CN113373230A - 检测生物标志物的试剂在诊断胃癌中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了检测生物标志物的试剂在诊断胃癌中的应用，所述的生物标志物包括LINC02204。本发明提供了一种灵敏度和准确度高的用于检测胃癌或预测胃癌患者使用Notch1抑制剂预后的产品。本发明还提供了一种筛选预防或治疗胃癌的候选药物的方法。本发明提供了新的胃癌治疗途径。

Description

检测生物标志物的试剂在诊断胃癌中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，更具体地，本发明涉及检测生物标志物的试剂在诊断胃癌中的应用。

背景技术

胃癌是目前严重危害人类健康的全球性公共疾病之一，其发病率和死亡率之高在东亚地区尤甚。由于饮食结构、遗传和环境因素、病原微生物(幽口螺杆菌、EB病毒)感染以及公共卫生水平的局限等因素，约有70％的胃癌新发病例来自于发展中国家，超过50％出现在东亚地区。根据国家癌症中心的数据统计，我国胃癌患者发病率及死亡率在肿瘤中仅次于肺癌，高居第二位。虽然目前诊疗手段多样，而且多学科综合诊治模式(multi-disciplinary team，MDT)的兴起使患者获益，但胃癌患者的预后仍不理想。其中一个很重要的原因是大多数胃癌患者早期并无明显症状，错过了早期诊断的黄金时间，确诊时已处于进展期。约90％的胃癌患者在确诊时已出现淋巴结转移，30％的患者更是出现远处转移。因此，早期诊断、早期干预仍是改善治疗疗效和提高生存时间的关键。目前胃镜是确诊胃癌的标准诊断手段，在日本及韩国，胃镜筛查已普及多年，对胃癌的早期诊断率有质的提升。然而我国人口基数大，且毕竟是有创检查，与操作者水平密切相关，所以目前胃镜筛查暂未能于我国广泛普及。临床上肿瘤标志物常被用于辅助胃癌的诊断和疗效评估，包括癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)和糖链标志物(carbohydrate antigen，CA)，如糖链抗原19-9(CA19-9)和糖链抗原72-4(CA72-4)等，鉴于其诊断胃癌时较低的敏感性或特异性，需要发现能够更好地辅助胃癌诊断的非侵入性生物标志物，从而对胃癌患者进行早期干预，进一步改善患者的预后。

长链非编码RNA是一类长度大于200个核苷酸且不具备蛋白翻译功能的RNA，其在转录调控中广泛表达。目前，lncRNA主要被分为五类:反义lncRNA、内含子lncRNA,lincRNA、启动子相关lncRNA和UTR相关lncRNA。LncRNA具有时空特异性，在不同组织中，表达模式行为也不同。相对于microRNA，lncRNA的长度较长，具有mRNA相似结构。LncRNA可以与microRNA，mRNA和蛋白结合，在细胞中起到重要的调控作用。目前来看，lncRNA与基因转录、表观遗传调控、蛋白编码基因、染色质组织等生物活动有关。随着研究的深入，lncRNA被证实与许多肿瘤的发展与转移密切相关。由此发现更多与疾病相关的长链非编码RNA对认识肿瘤的发生发展，并以此提供相应的防治措施有不可忽略的作用。

近年来研究发现，Notch1在多种恶性肿瘤包括胃癌中表达失调，且其表达水平与胃癌的侵袭、转移及预后密切相关。Yeh等采用Western Blot分析发现在胃癌细胞中，Notch1及其靶基因c-Myc表达上调(Yeh,T.S.,et al."The activated Notch1 signalpathway is associated with gastric cancer progression through cyclooxygenase-2."Cancer Research 69.12(2009):5039.)。提示在胃癌细胞系中，Notch1信号通路被活化。另外，该实验还发现活化的信号通路增强了胃癌细胞的侵袭和转移能力。李大卫用免疫组化法检测发现，Notch1在胃癌组织中表达上调，显著高于正常胃粘膜组织(李大卫,吴晴,彭志海,等.Notch1和PTEN在胃癌组织中的表达及其意义[J].癌症,2007,26(11):1183-1187.)。Wei G等用Notch1-siRNA转染胃癌细胞后发现，胃癌细胞的増殖与侵袭能力明显降低(Wei G,Chang Y,Zheng J,et al.Notch1 silencing inhibits proliferation andinvasion in SGC-7901gastric cancer cells[J].Molecular Medicine Reports,2014,9(4):1153-1158.)。因此，通过沉默Notch1的表达来寻找差异表达的lncRNA有望寻找到新的胃癌的生物标志物，为诊断胃癌提供新方法，并为发展新的更有效的治疗提供可能性。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的第一目的在于提供一种诊断胃癌或预测胃癌患者使用Notch1抑制剂预后的产品；本发明的第二目的在于提供一种筛选预防或治疗胃癌的候选药物的方法；本发明的第三目的在于提供一种预防或治疗胃癌的药物组合物。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种诊断胃癌或预测胃癌患者使用Notch1抑制剂预后的产品，所述的产品包括检测生物标志物的试剂，所述的生物标志物包括LINC02204。

进一步，所述的试剂选自：

特异性识别LINC02204的探针；

或特异性扩增LINC02204的引物；

进一步，所述的特异性扩增LINC02204的引物序列如SEQ ID NO.5～6所示。

进一步，所述的产品包括试剂盒、芯片、核酸膜条。

进一步，所述的试剂盒包括用于处理样品的试剂，优选的，所述的样本为组织。

本发明提供了用于检测生物标志物的试剂在制备诊断胃癌或预测胃癌患者使用Notch1抑制剂预后的产品中的应用，所述的生物标志物包括LINC02204。

本发明提供了一种筛选预防或治疗胃癌的候选药物的方法，所述的方法包括：用待筛选物质处理表达或含有LINC02204的体系；检测所述体系中LINC02204的表达水平；其中，若所述待筛选的物质可以抑制LINC02204的表达，则表明该候选物质是预防或治疗胃癌的候选药物。

本发明提供了LINC02204在筛选预防或治疗胃癌的候选药物中的应用。

本发明提供了一种预防或治疗胃癌的药物组合物，所述药物组合物包括特异性抑制LINC02204表达的试剂。

进一步，所述试剂选自核酸分子、碳水化合物、小分子化合物或干扰慢病毒。

进一步，所述核酸分子选自：反义寡核苷酸、双链RNA、小干扰RNA或短发夹RNA。

进一步，所述核酸分子选自小干扰RNA。

进一步，所述的药物组合物还包括稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、PH控制剂或表面活性剂。

本发明提供了LINC02204在制备预防或治疗胃癌的药物组合物中的应用。

本发明的优点和有益效果：

本发明提供了一种生物标志物在制备诊断胃癌或预测胃癌患者使用Notch1抑制剂预后的产品中的应用，所述的生物标志物为LINC02204。本发明为胃癌诊断提供了新的方法，为胃癌治疗提供了新的药物靶点。

本发明还提供了一种筛选预防或治疗胃癌的候选药物的方法。

附图说明

图1是转染Notch1敲除慢病毒后胃癌细胞中的Notch1蛋白表达水平图；其中，图A是MKN45细胞的Notch1蛋白表达水平图；图B是MGC-803细胞的Notch1蛋白表达水平图；图C是AGS细胞的Notch1蛋白表达水平图；

图2是qPCR检测胃癌组织中LINC02204相对表达量统计图；

图3是LINC02204诊断胃癌的ROC曲线图。

具体实施方式

本发明中所述的“生物标志物”也称为“基因标志物”，是在组织或细胞中的表达水平与正常或健康细胞或组织的表达水平相比发生改变的任何基因或蛋白。

基因标志物可以在任何水平上差异地存在，但是一般以如下的水平存在，所述水平增加了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、或更多；或一般以如下的水平存在，所述水平减少了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或100％(即不存在)。

优选地，基因标志物以具有统计显著性的水平差异地存在。

在本发明的具体实施方式中，所述的生物标志物包括LINC02204，所述的LINC02204是指Gene ID为101929151的基因。在本发明中，提及差异表达的基因时，该基因的不同的转录本同时包含在本发明中，其突变型或其片段也包含在本发明中。

芯片、试剂盒

本发明提供了检测样本中LINC02204基因的表达水平的产品，所述的产品包括试剂盒、芯片、核酸膜条。其中芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于LINC02204所示的部分或全部序列。

所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。

本发明的试剂盒包括检测LINC02204基因的试剂，还包括选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对肿瘤发展进行判断、对治疗方案进行选择。

试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。

药物组合物

本发明提供了一种预防或治疗胃癌的药物组合物，所述药物组合物包括LINC02204的抑制剂。

如本文所用，所述的“小干扰RNA”是一种双链小RNA分子，其由完全互补的第一链和第二链组成，由Dicer(RNAaseⅢ家族中对双链RNA具有特异性的酶)加工而成。所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与LINC02204基因中的靶序列相同，或者为与该靶序列在高等严紧条件下杂交的序列。所述双链RNA第一链和第二链的长度均为15-27个核苷酸；优选地，长度均为19-23个核苷酸；更优选地，长度均为19、20或者21个核苷酸。siRNA是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标基因的沉默。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是指内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的细胞内mRNA发生特异性降解，从而导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型缺失的现象。

如本文所用，所述shRNA，即小发卡或短发卡RNA(a small hairpin RNA orshorthairpin RNA,shRNA)是一段具有紧密发卡环(tight hairpin turn)的RNA序列，其包含正义链片段、反义链片段以及连接正义链片段和反义链片段的茎环结构，常被用于RNA干扰沉默靶基因的表达。其中正义链和反义链的序列互补，并且所述正义链片段的序列与LINC02204基因中15-27个连续的核苷酸序列相同，优选地，所述正义链片段与LINC02204基因中19-23个连续的核苷酸序列相同；更优选地，所述正义链片段与LINC02204基因中19、20或者21个连续的核苷酸序列相同，或者为与上述各序列在高等严紧条件下杂交的序列。shRNA的发卡结构可被细胞机制切割成siRNA，然后siRNA结合到RNA诱导沉默复合物上(RNA-induced silencing complex，RISC)，该复合物能够结合到目的基因并将其降解。

本发明所述的小干扰RNA可以是化学合成的双链RNA；也可以是载体或表达框架表达的双链RNA，所述载体或表达框架中可采用例如RNA聚合酶III启动子和RNA聚合酶III终止子调控小干扰RNA在哺乳动物细胞中的表达，RNA聚合酶III启动子包括人源或鼠源的U6启动子和人H1启动子等。

本发明所述的小干扰RNA可以是由作用于一个靶序列的单一小干扰RNA组成，也可以由作用于一个基因的多个靶序列或多个基因上的靶序列的多个小干扰RNA组成；所述的靶序列可以是LINC02204基因的基因组序列，或LINC02204基因的cDNA序列。

本发明的siRNA可通过本文实施例中公开的方法或者本领域已知的方法筛选。

本发明的siRNA中的第一链和shRNA中的正义链的序列与靶序列相同，其与siRNA靶序列相比具有至少连续10个(优选至少连续15个，更优选至少连续18个)相同的核苷酸序列，或者为与该靶序列在高等严紧条件下杂交的序列。

在本发明中，所述核酸构建体是指包括复制系统以及能够在给定的靶细胞内转录的序列。其可以通过将编码本文中所述的shRNA的片段克隆入已知载体获得。进一步地，所述核酸构建体为慢病毒载体。所述慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染细胞，进而转录出本发明所述shRNA，通过酶切加工等步骤，最终获得所述siRNA，用于特异性沉默LINC02204基因的表达。

本发明的药物组合物可另外包含药学上可接受的载体。术语载体包括适用于制备所需特定剂型的任何和所有溶剂、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。可用作药学上可接受的载体的材料的一些示例包括，但不限于，糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，诸如丙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏液；乙醇和磷酸盐缓冲液，以及根据配制人员的判断，组合物中还可以存在其他无毒相容的润滑剂诸如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1干扰胃癌细胞中的Notch1基因表达

一、实验材料

1、实验试剂：如表1所示，抗体信息如表3所示；

2、实验仪器：如表2所示；

3、Notch1敲除慢病毒、阴性对照慢病毒；

4、胃癌细胞系MKN45、MGC-803、AGS。

表1实验试剂

表2.实验仪器

表3抗体信息

二、实验方法

1、病毒感染

(1)铺板：对数生长期的细胞消化铺板后，按照1*10⁵/孔接种于12孔板，生长过夜；

(2)感染：将12孔板中的培养液吸除，换新鲜的培养液，同时加入PBS浓度梯度稀释的病毒液，混合均匀后放入培养箱培养；

(3)24h左右可换液，48h左右可看荧光。

2、Western Blot验证

(1)细胞总蛋白提取

a.用PBS冲洗细胞2-3次。最后一次彻底吸干残留液。

b.加入适当体积的RIPA(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂)于培养板、瓶内3-5min。期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。

c.用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5mL离心管中。

d.冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。

e.12000rpm,4℃，离心10min，收集上清，即为总蛋白溶液。

(2)蛋白浓度测定

取未变性的蛋白溶液，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测蛋白浓度。

(3)蛋白变性

将蛋白溶液按照4:1的比例加入5*蛋白上样缓冲液，沸水浴变性15min，收入-20℃冰箱保存备用。

(4)SDS-PAGE电泳

a.配置蛋白质凝胶

b.将制胶器放入电泳槽后加足够的电泳液后上样电泳。将样品加入电泳孔中，电泳。浓缩胶电压75V，分离胶用120V。

c.电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳，进行转膜。

(5)转膜

a.准备6张7×9cm的滤纸和一张大小适中的PVDF膜，PVDF膜在使用之前要先用甲醇活化。

b.在加有转移液的盆里放入转膜用的夹子，两块海绵垫，一支玻棒，滤纸和经过活化的PVDF膜。

c.将夹子打开使黑的一面保持水平。在垫子上垫海绵、三层滤纸。

d.小心剥下分离胶放在滤纸上，将PVDF膜盖于胶上，不要有气泡。在膜上盖三张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫。

e.转膜条件(湿转)

快转：300mA恒流转膜半小时，或者200mA转膜1小时，时间可以略微调整，电流对应调整。转膜过程中将转膜的槽子放在冰水中降温。

慢转：转膜过夜，25V恒压转膜过夜。

(6)免疫反应

a.将转好的膜于室温下脱色摇床上用5％的脱脂牛奶(0.5％TBST配)，封闭1h。

b.稀释一抗(TBST溶解的5％脱脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5％BSA)，4℃孵育过夜(快转)，或者4℃孵育抗体3小时(慢转)。

c.用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min。

d.将二抗用TBST稀释3000倍，室温下孵育30min后，用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min。

(7)化学发光

在暗室中将ECLA和ECLB两种试剂在离心管中等体积混合，在曝光匣上贴双层手套或者其他透明薄膜，将PVDF膜的蛋白面朝上放在曝光匣两层薄膜之间，加入混合好的ECL溶液充分反应，1-2min后，去尽残液，盖上上面的一层薄膜开始曝光。曝光后的胶片用显影、定影试剂进行显影和定影。根据不同的发光强度调整曝光条件。

(8)凝胶图像分析

将胶片进行扫描存档，PhotoShop整理去色，Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值。

三、实验结果

如图1所示，转染Notch1敲除慢病毒后，胃癌细胞(MKN45、MGC-803、AGS)中Notch1蛋白表达量显著下调，该结果证明成功获得敲低Notch1基因的胃癌细胞系。

实施例2筛选差异表达基因

一、高通量测序数据处理

Trizol法收集实施例1中的空白对照和Notch1基因敲低组胃癌细胞，各3个重复，进行高通量测序，并对原始测序数据进行过滤：

1.去除reads中的adapter序列；

2.剪切前去除5’端含有非AGCT的碱基；

3.修剪测序质量较低的reads末端(测序质量值小于Q20)；

4.去除含N的比例达到10％的reads；

5.舍弃去adapter及质量修剪后长度小于25bp的小片段。

对质量剪切后的序列进行数据量统计，结果如表4所示。

表4测序数据统计表

二、参考序列比对分析

将质控后得到的高质量测序序列与指定的参考基因组比对，研究物种为人，参考基因组来自于Ensembl数据库，基因组版本GRCh38.p13。

分析软件：hisat2，版本为v 2.1.0，与参考基因组比对结果统计表如表5所示。

表5 Clean Mapping比率统计

三、mRNA表达量分析

在RNA-seq分析中，通过比对到参考基因组区域的序列(clean reads)的数量来计算基因的表达水平。根据所有样本与参考基因组的比对结果，计算每个基因/转录本在样本中的count值，以该值作为基因/转录本在样本中的表达量。最后对所有基因/转录本在各组样本中的表达进行差异显著性分析，找出相对差异表达的基因/转录本，并对其进行可视化分析。

采用软件DESeq2从RNA-Seq数据中识别差异基因，其基于二项分布模型集成了Fisher检验和似然比检验进行差异表达检验，显著差异mRNA筛选条件：P_value<0.05，|logFC|>0.585。

四、数据分析结果

用上述标准筛选得到差异基因145个，其中表达上调基因102个，表达下调的基因有43个。本发明中所述的基因LINC02204在Notch1基因敲低组胃癌细胞中表达下调，如表6所示，该结果表明，Notch1抑制剂可能通过下调LINC02204表达来抑制胃癌细胞株的增殖与侵袭。

表6 LINC02204的差异表达情况

基因	baseMean	log2 FoldChange	P.Value	updown
					LINC02204	25.689	-2.308	0.005	Down

实施例3 qPCR检测胃癌组织样本中LINC02204表达量的变化

一、实验材料

1、样本：46份胃组织样本，其中23份胃癌组织样本，23份癌旁对照组织。

2、实验试剂：如表7所示。

表7使用试剂清单

3、实验主要仪器：如表8所示。

表8使用仪器清单

二、实验方法

1.引物设计

Real Time PCR检测目的基因引物。引物在博迈德公司合成，引物序列如表9所示。

表9引物序列

引物名称	引物序列(5'to3')
		GAPDH-F(内参)	CTGGGCTACACTGAGCACC(SEQIDNO.1)
GAPDH-R(内参)	AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG(SEQIDNO.2)
		ACTB-F(内参)	GATCAAGATCATTGCTCCTCCT(SEQIDNO.3)
ACTB-R(内参)	TACTCCTGCTTGCTGATCCA(SEQIDNO.4)
		LINC02204-F	TGGAGGTTGAGGCTGCAGT(SEQIDNO.5)
LINC02204-R	CACTGGGTGCCACTTCCATC(SEQIDNO.6)

2、提取样本总RNA

(1)将1mL TRIzol在超净台里加入至玻璃匀浆瓶中(提前将匀浆瓶用烘箱180度烘4个小时)，将匀浆瓶按到仪器上，称取50—100mg的组织放入玻璃匀浆瓶内，将转速调至1500转左右，开始在冰水浴中进行匀浆，每研磨30s，停止30s，反复3-4次即可。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

(2)将加入TRIzol的样品在室温(15-30℃)放置10min，使核酸蛋白复合物完全分离。

(3)1mLTRIzol加入200μL氯仿，剧烈振荡2min，每隔1分钟再晃动两下，5—6次后，再静止7min。

(4)4℃，12000rpm，离心15min。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol的60℅。

(5)把上层水相转移到新的EP管中(约400μL，尽量不要吸取到中间层以免污染)。加入500μL异丙醇，室温放置10min。

(6)制备75％乙醇，置于冰盒中预冷。

(7)4℃，12000rpm，离心15min，离心后在管底出现白色沉淀。用移液器小心移去上清。

(8)加入1mL 75℅冷乙醇，震荡洗涤沉淀。4℃，7500rpm，离心5min，小心弃掉上清。

(9)将EP管倒扣于滤纸上吸去多余的水分，并用10μL枪头小心吸取管内的液体(枪头不要接触RNA)，将EP管室温放置5min(时间太久，过于干燥会使RNA活性降低)，RNA变透明；

(10)加入40μL无RNase的水(DEPC水),用naodrop检测OD值与浓度，在管上做好标记；

(11)置于-80℃冰箱保存。

3、逆转录合成mRNAcDNA

采用FastKing cDNA第一链合成试剂盒(货号：KR116)进行mRNA反转录，首先去除基因组DNA反应，在试管中加入5×gDNABuffer 2.0μL，TotalRNA1μg，加Rnase Free ddH2O使总体积至10μL，水浴锅中42℃加热3min，再将10×King RT Buffer 2.0μL，FastKing RTEnzyme Mix 1.0μL，FQ-RT Primer Mix2.0μL，RNase Free ddH2O 5.0μL，混合后加入上述试管中一起混合共20μL，水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min，合成的cDNA需要长期保存时，请于-20℃或更低温度保存。

4、Real-TimePCR

用ABI 7300型荧光定量PCR仪，采用2^-△△CT法进行数据的相对定量分析：(1)用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(货号：FP205)，进行扩增，实验操

作按产品说明书进行。Real-Time反应体系如表10所示：

表10 Real-Time PCR反应体系

试剂	使用量
		2×SuperRealPreMixPlus	10μL
上游引物(10μM)	0.6μL
		下游引物(10μM)	0.6μL
50×ROXReferenceDye<sup>△</sup>	2μL
		DNA模板	2μL
灭菌蒸馏水	4.8μL

(2)扩增程序为：95℃15min，(95℃10sec，55℃30sec，72℃32sec)×40个循环，95℃15sec，60℃60sec，95℃15sec)。

(3)引物筛选

将各样本cDNA混合后，以此为模板进行10倍梯度稀释，稀释后样品各取2μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增(见表11)，同时在60-95℃进行溶解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。

表11引物筛选标准曲线Real-TimePCR设计

(4)样品Real-TimePCR检测

将各样品cDNA20倍稀释后取2μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增(见表12)。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。

表12样品Real-TimePCR检测设计

模板	样品cDNA	样品cDNA
			重复检测孔道数	3	3
引物	目的基因引物	内参基因引物

5、数据统计

将运行程序下机所导出的原始结果ct值按照上样顺序进行整理，得到各个样本每个基因的三个复孔原始ct值，在excel中分别求出目的基因与内参基因的三个复孔ct值的平均值，分别计算对照组(癌旁组织)和试验组(胃癌组织)中目的基因相对于内参基因的表达，采用GraphPad软件进行统计分析，两者之间的差异采用t检验。

二、实验结果

统计结果如图2所示，与癌旁组织相比，胃癌组织样本中LINC02204表达量上调。

实施例4 LINC02204的诊断效能验证

采用SPSS软件绘制受试者工作曲线(ROC)，分析AUC值、敏感性和特异性，判断指标单独的诊断效能。

如表13、图3所示，LINC02204具有较高的诊断效能，提示LINC02204可用于诊断胃癌。

表13 LINC02204诊断效能数据

基因	AUC	敏感性	特异性
				LINC02204	0.682	0.783	0.609

以上结合附图详细描述了本申请的优选实施方式，但是，本申请并不限于上述实施方式中的具体细节，在本申请的技术构思范围内，可以对本申请的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本申请的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本申请对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本申请的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本申请的思想，其同样应当视为本申请所公开的内容。

序列表

<110> 福建医科大学附属第一医院

<120> 检测生物标志物的试剂在诊断胃癌中的应用

<141> 2021-06-18

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgggctaca ctgagcacc 19

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aagtggtcgt tgagggcaat g 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gatcaagatc attgctcctc ct 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tactcctgct tgctgatcca 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tggaggttga ggctgcagt 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cactgggtgc cacttccatc 20

Claims (10)

1.一种诊断胃癌或预测胃癌患者使用Notch1抑制剂预后的产品，其特征在于，所述的产品包括检测生物标志物的试剂，所述的生物标志物包括LINC02204。

2.根据权利要求1所述的产品，其特征在于，所述的试剂选自：

特异性识别LINC02204的探针；

或特异性扩增LINC02204的引物；

优选的，所述的特异性扩增LINC02204的引物序列如SEQ ID NO.5～6所示。

3.根据权利要求1所述的产品，其特征在于，所述的产品包括试剂盒、芯片、核酸膜条。

4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述的试剂盒包括用于处理样品的试剂，优选的，所述的样本为组织。

5.用于检测生物标志物的试剂在制备诊断胃癌或预测胃癌患者使用Notch1抑制剂预后的产品中的应用，其特征在于，所述的生物标志物包括LINC02204。

6.一种筛选预防或治疗胃癌的候选药物的方法，其特征在于，所述的方法包括：用待筛选物质处理表达或含有LINC02204的体系；检测所述体系中LINC02204的表达水平；其中，若所述待筛选的物质可以抑制LINC02204的表达，则表明该候选物质是预防或治疗胃癌的候选药物。

7.LINC02204在筛选预防或治疗胃癌的候选药物中的应用。

8.一种预防或治疗胃癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括特异性抑制LINC02204表达的试剂，优选的，所述试剂选自核酸分子、碳水化合物、小分子化合物或干扰慢病毒；优选的，所述核酸分子选自：反义寡核苷酸、双链RNA、小干扰RNA或短发夹RNA，优选的，所述核酸分子选自小干扰RNA。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物还包括稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、PH控制剂或表面活性剂。

10.LINC02204在制备预防或治疗胃癌的药物组合物中的应用。

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