multi-pozzetto da 6 pozzetti e contate utilizzando la camera Thoma a 24 ore, 48 ore, 72 ore, 96 ore dalla trasfezione. Ogni punto ? stato contato 2 volte da due investigatori. Sono stati valutati tre replicati biologici. Per i saggi di formazione di colonie, le cellule sono state trasfettate come descritto sopra e 24 ore dopo la trasfezione tripsinizzate e piastrate in piastre multi-pozzetto a 6 pozzetti (400 cellule per pozzetto). Il mezzo fresco ? stato aggiunto una volta alla settimana. Le colonie sono state fissate / colorate e contate dopo 3 settimane.
RISULTATI
Identificazione di eventi di splicing dipendenti da ID4 / p53 mutata tramite "arrays" esonici
Come accennato precedentemente, ? stato dimostrato che le proteine ID4 e p53 mutata, attraverso l'interazione con il fattore di splicing SRSF1 ed il lncRNA MALAT1, interagiscono e controllano la formazione di isoforme di splicing del VEGF nelle cellule di carcinoma mammario. Abbiamo quindi esplorato se il complesso ID4 / p53 mutata controllasse il processo di splicing di altri trascritti, oltre a VEGF. A tal fine, l'RNA estratto da cellule MDA-MB-468 (che esprimono il mutante endogeno p53R273H) e SKBR3 (che esprimono il mutante endogeno p53R175H), interferite o meno per l'espressione di ID4, p53 mutata o MALAT1, mediante trasfezione di siRNA, ? stato marcato e ibridato su "arrays" esonici (su piattaforma Agilent). L'analisi degli esoni espressi in modo differenziale ha identificato un pannello di geni comunemente deregolato in seguito all'interference di ID4 o p53 mutata a livello di splicing (Figura 1). La maggior parte di questi esoni ? anche modulata in seguito al silenziamento di MALAT1. In particolare, 59 e 67 esoni sono risultati controllati sia da ID4 che da p53 mutata nelle cellule MDA-MB-468 e SKBR3, rispettivamente, con 24 eventi di splicing condivisi dalle due linee cellulari (Figura 1).
Le regioni genomiche che racchiudono gli esoni dipendenti da ID4 / p53 mutata sono arricchite di sequenze consenso per specifiche proteine leganti l'RNA Successivamente, sono state analizzate le regioni genomiche che racchiudono e circondano gli esoni la cui espressione ? risultata alterata in seguito alla deplezione di ID4 / p53 mutata. L'analisi ? stata eseguita sulla lista dei geni alterati a livello di esone dall'interference di ID4 o p53 mutata nelle cellule SKBR3 (cut-off di indice di splicing SI 1.4) poich? in questa linea cellulare sono stati osservati cambiamenti pi? marcati dell'indice di splicing (SI). Sulla base di studi precedenti che riportavano la localizzazione genomica dei siti di legame per SRSF1 (Sanford et al., 2009), il fattore di splicing che collabora con ID4 / p53 mutata nel controllo dello splicing di VEGF (Pruszko et al., 2017), le seguenti regioni genomiche sono state considerate per l'analisi: Inizio dell'esone /- 40bp; Fine dell'esone /- 40 bp; esone intero /- 40 bp. Gli esoni scelti in modo casuale dagli stessi geni sono stati usati come controlli per le analisi di arricchimento.
? stato innanzitutto valutato che la sequenza di consenso per SRSF1 ? arricchita nelle regioni considerate: l'analisi dell'arricchimento di motivi noti mostra che un motivo SRSF1 ? altamente arricchito e identifica altre proteine leganti l'RNA, come ad esempio ZNF638, QKI e PTBP1, che potrebbero potenzialmente partecipare al controllo dello splicing esercitato dalle proteine ID4 / p53 mutata (Tabella 3). Quando si analizza la presenza di tutti i motivi annotati per SRSF1, 41 regioni esoniche su 86 hanno motivi, 21 sono all'inizio, 20 sono alla fine, 29 geni su 43 hanno siti di legame, 12 geni su 43 hanno siti di legame sia all'inizio che alla fine dell'esone. Ci? suggerisce che SRSF1 coopera con le proteine ID4 / p53 mutata nel controllo di ulteriori eventi di splicing, oltre a quello del VEGF.
La tabella 3 mostra le proteine leganti l'RNA le cui sequenze di consenso sono state trovate arricchite nelle regioni genomiche che racchiudono gli esoni che sono stati identificati come alterati in seguito alla deplezione di ID4 o di p53 mutata nelle cellule SKBR3.
Tabella 3
Gli esoni dipendenti da ID4 / p53 mutata sono coinvolti nella formazione di prodotti di RNA circolare L'analisi degli esoni la cui espressione ? alterata dal silenziamento di ID4 / p53 mutata nelle cellule MDA-MB-468 e SKBR3 ha rivelato che la loro posizione genomica era distribuita nella sequenza codificante (CDS) e nelle regioni non tradotte 5'-UTR o 3'-UTR. ? importante sottolineare che una gran parte di questi esoni non ? coinvolta in eventi di splicing alternativi, come ci si sarebbe potuto aspettare, ma, al contrario, sono esoni costitutivi. Questo risultato inaspettato ha suggerito che la modulazione di questi esoni da parte di ID4 / p53 mutata non poteva essere attribuita a eventi di splicing alternativi canonici. Studi recenti mostrano che la proteina p53 mutata pu? essere coinvolta nella generazione di prodotti di RNA circolare; in particolare, p53 mutata modula l'espressione di circPVT1, un RNA circolare derivante dal lncRNA PVT1, nelle cellule HNSCC (Verduci et al., 2017). ? stato quindi esaminato se anche gli eventi di splicing modulati dalle proteine ID4 / p53 mutata nelle cellule di carcinoma mammario potessero portare alla generazione di prodotti di RNA circolare. Per rispondere a questa domanda sono stati disegnati oligonucleotidi sia convergenti che divergenti negli esoni la cui espressione risultava alterata dall'analisi di microarray. L'analisi di RT-qPCR utilizzando oligonucleotidi convergenti ha validato i risultati dell'"array", mostrando che l'espressione di FGFR3, SKIV2L e RBM15, modulati a livello di esone, cos? come quella di ITGB5, modulato a livello di espressione e scelto come controllo, ? ridotta nelle cellule prive di ID4 o p53 mutata (Figura 2A); la riduzione dell'espressione era pi? marcata quando sono state analizzate cellule con deplezione concomitante di ID4 e p53 mutata.
L'analisi mediante RT-PCR utilizzando oligonucleotidi divergenti ed un cDNA derivato dall'RNA trattato con RNaseR, consentendo la degradazione di tutte le forme di RNA lineare, ha evidenziato che forme di RNA circolare sono generate da un gruppo di esoni scelti tra i 24 esoni sopra menzionati, ovvero LTBP2, SKIV2L, PDGFRB e FGFR3 (Figura 2B-E), mentre non ? stata osservata alcuna amplificazione da ITGB5 (non mostrato). L'analisi di GAPDH ? stata eseguita come controllo utilizzando un cDNA da RNA non trattato con RNaseR (Figura 2F). GAPDH non era rilevabile sui campioni trattati con RNaseR (non mostrato). Da notare, i circRNA provenienti da LTBP2, SKIV2L e PDGFRB, ma non quello da FGFR3, sono rilevabili anche sull'RNA totale estratto dagli esosomi (Figura 2B-E).
Gli esoni dei geni LTBP2, SKIV2L, PDGFRB e FGFR3, utilizzati per il disegno degli oligonucleotidi divergenti, secondo la versione del genoma umano GRCh37 / hg19, sono i seguenti:
LTBP2 (chr14: 75016566-75016669) TGTGCCAACCCTCTGCTGGAGCTGACTACCCAGGAGGACTGCTGTGGCAG TGTGGGAGCCTTCTGGGGGGTGACTTTGTGTGCCCCATGCCCACCCAGACCAG
(SEQ ID NO:24)
SKIV2L (chr6: 31928972-31929163) GGCATGGACTTTGCACCAAAAGATTGTCCAACTCCAGCTCCTGGACTACT AAGCCTTAGCTGTATGTTGGAGCCTCTGGATTTGGGTGGGGGTGACGAGGATGAG AATGAGGCAGTGGGACAGCCAGGAGGTCCCAGAGGGGACACTGTTTCAGCCTCTC CCTGCAGTGCTCCCCTGGCCCGAGCAAGCAGCTTGGAAGACCTAGTGTTGAAGGA AGCGTCCACAGCTGTATCCACCCCAGAGGCCCCAGAGCCTCCATCTCAGGAGCAG TGGGCCATCCCTGTGGACGCCACCTCCCCTGTTGGTGATTTCTATCGCCTCATTC CCCAGCCAGCCTTCCAGTGGGCATTTGAGCCAGATGTGTTTCAGAAA (SEQ ID NO:25)
PDGFRB (chr5: 149534960-149535423) CTCCTGAGGCTGCCAGCAGCCAGCAGTGACTGCCCGCCCTATCTGGGACC CAGGATCGCTCTGTGAGCAACTTGGAGCCAGAGAGGAGATCAACAAGGAGGAGGA GAGAGCCGGCCCCTCAGCCCTGCTGCCCAGCAGCAGCCTGTGCTCGCCCTGCCCA ACGCAGACAGCCAGACCCAGGGCGGCCCCTCTGGCGGCTCTGCTCCTCCCGAAGG ATGCTTGGGGAGTGAGGCGAAGCTGGGCCGCTCCTCTCCCCTACAGCAGCCCCCT TCCTCCATCCCTCTGTTCTCCTGAGCCTTCAGGAGCCTGCACCAGTCCTGCCTGT CCTTCTACTCAGCTGTTACCCACTCTGGGACCAGCAGTCTTTCTGATAACTGGGA GAGGGCAGTAAGGAGGACTTCCTGGAGGGGGTGACTGTCCAGAGCCTGGAACTGT GCCCACACCAGAAGCCATCAGCAGCAAG (SEQ ID NO:26)
FGFR3 (chr4: 1800980-1801250) AAGTCCCGGGCCCAGAGCCCGGCCAGCAGGAGCAGTTGGTCTTCGGCAGC GGGGATGCTGTGGAGCTGAGCTGTCCCCCGCCCGGGGGTGGTCCCATGGGGCCCA CTGTCTGGGTCAAGGATGGCACAGGGCTGGTGCCCTCGGAGCGTGTCCTGGTGGG GCCCCAGCGGCTGCAGGTGCTGAATGCCTCCCACGAGGACTCCGGGGCCTACAGC TGCCGGCAGCGGCTCACGCAGCGCGTACTGTGCCACTTCAGTGTGCGGGTGACAG
(SEQ ID NO:27)
Un circRNA dipendente da ID4 / p53 mutata viene generato dal gene VEGFA nelle cellule di carcinoma mammario ed ? secreto negli esosomi
Diversi circRNA sono generati anche dal gene VEGFA (Salzman et al., 2013), come riportato nel database circBase (http://www.circbase.org). Tuttavia, il complesso modello di splicing derivante da questo gene rende difficile l'interpretazione dei risultati degli array esonici per il VEGFA. La posizione genomica dei circRNA prodotti dal gene VEGF ? stata quindi analizzata e si ? deciso di valutare il prodotto corrispondente all'Esone 7, poich? l'equilibrio tra le isoforme VEGF165 e VEGF121, che comprendono o meno l'esone 7, rispettivamente, ? controllato da ID4 e p53 mutata nelle cellule di carcinoma mammario (Pruszko et al., 2017).
Secondo la versione del genoma umano GRCh37 / hg19, la sequenza di VEGFA Esone7, chr6: 43749693-43749824, ?: TCCCTGTGGGCCTTGCTCAGAGCGGAGAAAGCATTTGTTTGTACAAGATCCGCAG ACGTGTAAATGTTCCTGCAAAAACACAGACTCGCGTTGCAAGGCGAGGCAGCTTG AGTTAAACGAACGTACTTGCAG (SEQ ID NO:28)
Utilizzando oligonucleotidi divergenti nell'esone 7 in RT-PCR e successivo sequenziamento, ? stato scoperto che il circRNA che racchiude questo esone (hsa-circ-0076611) ? effettivamente prodotto nelle cellule di carcinoma mammario MDA-MB-468 in modo ID4 / p53 mutatadipendente (Figura 3).
Per rilevare il circ-0076611 mediante RT-qPCR, ? stato progettato un saggio TaqMan composto da una coppia di oligonucleotidi divergenti nell'esone 7 del VEGF e una sonda TaqMan che copre la giunzione 5'-3'. La specificit? del rilevamento di circ-0076611 ? stata valutata trattando o meno inizialmente l'RNA totale con RNaseR, che degrada specificamente le forme lineari di RNA, e in secondo luogo con RNaseH, che degrada ibridi RNA/DNA, in presenza di un oligonucleotide complementare all'esone 7 di VEGF (Figura 4A -B). Come previsto, ? stata rilevata una ridotta espressione di circ-0076611 solo in presenza di RNaseH, a causa dell'oligonucleotide complementare all'esone 7 del VEGF; circ-0076611 non ? stato influenzato da RNaseR. Al contrario, le forme lineari di mRNA di VEGF (VEGF165 o VEGF206), che racchiudono l'esone 7, sono state diminuite sia da RNaseH che da RNaseR (Figura 4A-C). L'efficacia e la specificit? delle RNasi sono state ulteriormente dimostrate dall'analisi dei livelli di mRNA di GAPDH; l'espressione di GAPDH infatti ? influenzata solo dal trattamento con RNaseR e non dall' RNaseH, poich? l'oligonucleotide impiegato nell'esperimento riconosce specificamente l'esone 7 di VEGF e non la sequenza di GAPDH (Figura 4C). ? stato successivamente quantificato circ-0076611 nelle cellule di carcinoma mammario silenziate o meno per l'espressione di p53 mutata o ID4. Come previsto, il silenziamento di p53 mutata o ID4 ha ridotto i livelli di hsa-circ-0076611 nelle cellule MDA-MB-468, HCC1954 e SKBR3 (Figura 4D).
Successivamente, ? stata valutata l'espressione di circ-0076611 in un pannello di linee cellulari di carcinoma mammario di tipo basale e in cellule mammarie epiteliali MCF10A non trasformate. Come mostrato nella Figura 5A, circ-0076611 ? espresso a livelli pi? alti in Basal-A rispetto al sottotipo Basal-B e alle cellule MCF10A. Al contrario, VEGF165 e VEGF121, le isoforme VEGF pi? espresse, sono espresse in modo variabile nelle cellule Basal-A, -B e MCF10A (Figura 5B-C). ? stato anche notato che i livelli di circ-0076611 sono pi? elevati nelle cellule HCC1954 e HCC70 coltivate come mammosfere rispetto alle cellule aderenti (Figura 5D). L'analisi delle frazioni nucleari e citoplasmatiche delle cellule MDA-MB-468 ha rivelato che l'espressione di circ-0076611 ? principalmente nucleare (Figura 5E). Infine, l'analisi dell'RNA estratto dagli esosomi ha rivelato che circ-0076611 ? fortemente arricchito in esosomi derivati da due linee di cellule tumorali (Figura 5F).
circ-0076611 ? espresso nei tumori di pazienti con carcinoma mammario
L'analisi di tumori congelati freschi (T) e dei tessuti peritumorali adiacenti (PT) da un piccolo gruppo di 12 pazienti con carcinoma mammario ER-negativo, ha evidenziato che circ-0076611 ? rilevabile nella met? dei tumori ed ? assente nei tessuti peritumorali (Figura 5G).
? stata valutata anche l'espressione di circ-0076611 utilizzando la tecnologia BaseScope per l'ibridazione in situ utilizzando una sonda che copre la giunzione di splicing. Sono stati selezionati 9 casi di carcinoma mammario triplo negativo che presentavano un alto livello di espressione della proteina ID4 (punteggio 3+). Questa analisi ha evidenziato 6 casi con bassa espressione (valutati come 1+) e 3 casi con alta espressione (valutati come 2+ e 3+). Inoltre, questa analisi ha confermato la localizzazione principalmente nucleare di questo circRNA.
circVEGF interagisce con i membri del gruppo miR-107
Per esplorare la funzione di circ-0076611 nel carcinoma mammario, ? stata analizzata la sequenza di circRNA alla ricerca di siti di legame per i microRNA. Il sequestro dei microRNA ? infatti una delle principali funzioni dei circRNA, anche nei meccanismi alla base del cancro. Attraverso la previsione bioinformatica dell'interazione RNA:RNA (http://rna.informatik.uni-freiburg.de/IntaRNA), ? stato osservato che circ-0076611 ha regioni complementari a vari membri del gruppo di microRNA miR-15/107 (Figura 6A). Il gruppo genico miR-15/107 contiene pi? membri di microRNA altamente conservati, inclusi miR-15a-5p, miR-15b-5p, miR-16-5p, miR-103a-3p, miR-107, miR-195-5p, miR-424-5p, miR-497-5p, miR-503-5p e miR-646 (Finnerty et al., 2010). L'inclusione nel gruppo miR-15/107 si basa sulla presenza di "AGCAGC" nella regione "seed" del miRNA a partire dal primo nucleotide o dal secondo nucleotide dall'estremit? 5' del miRNA maturo (? 22 nt, singolo filamento).
Quelli con l'interazione prevista pi? forte sono miR-646, miR-503-5p, miR-497-5p e miR-107/103. Il gruppo miR-15/107 ? gi? stato correlato ad ID4 in studi precedenti (Donzelli et al., 2018). Saggi di ChIRP sono stati utilizzati per valutare l'interazione di circ-0076611 con i microRNA putativi interattori. In particolare, il circRNA e tutti i suoi RNA interagenti sono stati recuperati utilizzando un oligonucleotide biotinilato complementare alla giunzione di splicing 5'-3' dell'esone 7 di VEGF nelle cellule MDA-MB-468 (Figura 6B-E). Come controllo negativo ? stato utilizzato un oligonucleotide LacZ biotinilato. L'analisi di RT-qPCR del gruppo miR-107 ha evidenziato che circ-0076611 mostra una forte interazione con miR-497, miR-646 e miR-503, legati in modo dipendente da ID4 (Figura 6B-E).
circVEGF ? necessario per la proliferazione delle cellule di carcinoma mammario
Per studiare la ricaduta biologica della presenza di circ-0076611 nelle cellule di carcinoma mammario, il silenziamento di circ-0076611 ? stato messo a punto attraverso la trasfezione di oligonucleotidi GapmeR (G1 e G2) complementari alla giunzione di splicing 5'-3' dell'esone 7 del VEGF. La specificit? del silenziamento del circRNA ? stata valutata mediante analisi di RT-qPCR dei livelli di circ-0076611 nonch? delle principali isoforme lineari di VEGF (ad es. VEGF165A/B e VEGF121A/B). Come mostrato nella Figura 7A, sia il GapmeR G1 che il G2 sono in grado di ridurre l'espressione di circ-0076611, con G2 che mostra un'efficienza maggiore di G1. Inoltre, G1 mostra una bassa specificit? in quanto influenza in modo significativo anche le isoforme VEGF165 e VEGF121 (Figura 7A), e per questo motivo solo G2 ? stato utilizzato negli esperimenti successivi. Negli studi funzionali ? stato introdotto anche l'uso di un controllo aggiuntivo GapmeR (G2-MUT), che presenta cinque nucleotidi mutati rispetto a G2. La trasfezione di G2-MUT non ha influenzato l'espressione di circ-0076611 (Figura 7B).
L'analisi della curva di crescita ? stata eseguita in cellule MDA-MB-468 trasfettate con GapmeR di controllo (NC1), G2 e G2-MUT. Come mostrato nella Figura 7C, il silenziamento di circ-0076611 (condizione G2) ha gravemente compromesso la proliferazione delle cellule. Coerentemente, il test di formazione delle colonie ha mostrato un numero notevolmente ridotto di colonie nei campioni trasfettati con G2 GapmeR, rispetto ai controlli NC1 e G2mut (Figura 7D).
I membri del gruppo miR-107 hanno dimostrato di modulare la proliferazione attraverso la loro capacit? di inibire l'espressione di geni correlati al ciclo cellulare, come cicline e CDK. ? stato quindi studiato se circ-0076611 influisce sulla proliferazione attraverso la sua capacit? di sequestrare i membri del gruppo miR-107. Per rispondere a questa domanda, ? stata valutata l'espressione di CCNE1 (ciclina E1), un bersaglio molto ben caratterizzato del gruppo miR-107, dopo la trasfezione del GapmeR G2. Come mostrato nella Figura 7E, il silenziamento di circ-0076611 ha portato a una diminuzione del livello della proteina CCNE1, suggerendo che questo circRNA controlla la proliferazione cellulare attraverso il sequestro dei membri del gruppo miR-107.

Claims (14)

RIVENDICAZIONI
1) Metodo per la diagnosi in vitro del rischio di recidiva e/o di metastasi in una paziente precedentemente diagnosticata con carcinoma mammario triplo negativo, detto metodo comprendendo misurare l'espressione, in un campione biologico, di uno, pi? di uno o tutti i seguenti RNA circolari:
LTBP2 circRNA di sequenza UGUGCCAACCCUCUGCUGGAGCUGACUACCCAGGAGGACUGCUGUGGCAGUGUGG GAGCCUUCUGGGGGGUGACUUUGUGUGCCCCAUGCCCACCCAGACCAG (SEQ ID NO:1),
SKIV2L circRNA di sequenza GGCAUGGACUUUGCACCAAAAGAUUGUCCAACUCCAGCUCCUGGACUACUAAGCC UUAGCUGUAUGUUGGAGCCUCUGGAUUUGGGUGGGGGUGACGAGGAUGAGAAUGA GGCAGUGGGACAGCCAGGAGGUCCCAGAGGGGACACUGUUUCAGCCUCUCCCUGC AGUGCUCCCCUGGCCCGAGCAAGCAGCUUGGAAGACCUAGUGUUGAAGGAAGCGU CCACAGCUGUAUCCACCCCAGAGGCCCCAGAGCCUCCAUCUCAGGAGCAGUGGGC CAUCCCUGUGGACGCCACCUCCCCUGUUGGUGAUUUCUAUCGCCUCAUUCCCCAG CCAGCCUUCCAGUGGGCAUUUGAGCCAGAUGUGUUUCAGAAA (SEQ ID NO:2),
PDGFRB circRNA di sequenza CUCCUGAGGCUGCCAGCAGCCAGCAGUGACUGCCCGCCCUAUCUGGGACCCAGGA UCGCUCUGUGAGCAACUUGGAGCCAGAGAGGAGAUCAACAAGGAGGAGGAGAGAG CCGGCCCCUCAGCCCUGCUGCCCAGCAGCAGCCUGUGCUCGCCCUGCCCAACGCA GACAGCCAGACCCAGGGCGGCCCCUCUGGCGGCUCUGCUCCUCCCGAAGGAUGCU UGGGGAGUGAGGCGAAGCUGGGCCGCUCCUCUCCCCUACAGCAGCCCCCUUCCUC CAUCCCUCUGUUCUCCUGAGCCUUCAGGAGCCUGCACCAGUCCUGCCUGUCCUUC UACUCAGCUGUUACCCACUCUGGGACCAGCAGUCUUUCUGAUAACUGGGAGAGGG CAGUAAGGAGGACUUCCUGGAGGGGGUGACUGUCCAGAGCCUGGAACUGUGCCCA CACCAGAAGCCAUCAGCAGCAAG (SEQ ID NO:3),
FGFR3 circRNA di sequenza AAGUCCCGGGCCCAGAGCCCGGCCAGCAGGAGCAGUUGGUCUUCGGCAGCGGGGA UGCUGUGGAGCUGAGCUGUCCCCCGCCCGGGGGUGGUCCCAUGGGGCCCACUGUC UGGGUCAAGGAUGGCACAGGGCUGGUGCCCUCGGAGCGUGUCCUGGUGGGGCCCC AGCGGCUGCAGGUGCUGAAUGCCUCCCACGAGGACUCCGGGGCCUACAGCUGCCG GCAGCGGCUCACGCAGCGCGUACUGUGCCACUUCAGUGUGCGGGUGACAG (SEQ ID NO:4) or
hsa-circ-0076611 di sequenza UCCCUGUGGGCCUUGCUCAGAGCGGAGAAAGCAUUUGUUUGUACAAGAUCCGCAG ACGUGUAAAUGUUCCUGCAAAAACACAGACUCGCGUUGCAAGGCGAGGCAGCUUG AGUUAAACGAACGUACUUGCAG (SEQ ID NO:5),
in cui la sovraespressione di uno, pi? di uno o di tutti detti RNA circolari in detto campione biologico rispetto alla loro espressione in soggetti sani indica un rischio di recidiva e/o di metastasi.
2) Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detti pi? di uno RNA circolari sono scelti dal gruppo consistente in LTBP circRNA e SKIV2L circRNA; LTBP2 circRNA e PDGFRB circRNA; LTBP2 circRNA e FGFR3 circRNA; LTBP2 circRNA e hsa-circ-0076611; SKIV2L circRNA e PDGFRB circRNA; SKIV2L circRNA e FGFR3 circRNA; SKIV2L circRNA e hsa-circ-0076611; PDGFRB circRNA e FGFR3 circRNA; PDGFRB circRNA e hsa-circ-0076611; FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA e PDGFRB circRNA; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA e FGFR3 circRNA; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA e hsa-circ-0076611; LTBP2 circRNA, PDGFRB circRNA e FGFR3 circRNA; LTBP2 circRNA, PDGFRB circRNA e hsa-circ-0076611; LTBP2 circRNA, FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611; SKIV2L circRNA, PDGFRB circRNA e FGFR3 circRNA; SKIV2L circRNA, PDGFRB circRNA e hsa-circ-0076611; SKIV2L circRNA, FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611; PDGFRB circRNA, FGFR3 circRNA e hsacirc-0076611; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA, PDGFRB circRNA e FGFR3 circRNA; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA, PDGFRB circRNA e hsa-circ-0076611; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA, FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611; LTBP2 circRNA, PDGFRB circRNA, FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611; SKIV2L circRNA, PDGFRB circRNA, FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611.
3) Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-2, in cui il campione biologico ? una biopsia liquida.
4) Metodo secondo la rivendicazione 3, in cui detta biopsia liquida ? selezionata dal gruppo consistente in campione di sangue, campione di siero, campione di plasma o campione di esosomi.
5) Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, in cui detto metodo viene eseguito mediante Real Time PCR, Droplet Digital PCR, Microarray, Metodi di ibridazione dell'RNA come Northern Blot o Dot Blot, RNA Next Generation Sequencing.
6) Uso di uno, pi? di uno o tutti i seguenti RNA circolari
LTBP2 circRNA di sequenza SEQ ID NO:1,
SKIV2L circRNA di sequenza SEQ ID NO:2,
PDGFRB circRNA di sequenza SEQ ID NO:3,
FGFR3 circRNA di sequenza SEQ ID NO:4, or
hsa-circ-0076611 di sequenza SEQ ID NO:5,
come biomarcatori per la diagnosi in vitro del rischio di recidiva e/o di metastasi in una paziente precedentemente diagnosticata con tumore mammario triplo negativo.
7) Uso secondo la rivendicazione 6, in cui detti pi? di uno RNA circolari sono scelti dal gruppo consistente in LTBP circRNA e SKIV2L circRNA; LTBP2 circRNA e PDGFRB circRNA; LTBP2 circRNA e FGFR3 circRNA; LTBP2 circRNA e hsa-circ-0076611; SKIV2L circRNA e PDGFRB circRNA; SKIV2L circRNA e FGFR3 circRNA; SKIV2L circRNA e hsa-circ-0076611; PDGFRB circRNA e FGFR3 circRNA; PDGFRB circRNA e hsa-circ-0076611; FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA e PDGFRB circRNA; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA e FGFR3 circRNA; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA e hsa-circ-0076611; LTBP2 circRNA, PDGFRB circRNA e FGFR3 circRNA; LTBP2 circRNA, PDGFRB circRNA e hsa-circ-0076611; LTBP2 circRNA, FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611; SKIV2L circRNA, PDGFRB circRNA e FGFR3 circRNA; SKIV2L circRNA, PDGFRB circRNA e hsa-circ-0076611; SKIV2L circRNA, FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611; PDGFRB circRNA, FGFR3 circRNA e hsacirc-0076611; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA, PDGFRB circRNA e FGFR3 circRNA; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA, PDGFRB circRNA e hsa-circ-0076611; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA, FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611; LTBP2 circRNA, PDGFRB circRNA, FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611; SKIV2L circRNA, PDGFRB circRNA, FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611.
8) Kit per la diagnosi in vitro del rischio di recidiva e/o di metastasi in una paziente precedentemente diagnosticata con carcinoma mammario triplo negativo, detto kit comprendendo oligonucleotidi e/o sonde per il rilevamento di uno, pi? di uno o tutti i seguenti circolari RNA:
LTBP2 circRNA di sequenza SEQ ID NO:1,
SKIV2L circRNA di sequenza SEQ ID NO:2,
PDGFRB circRNA di sequenza SEQ ID NO:3,
FGFR3 circRNA di sequenza SEQ ID NO:4, or
hsa-circ-0076611 di sequenza SEQ ID NO:5.
9) Kit secondo la rivendicazione 8, in cui detti pi? di uno RNA circolari sono scelti dal gruppo consistente in LTBP circRNA e SKIV2L circRNA; LTBP2 circRNA e PDGFRB circRNA; LTBP2 circRNA e FGFR3 circRNA; LTBP2 circRNA e hsa-circ-0076611; SKIV2L circRNA e PDGFRB circRNA; SKIV2L circRNA e FGFR3 circRNA; SKIV2L circRNA e hsa-circ-0076611; PDGFRB circRNA e FGFR3 circRNA; PDGFRB circRNA e hsa-circ-0076611; FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA e PDGFRB circRNA; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA e FGFR3 circRNA; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA e hsa-circ-0076611; LTBP2 circRNA, PDGFRB circRNA e FGFR3 circRNA; LTBP2 circRNA, PDGFRB circRNA e hsa-circ-0076611; LTBP2 circRNA, FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611; SKIV2L circRNA, PDGFRB circRNA e FGFR3 circRNA; SKIV2L circRNA, PDGFRB circRNA e hsa-circ-0076611; SKIV2L circRNA, FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611; PDGFRB circRNA, FGFR3 circRNA e hsacirc-0076611; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA, PDGFRB circRNA e FGFR3 circRNA; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA, PDGFRB circRNA e hsa-circ-0076611; LTBP2 circRNA, SKIV2L circRNA, FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611; LTBP2 circRNA, PDGFRB circRNA, FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611; SKIV2L circRNA, PDGFRB circRNA, FGFR3 circRNA e hsa-circ-0076611.
10) Kit secondo la rivendicazione 9, in cui i primer per la rilevazione di detti uno o pi? RNA circolari sono:
oligonucleotide senso: 5'-GGGGGTGACTTTGTGTGC-3'(SEQ ID NO:6)
oligonucleotide antisenso: 5'-GCAGTCCTCCTGGGTAGTCA-3 '(SEQ ID NO:7)
per rilevare LTBP2 circRNA;
oligonucleotide senso: 5'-TGATAACTGGGAGAGGGCAG-3'(SEQ ID NO:8)
oligonucleotide antisenso: 5'-GGCTCTCTCCTCCTCCTTGT-3 '(SEQ ID NO:9)
per rilevare circRNA PDGFRB;
oligonucleotide senso: 5'-CAGCTTGGAAGACCTAGTGTTG-3'((SEQ ID NO:10)
oligonucleotide antisenso: 5'-TCCAGAGGCTCCAACATACA-3'(SEQ ID NO:11)
per rilevare SKIV2L circRNA;
oligonucleotide senso: 5'-ACTTCAGTGTGCGGGTGAC-3 '(SEQ ID NO:12)
oligonucleotide antisenso: 5'-GAAGACCAACTGCTCCTGCT-3'(SEQ ID NO:13)
per rilevare circRNA FGFR3;
oligonucleotide senso: 5'-CGCAGACGTGTAAATGTTCCT-3'(SEQ ID NO:14)
oligonucleotide antisenso: 5'-AGGAACATTTACACGTCTGCG-3'(SEQ ID NO:15)
per rilevare hsa-circ-0076611;
oligonucleotide senso: 5'-AAACACAGACTCGCGTTGC-3'(SEQ ID NO:16)
oligonucleotide antisenso: 5'-CAAATGCTTTCTCCGCTCTG-3'(SEQ ID NO:17)
per rilevare hsa-circ-0076611.
11) Kit secondo la rivendicazione 10, comprendente ulteriormente la sonda AACGTACTTGCAGTCCCTGT (SEQ ID NO:18) quando i primer sono SEQ ID NO:16 e SEQ ID NO:17.
12) RNA circolare scelto dal gruppo consistente in LTBP2 circRNA di sequenza SEQ ID NO:1,
SKIV2L circRNA di sequenza SEQ ID NO:2,
PDGFRB circRNA di sequenza SEQ ID NO:3, o
FGFR3 circRNA di sequenza SEQ ID NO:4.
13) Inibitore dell'RNA circolare hsa-circ-0076611 di sequenza SEQ ID NO:5 per l'uso nel trattamento del carcinoma mammario triplo negativo.
14) Inibitore secondo la rivendicazione 13, per l?uso secondo la rivendicazione 13, in cui detto inibitore ? un oligonucleotide antisenso, quale 5?-CAGGGACTGCAAGTAC-3? (SEQ ID NO:19).
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