KR20080003721A

KR20080003721A - 암 전이의 판정 방법 및 장치

Info

Publication number: KR20080003721A
Application number: KR1020070066029A
Authority: KR
Inventors: 모토나리 다이토; 카두키 나카바야시; 야스히로 오토모
Original assignee: 시스멕스 가부시키가이샤
Priority date: 2006-07-03
Filing date: 2007-07-02
Publication date: 2008-01-08
Also published as: US20080096204A1; ES2387494T3; CN101101288B; JP4943074B2; KR101403803B1; EP1876245B1; CN101101288A; EP1876245A1; JP2008011728A

Abstract

본 발명은 림프절에 어느 정도의 암세포가 전이하고 있는지를 객관적으로 판정할 수 있는 방법으로서, 암세포의 전이가 의심되는 림프절로부터 조제된 검출용 시료 중의 종양 마커 mRNA를 정량하는 단계 및 상기 mRNA의 정량 결과에 기초하여 상기 림프절에서의 전이소의 크기를 구하는 단계를 포함하는 전이소의 크기의 판정 방법에 관한 것이다.

Description

암 전이의 판정 방법 및 장치{A Method and Apparatus for Measuring Carcinomatous Lesion}

도 1은 본 발명의 일 실시형태에 의한 장치(1)의 전체 구성을 나타낸 사시도이다.

도 2는 핵산 정량부(101)의 전체 구성을 나타낸 사시도이다.

도 3은 핵산 정량부(101)의 개략 평면도이다.

도 4는 제어부(102d)의 구성을 나타내는 블록도이다.

도 5는 제어부(102d)에 의한 처리 플로우이다.

도 6은 표시부(102c)에서의 판정 결과의 표시 화면의 일 예이다.

도 7은 유방암의 전이소 크기와 CK19 mRNA 정량 결과와의 관계를 보여주는 그래프이다.

도 8은 대장암의 전이소 크기와 CK19 mRNA 정량 결과와의 관계를 보여주는 그래프이다.

도 9는 유두선관암에 유래하는 암세포가 전이한 림프절 중의 mRNA 발현량과 전이소에 포함된 암세포 수의 관계를 보여주는 그래프이다.

도 10은 충실선관암(solid tubular carcinoma)에 유래하는 암세포가 전이한 림프절 중의 mRNA 발현량과 전이소에 포함되는 암세포 수의 관계를 보여주는 그래프이다.

도 11은 특정 부피의 전이소를 갖는 림프절중의 CK19 mRNA 발현량의 추정값이다.

도 12는 유방암 환자로부터 채취된 림프절을 사용했을 경우의 CK19 mRNA 정량 결과를 보여주는 그래프이다.

도 13은 대장암 환자로부터 채취된 림프절을 사용했을 경우의 CK19 mRNA 정량 결과를 보여주는 그래프이다.

본 발명은 림프절에 포함된 암 전이를 판정하는 방법 및 장치에 관한 것이다.

림프절 조직에 어느 정도 암이 전이되어 있는지를 판정하기 위해 조직진(組織診)이 일반적으로 행해진다. 조직진에서는 림프절 조직을 얇게 슬라이스한 절편을 제작하여, 암세포에 특이적으로 결합하는 표지 항체를 사용하여 절편 중의 암세포를 염색하고, 이것을 검경함으로써 암 전이의 정도가 측정된다. 그러나, 검사에는 숙련을 요하기 때문에 검사자의 기능에 의존하는 점이 커서 객관적인 판정 결과 를 얻기가 어렵다.

암세포의 림프절 전이를 판정하는 방법으로서, 예를 들면 JP2006053113에 기재된 방법이 알려져 있다. JP2006053113에는 폐선암의 림프절 전이를 진단하는 방법에 대해 기재되어 있다. 구체적으로는, 림프절 전이가 있는 환자의 폐의 조직편과 림프절 전이가 없는 환자의 폐의 조직편을 시료로 하여, 여러 가지 분자의 발현량을 측정함으로써 전이 진단 마커로서 유용한 분자를 동정하고 있다. 또, 이 분자를 사용함으로써 폐선암 환자에서의 폐암의 림프절 전이를 진단하는 것이 가능하다는 것이 개시되어 있다. 그러나, 이 기술로는 어느 정도 림프절에 암이 전이하고 있는지를 판정할 수 없다.

본 발명의 범위는 첨부된 특허청구범위에 의해서만 정의되며, 본 상세한 설명 내의 기재는 하등 영향을 미치지 않는다.

본 발명의 목적은 림프절에 어느 정도의 암세포가 전이하고 있는지를 객관적으로 판정하는 것이 가능한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 암세포의 전이가 의심되는 림프절로부터 조제된 검출용 시료 중의 종양 마커 mRNA를 정량하는 단계; 및 상기 mRNA의 정량 결과에 기초하여 상기 림프절에서의 전이소의 크기를 구하는 단계를 포함하는 전이소 크기의 판정 방법을 제공한다.

또, 본 발명은 암세포의 전이가 의심되는 림프절로부터 조제된 검출용 시료 중의 종양 마커 mRNA를 정량하는 정량부 및 상기 mRNA의 정량 결과를 제1 역치 및 상기 제1 역치보다 높은 값인 제2 역치와 비교하는 비교부, 비교 결과에 기초하여 상기 림프절이 암 전이 음성, 암 전이 약양성 및 암 전이 강양성의 어느 쪽인지를 판정하는 판정부를 포함하는 암 전이의 판정 장치를 제공한다.

본 발명에 의하면, 림프절에 어느 정도 암세포가 전이하고 있는지를 판정할 수 있다.

본 발명의 일 실시형태는 생체로부터 채취된 림프절에 포함된 암 전이를 판정하는 방법이다. 이 방법에 의하면, 림프절에서의 암의 전이소(이하, 단순히 '전이소'라고도 함)의 크기를 구할 수 있다.

여기서, 전이소의 크기란 림프절로부터 조직 절편을 제작했을 때에 관찰되는 전이소의 장경(長徑)이나 면적, 이 장경으로부터 산출되는 전이소의 부피, 전이소의 중량, 전이소에 포함되는 암세포의 수 등을 포함하는 개념이다.

본 명세서에서의 암이란 악성화된 종양으로서, 악성 종양과 동일한 뜻이다. 암에는 암종, 육종, 조혈기 유래의 암 등이 포함된다. 암종으로는 유방암, 위암, 대장암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁체부암 등의 상피 세포 유래의 암이 예시된다. 육종으로는 골육종, 연부육종 등이 예시된다. 조혈기 유래의 암으로는 백혈병이나 악성 림프종 등이 예시된다.

전이소의 크기를 구하기 위하여, 먼저 림프절에 포함된 종양 마커 mRNA(이 하, 단순히 'mRNA'라고도 함)를 정량한다. 종양 마커 mRNA란 종양 마커 유전자로부터 전사된 mRNA이다. 종양 마커 유전자란 상술한 바와 같이 암세포에서의 발현량과 정상세포에서의 발현량이 유의하게 다른 유전자를 가리킨다. 종양 마커 유전자의 예로는 CK18, CK19, CK20 등의 CK(사이토케라틴), CEA(암태아성 항원), MUC1, MMG(맘마글로빈), PSA(전립선 특이항원: Prostate specific antigen), CA15-3, EpCAM (Epithelial cellular adhesion molecule) 등을 코딩하는 유전자를 들 수 있다.

mRNA의 정량에 즈음해서는, 상기 림프절로부터 검출용 시료를 조제하고, 이 검출용 시료에 포함되는 mRNA를 정량하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 림프절과 완충액을 혼합하여 완충액 중의 세포에 대해 화학적 및/또는 물리적 처리를 행함으로써 세포 중의 RNA를 액중에 이행(가용화)시켜, 이 RNA를 함유한 용액을 검출용 시료로 할 수 있다.

RNA의 분해를 억제하기 위하여 완충액은 강산성인 것이 바람직하다. pH의 바람직한 범위는 2.5∼5.0이며, 보다 바람직하게는 3.0∼4.0이다. pH를 이 범위로 유지하기 위해 공지의 완충제를 사용할 수 있다.

또, 완충액에는 계면활성제를 함유시키는 것이 바람직하다. 계면활성제에 의해 세포막이나 핵막이 손상된다. 이 손상을 통해 세포 중의 핵산이 용액 중으로 이행하기 쉬워진다. 이와 같은 작용을 가지는 것이라면 계면활성제의 종류는 특별히 한정되지 않으나, 비이온성 계면활성제가 바람직하며, 폴리옥시에틸렌계 비이온성 계면활성제가 보다 바람직하다.

특히, 다음과 같은 일반식으로 나타내지는 폴리옥시에틸렌계 비이온성 계면활성제가 적합하다:

R1-R2-(CH₂CH₂O)n-H

(여기서, R1은 탄소수 10∼22의 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 이소옥틸기; R2는 -O- 또는 -(C₆H₆)-O-；n은 8∼120의 정수).

예를 들면, 폴리옥시에틸렌라우릴에테르, 폴리옥시에틸렌세틸에테르, 폴리옥시에틸렌올레일에테르, 폴리옥시에틸렌미리스티릴에테르, 폴리옥시에틸렌스테아릴에테르, 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르, 폴리옥시에틸렌이소옥틸페닐에테르 등을 들 수 있다. 구체적으로는, Brij35(폴리옥시에틸렌(35)라우릴에테르) 등이 적합하다. 완충액 중의 계면활성제의 농도는 0.1∼6%(v/v)가 바람직하며, 보다 바람직하게는 1∼5%(v/v)이다.

또, mRNA의 정량을 후술하는 핵산 증폭에 의해 수행하는 경우에는 완충액에 디메틸설폭시드(DMSO)를 함유시키는 것이 바람직하다. 림프절에는 핵산 증폭에서의 효소 반응을 저해하는 물질(저해 물질)이 포함되어 있는 경우가 있으나, DMSO의 작용에 의해 이 저해 물질의 영향을 효과적으로 저감할 수 있다. 또, DMSO에는 핵산 증폭 효소의 활성 저하를 억제하는 효과도 있다. 처리액 중의 DMSO의 농도로는 1∼50%(v/v)가 바람직하고, 5∼30%(v/v)가 보다 바람직하며, 10∼25%(v/v)가 가장 바람직하다.

검출용 시료 조제시에는 림프절에 대해 균질화 등의 물리적 처리를 가하는 것이 바람직하다. 이에 의해, 림프절의 세포의 세포막이나 핵막이 물리적으로 파쇄되어 세포 내의 핵산이 용액 중으로 이행하기 쉬워진다. 균질화는 페슬(pestle) 등에 의해 수동으로 수행해도 되며, 시판되는 전동 균질기를 사용하여 수행해도 된다. 얻어진 균질물(homogenate)을 수초∼수분간 원심분리함으로써 균질물 중에 부유하고 있던 세포의 파편 등을 침전시킬 수 있다. 이에 의해, RNA 등을 함유하는 상청(上淸)(라이세이트(lysate))을 검출용 시료로 할 수 있다.

mRNA의 정량은 핵산 증폭이나 DNA 칩 등을 사용하여 공지의 방법에 의해 수행할 수 있다. 핵산 증폭법을 이용하는 경우에는 핵산 증폭 반응 전에 역전사 반응을 포함하는 RT-PCR (Reverse Transcription PCR)법이나 RT-LAMP (Reverse Transcription LAMP: LAMP법에 대해서는 US6410278)법 등이 적합하게 이용된다. 특히, 정량적 핵산 증폭법으로는 SYBR Green법이나 TaqMan(로슈 다이아그노스틱스 사의 등록상표)법(Linda G. Lee, 1993, Nucleic Acids Research, vol.21, p3761-3766 등 참조) 등의 공지의 방법을 이용할 수 있다.

mRNA의 정량에 사용할 수 있는 DNA 칩으로는 상기 종양 마커 유전자의 cDNA와 교잡(hybridize)가능한 DNA의 폴리뉴클레오티드 및/또는 그 단편을 고정화한 기반을 사용할 수 있다. DNA 칩을 사용한 RNA의 검출은 일반적으로 이용되는 공지의 방법에 의해 수행할 수 있다. 예를 들면, 이하와 같이 하여 수행할 수 있다. 먼저, 검출용 시료 중의 mRNA의 3' 말단에 존재하는 폴리 A 서열을 이용하여 역전사 반응을 수행한다. 역전사 반응시에, 예를 들면 Cy3나 Cy5 등의 형광 물질로 표지된 뉴클레오티드를 사용함으로써 형광 표지된 cDNA가 합성된다. 이것을 상기 폴리 뉴클레오티드를 고정화한 기반과 접촉시키면, 이 폴리뉴클레오티드와 표지된 cDNA가 2본쇄(二本鎖)를 형성한다. 2본쇄를 형성시킨 후 cDNA의 형광을 측정함으로써 mRNA를 정량할 수 있다.

상술한 방법에 의해 측정된 mRNA의 정량 결과는 단위 부피당 mRNA의 물질량, mRNA 중량, 카피 수 등이어도 된다. 또, 반응액의 형광 강도, 탁도, 투과광 강도 등이 소정의 값이 될 때까지의 시간, 사이클 수(PCR을 사용한 경우) 등이어도 된다.

통상은 종양 마커 mRNA의 정량과 함께 어떠한 세포라도 일정량을 항상 발현하고 있다고 생각되고 있는 유전자(예를 들면, 하우스키핑 유전자 등; 이하, '표준화 유전자'라고 함)의 mRNA를 정량하고, 종양 마커 mRNA의 정량값을 표준화 유전자 등의 mRNA의 정량값으로 나눔으로써(표준화함), 표준화 유전자의 mRNA당 종양 마커 mRNA 발현량으로 환산하는 것이 수행된다(예를 들면, M. Inokuchi et al., British Journal of Cancer, (2003), 89, 1750-1756 참조).

그러나, 림프절에 암세포뿐만 아니라 정상적인 림프절 세포도 많이 포함되는 경우에는 측정 결과가 정상세포의 수에 의해 좌우되기 때문에 정확하게 전이소의 크기를 구할 수 없는 경우가 있다. 따라서, 본 실시형태에서는 종양 마커 mRNA 정량값에 대해 표준화를 수행하지 않고 정량값(절대량)을 그대로 사용하는 것이 바람직하다.

mRNA의 정량 결과는 전이소의 크기에 상관하고 있다. 그 때문에, 상기한 바와 같이 mRNA의 정량 결과에 기초하여 림프절에서의 전이소의 크기를 구할 수 있 다. 또, 단계적으로 전이소의 크기를 구할 수도 있다. 단계적인 전이소의 크기를 구하는 경우에는 mRNA의 정량 결과와 복수의 역치가 비교된다. 이 경우, 적어도 1개의 역치(제1 역치)는 암 음성 및 암 양성을 식별 가능하게 설정되는 것이 바람직하다.

역치는 암이나 종양 마커의 종류에 따라 적절히 설정된다. 또, 전이소의 크기를 구하는 경우, 이 제1 역치를 사용하여 음성과 양성을 식별하고, 전이 양성의 것에 관해 전이소의 크기를 구하는 것이 바람직하다.

제1 역치는 암세포의 존재가 확인된 림프절(양성 검체)에 포함되는 mRNA의 정량값 이하이며, 암세포가 존재하지 않는 것이 확인된 림프절(음성 검체)에 포함되는 mRNA의 정량값보다 높은 값으로 설정할 수 있다. 복수의 양성 검체의 mRNA 정량값과 복수의 음성 검체의 mRNA 정량값을 미리 측정하여, 가장 높은 확률로 양성 검체와 음성 검체를 구별할 수 있는 값을 역치로 설정하는 것이 바람직하다.

상기와 같은 단계적인 정보를 얻는 경우에는 제1 역치 이외에 추가로 제2 역치가 사용된다. 즉, 상기 제1 역치와, 약양성과 강양성을 식별 가능한 제2 역치를 사용한다. 이에 의해, mRNA의 정량 결과가 제1 역치 미만이었을 경우에는 실질적으로 전이소가 존재하지 않는다(즉, 암 전이 음성)라고 판정할 수 있다. 또, mRNA의 정량 결과가 제1 역치 이상 제2 역치 미만이었을 경우에는 비교적 작은 전이소가 존재한다(암 전이 약양성)라고 판정할 수 있다. 또한, mRNA의 정량 결과가 제2 역치 이상이었을 경우에는 비교적 큰 전이소가 존재한다(암 전이 강양성)라고 판정할 수 있다.

림프절에서의 전이소는 크기에 기초하여 마이크로 전이(Micro metastasis)와 매크로 전이(Macro metastasis)로 분류된다. 림프절 조직으로 제작한 조직 절편에 있어서, 전이소가 확인되며 또한 전이소가 장경 2 ㎜ 미만인 전이는 마이크로 전이라고 불린다. 전이소가 장경 2 ㎜ 이상인 전이는 매크로 전이라고 불린다. 상기 제2 역치는 마이크로 전이와 매크로 전이를 식별 가능한 값으로 설정할 수 있다. 또, 제2 역치 이외에도 전이소의 크기에 따라 복수의 역치를 설정해도 된다.

또, 종양 마커 mRNA의 발현량으로부터 전이소 크기의 정량적인 정보도 취득할 수 있다. 즉, 림프절 중의 암세포의 수, 전이소의 면적, 부피 또는 중량 등을 정량적으로 구할 수 있다.

본 발명의 다른 실시형태는 상술한 방법을 실시하기 위한 암 전이의 판정 장치이다. 이 장치를 사용하면, 림프절에서의 전이소의 크기를 단계적으로 구하는 것도 가능하다. 이하, 도면에 기초하여 이 장치에 대해 설명한다.

도 1은 본 발명의 일 실시형태에 의한 장치(1)의 전체 구성을 나타낸 사시도이다. 이 장치(1)는 핵산 정량부(101)와, 핵산 정량부(101)와 유선 통신이 가능하도록 접속된 개인용 컴퓨터(PC)(102)에 의해 구성된다. 개인용 컴퓨터(102)는, 도 1에 나타내는 바와 같이, 키보드로 이루어진 입력부(102a), 모니터로 이루어진 표시부(102c), 측정 결과를 분석하는 제어부(102d)를 포함한다.

이하, 도 2 및 도 3을 이용하여 장치(1)의 핵산 정량부(101)에 대해 설명한다. 도 2는 핵산 정량부(101)의 전체 구성을 나타낸 사시도이다. 도 3은 도 2의 핵산 정량부(101)의 개략 평면도이다.

핵산 정량부(101)는 도 2에 나타내는 바와 같이 분주 기구부(10), 시료 세팅부(20), 칩 세팅부(30), 칩 폐기부(40) 및 5개의 반응 검출 블록(50a)으로 이루어진 반응 검출부(50)와, 분주 기구부(10)를 X축 방향 및 Y축 방향으로 이송하기 위한 이송부(60)를 포함하고 있다.

또, 분주 기구부(10)는, 도 2에 나타내는 바와 같이, 이송부(60)에 의해 X축 방향 및 Y축 방향(수평 방향)으로 이동되는 암(arm)부(11)와, 암부(11)에 대해 각각 독립하여 Z축 방향(수직 방향)으로 이동 가능한 2련(連)(2개)의 시린지(syringe)부(12)를 포함하고 있다.

또, 도 2 및 도 3에 나타내는 바와 같이, 시료 세팅부(20)에는 장치의 바로 앞에서부터 차례로, 10개의 시료 용기 세팅 구멍(21a∼21j), 1개의 효소 시약 용기 세팅 구멍(21k) 및 1개의 프라이머 시약 용기 세팅 구멍(211)이 설치되어 있다. 또, 10개의 시료 용기 세팅 구멍(21a∼21j)은 5행 2열로 배열하도록 설치되어 있다. 그리고, 시료 용기 세팅 구멍(21c,21d), 시료 용기 세팅 구멍(21e,21f), 시료 용기 세팅 구멍(21g,21h), 시료 용기 세팅 구멍(21i,21j)은 각각 장치의 안쪽으로부터 순서대로 시료 세팅 위치(1), 시료 세팅 위치(2), 시료 세팅 위치(3) 및 시료 세팅 위치(4)에 설치되어 있다.

또, 본 실시형태에서는 정면 좌측의 시료 용기 세팅 구멍(21c,21e,21g,21i)에는 미리 절제된 생체 조직을 상술한 처리(균질화, 여과 등)를 실시하여 조제된 라이세이트(검출용 시료)가 수용된 시료 용기(22)가 세팅되는 동시에, 정면 우측의 시료 용기 세팅 구멍(21d,21f,21h,21j)에는, 상기한 시료를 10배로 희석한 희석 시 료가 수용된 시료 용기(23)가 세팅된다.

또, 시료 용기 세팅 구멍(21a)에는 증폭해야 할 핵산이 정상적으로 증폭하는 것을 확인하기 위한 양성 컨트롤(InCt)이 수용된 용기(24)가 재치(載置)되는 동시에, 시료 용기 세팅 구멍(21b)에는 증폭해야 하는 것이 아닌 핵산이 정상적으로 증폭하지 않는 것을 확인하기 위한 음성 컨트롤을 수용한 용기(25)가 세팅된다.

또, 효소 시약 용기 세팅 구멍(21k) 및 프라이머 시약 용기 세팅 구멍(211)에는 각각 CK19의 mRNA(종양 마커 mRNA; 이하, 'CK19 mRNA'라고도 함)에 대응하는 cDNA(이하, 'CK19cDNA'라고도 함)를 증폭하기 위한 핵산 증폭 효소 시약이 수용된 효소 시약 용기(26)와, CK19cDNA에 교잡가능한 프라이머를 포함한 시약(이하, '프라이머 시약'이라고 함)이 수용된 프라이머 시약 용기(27)가 세팅되어 있다.

또, 반응 검출부(50)의 각 반응 검출 블록(50a)은, 도 2 및 도 3에 나타내는 바와 같이, 반응부(51)와 2개의 탁도 검출부(52)와, 덮개 닫힘 기구부(53)(도 3 참조)로 구성되어 있다. 각 반응 검출 블록(50a)에 설치되는 반응부(51)에는, 도 3에 나타내는 바와 같이, 검출 셀(54)을 세팅하기 위한 2개의 검출 셀 세팅 구멍(51a)이 설치되어 있다. 각 반응 검출 블록(50a)은 장치의 안쪽에서부터 순서대로 셀 세팅 위치(1), 셀 세팅 위치(2), 셀 세팅 위치(3), 셀 세팅 위치(4) 및 셀 세팅 위치(5)에 배치되어 있다.

또, 탁도 검출부(52)는 반응부(51)의 한쪽 측면 쪽에 배치된 기판(55a)에 장착된 465 ㎚의 파장을 갖는 청색 LED로 이루어진 LED 광원부(52a)와, 반응부(51)의 다른 한쪽의 측면 쪽에 배치된 기판(55b)에 장착된 포토다이오드 수광부(52b)에 의 해 구성되어 있다. 각 반응 검출 블록(50a)에는 1개의 LED 광원부(52a)와, 1개의 포토다이오드 수광부(52b)로 이루어진 1 세트의 탁도 검출부(52)가 2 세트씩 배치되어 있다.

또, 검출 셀(54)은 시료를 수용하기 위해 2개의 셀부(54a)와, 2개의 셀부(54a)를 막는 2개의 덮개부(54b)를 갖고 있다.

또, 이송부(60)는, 도 2에 나타내는 바와 같이, 분주 기구부(10)를 Y축 방향으로 이송하기 위한 직동 가이드(61) 및 볼나사(62), 볼나사(62)를 구동하기 위한 스테핑 모터(63), 분주 기구부(10)를 X축 방향으로 이송하기 위한 직동 가이드(64) 및 볼나사(65), 볼나사(65)를 구동하기 위한 스테핑 모터(66)를 포함하고 있다. 또한, 분주 기구부(10)의 X축 방향 및 Y축 방향으로의 이송은 스테핑 모터(63,66)에 의해 각각 볼나사(62,65)를 회전시킴으로써 수행한다.

다음으로, 도 1∼도 3을 참조하여 본 실시형태에 의한 핵산 정량부(101)의 동작에 대해 설명한다. 이 실시형태에서는, 상기한 바와 같이, 수술에 의해 절제된 림프절 조직 중의 CK19 mRNA(종양 마커)에 대응하는 cDNA를 RT-LAMP법을 이용하여 증폭시키고, 증폭에 수반하여 발생하는 피로인산 마그네슘의 백탁(白濁)에 의한 탁도의 변화를 측정한다. 탁도가 소정의 값에 도달하기까지의 시간(증폭 상승 시간)에 기초하여 CK19 mRNA의 양(카피 수/㎕·라이세이트)을 측정하고, 이것을 역치와 비교한다.

우선, 도 2 및 도 3에 나타내는 바와 같이, 미리 절제 조직을 처리(균질화, 여과 등)하여 제작된 검출용 시료가 수용된 시료 용기(22)를 시료 용기 세팅 구 멍(21c∼21j)에 세팅한다. 또, 양성 컨트롤이 수용된 용기(24) 및 음성 컨트롤이 수용된 용기(25)를 각각 시료 용기 세팅 구멍(21a,21b)(도 3 참조)에 세팅한다. 또, 효소 시약 용기 세팅 구멍(21k)(도 3 참조) 및 프라이머 시약 용기 세팅 구멍(211)에 각각 CK19cDNA의 증폭을 위한 핵산 증폭 효소 시약이 수용된 효소 시약 용기(26)와, CK19cDNA의 증폭을 위한 프라이머 시약이 수용된 프라이머 시약 용기(27)를 세팅한다. 또, 칩 세팅부(30)에 각각 36개의 일회용 피펫(pipette) 칩(31)이 수납된 2개의 래크(rack)(32)를 설치한다.

핵산 정량부(101)의 동작이 스타트하면, 우선, 도 2에 나타낸 이송부(60)에 의해 분주 기구부(10)의 암부(11)가 초기 위치로부터 칩 세팅부(30)로 이동된 후, 칩 세팅부(30)에서 분주 기구부(10)의 2개의 시린지부(12)가 아래 방향으로 이동된다. 이에 의해, 2개의 시린지부(12)의 노즐부의 선단이 2개의 피펫 칩(31)의 상부 개구부 내에 압입되므로, 2개의 시린지부(12)의 노즐부의 선단에 피펫 칩(31)이 자동적으로 장착된다. 그리고, 2개의 시린지부(12)가 위쪽으로 이동된 후, 분주 기구부(10)의 암부(11)는 프라이머 시약이 수용된 프라이머 시약 용기(27)의 위쪽을 향해 X축 방향으로 이동된다. 그리고, 프라이머 시약 용기(27)의 위쪽에 위치하는 한쪽 시린지부(12)가 아래 방향으로 이동되어 프라이머 시약이 흡인된 후, 그 한쪽의 시린지부(12)가 위쪽 방향으로 이동된다. 그 후, 다른 한쪽의 시린지부(12)가 동일한 프라이머 시약 용기(27)의 위쪽에 위치하도록 이송부(60)에 의해 분주 기구부(10)의 암부(11)가 Y축 방향으로 이동된다. 그리고, 다른 한쪽의 시린지부(12)가 아래 방향으로 이동되어 동일한 프라이머 시약 용기(27)로부터 프라이머 시약이 흡인된 후, 그 다른 한쪽의 시린지부(12)가 위쪽 방향으로 이동된다. 이와 같이 하여, 시린지부(12)에 장착되는 2개의 피펫 칩(31)에 의해 프라이머 시약 용기(27) 내의 프라이머 시약이 흡인된다.

프라이머 시약의 흡인 후, 2개의 시린지부(12)가 위쪽으로 이동된 후, 분주 기구부(10)의 암부(11)는 이송부(60)에 의해 가장 안쪽(장치 정면 안쪽)인 셀 세팅 위치(1)에 위치하는 반응 검출 블록(50a)의 위쪽으로 이동된다. 그리고, 가장 안쪽의 반응 검출 블록(50a)에서 2개의 시린지부(12)가 아래 방향으로 이동됨으로써, 2개의 시린지부(12)에 장착된 2개의 피펫 칩(31)이 각각 검출 셀(54)의 2개의 셀부(54a) 내에 삽입된다. 그리고, 시린지부(12)를 사용하여 프라이머 시약이 각각 2개의 셀부(54a)에 토출된다.

프라이머 시약의 토출 후, 2개의 시린지부(12)가 위쪽으로 이동된 후, 분주 기구부(10)의 암부(11)는 이송부(60)에 의해 칩 폐기부(40)의 위쪽을 향해 X축 방향으로 이동된다. 그리고, 칩 폐기부(40)에서 피펫 칩(31)의 폐기가 수행된다. 구체적으로는, 2개의 시린지부(12)가 아래 방향으로 이동됨으로써 칩 폐기부(40)의 2개의 칩 폐기 구멍(40a)(도 3 참조) 내에 피펫 칩(31)이 삽입된다. 이 상태에서 분주 기구부(10)의 암부(11)가 이송부(60)에 의해 Y축 방향으로 이동됨으로써 피펫 칩(31)이 홈부(40b) 아래로 이동된다. 그리고, 2개의 시린지부(12)가 위쪽 방향으로 이동됨으로써, 피펫 칩(31)의 상면의 테두리부는 홈부(40b)의 양측의 하면에 맞닿아 그 하면으로부터 아래 방향의 힘을 받으므로, 피펫 칩(31)이 2개의 시린지부(12)의 노즐부로부터 자동적으로 이탈된다. 이에 의해, 피펫 칩(31)이 칩 폐기 부(40)에 폐기된다.

다음으로, 동일한 동작에 의해 효소 시약 용기(26)로부터 효소 시약이 상기의 셀부(54a)에 토출되고, 또한 동일한 동작에 의해 시료 용기(22) 및 시료 용기(23)로부터 시료가 상기의 셀부(54a)에 토출된다.

그리고, 상기의 셀부(54a) 내에 대한 프라이머 시약, 효소 시약, 시료의 토출이 수행된 후, 검출 셀(54)의 덮개부(54b)의 덮개 닫힘 동작이 수행된다. 이 덮개 닫힘 동작이 완료된 후 검출 셀(54) 내의 액체 온도를 약 20℃로부터 약 65℃로 가온함으로써, RT-LAMP 반응에 의해 CK19 mRNA에 대응하는 cDNA를 증폭한다. 그리고, 증폭에 수반하여 생성되는 피로인산 마그네슘에 의한 백탁을 비탁법(比濁法)에 의해 검출한다. 구체적으로는, 도 3에 나타낸 LED 광원부(52a) 및 포토다이오드 수광부(52b)를 이용하여 증폭 반응시의 검출 셀(54) 내의 탁도를 검출(모니터링)함으로써 탁도의 검출을 수행한다.

시료의 탁도 데이터는 핵산 정량부(101)로부터 개인용 컴퓨터(102)의 제어부(102d)에 실시간으로 송신된다.

도 4는 제어부(102d)의 구성을 나타내는 블록도이다. 이 제어부(102d)는 CPU(6a), ROM(6b), RAM(6c), 하드디스크(6d), 입출력 인터페이스(6e), 화상출력 인터페이스(6f), 통신 인터페이스(6g)로 주로 구성되어 있으며, CPU(6a), ROM(6b), RAM(6c), 하드디스크(6d), 입출력 인터페이스(6e), 화상출력 인터페이스(6f) 및 통신 인터페이스(6g)는 버스(6h)에 의해 데이터 통신 가능하게 접속되어 있다.

CPU(6a)는 ROM(6b) 및 하드디스크(6d)에 기억되어 있는 컴퓨터 프로그램 및 RAM(6c)으로 읽어낸 컴퓨터 프로그램을 실행하는 것이 가능하다.

ROM(6b)은 CPU(6a)에 실행시키기 위한 컴퓨터 프로그램 및 해당 컴퓨터 프로그램의 실행에 이용하는 데이터 등을 기억하고 있다.

RAM(6c)은 ROM(6b) 및 하드디스크(6d)에 기억되어 있는 컴퓨터 프로그램의 읽어내기 및 컴퓨터 프로그램을 실행할 때의 CPU(6a)의 작업 영역에 사용된다.

하드디스크(6d)는 CPU(6a)에 실행시키기 위한 컴퓨터 프로그램 및 해당 컴퓨터 프로그램의 실행에 사용하는 데이터를 기억하고 있다. 이 컴퓨터 프로그램은 핵산 정량부(101)로부터 송신된 탁도 정보를 분석하고, 분석 결과를 출력하기 위한 기능을 완수한다.

입출력 인터페이스(6e)에는 키보드로 이루어진 입력부(102a)가 접속되어 있다. 입력부(102a)는 출력 화면상에서의 조작 등을 위해 설치되어 있다. 화상출력 인터페이스(6f)는 표시부(102c)에 접속되어 있다. 표시부(102c)는 핵산 정량부(101)로부터 송신되어 오는 탁도를 실시간으로 표시하거나 분석 결과를 출력하는 등을 위해 설치되어 있다. 통신 인터페이스(6g)는 핵산 정량부(101)에 접속되어 있으며, 탁도 정보를 수신하기 위한 기능을 완수한다.

다음으로, 도 5에 기초하여, 제어부(102d)에 의한 처리 플로우에 대해 설명한다. 제어부(102d)는 핵산 정량부(101)로부터 탁도 데이터를 실시간으로 수신한다(단계 S1). 반응액의 탁도가 소정의 값에 도달한 시간으로부터 mRNA의 카피 수(카피/㎕·라이세이트)를 산출하고(단계 S2), 이것을 미리 결정된 역치(제1 역치 및 제2 역치)와 비교함으로써 전이소의 크기 판정을 수행한다(단계 S3). 구체적으 로는, mRNA 카피 수가 250 카피/㎕·라이세이트(제1 역치) 미만인 경우에는 암 전이 음성, 즉 실질적으로 전이소는 존재하지 않는다고 판정한다. 250 카피/㎕·라이세이트(제1 역치) 이상 5,000 카피/㎕·라이세이트(제2 역치) 미만인 경우에는 암 전이 약양성(＋), 즉 마이크로 전이가 존재한다고 판정한다. 10,000 카피/㎕·라이세이트(제2 역치) 이상인 경우에는 암 전이 강양성(++), 즉, 매크로 전이가 존재한다고 판정한다. 다음으로, 제어부(102d)는 이들 판정 결과를 개인용 컴퓨터(102)의 표시부(102c)에 출력하고(단계 S4), 표시한다.

또한, 「카피/㎕·라이세이트」란, 직경 약 6 ㎜의 림프절 조직, 완충액(pH 3.4: 200 mM 글리신-HCl, 5%　Brij35(폴리옥시에틸렌(35)라우릴에테르, 시그마사 제) 및 20%　DMSO(와코순약)를 포함함) 4 ㎖ 중에서 가용화시키고, 또한 이것을 10배 희석함으로써 얻어지는 라이세이트 1 ㎕ 중의 mRNA 카피 수를 나타낸다.

상기 실시형태에서, 제1 역치는 50∼3,000 카피/㎕·라이세이트 사이에서 설정하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 100∼1,000 카피/㎕·라이세이트, 더욱 바람직하게는 200∼300 카피/㎕·라이세이트 사이에서 설정된다. 또, 제2 역치는 2,000∼20,000 카피/㎕·라이세이트 사이에서 설정하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 4,000∼10,000 카피/㎕·라이세이트 사이에서 설정된다.

다음으로, 도 6에 기초하여, 표시부(102c)에서의 판정 결과의 표시 화면의 일 예에 대해 설명한다. 난(欄)(200)에는 CK19 mRNA의 증폭 상승 시간이 표시되고, 난(205)에는 양성 컨트롤의 증폭 상승 시간이 표시된다. 이에 기초하여 CPU(6a)에 의해 산출된 CK19 mRNA 발현량(카피/㎕)은 난(201)에 표시된다. 이 발 현량을 제1 역치 및 제2 역치와 비교함으로써 얻어진 전이소의 크기에 관한 정보는 난(202)에 표시된다. 도 6에서는 ++, 즉 암 강양성인 것이 나타나 있다. 또, CK19 mRNA의 증폭을 수행한 반응액의 탁도의 실시간 곡선은 난(203)에, 양성 컨트롤의 증폭을 수행한 반응액 탁도의 실시간 곡선은 난(205)에 표시된다.

또한, 상기 실시형태의 장치에서는 역치와의 비교 결과에 기초하여 림프절 중의 전이소의 크기를 단계적으로 판정하였다. 그러나, 상술한 바와 같이 전이소의 면적이나 전이소에 포함되는 세포 수 등을 mRNA의 카피 수의 산출 결과로부터 정량적으로 취득할 수도 있다.

실시예 1

(1) 면역조직화학 염색

유방암 환자로부터 절제한 림프절 조직 11개와, 대장암 환자로부터 절제한 림프절 7개를 사용하여 면역조직화학 염색에 의한 전이소 면적(전이소 크기)의 측정을 수행하였다.

이들 림프절(약 50∼600 ㎎/개)의 중앙부 부근에서, 두께 약 10 ㎛의 절편(이하, '섹션'이라고도 함)을 잘라내어 슬라이드 글라스에 재치시켰다. 이 절편에 대해 항-CK19 항체 및 엔비젼 키트(Envision Kit, 모두 DAKO 사)를 사용하여 암세포의 염색을 수행하였다. GS-710 광농도계(Calibrated Densitometer, 바이오래드사)를 사용하여 이 절편의 암세포의 전이소 크기의 측정을 수행하였다. 측정 결과(㎟)를 하기 표 1에 나타낸다.

(2) CK19 mRNA 정량

상기에서 잘라낸 절편에 인접한 절편(두께 약 10 ㎛)을 잘라내고, 알엔이지 미니 키트(RNeasy Mini Kit, 퀴아겐 사)를 사용하여 RNA 추출을 수행하여, RNA 시료를 조제하였다. 이 RNA 시료를 사용하여, 이하의 조성의 반응액을 조제하여 TaqMan법에 의해 CK19 mRNA의 카피 수를 산출하였다. 또한, TaqMan법에 의한 측정은, TaqMan One-step RT-PCR Master Mix 및 Prism 7700 Realtime PCR system(모두 어플라이드 바이오시스템즈 사)을 이용하여 첨부의 사용 설명서에 따라 수행하였다.

반응액(50 ㎕) 조성

정제수 20.10 ㎕

RNA 시료 2 ㎕

TaqMan 2X Universal PCR Master Mix 25 ㎕

40X MultiScribe and RNase Inhibitor Mix 1.25 ㎕

100 μM 포워드 프라이머 0.15 ㎕

100 μM 리버스 프라이머 0.15 ㎕

7.4 pmol/㎕ (최종 농도 200 nM) TaqMan 프로브 1.35 ㎕

또, CK19 mRNA 검출을 위한 프라이머 서열 및 TaqMan 프로브의 서열은 이하와 같다.

포워드 프라이머: 5'-CAGATCGAAGGCCTGAAGGA-3' (서열번호 1)

리버스 프라이머: 5'-CTTGGCCCCTCAGCGTACT-3' (서열번호 2)

TaqMan 프로브: 5'-GCCTACCTGAAGAAGAACCATGAGGAGGAA-3' (서열번호 3)

또한, 이 TaqMan 프로브는 5' 말단에는 6-카르복시플루오레세인(FAM), 3' 말단에는 6-카르복시-테트라메틸-로다민(TAMRA)을 갖는다.

mRNA의 정량값(카피/섹션)을 하기 표 1에 나타낸다. 또, 유방암의 전이소 크기와 CK19 mRNA 정량 결과와의 관계를 도 7에, 대장암의 전이소 크기와 CK19 mRNA 정량 결과와의 관계를 도 8에 나타낸다.

	전이소의 크기(㎟)	CK19 mRNA(카피/섹션)
유방암	0.67	3.00×10⁶
	0.029	1.70×10⁴
	2.82	9.69×10⁶
	8.4	2.03×10⁷
	9.36	1.23×10⁷
	6.14	7.20×10⁶
	2.51	1.70×10⁷
	0.079	7.20×10⁴
	0.15	5.80×10⁵
	15.68	4.70×10⁷
	3.91	6.40×10⁶
대장암	4.45	8.00×10⁶
	9.39	2.00×10⁷
	8.18	2.90×10⁷
	6.29	3.40×10⁷
	5.33	9.70×10⁶
	1.47	1.10×10⁵
	3.04	2.10×10⁶

표 1, 도 7 및 도 8로부터, 대장암 및 유방암 모두 CK19 mRNA의 정량 결과와 전이소 크기(㎟)의 상관관계가 인정되었다. 따라서, CK19 mRNA를 정량함으로써 전이소의 크기(㎟)를 예측할 수 있음이 확인되었다.

(실시예 2)

유두선관암에 유래하는 암세포가 전이한 림프절 1개로부터 일정한 간격을 두고 두께 약 10 ㎛의 절편을 35매 잘라내었다. 이 35매의 절편에 대해 실시예 1(1)과 동일하게 하여 면역조직화학 염색을 수행하고, 암세포의 수(개/섹션)를 계수하였다.

면역조직화학 염색에 사용한 절편을 mRNA의 정량에 사용할 수 없기 때문에, 이 절편에 인접한 절편(두께 약 10 ㎕)의 mRNA 발현량(카피/섹션)을 실시예 1과 동일하게 하여 측정하고, 이 정량 결과를 면역조직화학 염색에 의한 암세포수와 대응시켰다. mRNA 발현량과 암세포수의 관계를 도 9에 나타낸다.

충실선관암에 유래하는 암세포가 전이한 림프절 1개로부터 일정한 간격으로 두께 약 10 ㎛의 절편을 30매 잘라내었다. 이 30매의 절편에 대해 실시예 1(1)과 동일하게 하여 면역조직화학 염색을 수행하고, 암세포의 수(개/섹션)를 계수하였다. 다음으로, 각 절편에 인접한 절편을 사용하여 실시예 1(2)과 동일하게 하여 mRNA 발현량(카피/섹션)을 측정하였다.

실시예 2와 동일하게 하여, 암세포 계수에 제공한 소정의 절편에서의 mRNA 발현량을 인접한 절편의 mRNA 발현량으로 하여, mRNA 발현량과 암세포수의 관계를 도 10에 나타낸다.

도 9 및 도 10으로부터 알 수 있듯이, CK19 mRNA의 발현량과 암세포수는 양호한 상관관계를 나타내었다. 따라서, CK19 mRNA를 정량함으로써 전이소에서의 암세포의 수를 예측할 수 있는 것이 확인되었다.

(실시예 3)

암 전이가 발견되지 않은 림프절 11개(음성 검체)를 사용하여 실시예 1(2)과 동일하게 하여 검출용 시료를 제작하여 각각의 검체에서의 CK19 mRNA 발현량(백그라운드의 값)을 측정하였다.

또, 표 1에 나타내는 유방암의 데이터를 기본으로, 각 절편에서 전이소가 한 변 1 ㎜의 입방체(부피 1 ㎣)라고 가정했을 경우의 CK19 mRNA 발현량과, 한 변 2 ㎜의 입방체(부피 8 ㎣)라고 가정했을 때의 CK19 mRNA 발현량을 산출하였다.

또한, 전이소가 1 ㎣였을 경우의 CK19 mRNA 발현량 및 8 ㎣였을 경우의 CK19 mRNA 발현량에, 백그라운드 값인 음성 검체의 CK19 mRNA 발현량을 각각 가산하였다. 즉, 이들 값은, 전이소를 갖지 않는 림프절 한 개의 CK19 mRNA 발현량(백그라운드), 1 ㎣의 전이소를 갖는 림프절 한 개의 CK19 mRNA 발현량의 추정값 및 8 ㎣의 전이소를 갖는 림프절 한 개의 CK19 mRNA 발현량의 추정값이다. 이들 값을 도 11에 나타낸다.

도 11에서, 1.0×10⁷ 카피에 제1 역치를 설정함으로써 상기의 검체를 음성과 양성으로 나눌 수 있었다. 즉, 림프절로부터 측정한 CK19 mRNA 발현량이 제1 역치 미만인 경우에는 이 림프절에 암세포가 전이하고 있지 않다고 예측할 수 있으며, 제1 역치 이상인 경우에는 이 림프절에 암세포가 전이하고 있다고 예측할 수 있다.

본 실시예에서는 제1 역치는 백그라운드의 최고값인 3.0×10⁶ 카피 이상으로 설정할 수 있다.

또, 조직진에서 전이소의 장경이 2 ㎜인 경우는 매크로 전이라고 불리며, 2 ㎜ 미만인 경우는 마이크로 전이라고 불린다. 따라서, 도 11에서, 한 변 2 ㎜의 입방체로 가정된 CK19 mRNA 발현량의 최저치가 약 2.0×10^8.0 카피이기 때문에, 이것을 제2 역치로서 설정함으로써 전이소가 마이크로 전이나 매크로 전이인지를 예측하는 것도 가능하다.

(실시예 4)

유방암 환자로부터 채취된 림프절 64개(음성 검체 42개, 양성 검체 22개) 및 대장암 환자로부터 채취된 림프절 69개(음성 검체 33개, 양성 검체 36개)(직경 약 6 ㎜/개)에 각각 pH 3.4의 완충액(200 mM 글리신-HCl, 5%　Brij35(폴리옥시에틸렌(35)라우릴에테르, 시그마사 제) 및 20%　DMSO(와코순약)를 포함함) 4 ㎖를 첨가하고, 블랜더로 균일화하였다. 10,000×g로 1분간 원심하여 상청을 채취하였다. 이 상청을 상기 완충액으로 10배로 희석하고, 검출용 시료(라이세이트) 2 ㎕을 채취하였다.

핵산 증폭 장치 「GD-100」(시스맥스제)에 이 검출용 시료와 핵산 증폭용 시약 「사이토케라틴 시약」(시스맥스제)을 세팅하고, 검출용 시료 중의 CK19 mRNA(카피 수/㎕·라이세이트)를 정량하였다.

유방암 환자로부터 채취된 림프절을 사용한 경우의 CK19 mRNA 정량 결과를 도 12에, 대장암 환자로부터 채취된 림프절을 사용한 경우의 CK19 mRNA 정량 결과를 도 13에 나타낸다.

본 실시예에서 사용한 검출용 시료는 실시예 3에서 사용한 검출용 시료에 비해 4만배로 희석하고 있기 때문에, 도 12 및 13에서 제1 역치를 250 카피/㎕·라이세이트로, 제2 역치를 5,000 카피/㎕·라이세이트로 설정하였다.

도 12에서, CK19 mRNA의 발현량(카피/㎕·라이세이트)과 제1 역치를 비교함으로써 모든 음성 검체를 음성으로 판정하고, 모든 양성 검체를 양성으로 판정할 수 있었다. 즉, 100%의 확률로 유방암의 림프절 전이가 음성인지 양성인지를 판정 가능한 것이 확인되었다. 또한, 본 실시예에서는 제1 역치를 200∼1,000 카피/㎕·라이세이트의 사이에서 설정함으로써 상기와 같은 결과를 얻을 수 있다.

또, 도 12에서 CK19 mRNA의 발현량(카피/㎕·라이세이트)이 제2 역치 이상이었던 검체는 유방암의 매크로 전이를 포함하는 것이 예상되며, 제1 역치 이상 제2 역치 미만이었던 검체는 유방암의 마이크로 전이를 포함하는 것이 예상된다.

도 13에서, CK19 mRNA의 발현량(카피/㎕·라이세이트)과 제1 역치(250 카피/㎕·라이세이트)를 비교함으로써 모든 음성 검체를 음성으로 판정하고, 36개의 양성 검체 중 35개를 양성으로 판정할 수 있었다. 즉, 약 99%의 높은 확률로 대장암의 림프절 전이가 음성인지 양성인지를 판정할 수 있는 것이 확인되었다. 또한, 본 실시예에서는 제1 역치를 100∼300 카피/㎕·라이세이트의 사이에서 설정함으로써 상기와 같은 결과를 얻을 수 있다.

또, 도 13에서 CK19 mRNA의 발현량(카피/㎕·라이세이트)이 제2 역치 이상이었던 검체는 대장암의 매크로 전이를 포함하는 것이 예상되며, 제1 역치 이상 제2 역치 미만이었던 검체는 대장암의 마이크로 전이를 포함하는 것이 예상된다.

본 실시예의 결과로부터, 유방암에서도 대장암에서도 같은 역치(제1 역치 및 제2 역치)를 사용함으로써 림프절 중의 전이소의 측정을 수행할 수 있음이 판명되었다.

전술한 발명의 상세한 설명 및 실시예는 예시 및 설명의 방법으로 제공된 것이며, 첨부된 특허청구범위를 제한할 의도는 아니다. 본 바람직한 구현예의 많은 변형이 해당 분야의 당업자에게서 자명할 것이며, 첨부된 특허청구범위 및 그 균등물의 범위 내에 포함된다.

본 발명의 암 전이의 판정 방법 및 장치를 이용하면, 림프절에 어느 정도의 암세포가 전이하고 있는지를 객관적으로 판정하는 것이 가능하다.

<110> SYSMEX CO., LTD. <120> A method and apparatus for measuring carcinomatous lesion <130> 2007-fpa-2413 <160> 3 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed primer for CK19 mRNA <400> 1 cagatcgaag gcctgaagga 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed primer for CK19 mRNA <400> 2 cttggcccct cagcgtact 19 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Desinged probe for CK19 mRNA <400> 3 gcctacctga agaagaacca tgaggaggaa 30

Claims

암세포의 전이가 의심되는 림프절로부터 조제된 검출용 시료 중의 종양 마커 mRNA를 정량하는 단계; 및

상기 mRNA의 정량 결과에 기초하여 상기 림프절에서의 전이소의 크기를 구하는 단계를 포함하는 전이소 크기의 판정 방법.
제1항에 있어서,

상기 mRNA의 정량 결과가 상기 검출용 시료 중의 상기 mRNA의 절대량인 전이소 크기의 판정 방법.
제1항에 있어서,

상기 종양 마커가 사이토케라틴 19인 전이소 크기의 판정 방법.
제1항에 있어서,

상기 mRNA의 정량 결과를 제1 역치와 비교하는 단계를 더 포함하며, 상기 전이소의 크기를 구하는 단계는 상기 mRNA의 정량 결과가 상기 제1 역치 이상인 경우에 실행되는 전이소 크기의 판정 방법.
제4항에 있어서,

상기 제1 역치가 50∼3,000 카피/㎕·라이세이트로 설정되는 전이소 크기의 판정 방법.
암세포의 전이가 의심되는 림프절로부터 조제된 검출용 시료 중의 종양 마커 mRNA를 정량하는 단계;

상기 mRNA의 정량 결과를 제1 역치와 비교하는 단계; 및

상기 비교 결과에 기초하여 상기 림프절이 암 전이 음성 및 암 전이 양성의 어느 쪽인지를 판정하는 단계를 포함하는 암 전이의 판정 방법.
제6항에 있어서,

상기 판정 결과에 기초하여 상기 림프절이 암 전이 음성 및 암 전이 양성의 어느 쪽인지를 나타내는 정보를 출력하는 단계를 더 포함하는 암 전이의 판정 방법.
제7항에 있어서,

상기 출력 단계는 상기 판정 결과가 암 전이 양성인 경우에 전이소의 크기를 추가로 출력하도록 실행되는 암 전이의 판정 방법.
제6항에 있어서,

상기 비교 단계가, 상기 mRNA의 정량 결과를 제1 역치 및 상기 제1 역치보다 높은 값인 제2 역치와 비교하도록 실행되며,

상기 판정 단계가, 제1 역치 및 제2 역치와의 비교 결과에 기초하여 상기 림프절이 암 전이 음성, 암 전이 약양성 및 암 전이 강양성의 어느 쪽인지를 판정하도록 실행되는 암 전이의 판정 방법.
제9항에 있어서,

제1 역치 및 제2 역치와의 비교 결과에 기초하여 상기 림프절이 암 전이 음성, 암 전이 약양성 및 암 전이 강양성의 어느 쪽인지를 나타내는 정보를 출력하는 단계를 더 포함하는 암 전이의 판정 방법.
제10항에 있어서,

상기 출력 단계는 상기 판정 결과가 암 전이 약양성인 경우에 전이소가 마이크로 전이인 것을 나타내는 정보를 추가로 출력하도록 실행되는 암 전이의 판정 방법.
제10항에 있어서,

상기 출력 단계는 상기 판정 결과가 암 전이 강양성인 경우에 전이소가 매크로 전이인 것을 나타내는 정보를 추가로 출력하도록 실행되는 암 전이의 판정 방법.
제9항에 있어서,

상기 제2 역치가 2,000∼20,000 카피/㎕·라이세이트로 설정되는 암 전이의 판정 방법.
암세포의 전이가 의심되는 림프절로부터 조제된 검출용 시료중의 종양 마커 mRNA를 정량하는 정량부;

상기 mRNA의 정량 결과를 제1 역치와 비교하는 비교부; 및

상기 비교 결과에 기초하여 상기 림프절이 암 전이 음성 및 암 전이 양성의 어느 쪽인지를 판정하는 판정부를 포함하는 암 전이의 판정 장치.
제14항에 있어서,

상기 판정 결과에 기초하여 상기 림프절이 암 전이 음성 및 암 전이 양성의 어느 쪽인지를 나타내는 정보를 출력하는 표시부를 더 포함하는 암 전이의 판정 장치.
제15항에 있어서,

상기 표시부는 상기 판정 결과가 암 전이 양성인 경우에 전이소의 크기를 추가로 출력하는 암 전이의 판정 장치.
제14항에 있어서,

상기 비교부는 상기 mRNA의 정량 결과를 제1 역치 및 상기 제1 역치보다 높은 값인 제2 역치와 비교하고,

상기 판정부는 상기 제1 역치 및 제2 역치와의 비교 결과에 기초하여 상기 림프절이 암 전이 음성, 암 전이 약양성 및 암 전이 강양성의 어느 쪽인지를 판정하는 암 전이의 판정 장치.
제17항에 있어서,

상기 판정 결과에 기초하여 상기 림프절이 암 전이 음성, 암 전이 약양성 및 암 전이 강양성의 어느 쪽인지를 나타내는 정보를 출력하는 표시부를 더 포함하는 암 전이의 판정 장치.
제18항에 있어서,

상기 표시부는 상기 판정 결과가 암 전이 약양성인 경우에 전이소가 마이크로 전이인 것을 나타내는 정보를 추가로 출력하는 암 전이의 판정 장치.
제18항에 있어서,

상기 표시부는 상기 판정 결과가 암 전이 강양성인 경우에 전이소가 매크로 전이인 것을 나타내는 정보를 추가로 출력하는 암 전이의 판정 장치.