JPH1066581A

JPH1066581A - 新規な癌関連分子及び該分子をコードする遺伝子

Info

Publication number: JPH1066581A
Application number: JP8241370A
Authority: JP
Inventors: Motomi Nakada; 元巳中田; Hideyuki Satani; 秀行佐谷; Takashi Makino; 敬史牧野
Original assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Current assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Priority date: 1996-08-23
Filing date: 1996-08-23
Publication date: 1998-03-10

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、新規な癌関連分子及び該分子をコ
ードする遺伝子を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、新規なｄｌｇファミリー分子
（ＮＥ−ｄｌｇ）及び該分子をコードする遺伝子に関す
る。また、本発明は、ＮＥ−ｄｌｇ分子を特異的に認識
する抗体に関する。本発明の遺伝子、蛋白質及び抗体
は、ｄｌｇ分子の機能解明に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規な癌関連分子
及び該分子をコードする遺伝子に関し、特には、新規な
ヒトｄｌｇ分子及び該分子をコードする遺伝子に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】ショウジョウバエにおいて、これまでに
いくつかの癌抑制遺伝子が単離され、その遺伝子の遺伝
的な解析が成されている。これらの遺伝子は、生殖細胞
系列（germ line）での変異は、劣性致死（recessive l
ithal）として挙動する。ｄｌｇ（discs large 1）遺伝
子は、その欠失により成虫盤（imaginal dis）新生の過
増殖を引き起こす遺伝子として単離された（Woodら, Ce
ll, 66巻, 451〜464ページ, 1991年）。その文献は、ｄ
ｌｇ遺伝子が、３コピーのＤＨＲドメイン（discs-larg
e homologous region）、ＳＨ３モチーフ、及び酵母の
グアニル酸キナーゼにホモロジーのあるドメインをもつ
と報告している。これらの構造から、ｄｌｇは細胞内シ
グナル伝達に関わっていると予想されているが、その直
接的な証明はまだなされていない。

【０００３】最近、ｄｌｇにホモロジーがある分子がい
くつか同定されている。ｄｌｇを含むこれらの分子は、
ＭＡＧＵＫ（membrane-associated guanylate kinase h
omology）と呼ばれ、新しい蛋白質ファミリーと考えら
れている（Wood ら, Mechanism of Development, 44,p.
85-89, 1993）。以降、この蛋白質ファミリーをｄｌｇ
ファミリーという。また、このファミリーに属する蛋白
質をｄｌｇファミリー分子といい、その蛋白質が由来す
る動物種を明示するときはヒトｄｌｇファミリー分子と
いうように種をｄｌｇファミリー分子の前に付けて呼
ぶ。このｄｌｇファミリー分子の中には、ヒトのｄｌｇ
であるｈｄｌｇ１、ｈｄｌｇ２が含まれ、さらにラット
ＳＡＰ−９７、ラットＰＳＤ−９５、ラットＳＡＰ−９
０、ＺＯ−１（ヒト）、ＺＯ−２（ヒト）及びヒトｐ５
５もこのファミリーに含まれる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ヒトのｄｌｇ１（ｈｄ
ｌｇ１）は、Ｌｅｕらにより、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 91巻, 9818〜9822頁, 1994年に報告されており、
この蛋白質は、protein4.1 と結合すると記載されてい
る。この文献にはまた、ｈｄｌｇ１遺伝子は約１００ｋ
ｄの蛋白質をコードする遺伝子であり、ヒトの組織中の
うち、リンパ球、心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、筋肉、腎
臓で発現していると記載している。また、ｈｄｌｇ１分
子の細胞での局在性については、ｈｄｌｇ１分子は細胞
膜上に存在していると記載されている。

【０００５】また、ショウジョウバエで見つかったｄｌ
ｇ遺伝子は、その欠失により、成虫盤新生の過増殖から
最終的には神経芽細胞腫を形成することが報告されてい
る（前掲の Cell, 1991）。このことより、ｄｌｇ分子
は、通常は、細胞の過増殖を抑える働きをする分子、即
ち一種の癌抑制遺伝子としての働きをする分子である可
能性が示唆されている。

【０００６】また、ラットｄｌｇファミリー分子として
は、既に上記の３種のｄｌｇファミリー分子（ラットＳ
ＡＰ−９７、ラットＰＳＤ−９５、ラットＳＡＰ−９
０）が単離され、それをコードする遺伝子が単離されて
いる。そこで、本発明者らは、ヒトにおいても、さらに
多くのｄｌｇファミリー分子が存在するのではないかと
考え、まだ単離されていない新しいｄｌｇ分子の単離を
試みた。即ち、本発明者らは、ラットより高等な生物で
あるヒトにおいては、ラットと同様に又はラット以上に
複数種のｄｌｇファミリー分子が存在すると考えた。

【０００７】よって、本発明の目的は、新たな癌関連分
子であるヒトのｄｌｇファミリー分子及びそれをコード
する遺伝子（ＤＮＡ）を提供することを目的とする。

【０００８】また本発明は、ｄｌｇファミリー分子の機
能解明に有用な、新たなヒトｄｌｇファミリー分子の抗
体やポリヌクレオチドプローブ等を提供することを目的
とする。

【０００９】また、本発明は、医薬への応用が可能なア
ンチセンスポリヌクレオチドを提供することを目的とす
る。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を行った結果、ヒトの胎児脳のｃＤＮＡライブラリーよ
り新規なｄｌｇファミリー分子をコードするＤＮＡを単
離し、本発明を完成するに至った。本発明者らはまた、
この新規なｄｌｇファミリー分子の単離及び同定に成功
し、これをＮＥ−ｄｌｇと命名した。このＮＥ−ｄｌｇ
分子をコードする遺伝子は、ヒトｄｌｇ１及びヒトｄｌ
ｇ２遺伝子とホモロジーを有していた。

【００１１】本発明者らは、ショウジョウバエのｄｌｇ
分子をコードする遺伝子を基に、ＥＳＴ databaseを用
いて、それにホモロジーにある断片を検索した。次い
で、この断片の両端部分の配列を基に、この断片を増幅
するためのオリゴＤＮＡプライマーを合成した。次に、
前記の合成オリゴＤＮＡプライマーを用い、ヒトの胎児
脳のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法によ
り、前記オリゴＤＮＡプライマーを両端にもつ断片を増
幅した。そして、この断片をクローニングベクターに組
み込んだ後、断片のＤＮＡ配列を決定した。この配列デ
ータを基に全長のｃＤＮＡを取得するため、前記断片の
両端部分の配列を基に断片の外側に向かうプライマーを
合成し、次いで、そのプライマーを用い前記ヒト胎児脳
ｃＤＮＡを鋳型として、断片の外側に向けてＰＣＲを行
った。この操作を必要に応じ繰り返した後、全長のｃＤ
ＮＡを取得し、そのＤＮＡ配列を決定した。その結果、
新規なヒトｄｌｇ遺伝子（ＮＥ−ｄｌｇ遺伝子）を取得
し、その遺伝子がコードするヒトｄｌｇファミリー分子
（ＮＥ−ｄｌｇ分子）のアミノ酸配列を同定するに至っ
た。

【００１２】本発明者らはまた、このＮＥ−ｄｌｇ遺伝
子の断片を用いてノーザンブロットを行い、ＮＥ−ｄｌ
ｇが、膵臓、気管支、前立腺、甲状腺及び脳で発現して
いることを見いだし、さらには、ＮＥ−ｄｌｇのｍＲＮ
Ａが２種類存在し、選択的スプライス機構（alternativ
e splicing）の形態をとることを見いだし、そして２つ
のタイプのＮＥ−ｄｌｇ分子を提供した。

【００１３】さらに、本発明者らは、ＮＥ−ｄｌｇ分子
に特異的なオリゴペプチドを用いて、ＮＥ−ｄｌｇに対
する抗体を作製した。これらの抗体を用いて、ＮＥ−ｄ
ｌｇ分子の発現等の機能解明が可能となった。

【００１４】本発明者らはまた、これらの抗体を用い
て、脳組織では神経細胞において神経突起に沿ってＮＥ
−ｄｌｇ分子が発現しており、また膵臓組織ではインシ
ュリンを産生しているランゲルハンス島細胞においての
みＮＥ−ｄｌｇ分子が発現していることを見いだした。
このことより、ＮＥ−ｄｌｇ分子は、神経内分泌系組織
に特異的な分子であると考えられる。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下に本発明を詳細に説明する。

【００１６】本発明は、新規なｄｌｇファミリー分子及
び該分子をコードする遺伝子に関し、さらには、該遺伝
子に対するプローブ、該分子に対する抗体に関する。

【００１７】本発明の一つの特徴は、神経内分泌組織で
発現が見られるヒトｄｌｇファミリー分子である。

【００１８】また本発明の一つの特徴は、脳、膵臓、気
管支、前立腺及び甲状腺で発現が見らるヒトｄｌｇファ
ミリー分子である。

【００１９】また本発明の一つの特徴は、脳、膵臓、気
管支、前立腺及び甲状腺で発現が見られかつ心臓、肺、
肝臓及び腎臓で発現が見られないるヒトｄｌｇファミリ
ー分子である。

【００２０】また本発明の一つの特徴は、膵臓のインシ
ュリンを発現しているランゲルハンス島で発現されてい
るヒトｄｌｇファミリー分子である。

【００２１】さらに本発明の特徴の一つは、配列表の配
列番号５に記載のアミノ酸配列を有するヒトｄｌｇファ
ミリー分子である。

【００２２】さらに本発明の特徴の一つは、配列表の配
列番号６に記載のアミノ酸配列を有するヒトｄｌｇファ
ミリー分子である。

【００２３】また本発明の一つの特徴は、配列表の配列
番号１に記載のアミノ酸配列を有するｄｌｇファミリー
分子である。

【００２４】本発明の一つの特徴はまた、配列表の配列
番号３に記載のアミノ酸配列を有するｄｌｇファミリー
分子である。

【００２５】また本発明の一つの特徴は、１又は２以上
のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する上記ｄｌｇフ
ァミリー分子である。

【００２６】また本発明の一つの特徴は、配列表の配列
番号の５又は６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドに特異的な抗体により認識されるｄｌｇファミリー
分子である。

【００２７】さらに本発明の一つの特徴は、前記ｄｌｇ
ファミリー分子をコードするポリヌクレオチドである。

【００２８】また本発明の一つの特徴は、配列表の配列
番号の２又は４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオ
チドである。

【００２９】また本発明の一つの特徴は、前記のポリヌ
クレオチドのうちの、１２塩基以上でありかつＧＣ含有
率が３０〜７０％である部分を含むポリヌクレオチドで
ある。

【００３０】また本発明の一つの特徴は、前記のポリヌ
クレオチドのうちの、１６塩基以上でありかつＧＣ含有
率が３０〜７０％である部分を含むポリヌクレオチドで
ある。

【００３１】さらに本発明の特徴の一つは、配列表の配
列番号２又は４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオ
チドに対応するＲＮＡである。

【００３２】また本発明の一つの特徴は、前記のｄｌｇ
分子に翻訳される塩基配列を有するＲＮＡである。

【００３３】さらに本発明の一つは、前記のポリヌクレ
オチド、又は配列番号５又は６に記載のアミノ酸をコー
ドするポリヌクレオチドを用いてｄｌｇ遺伝子を検出す
る方法である。

【００３４】また本発明の一つの特徴は、前記のポリヌ
クレオチドのうちの、塩基配列の長さが１５塩基以上で
ある部分のポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレ
オチド及びその誘導体である。

【００３５】また本発明の一つの特徴は、前記のポリヌ
クレオチドのうちの、塩基配列の長さが１５塩基〜３０
塩基である部分のポリヌクレオチドのアンチセンスポリ
ヌクレオチド及びその誘導体である。

【００３６】本発明の特徴の一つは、配列表の配列番号
１又は３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを
認識する抗体である。

【００３７】本発明の一つの特徴はまた、配列表の配列
番号５又は６に記載のポリペプチドに特異的異な抗体で
ある。

【００３８】さらに本発明の特徴の一つは、前記の抗体
を用いて、ｄｌｇ分子を検出する方法である。

【００３９】本明細書において、ＮＥ−ｄｌｇはポリペ
プチドを表し、該ポリペプチドをコードする遺伝子はＮ
Ｅ−ｄｌｇ遺伝子又はＮＥ−ｄｌｇｃＤＮＡと表記す
る。該ポリペプチドに対する抗体は、抗ＮＥ−ｄｌｇ抗
体と表記する。

【００４０】また、遺伝子については、天然に存在する
ｍＲＮＡからの逆転写により得たＤＮＡ（該ＤＮＡを増
幅して得られるＤＮＡを含む）を表す場合、その意味を
明確するときはｃＤＮＡと称する。

【００４１】自然の変異により又は人工の変異（例え
ば、『ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ２ｎｄ
Ｅｄｉｔｉｏｎ』（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、１９８９年）
１５．１〜１５．１１３頁を参照）によりポリヌクレオ
チドの構造の一部を、該ポリヌクレオチドがコードする
ポリペプチドの主たる機能である活性に変化を与えるこ
となく変化させることが可能である。本発明のＮＥ−ｄ
ｌｇも、配列表の配列番号１又は３に記載のアミノ酸配
列の一又は複数のアミノ酸を、該ポリペプチドの主たる
機能を変化させずに、置換、欠失又は付加を与えること
が可能である。これらを本発明ではＮＥ−ｄｌｇ変異体
という。

【００４２】遺伝暗号の縮重により、ポリヌクレオチド
から生産されるポリペプチドのアミノ酸配列を変えるこ
となく、該ポリヌクレオチドの塩基配列の少なくとも一
部の塩基を他の種類の塩基に置換することができる。し
たがって、本発明のＮＥ−ｄｌｇ及びＮＥ−ｄｌｇ変異
体をコードするポリヌクレオチドとは、該ＮＥ−ｄｌｇ
又はｄｌｇ変異体のポリペプチドをコードしうる全ての
縮重のパターンを含むものである。

【００４３】配列表の配列番号２に示される塩基配列
は、本発明の一つである天然に存在するＮＥ−ｄｌｇ
（オリジナルフォーム）遺伝子の塩基配列であり、配列
表の配列番号４に示される塩基配列は、本発明の一つで
ある天然に存在するＮＥ−ｄｌｇ（スプライスフォー
ム）遺伝子の塩基配列である。

【００４４】配列表の配列番号２又は４の塩基配列のう
ちの連続する１２塩基以上の一部を有するＤＮＡ又は該
ＤＮＡにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、ｃＤ
ＮＡライブラリー等からＮＥ−ｄｌｇ遺伝子をスクリー
ニングするためのプローブとして使用可能である。この
とき、ＧＣ含有率が３０ないし７０％のものが好適に使
用可能である。また、連続する１６塩基以上であるＤＮ
Ａ又は該ＤＮＡにハイブリダイズするポリヌクレオチド
が特に好ましい。プローブとして用いる該ポリヌクレオ
チドは誘導体であってもよい。通常、上記の塩基数以上
の配列は、特異性のある配列であると認識されている。
該プローブを用いたスクリーニングにおいて使用するｃ
ＤＮＡライブラリーとしては、ヒト細胞株のｍＲＮＡか
ら作製されたものが好ましく使用できる。これらのｃＤ
ＮＡライブラリーからランダムサンプリングにより選択
された一群のｃＤＮＡを検索の試料とすることができ
る。また、市販のものでも使用可能である。

【００４５】本発明のＮＥ−ｄｌｇ遺伝子及びその変異
体の塩基配列の決定方法は、特に制限されない。例え
ば、Ｔａｑサイクルシークエンシング法（『Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓｖｏｌ．７』（１９８９年）４９４
〜４９９頁に記載の方法は好ましく使用可能である。

【００４６】本発明のＮＥ−ｄｌｇ遺伝子の変異体の塩
基配列から翻訳されるアミノ酸配列及び本発明のＮＥ−
ｄｌｇ変異体のアミノ酸配列と、ＮＥ−ｄｌｇのアミノ
酸配列との比較方法については、特に制限がない。例え
ば、市販のプログラム（例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ（登録
商標）−ＣＤプログラムＶｅｒ．３３（ソフトウェアデ
ィベロプメント社製）を用いて可能である。

【００４７】プラスミドを大腸菌等の適当な宿主に導入
して、形質転換体を得ることは公知の方法により可能で
ある。例えば、『細胞工学プロトコール』（秀潤社、１
９９１年）１０５〜１０７頁に記載の方法により可能で
ある。得られた形質転換体を培養し、遺伝子の増幅、発
現を行いＮＥ−ｄｌｇを製造することが可能である。次
に培養物を回収し、必要に応じて濃縮、可溶化、透析、
各種クロマトグラフィー等の操作を行うことにより、本
発明のＮＥ−ｄｌｇ及びＮＥ−ｄｌｇ変異体を精製する
ことが可能である。

【００４８】形質転換体の培養については、各種の教科
書があり、例えば、『微生物実験法』（社団法人日本生
化学会編、東京化学同人、１９９２年）に記載の方法で
行うことが可能である。本発明に記載の塩基配列に基づ
いてＮＥ−ｄｌｇを発現させることも、公知の方法によ
り可能である。このとき、宿主としては、大腸菌等の細
菌、酵母、動物細胞のいずれも使用可能である。特に、
動物細胞が好ましい。細胞に遺伝子を導入するには、リ
ポソーム法、エレクトロポーレーション法等を用いるこ
とができる。特に、ＤＥＡＥ−デキストラン法（ファル
マシア社製）を用いることが好ましい。

【００４９】得られた培養物からＮＥ−ｄｌｇを精製す
る精製方法には、免疫沈降法、塩析法、限外濾過法、等
電点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロ
マトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーや抗体クロ
マトグラフィー等の各種アフィニティークロマトグラフ
ィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフ
ィー法及び逆相クロマトグラフィー等があり、適宜選択
して行えばよい。例えば、国際公開番号ＷＯ９５／０６
７３８の明細書３９頁に示されている免疫沈降法は好適
な方法である。

【００５０】また、製造段階において、製造するＮＥ−
ｄｌｇは、他のポリペプチドとの融合ペプチドとして形
質転換体に生産させてもよい。この場合は、精製工程に
おいて、ブロムシアン等の化学物質やプロテアーゼ等の
酵素で処理して、該ＮＥ−ｄｌｇを切り出す操作が必要
になる。

【００５１】本発明のＮＥ−ｄｌｇアンチセンスポリヌ
クレオチドには、塩基、リン酸、糖からなるヌクレオチ
ドが複数結合したものが、天然には存在しないものを含
めて全て含まれる。その代表的なものは、ＤＮＡとｍＲ
ＮＡである。

【００５２】また、本発明のアンチセンスポリヌクレオ
チド誘導体には、その立体構造や機能がポリヌクレオチ
ドと類似するものが全て含まれる。例えば、ポリヌクレ
オチドの３’末端もしくは５’末端に他の物質が結合し
たものやポリヌクレオチドの塩基、糖、リン酸の少なく
ともいずれか一部において、置換や欠失や付加の修飾が
生じた物質、天然に存在しないような塩基、糖、リン酸
を有するものや、糖−リン酸骨格以外の骨格を有するも
のである。

【００５３】該アンチセンスポリヌクレオチド及びその
誘導体は、ＮＥ−ｄｌｇ又はＮＥ−ｄｌｇ変異体をコー
ドするポリヌクレオチドのいかなる部分にハイブリダイ
ズするものであってもよい。なお、ＮＥ−ｄｌｇ又はＮ
Ｅ−ｄｌｇ変異体の全部又は一部をコードするｍＲＮＡ
の一部に対して相補的な塩基配列を有し、該ｍＲＮＡに
ハイブリダイズするものが好ましい。特に好ましくは、
少なくともＮＥ−ｄｌｇもしくはＮＥ−ｄｌｇ変異体を
コードするｍＲＮＡにハイブリダイズするものである。

【００５４】また、該アンチセンスポリヌクレオチド及
びその誘導体は、組織や細胞におけるＮＥ−ｄｌｇ又は
ＮＥ−ｄｌｇ変異体をコードするポリヌクレオチドの存
在やその発現状況を調べるための研究用ポリヌクレオチ
ドプローブとして、直ちに使用可能である。また、診断
用ポリヌクレオチドプローブとしても使用可能である。
なお、プローブとしては、１２塩基以上且つＧＣ含有率
が３０ないし７０％であるものが好ましく、１６塩基以
上且つＧＣ含有率が３０ないし７０％であるものが、特
に好ましい。

【００５５】また、該アンチセンスポリヌクレオチド及
びその誘導体を使用して、ＮＥ−ｄｌｇ又はＮＥ−ｄｌ
ｇ変異体の発現を調節することが可能である。これらは
ＮＥ−ｄｌｇもしくはＮＥ−ｄｌｇ変異体をコードする
遺伝子もしくはｍＲＮＡにハイブリダイズしてＮＥ−ｄ
ｌｇ又はＮＥ−ｄｌｇ変異体の発現を抑制することが期
待されるので、ラットＮＥ−ｄｌｇ又はラットＮＥ−ｄ
ｌｇ変異体が関与する機能の異常に基づく疾患の治療薬
として使用可能である。すなわち、該アンチセンスポリ
ヌクレオチドやその誘導体よりアンチセンス医薬品を開
発することが可能である。

【００５６】ポリペプチドをコードするＤＮＡやｍＲＮ
Ａの相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを使用し
て、該ポリペプチドの発現を調節する方法は、アンチセ
ンス法と呼ばれており、現在多くの研究者によって研究
が進められている技術である。相補的な配列を有するポ
リヌクレオチドは、遺伝子からｐｒｅ−ｍＲＮＡへの
転写段階、ｐｒｅ−ｍＲＮＡから成熟ｍＲＮＡへのプ
ロセッシング段階、核膜通過段階、蛋白への翻訳段
階のいずれかで、遺伝情報を担うＤＮＡ又はｍＲＮＡに
結合し、遺伝情報の伝達の正常な流れに影響を与えてポ
リペプチドの発現を調節すると考えられている。

【００５７】一般的には、１５塩基以上の塩基を含む塩
基配列であれば特異性のある配列であると考えられてい
る（横山一成、蛋白質・核酸・酵素、３８巻、754〜765
頁、1994年）。従って、本発明のアンチセンスポリヌク
レオチド及びアンチセンスポリヌクレオチド誘導体も、
ＮＥ−ｄｌｇ遺伝子若しくはＮＥ−ｄｌｇに対するｍＲ
ＮＡに相補的な塩基配列であって１５塩基以上からなる
塩基配列を含むものであれば、ＮＥ−ｄｌｇ遺伝子もし
くはＮＥ−ｄｌｇに対するｍＲＮＡに特異的に結合する
ことが期待される。

【００５８】一方、ポリヌクレオチドを細胞内に取り込
ませるには、その長さはあまりに長すぎても不適当であ
る。本発明のアンチセンスポリヌクレオチド及びその誘
導体は、いかなる長さのものであってもよいが、本発明
のアンチセンスポリヌクレオチドおよびアンチセンスポ
リヌクレオチド誘導体を細胞内に取り込ませ、ＮＥ−ｄ
ｌｇの発現を調節させることを考慮すると、前記アンチ
センスポリヌクレオチド及びこれらアンチセンスポリヌ
クレオチドの誘導体はＮＥ−ｄｌｇ遺伝子若しくはＮＥ
−ｄｌｇに対するｍＲＮＡに相補的な１５塩基以上３０
塩基以下、好ましくは１５塩基以上２５塩基以下、より
好ましくは１８塩基以上２２塩基以下の塩基数から成る
塩基配列を有するものが好ましい。

【００５９】本発明のアンチセンスポリヌクレオチド及
びアンチセンスヌクレオチド誘導体においても、公知の
アンチセンス技術を用いて、ポリヌクレオチドの医薬品
としての効果を高めることを目的として様々な誘導体、
即ち、目的のＤＮＡやｍＲＮＡとの結合力、組織選択
性、細胞透過性、ヌクレアーゼ耐性、細胞内安定性の高
い様々なポリヌクレオチド誘導体が得られうる。

【００６０】ハイブリダイズのし易さの点では、一般的
には、ステムループを形成している領域の塩基配列に相
補的な塩基配列を持つポリヌクレオチド又はポリヌクレ
オチド誘導体を設計するとよいとされている（『臨床免
疫２５巻』１２００〜１２０６頁、１９９３年）。本
発明のポリヌクレオチド及びその誘導体は、必要に応
じ、ステムループを形成することが可能である。

【００６１】また、翻訳開始コドン付近、リボソーム結
合部位、キャッピング部位、スプライス部位の配列に相
補的な配列を有するようなポリヌクレオチドは、一般に
高い発現抑制効果が期待できる（『癌と化学療法２０
巻１３号』１８９９〜１９０７頁）。したがって、本発
明のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体であ
って、ＮＥ−ｄｌｇ又はＮＥ−ｄｌｇ変異体をコードす
る遺伝子又は該遺伝子に対するｍＲＮＡの翻訳開始コド
ン付近、リボソーム結合部位、キャッピング部位、スプ
ライス部位の相補的な配列を含むものは、高い発現抑制
効果が期待される。

【００６２】現在一般に知られている誘導体は、ヌクレ
アーゼ耐性、組織選択性、細胞透過性、結合力の少なく
とも１つが高められた誘導体であることが好ましく、特
に好ましくは、当該ポリヌクレオチド誘導体は、フォス
フォロチオエート結合（「癌と化学療法」２０巻、１３
号、1899-1907頁、1993年参照）を骨格構造として有す
る誘導体であることが示されている。本発明のポリヌク
レオチド及びその誘導体についても、これらの機能又は
構造を有する誘導体が含まれる。

【００６３】本発明のアンチセンスポリヌクレオチド誘
導体の製造方法については、例えば、『ｉｎＡｎｔｉ
ｓｅｎｓｅＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＡｐｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎｓ』（Michael J. GAIT, p290-299, CRC出
版, フロリダ,1993年）に記載の方法を用いることが可
能である。

【００６４】例えば、天然型のＤＮＡやＲＮＡであれ
ば、化学合成機を使用して合成したり、ＮＥ−ｄｌｇ又
はＮＥ−ｄｌｇ変異体をコードする遺伝子を鋳型とする
ＰＣＲ法により本発明のアンチセンスポリヌクレオチド
を得ることができる。また、メチルフォスフォネート型
やフォスフォロチオエート型等、誘導体の中には、化学
合成機（例えば、パーキンエルマージャパン社製３９４
型）を使用して合成できるものもある。この場合には、
化学合成機に添付されている説明書にしたがって操作を
行い、得られた合成産物を逆相クロマトグラフィー等を
用いたＨＰＬＣ法により精製することによっても、目的
のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体を得る
ことができる。

【００６５】本発明の抗ＮＥ−ｄｌｇ抗体とは、本発明
のＮＥ−ｄｌｇ又はその変異体と反応する限り、ポリク
ローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも含む。ま
た、その活性フラグメント及びその活性フラグメントを
含むキメラ抗体も含まれる。

【００６６】抗体、すなわち免疫グロブリンは、Ｈ鎖と
Ｌ鎖を持ち、物理化学的性質や免疫学的性質から５つの
クラス（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、）
に分けられる。このうち、ＩｇＡ、ＩｇＧはＨ鎖のタイ
プによってさらにサブクラスに分けられる。本発明の新
規抗体は、これらの全てのクラス、サブクラスに属する
ものを含む。

【００６７】さらに、本発明の抗体は、必ずしも抗体分
子全体を用いる必要はなく、活性を有する限り、分子の
一部（活性フラクメント）を用いることができる。活性
フラグメントとしては、具体的にはＦ（ａｂ’）₂ 、Ｆ
ａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、組み換えＦｖ体及び一本鎖Ｆｖ
を挙げることができる。例えば、ペプシンで分解すると
Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆｃ’が得られ、パパインで分解する
とＦａｂ、Ｆｃが得られる。

【００６８】これらの活性フラグメントは、単独でも用
いられるが、必要に応じて、アルブミン、ポリエチレン
グリコール等の物質と結合させ、新たな複合物として用
いることができる。このような複合物は、一般に、生体
内では、長時間分解されずにその効果を最大限まで発揮
することが多い。活性フラグメントに、アルブミン、ポ
リエチレングリコール等の物質を付加する方法は、例え
ば、『Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙＭａｎｕａｌ』（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨｅｒｂ
ｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）ｐ．７７−８
１、ｐ１２９−１３７に記載されている。一般的には、
ＳＰＤＰ（ファルマシア社製）、ＳＭＰＢ（ピアス社
製）、ＥＭＣＳ（ドータイト社製）等の２価反応性試薬
を用いれば、活性フラグメントをアルブミン等と容易に
結合させることができる。

【００６９】本発明のラットＮＥ−ｄｌｇ抗体は、公知
の方法によって得ることが可能である。例えば、『免疫
実験操作法』（日本免疫学会編、日本免疫学会発行）を
参考にして得ることができる。免疫抗原としては本発明
のＮＥ−ｄｌｇの一部、すなわち配列表の配列番号１又
は３に記載のアミノ酸配列のうちの連続する８個以上の
アミノ酸からなるポリペプチドであればよい。また、そ
れが抗体の作製に使用しうる精製度のものであれば、該
ＮＥ−ｄｌｇが得られた方法は問わない。

【００７０】免疫抗原が、８ないし約２０個のアミノ酸
からなるポリペプチドである場合には、それをキーホー
ルリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等のキャリアと結
合させて抗原として使用すればよい。

【００７１】該免疫抗原を免疫する動物はヒト以外のい
ずれでもよく、通常当業者で使用される動物から目的の
抗体を産生し得る動物種を選択して使用することが好ま
しい。

【００７２】ポリクローナル抗体は、得られた抗血清を
精製することによって得られる。精製は、塩析、イオン
交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー等の方法を組み合わせて行えばよい。

【００７３】モノクローナル抗体は、通常のハイブリド
ーマを作製する方法によって融合細胞を得た後、該細胞
に抗体を産生させることにより得られる。細胞融合に
は、ポリエチレングリコール、センダイウィルス、電気
パルス等を用いる手法が使用可能である。

【００７４】また、上記以外に、遺伝子工学的な方法を
用いても該モノクローナル抗体が得られうる。例えば、
本発明のＮＥ−ｄｌｇ又はその一部で免疫した動物の脾
細胞、リンパ球又は該モノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマからｍＲＮＡを採取し、これをもとにｃＤ
ＮＡライブラリーを作製する。次に、該ｃＤＮＡライブ
ラリーにより抗体を発現させる。抗原と反応する抗体を
産生するクローンをスクリーニングによりｃＤＮＡライ
ブラリーから得、得られたクローンを培養し、培養混合
物から目的とする抗体を、塩析、イオン交換クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法
を組み合わせて精製することができる。

【００７５】本発明の抗体は、脳、膵臓、前立腺、甲状
腺などの神経内分泌組織の細胞に存在する本発明のＮＥ
−ｄｌｇ、ＮＥ−ｄｌｇ変異体又はそれらの一部の検出
に用いることができる。また、本発明のＮＥ−ｄｌｇ、
ＮＥ−ｄｌｇ変異体又はそれらの一部を精製するために
使用する抗体カラムの作製、各分画中の該ＮＥ−ｄｌ
ｇ、ＮＥ−ｄｌｇ変異体又はその一部の検出のために用
いることができる。

【００７６】

【実施例】以下に実施例を示して本発明をさらに詳述す
るが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。

【００７７】（実施例１）ＮＥ−ｄｌｇ分子の同定（１）データベース検索ショウジョウバエのｄｌｇ１分子をコードする遺伝子を
基に、インターネット上の遺伝子データベースにアクセ
スし、コンピュータを用いてホモロジー・サーチを行っ
た。具体的には、ＥＳＴ datebase（ＮＣＢＩのサイ
ト；[http://www.ncbi.nlm.nih.gov./index html]）を
用いてホモロジー解析を実施した（ＥＳＴ datebase と
は、ｍＲＮＡの断片を取得してその配列決定を行った結
果得られた配列をデータベースとして登録してあるもの
である）。その結果、ショウジョウバエｄｌｇ１と高い
相同性を有するヒトのＤＮＡ断片であるＥＳＴクローン
#R16282に以下の配列が登録されていることが判った。

【００７８】 5'- TGCCTCGTGATGATGAGTGGTNGCAGGCAAGGNTGGTGACCCCACACGGAGAAAGTGAGC AGATCGGTGTGAGCCCCAGTAAGAAGAGGGTGGAAAAGAAAGAAAGAGCTCGATTGAAAA CTGTGAAGTTCCATGCCAGGACGGGGATGATTGAGTCTAACAGGGACTTCCCGGGGTTAA GTGACGATTATTATGGAGCAAAGAACCTGAAAGGACAAGAGGATGCTATTTTGTCATATG AGCCAGTGACACGGCAAGAAATTCACTATGCAAGGCCTGTGATCATCCTGGGGCCCAATG AAGGACCGAGTCAATGATGACCTTGATCTTCCGAATTTCCACATTAAATTTTGGGTCCTN TGTTGCCACATANTACC -3' この配列を基に、新規ｄｌｇファミリー分子の取得を試
みた。

【００７９】（２）ブライマーの合成クローン#R16282の配列を含む遺伝子を取得するため、
以下のブライマーＰ１及びＰ２を合成した。即ち、ｐ１ブラィマー；５’−ＴＣＧＧＡＧＡＴＣＡＧＧＴＣ
ＡＴＣＡＴＴＧＡー３’ ｐ２プライマー；５’−ＴＧＡＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＧ
ＣＡＡＧＧＣＴＧＧＴ−３’ を設計し、ＤＮＡ合成機（ＡＢＩモデル 392）にて合成
した。合成したＤＮＡプライマーは蒸留水中に、20 pm
ol／μｌになるように溶解した。これをＰＣＲブライマ
ーとして用い、以下のＰＣＲ操作を行った。

【００８０】（３）ＰＣＲ操作ｃＤＮＡライブラリーとしては、ヒトの胎児脳のｃＤＮ
Ａライブラリー（クローンテック社製）を用いた。ＰＣ
Ｒ操作は、ｃＤＮＡ（１μｇ／μl）２μｌ、ｄＮＴＰ
混合液（各ＮＴＰが２０pmol／μlにて蒸留水中に溶解
されている）１μｌ、Ｐ１プライマー（20 pmol／μl）
１μｌ、Ｐ２プライマー（20 pmol／μl）１μｌ、１０
倍濃度のＰＣＲ緩衝液（100 mM Tris-HCl(pH 8.3)、500
mM KCl、25 mM MgCl₂、1 mg/ml BSA）１．５μｌ、蒸
留水８μｌ及びＴａｑポリメラーゼ（５ｕｎｉｔｓ／
μｌ）０．５μｌ（合計１５μｌ）の組成から成る液を
試験管に入れ、その上にミネラルオイル１５μｌを重層
し、９４℃で５分間放置した。その後、６０℃で３０秒
間、続いて７２℃で１．５分間、続いて９４℃で３０秒
間のサイクルを３５回繰り返して反応を行った。最後
に、７２℃で１０分間反応させて、断片の伸長反応を行
いＰＣＲ操作を完了した。

【００８１】上記の反応後、ＰＣＲ生成物についてミニ
ゲル電気泳動（１．５％アガロースゲル）を行なった。
約０．４ｋｂのバンドが観察された。このバンドがｄｌ
ｇをコードする遺伝子と考えられるので、そのバンドを
含むゲルを切り出した。これから、Gene clean II（登
録商標、BIO 101社製）を用いて、ＰＶＲ生成物を回収
した。該回収物の一部を用いて、上記ミニゲル電気泳動
を再度行ない、約０．４ｋｂの大きさのバンドが現われ
ることを確認した。

【００８２】（４）べクターへの組み込み操作（３）により得られたＤＮＡ断片を、ｐＣＲIIＴＡ
クローニングベクターキット（インビトロジェン社製）
を用いて、サブクローニングした。

【００８３】サブクローニングは、仕様書に従って、下
記の組成（滅菌蒸留水５μｌ、１０倍濃度のライゲー
ション緩衝液１μｌ、ｐＣＲIIベクター２μｌ、操作
（３）よりのＤＮＡフラグメント（ＰＣＲ増幅物）１μ
ｌ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ）にて、１４℃で一晩反応を
行い、ライゲーション混合物を得た。

【００８４】（５）形質転換ＴＡクローニング・キツトを用いて、以下の通りにして
形質転換を行なった。

【００８５】氷上にて、細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ）５０μ
ｌに、０．５Ｍの２−メルカブトエタノール２μｌ及
び操作（４）で調製したライゲーション混合物１０μｌ
を添加して３０分間放置した後、４２℃の湯浴中に３０
秒間次いで氷上に２０分間放置した。それに、４５０μ
ｌのＳＯＣ培地を加え、２２５ｒｐｍで振とうしなが
ら、３７℃で１時間インキユベートした。

【００８６】次いで、細胞を、ＬＢ寒天プレート（Ａ
ｍｐ、Ｘ−Ｇａｌ、ＩＰＴＧを含む）に拡散し、３７℃
で１８時間インキユベートした。その結果、白と青のコ
ロニーが出現した。白いコロニーが、目的のＤＮＡ断片
が組み込まれたｐＣＲIIベクターを有するＥ．ｃｏｌｉ
のコロニーである。

【００８７】（６）ミニ培養前記プレートから白いコロニーを４個選択し、それぞれ
のコロニーを、３ｍｌのＬＢ培地（Ａｍｐを含有する）
が入ったチューブにいれ、これをー晩３７℃で振盪培養
した。

【００８８】（７）プラスミドのミニ調製プラスミドのミニ調製は、Molecular Cloning A Labora
tory Manual 2nd Edition (Maniatis et al ) Cold Spr
ing Habor Laboratory Press, 1989年, 1.25頁に記載の
方法に従って行った。

【００８９】（８）ＤＮＡ配列決定前記（７）で調製したプラスミドの１μｌをとり、９９
μｌのＴＥ緩衝液に希釈した。希釈液の２６０ｎｍでの
吸収（Ａ₂₆₀）を測定し、ＤＮＡ濃度を計算した（２６
０ｎｍでの吸光度１．０が、５０μｇ／ｍｌのＤＮＡ濃
度として計算した）。ＤＮＡ濃度が１μｇ／ｍｌとなる
ようにＴＥ緩衝液でさらに希釈した。Ｄｙｅターミネー
ター法により、オートシーケンサ（ＡＢＩモデル３７３
Ａ）を用いて、ＤＮＡ配列決定を行った。その結果、塩
基配列表の配列番号２に記載の配列の1844〜2213の部分
に相当する配列が確認された。この結果、ＥＳＴ detab
aseに掲載されていた#R16282は、上記方法で取得した断
片の塩基配列といくつかの塩基において相違していた。
従って、以下の操作は、上記方法によりヒト胎児脳のｃ
ＤＮＡライブラリーより得られた断片の塩基配列に基づ
いて行った。

【００９０】（９）３’側の伸長反応得られたＤＮＡ断片の配列から、全長のｃＤＮＡを取得
するために、蛋白質の開始領域があると考えられる５’
側への伸長反応と蛋白質の終始コドンが含まれると考え
られる３’側への伸長反応を行なった。

【００９１】鋳型としては、前期と同じ胎児脳のｃＤＮ
Ａライブラリーを用いた。

【００９２】５’側伸長反応によるＤＮＡ断片の取得
（Ｉ）前記のＰ１プライマーを用いて、シングルＰＣＲ（一方
のプライマーのみで行なうＰＣＲ）を行なった。

【００９３】ＰＣＲ操作は、ｃＤＮＡ（１μｇ／μl）
２μｌ、ｄＮＴＰ混合液１μｌ、Ｐ１プライマー（20 p
mol／μl）１μｌ、１０倍濃度のＰＣＲ緩衝液１．５μ
ｌ、蒸留水９μｌ及びＴａｑポリメラーゼ０．５μｌ
（合計１５μｌ）の組成から成る液を試験管に入れ、そ
の上にミネラルオイル１５μｌを重層し、９４℃で５分
間放置した。その後、６０℃で３０秒間、続いて７２℃
で１．５分間、続いて９４℃で３０秒間のサイクルを５
０回繰り返して反応を行った。次いで５５℃で２分間、
最後に、７２℃で１０分間反応させて、断片の伸長反応
を行いＰＣＲ操作を完了した。

【００９４】次いでこのＰＣＲ産物を鋳型としてさらに
２度目のＰＣＲを以下の通りにして実施した。

【００９５】前記（８）で得た配列を基に、３’ブライ
マーとして、Ｐ３プライマー；５’−ＣＡＧＧＴＴＣＴ
ＴＴＧＣＴＣＣＡＴＡＡＴＡ−３’、５’プライマーと
して、Ｔ３プライマー；５’−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡ
ＣＴＡＡＡＧ−３’をＤＮＡ合成機により合成し、それ
ぞれ蒸留水中に、20 pmol／μｌになるように溶解し、
ＰＣＲプライマーとして用いた。

【００９６】ＰＣＲ操作は、前記の一回目のＰＣＲ産物
５μｌ、ｄＮＴＰ混合液１μｌ、Ｐ３プライマー（20 p
mol／μl）１μｌ、Ｔ３プライマー（20 pmol／μl）１
μｌ、１０倍濃度のＰＣＲ緩衝液２μｌ、蒸留水９．
５μｌ及びＴａｑポリメラーゼ０．５μｌ（合計２０μ
ｌ）の組成から成る液を試験管に入れ、その上にミネラ
ルオイル２０μｌを重層し、９４℃で５分間放置した。
その後、６０℃で３０秒間、続いて７２℃で１分間、続
いて９４℃で３０秒間のサイクルを４０回繰り返して反
応を行った。次いで、５５℃で２分間、最後に７２℃で
１０分間反応させて、断片の伸長反応を行いＰＣＲ操作
を完了した。

【００９７】３’側伸長反応によるＤＮＡ断片の取得前記のＰ２プライマーを用いて、シングルＰＣＲ（一方
のプライマーのみで行なうＰＣＲ）を行なった。

【００９８】ＰＣＲ操作は、ｃＤＮＡ（１μｇ／μl）
２μｌ、ｄＮＴＰ混合液１μｌ、Ｐ２プライマー（20 p
mol／μl）１μｌ、１０倍濃度のＰＣＲ緩衝液１．５μ
ｌ、蒸留水９μｌ及びＴａｑポリメラーゼ０．５μｌ
（合計１５μｌ）の組成から成る液を試験管に入れ、そ
の上にミネラルオイル１５μｌを重層し、９４℃で５分
間放置した。その後、６０℃で３０秒間、続いて７２℃
で１．５分間、続いて９４℃で３０秒間のサイクルを５
０回繰り返して反応を行った。次いで５５℃で２分間、
最後に、７２℃で１０分間反応させて、断片の伸長反応
を行いＰＣＲ操作を完了した。

【００９９】次いでこのＰＣＲ産物を鋳型としてさらに
２度目のＰＣＲを以下の通りにして実施した。

【０１００】前記（８）で得た配列を基に、５’プライ
マーとして、Ｐ４プライマー；５’−ＡＣＡＣＧＧＡＧ
ＡＡＡＧＴＧＡＧＣＡＧＡＴＣＧＧ−３’、５’プライ
マーとして、Ｔ７プライマー；５’−ＡＡＴＡＣＧＡＣ
ＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’をＤＮＡ合成機により合成
し、それぞれ蒸留水中に、20 pmol／μｌになるように
溶解し、ＰＣＲプライマーとして用いた。

【０１０１】ＰＣＲ操作は、前記の一回目のＰＣＲ産物
５μｌ、ｄＮＴＰ混合液１μｌ、Ｐ４プライマー（20 p
mol／μl）１μｌ、Ｔ７プライマー（20 pmol／μl）１
μｌ、１０倍濃度のＰＣＲ緩衝液２μｌ、蒸留水９．
５μｌ及びＴａｑポリメラーゼ０．５μｌ（合計２０μ
ｌ）の組成から成る液を試験管に入れ、その上にミネラ
ルオイル２０μｌを重層し、９４℃で５分間放置した。
その後、６０℃で３０秒間、続いて７２℃で１分間、続
いて９４℃で３０秒間のサイクルを４０回繰り返して反
応を行った。次いで、５５℃で２分間、最後に７２℃で
１０分間反応させて、断片の伸長反応を行いＰＣＲ操作
を完了した。

【０１０２】上記及びの操作により得られた、
５’側伸長反応によるＤＮＡ断片及び３’側伸長反応に
よるＤＮＡ断片のそれぞれについてダイレクトＤＮＡ配
列決定を行った。配列決定は、それぞれの得られたＤＮ
Ａ断片について、Ｔ３或いはＴ７プライマーを用いてＤ
ｙｅターミネーター法により、オートシーケンサ（ＡＢ
Ｉモデル３７３Ａ）を用いて、ＤＮＡ配列決定を行っ
た。その結果、３’側伸長反応によるＤＮＡ断片中に、
終始コドンが見つかった。５’側については、開始コド
ンを見いだすべく、さらに以下の如く伸長反応を行っ
た。

【０１０３】５’側伸長反応によるＤＮＡ断片の取得
（II）Ｔ３及びＰ３プライマーを用いたＰＣＲによる増幅反応
で得たＴ３−Ｐ３断片を基に、さらなる５’側伸長反応
を以下の通りにして行った。

【０１０４】Ｔ３−Ｐ３断片の配列情報を基に、３’側
プライマーとして、Ｐ５プライマー；５’−ＧＴＴＧＴ
ＣＴＣＣＴＧＧＧＡＴＧＴＧＣＴＧＧＴＴＧ−３’、及
びＰ６プライマーとして；５’−ＧＡＡＡＣＣＣＡＧＧ
ＣＣＴＴＴＧＧＧＣＣＣＴＴＴＧ−３’を設計し、ＤＮ
Ａ合成機により合成し、それぞれ蒸留水中に、20pmol／
μｌになるように溶解し、ＰＣＲプライマーとして用い
た。

【０１０５】前記のＰ５プライマーを用いて、シングル
ＰＣＲを行なった。

【０１０６】ＰＣＲ操作は、ｃＤＮＡ（１μｇ／μl）
２μｌ、ｄＮＴＰ混合液１μｌ、Ｐ５プライマー（20 p
mol／μl）１μｌ、１０倍濃度のＰＣＲ緩衝液１．５μ
ｌ、蒸留水９μｌ及びＴａｑポリメラーゼ０．５μｌ
（合計１５μｌ）の組成から成る液を試験管に入れ、そ
の上にミネラルオイル１５μｌを重層し、９４℃で５分
間放置した。その後、６０℃で３０秒間、続いて７２℃
で１．５分間、続いて９４℃で３０秒間のサイクルを５
０回繰り返して反応を行った。次いで５５℃で２分間、
最後に、７２℃で１０分間反応させて、断片の伸長反応
を行いＰＣＲ操作を完了した。

【０１０７】次いでこのＰＣＲ産物を鋳型としてさらに
２度目のＰＣＲを以下の通りにして実施した。ＰＣＲプ
ライマーとしては、前記のＰ６プライマー及びＴ３プラ
イマーを用いた。

【０１０８】ＰＣＲ操作は、前記の一回目のＰＣＲ産物
５μｌ、ｄＮＴＰ混合液１μｌ、Ｐ６プライマー（20 p
mol／μl）１μｌ、Ｔ３プライマー（20 pmol／μl）１
μｌ、１０倍濃度のＰＣＲ緩衝液２μｌ、蒸留水９．
５μｌ及びＴａｑポリメラーゼ０．５μｌ（合計２０μ
ｌ）の組成から成る液を試験管に入れ、その上にミネラ
ルオイル２０μｌを重層し、９４℃で５分間放置した。
その後、６０℃で３０秒間、続いて７２℃で１分間、続
いて９４℃で３０秒間のサイクルを４０回繰り返して反
応を行った。次いで、５５℃で２分間、最後に７２℃で
１０分間反応させて、断片の伸長反応を行いＰＣＲ操作
を完了した。

【０１０９】上記の操作により得られた、５’側伸
長反応によるＤＮＡ断片についてダイレクトＤＮＡ配列
決定を行った。配列決定は、得られたＤＮＡ断片につい
て、Ｔ３プライマーを用いてＤｙｅターミネーター法に
より、オートシーケンサ（ＡＢＩモデル３７３Ａ）を用
いて、ＤＮＡ配列決定を行った。その結果、５’側伸長
反応によるＤＮＡ断片中に、開始コドンが見つかった。

【０１１０】各ＤＮＡ断片の整列上記〜の操作により得られた４つのＤＮＡ断片か
ら、一つの遺伝子が見つかった。各ＤＮＡ断片の位置関
係を図１に示す。この遺伝子は新規な遺伝子であった。
次に、この４つの断片より、以下に述べる方法により１
つのｃＤＮＡを作成した。

【０１１１】（１０）全長ｃＤＮＡの作成上記（９）の操作により得られた４つの断片の配列情報
を基に翻訳開始部（ＡＴＧ）にセンスプライマー；５’
−ＣＣＧＣＧＴＣＴＡＧＡＡＧＴＧＣＣＡＴＧＣＡＣＡ
ＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＴＧＣＴＧ−３’を、また、翻
訳停止部にアンチセンスプライマ一；５’−ＡＴＧＧＴ
ＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＣＣＴＴＣＡＧＡＧＴＴＴＴＴＣ
ＡＧＧＧＧＡＴＧＧＧＡＣ−３’を設計し、ＤＮＡ合成
機を用いて合成し、それぞれ蒸留水中に、20 pmol／μ
ｌになるように溶解し、ＰＣＲプライマーとして用い
た。

【０１１２】これらのプライマーを用い、ヒト胎児脳の
ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、以下の通りにし
て、再度ＰＣＲを行ない全長コード領域を得た。

【０１１３】ＰＣＲ操作は、ｃＤＮＡ（１μｇ／μl）
５μｌ、ｄＮＴＰ混合液１μｌ、センスプライマー（20
pmol／μl）１μｌ、アンチセンスプライマー（20 pmo
l／μl）１μｌ、１０倍濃度のＰＣＲ緩衝液２μｌ、蒸
留水９．５μｌ及びＴａｑポリメラーゼ０．５μｌ
（合計２０μｌ）の組成から成る液を試験管に入れ、そ
の上にミネラルオイル２０μｌを重層し、９４℃で５分
間放置した。その後、６０℃で３０秒間、続いて７２℃
で１分間、続いて９４℃で３０秒間のサイクルを４０回
繰り返して反応を行った。次いで、５５℃で２分間、最
後に７２℃で１０分間反応させて、断片の伸長反応を行
いＰＣＲ操作を完了した。

【０１１４】上記の如くして得た全長ＤＮＡを、蛍光ダ
イターミネーター法によりＤＮＡシーケンサー（モデル
３７３Ａ、ＡＢＩ）を用いて配列決定し、目的の遺伝子
の全長が取得したことを確認した。この遺伝子をＮＥ−
ｄｌｇと命名した。この遺伝子の塩基配列を、配列表の
配列番号２に示したさらに、ＮＥ−ｄｌｇ遺伝子をＰ
ＣＲ^TM３ベクター（インビトロジェン社製）に組み込
み、Ｅ．ｃｏｌｉに導入し、形質転換を行った。この形
質転換体は、平成８年８月９日に、工業技術院生命工学
工業技術研究所に寄託した（受託番号ＦＥＲＭＰ−
１５７８４）。

【０１１５】（実施例２）ノーザンブロットによるＮＥ
−ｄｌｇ分子の各組織での発現の検討得られたＮＥ−ｄ
ｌｇ分子が発現している組織を下記のようにして調べ
た。

【０１１６】ヒトの各組織のｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ
（ｍＲＮＡ）及びヒトの各種細胞株のｐｏｌｙ（Ａ）＋
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）２μｇをメンブレンにブロットした
キツト（Human Multiple Tissue Northern Blot I, II
及び Humen Cancer Cell Line Multiple Tissue Northe
rn Blot）をクローンテック社より購入した。ＮＥ−ｄ
ｌｇ遺伝子の一部である１．４ｋｂのｃＤＮＡ（配列表
の配列番号２の配列の１２８４〜２６８７の部分）を以
下の通りにして、このメンブレンにハイブリダイズさせ
た。まず、ＮＥ−ｄｌｇの１．４ｋｂのｃＤＮＡの断片
を、ランダムプライムド・ラベリングキット（ＴＡＫＡ
ＲＡ社製）を用いて、³²Ｐ−ＣＴＰで標識した。次い
で、標識したｃＤＮＡを、ハイストリンジェンシーの条
件下で、Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd
Edition, p.7.39〜7.52の記載に従って、メンブレンに
ハイブリダイズさせた。

【０１１７】各組織についての結果の写真を、図３Ａ及
びＢに示す。写真より、ＮＥ−ｄｌｇが、脳の他、膵
臓、前立腺、甲状腺、気管においても発現していること
が判った。さらに、脳においては、６．７ｋｂと５．５
ｋｂの２種類のタイプのｍＲＮＡが発現していることが
判った。また、前記の他の組織においても、５．５ｋｂ
と４．０ｋｂの２種類のタイプのｍＲＮＡが発現してい
ることが確認された。一方、先に報告されているヒトｄ
ｌｇ１のｍＲＮＡは、５．５ｋｂのみが報告されてい
る。

【０１１８】各種細胞についての結果の写真を図４に示
す。写真より、Ｓ３、ＭＯＬＴ−４、ＳＷ４８０におい
てＮＥ−ｄｌｇの発現が確認された。Ｓ３、ＭＯＬＴ−
４及びＳＷ４８０は、それぞれヒトの細胞で、Ｈｅｌａ
Ｓ３（ヒト子宮けいガン）、ヒトＴ細胞株ＭＯＬＴ−
４、及びヒトアデノカルシノーマＳＷ４８０（大腸ガン
由来）である。

【０１１９】以上のことより、ＮＥ−ｄｌｇは、脳、膵
臓、前立腺、甲状腺、気管で発現しており、ヒトｄｌｇ
とはその分布が異なっている。このことより、ＮＥ−ｄ
ｌｇ分子が神経内分泌に特異的な分子であることを示し
ている。

【０１２０】さらに、以下に述べる方法で、ＮＥ−ｄｌ
ｇ分子が選択的にスプライシングされ、２種類のｍＲＮ
Ａを生じることを確認した。

【０１２１】ＮＥ−ｄｌｇの発現が見られた各種腫瘍細
胞株（Ｓ３、ＭＯＬＴ−４及びＳＷ４８０）からファル
マシア社製のQuick prep（商標）mRNA Purification ki
tを用いてｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法に付し
た。ＲＴーＰＣＲ法は、新細胞工学実験プロトコール、
秀潤社、第１７５〜１７６頁（1993年）の記載に従って
行った。その結果、ＳＨ３ドメイン（配列表の配列番号
２の塩基配列の１７４０番目のＴから１９３７番目のＡ
まで）とＧＵＫドメイン（配列表の配列番号２の塩基配
列の２１１５番目のＡから２６４２番目のＣまで）の間
に、アルタネーティブスプライシングが存在することを
確認した。即ち、ＮＥ−ｄｌｇ遺伝子配列の２００７番
目からの配列に２つのタイプが存在することが確認され
た。一つ目のフォームは、オリジナルフォームでありＦ
フォームと命名した。この塩基配列を、配列表の配列番
号２に示す。２つ目のフォームは、スプライシングフォ
ームであり、その塩基配列を配列表の配列番号４に示
す。それぞれの遺伝子がコードするアミノ酸配列を、そ
れぞれ、配列表の配列番号１、３に示す。また、配列表
１のＮＥ−ｄｇｌのアミノ酸配列とｈｄｌｇ１及びｈｄ
ｌｇ２分子のアミノ酸配列の相同性を検討した。結果
を、図２に示す。線枠で囲ってあるところは、３種のｄ
ｌｇ間で相同の配列を示すところである。これにより、
ＮＥ−ｄｌｇの１〜１０、１７〜２６、４２〜７０及び
５８６〜６０２のアミノ酸配列が、ｈｄｌｇ１及びｈｄ
ｌｇ２と大きく異なることが判る。

【０１２２】（実施例３）染色体マッピング得られたＮＥ−ｄｌｇ遺伝子の染色体上の位置の同定
を、somatic cell hybridを用いたＰＣＲマッピングの
手法とＦＩＳＨ（ FIuoresence in situ hybridizatio
n）を組み合わせた手法を用いて行った。

【０１２３】ＰＣＲマッピングＰＣＲは、MONOCHROMOSOMAL SOMATIC CELL HYBRID DNA
PANEL（ UK HGMP RESORCE CENTER ）とGENEBRIDGE 4 Ra
diation Hybrid Screening Panel（ ResearchGenetics,
Inc.）を鋳型にして、Ｓ−１（５’−ＴＧＡＧ
ＴＧＧＴＧＧＣＡＧＧＣＡＡＧＧＣＴＧＧＴ−３’）と
ＡＳ−１（５’−ＴＧＧＡＡＴＣＡＧＡＡＡＧＡＡＧＴ
ＣＣＴＧＴＴＡ−３’)をプライマーとして行った。Ｓ
−１プライマー及びＡＳ−１プライマーは、ＤＮＡ合成
機により合成し、それぞれ蒸留水中に、20 pmol／μｌ
になるように溶解し、ＰＣＲプライマーとして用いた。

【０１２４】ＰＣＲ操作は、キットのｐａｎｅｌ１μ
ｌ、ｄＮＴＰ混合液１μｌ、Ｓ−１プライマー１μ
ｌ、ＡＳ−１プライマー１μｌ、１０倍濃度のＰＣＲ
緩衝液１．５μｌ、蒸留水９μｌ及びＴａｑポリメラ
ーゼ０．５μｌ（合計１５μｌ）の組成から成る液を試
験管に入れ、その上にミネラルオイル１５μｌを重層
し、９４℃で５分間放置した。その後、６０℃で３０秒
間、続いて７２℃で３０秒間、続いて９５℃で３０秒間
のサイクルを３５回繰り返して反応を行った。次いで、
６０℃で２分間、最後に７２℃で１０分間反応させて、
断片の伸長反応を行いＰＣＲ操作を完了した。

【０１２５】その後、ＰＣＲ産物の５μｌを、２．０％
アガロースゲル電気泳動した。その結果を、インターネ
ット上の、Whitehead Institute/MIT Center(http://ww
w-genome.wi.mit.edu/）でマッピングした。その結果、
ＮＥ−ｄｌｇは染色体Ｘ上のＤＸＳ９８３から２．６３
ｃＲの位置に存在することが明らかとなった。

【０１２６】ＦＩＳＨ実施例１により取得したヒトＮＥ−ｄｌｇ遺伝子の２１
７番目〜１９９１番目に相当する１．７ｋｂのＤＮＡ断
片を用いてＦＩＳＨを行なった。この断片をビオチン化
したものをプローブとして、ヒトの膵臓のＤＮＡとサケ
の精子ＤＮＡとともにエタノール沈殿させた。その後、
エタノール沈殿物をハイブリダイゼーション液（５０％
ホルムアミド、２×ＳＳＣ（０．３ＭＮａＣｌ、
０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、１０％
デキストラン硫酸）に再懸濁させた。この液を、ＰＨＡ
（Phytohemagglutinin）で刺激した末梢血リンパ球をチ
ミジンにより同調しそしてプロモデオキシウリジン処理
したクロモゾーム・スライドに反応させ、１回目のハイ
ブリダイゼーションを行った。その後、Kuwano らの論
文（ Am J Hum Genet 49巻、4号、707頁〜714頁、1991
年）に記載の方法に従い、２回目のハイブリダイゼーシ
ョンを行なった。簡単に書けば、スライドを、２×ＳＳ
Ｃに溶かしたＨｏｅｃｈｓｔ33258（ドイツ、ヘキスト
社）で染色し、７５℃で黒色ランプで露光し、さらに変
性後、３７℃で３０分間 in situ ハイブリダイゼーシ
ョンを行なった。その後、ＦＩＴＣ−アビジン液を用い
てビオチン化ブローブと反応後、０．７μｇ／ｍｌのブ
ロピディウム・イオダイドを用いて染色し、ニコンのOp
tiphoto-2（ニコン社製）とニコンフイルターＢ−２Ａ
（４５０〜４９０ｎｍで励起）を組み合わせて解析し
た。これを、コダックの Ektachrome ASA 100フィルム
を用いて写真を撮った。解析後、ＮＥ−ｄｌｇは染色体
のＸｑ１３上に位置することが確認された。

【０１２７】（実施例４）ＮＥ−ｄｌｇに対する抗体の
作製抗原の調製ＮＥ−ｄｌｇ分子のー部の配列であり、かつオリジナル
フォームとスプライシングフォームのそれぞれに特異的
な箇所である下記の２つのべプチドをペプチド合成機で
合成した。

【０１２８】配列１：ＮＥ−ｄｌｇ分子のオリジナルフ
オームに特異的な配列（５８５位〜６０３位まで配
列）、Gly Met lle Glu Ser Asn Arg Asp Phe Pro Gly
Leu Ser Asp Asp Tyr Tyr Gly Ala （１文字表記：ＧＭ
ＩＥＳＮＲＤＦＰＧＬＳＤＤＹＹＧＡ）（配列表の配列
番号５）のＮ末端にCys（Ｃ）を付けた２０ｍｅｒのペ
プチド配列２：ＮＥ−ｄｌｇ分子のスプライシングフォームに
特異的な配列（５９２位〜６１１位の配列）、Ser Ile
Lys Thr Lys Arg Lys Lys Ser Phe Arg Leu SerArg Lys
Phe Pro Phe Tyr Lys（１文字表記：ＳＩＫＴＫＲＫＫ
ＳＦＲＬＳＲＫＦＰＦＹＫ）（配列表の配列番号６）の
Ｎ末端にCys（Ｃ）を付けた２１ｍｅｒのペプチドポリクローナル抗体の作製で合成したペプチドについて、それぞれ独立に以下の
手順で抗体を作製した。

【０１２９】i)合成したペプチド２ｍｇをマレイミド化
ＫＬＨ（スカシ貝のへモシアニン）（ピアス社製）２ｍ
ｇに結合させた。反応はピアス社のキットに記載の方法
に従って行なった。

【０１３０】ii)このペプチド−ＫＬＨの１００μｇを
１回の免疫で使用した。すなわち、ペプチド−ＫＬＨ液
（１μｇ／ｍｌ）１００μｌにＰＢＳ０．５ｍｌとフロ
イント・コンブリート・アジュバント（ディフコ社製）
０．５ｍｌをシリンジにとり混合して工マルジヨンと
し、これを初回免疫に用いた。

【０１３１】iii)このエマルジョンをウサギに皮下接種
した。接種はウサギの背に４カ所に分けて接種した。

【０１３２】iV)１週間後、２回目の免疫を行なった。
２回目からはアジュバントをフロイント・インコンプリ
ート・アジュバント（ディフコ社製）に変えて免疫を行
なった。その他の操作は１回目同様である。２回目以降
は１週間間隔をあけて、合計６回免疫を行なった。

【０１３３】v)最終免疫の１週間後、採血して血清を取
得した。血清は採血した血液を室温で３時間放置し十分
に血液凝固を行なった後、３，０００ｒｐｍ、５分間遠
心分離を行い、上清（血清）を回収した。

【０１３４】vi)この血清に１００％の飽和硫安を最終
濃度が５０％飽和になるように加え塩析した。このサン
プルを遠心分離して、抗体が含まれる画分を沈殿させ
た。その後、沈殿物をＰＢＳに溶解し、さらにＰＢＳに
対して透析した。その後、Protein Gセファロース・カ
ラム（ファルマシア社製）を用いて、抗体をアフィニテ
ィー精製した。その結果、全量で３７０ｍｇのＩｇＧ画
分を得た。

【０１３５】vii)上記の操作で得たＩｇＧ画分をさら
に、免疫に使用したＮＥ−ｄｌｇペブチドを用いてアフ
ィニティー精製した。ＮＥ−ｄｌｇペプチドカラムは、
ペプチドをＮＨＳ−活性化セファロース（ファルマシア
社製）に、添付のマニュアルに従い結合させて作製し
た。この力ラムを用い、vi)で得た精製されたＩｇＧ画
分をさらにアフィニティー精製した。その結果、全量で
５ｍｇのペプチド特異的抗体が得られた。

【０１３６】抗体の力価測定（ＥＬＩＳＡ）で得られたペプチド特異的抗体の力価をＥＬＩＳＡに
て測定した。

【０１３７】なお、配列１のペプチドに対する抗体は、
上記ののi)〜vii)までの操作を行い、ペプチドカラム
を用いて精製した。一方、配列２のペプチドに対する抗
体は、上記ののi)〜v)までの操作を行い、抗血清とし
て得た。

【０１３８】i)抗原液（配列１のべブチド及び配列２の
べブチド）をそれぞれ２５μｇ／ｍｌの濃度となるよう
にＰＢＳに溶解して、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート
（ Xenobind、キセノポア社製）各ウェルに５０μｌず
つ分注し、４℃で一晩放置した。

【０１３９】ii)抗原液を捨て、蒸留水で４倍に希釈し
たブロックエース（大日本製薬社製）を各ウェルに２０
０μｌずつ分注し、室温で２時間放置することによりブ
ロッキングを行なった。

【０１４０】iii)ブロッキング液を捨て、１次抗体とし
て検討すべき精製した抗体を添加した。精製抗体は９６
ウェルの１列目から順に１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍ
ｌ、２．５μｇ／ｍｌ・・・・の濃度となるように、Ｐ
ＢＳで倍々希釈した液を各ウェルに加えた。最終ウェル
中の抗体の濃度は約０．００４μｇ／ｍｌとなった。な
お、コントロールとして、免役していないウサギの血液
から精製したＩｇＧを用いた。各ウェルに分注後、室温
で１時間放置した。

【０１４１】一次抗体を含む液として、ウサギより採取
した血清を用いる場合は、最初のウェルにＰＢＳを用い
て４０倍に希釈した液を入れ、順にＰＢＳを用いて倍々
希釈した液を入れた。

【０１４２】iV)抗体液を捨て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ
２０／ＰＢＳでプレートを４回洗浄し、次いで２次抗体
液としてＰＢＳで1000倍希釈したビオチン化抗ウサギＩ
ｇＧ抗体（ベクター社製）を各ウェルに５０μｌずつ分
注し、室温で１時間放置した。

【０１４３】v)２次抗体液を捨てた後、０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ２０／ＰＢＳでプレートを４回洗浄し、１０００
倍に希釈したＡＢＣ溶液（ベクター社製）を各ウェルに
５０μｌずつ分注した。その後室温で、３０分間放置し
た。

【０１４４】vi)次いで、ＡＢＣ液を捨てた後、０．０
５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳでプレートを４回洗浄し、
ＯＰＤ（オルトフェニレンジアミン）−Ｈ２０２／ＰＣ
Ｂを各ウェルに１００μｌずつ分注した。十分に発色
後、２Ｎの硫酸で反応を止めた後、４９０ｎｍでの吸光
度をマイクロ・ブレートリーダー（ Bio-rad社製）にて
測定した。

【０１４５】この結果を図５及び６に示す。図５が配列
１のペプチドに対するポリクローナル抗体のＥＬＩＳＡ
の結果で、図６が配列２のペプチドに対するポリクロー
ナルのＥＬＩＳＡの結果である。図中、横軸は加えた抗
体の濃度又は血清の希釈倍数を表しており、縦軸は４９
０ｎｍにおける吸光度を表わしている。いずれの図にお
いても、免疫したウサギ由来の抗体価はコントロールに
比べて高く、それぞれの配列のペプチドに対するポリク
ローナル抗体が取得できた。

【０１４６】（実施例５）ウェスタンブロット実施例４で得られたＮＥ−ｄｌｇ抗体を用いてウェスタ
ンブロットを行った。以下にプロトコルを示す。

【０１４７】ＶＡ−１３細胞（ＮＥ−ｄｌｇ遺伝子を
導入したＡＴＣＣＣＣＬ７５−１細胞）、その親株の
細胞（ＮＥ−ｄｌｇ遺伝子がない細胞：Ｍｏｃｋと表記
する）及びヒトの脳組織を用意した。細胞は１×１０⁶
個の細胞を、組織は２ｍｍ角の組織を用い、以下のよう
にして細胞又は組織を溶解してその上清を回収した。

【０１４８】細胞溶解液の組成は、50 mM Tris-HCl, 15
0 mM NaCl, 1% Triton X-100, 50 mM ヨードアセトアミ
ド, 2 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂,0.1% NaN₃, 10μg/ml 大
豆トリプシン・インヒビター, 1 μg/ml アプロチニン,
1 mM PMSF（フェニル・メチル・スルホニル・フロライ
ド）,1 μg/ml ロイペプチンである。この細胞溶解液１
００μｌを、細胞のペレット及び組織片のそれぞれに加
えよく撹拌して溶解した。氷上に６０分間放置した後、
15,000 rpm、１０分間遠心分離し、上清液を回収した。

【０１４９】回収した上清液に、免疫していないウサ
ギのＩｇＧ１ｍｇを結合させたＣＮＢｒ活性化セファ
ロース・ビーズ（ファルマシア社製）（抗体濃度１ｍｇ
／１ｍｌ樹脂）５０μｌを添加した。４℃で一晩反応
後、遠心分離を行ない、ビーズに結合する非特異的結合
蛋白質を除去し、上清を回収した。

【０１５０】で得られた上清１０μｌを、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ用サンプルバッファー及び１μｌの２−メルカ
ブトエタノールと混和し、９５℃で熱処理を５分間行な
った後、５−２０％のグラディエント・ゲルで電気泳動
した。

【０１５１】電気泳動後、トランスブロットシステム
(マリソル製)を用い、泳動された蛋白質をニトロセルロ
ース膜に転写した。

【０１５２】ニトロセルロース膜をブロックエース
（大日本製薬製）に浸し、１時間放置してブロッキング
した。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで５
分間×２回洗浄した。

【０１５３】実施例４で調製した配列１に対する抗Ｎ
Ｅ−ｄｌｇ抗体を１μｇ／ｍｌになるようにＰＢＳで希
釈したものを、メンブレンに加え室温で２時間反応させ
た。その後、メンブレンを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／
ＰＢＳで５分間×３回洗浄した。

【０１５４】ベルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ溶
液（カルタグ社製）をＰＢＳで１００倍に希釈した液
を、上記メンブレンに加え、さらに１時間室温にて反応
させた。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで
５分間×３回洗浄した。

【０１５５】ＥＣｌキット（アマシャム社製）の発色
液５ｍｌをメンブレンに加えて１分間反応させた。そ
の後、このメンブレンをＸ線フィルムに２０秒間露光し
て現像した後、写真撮影した。その結果を図７に示す。
図７では、ＶＡ−１３細胞と脳組織に約１２０ｋｄの位
置にＮＥ−ｄｌｇ分子のバンドが確認された。この分子
量は、ＮＥ−ｄｌｇのアミノ酸配列から予想される分子
量とほぼ一致する。脳組織において、低分子のバンドが
見えるがこのバンドまＮＥ−ｄｌｇ分子がプロテアーゼ
により一部分解したためだと考えられる。

【０１５６】（実施例６）組織染色実施例４で得られた抗体を用いてＮＥ−ｄｌｇが発現し
ている組織を、免疫組織染色により検討した。材料は、
ヒトの膵臓の組織とヒトの脳の組織を用いて、以下の通
りにいて行った。

【０１５７】ヒトの膵臓の組織及び脳の組織をコンパ
ウンドに入れ凍結ブロックを作製した。そのブロックに
ついて、クライオスタットで凍結切片にし、その切片を
スライドグラスにのせた。

【０１５８】それぞれの凍結切片組織を、４％バラホ
ルムアルデヒドで３分間処理した後、−２０℃で冷却し
たアセトンで１分間処理を行ない固定した。その後、ス
ライドを５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で
洗浄した（５分間×３回）。

【０１５９】ブロックエース（大日本製薬社製）をス
ライドグラス上の組織の上にのせ、室温で１時間放置し
てブロッキングを行なった。その後、スライドを５０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で洗浄した（５分
間×３回）。

【０１６０】実施例４で調製した配列１に対する抗Ｎ
Ｅ−ｄｌｇ抗体を１μｇ／ｍｌになるようにＰＢＳで希
釈したものを、スライド上の組織に加え、室温で１時間
反応させた。その後、スライドを５０ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で洗浄した（５分間×３回）。

【０１６１】ＰＢＳで１０００倍に希釈したベルオキ
シダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体液（カルタグ社製）を
スライド上の組織に加え室温で１時間反応させた。その
後、スライドを５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）で洗浄した（５分間×３回）。

【０１６２】ＤＡＢ（ジアミノベンジジン）２０ｍｇ
と３０％Ｈ₂Ｏ₂が入った５０ｍｌの５０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）液に上記スライドグラスを浸
し、室温にて１０分間反応させた。その後、蒸留水中に
スライドグラスを移して反応を止めた。このスライドグ
ラスの結果の写真を図８〜１１に示す。ヒトの膵臓組織
についての結果が図９〜１１であり、ヒトの脳組織につ
いての結果が図８である。

【０１６３】図８から判るように、脳の組織において
は、ＮＥ−ｄｌｇは、神経細胞が神経突起を伸ばしてい
るところに沿って発現していることが確認された。

【０１６４】また、図９〜１１から判るように、膵臓の
組織においては、ランゲルハンス細胞の血管と接触して
おりかつインシュリンを産生している細胞にそってＮＥ
−ｄｌｇの発現が確認された。の抗ＮＥ−ｄｌｇ抗体
の代わりに抗インシュリン抗体を添加したところ、イン
シュリン産生細胞のー部の細胞においてＮＥ−ｄｌｇが
発現しているのがよく解る。

【０１６５】以上のことから考察すると、ＮＥ−ｄｌｇ
は細胞内から分泌する蛋白、たとえばインシュリンが細
胞内を移送されるとき、または細胞の局所で必要な蛋白
をその必要な局所へ移送するときに、その移送を司る蛋
白質としてー過的に発現するのではないかと考えられ
る。

【０１６６】また、脳についても、神経細胞が神経突起
を伸ばしているときにその突起の先端部分を中心に発現
が見られることから、ニューロトランスミツター（アセ
チルコリン、ドーパミン、ノルアドレナリン等の神経伝
達物質）の輸送に関与しているのではないかと考えられ
る。

【０１６７】上記の如く、本発明者らは、新規なＮＥ−
ｄｌｇ及び該蛋白質をコードするＤＮＡを見いだし、さ
らには、ＮＥ−ｄｌｇが、脳組織では神経細胞において
神経突起に沿って発現しており、また膵臓組織ではラン
ゲルハンス島細胞において発現されていることを見いだ
した。このことは、ＮＥ−ｄｌｇが神経内分泌系組織に
特異的な分子であるということを示唆するものである。

【０１６８】本発明のＮＥ−ｄｌｇは、細胞内蛋白とし
てのｄｌｇファミリー分子の機能解明、細胞内の蛋白移
送のメカニズムの解明に有用であると考えられる。

【０１６９】さらには、ショウジョウバエのｄｌｇが細
胞の過増殖を抑える分子であることより、本発明のＮＥ
−ｄｌｇは、神経系での発ガンのメカニズムの解明にも
有用であろうと考えられる。

【０１７０】また、本発明のＮＥ−ｄｌｇは、インシュ
リンの分泌に深く関わっていると考えられるので、糖尿
病の発症機序、糖尿病の遺伝治療等への利用も期待され
る。

【０１７１】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：８１７配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met His Lys His Gln His Cys Cys Lys Cys Pro Glu Cys Tyr Glu Val 1 5 10 15 Thr Arg Leu Ala Ala Leu Arg Arg Leu Glu Pro Pro Gly Tyr Gly Asp 20 25 30 Trp Gln Val Pro Asp Pro Tyr Gly Pro Gly Gly Gly Asn Gly Ala Ser 35 40 45 Ala Gly Tyr Gly Gly Tyr Ser Ser Gln Thr Leu Pro Ser Gln Ala Gly 50 55 60 Ala Thr Pro Thr Pro Arg Thr Lys Ala Lys Leu Ile Pro Thr Gly Arg 65 70 75 80 Asp Val Gly Pro Val Pro Leu Lys Pro Val Pro Gly Lys Ser Thr Pro 85 90 95 Lys Leu Asn Gly Ser Gly Pro Ser Trp Trp Pro Glu Cys Thr Cys Thr 100 105 110 Asn Arg Asp Trp Tyr Glu Gln Val Asn Gly Ser Asp Gly Met Phe Lys 115 120 125 Tyr Glu Glu Ile Val Leu Glu Arg Gly Asn Ser Gly Leu Gly Phe Ser 130 135 140 Ile Ala Gly Gly Ile Asp Asn Pro His Val Pro Asp Asp Pro Gly Ile 145 150 155 160 Phe Ile Thr Lys Ile Ile Pro Gly Gly Ala Ala Ala Met Asp Gly Arg 165 170 175 Leu Gly Val Asn Asp Cys Val Leu Arg Val Asn Glu Val Glu Val Ser 180 185 190 Glu Val Val His Ser Arg Ala Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Gly Pro 195 200 205 Val Val Arg Leu Val Val Arg Arg Arg Gln Pro Pro Pro Glu Thr Ile 210 215 220 Met Glu Val Asn Leu Leu Lys Gly Pro Lys Gly Leu Gly Phe Ser Ile 225 230 235 240 Ala Gly Gly Ile Gly Asn Gln His Ile Pro Gly Asp Asn Ser Ile Tyr 245 250 255 Ile Thr Lys Ile Ile Glu Gly Gly Ala Ala Gln Lys Asp Gly Arg Leu 260 265 270 Gln Ile Gly Asp Arg Leu Leu Ala Val Asn Asn Thr Asn Leu Gln Asp 275 280 285 Val Arg His Glu Glu Ala Val Ala Ser Leu Lys Asn Thr Ser Asp Met 290 295 300 Val Tyr Leu Lys Val Ala Lys Pro Gly Ser Leu His Leu Asn Asp Met 305 310 315 320 Tyr Ala Pro Pro Asp Tyr Ala Ser Thr Phe Thr Ala Leu Ala Asp Asn 325 330 335 His Ile Ser His Asn Ser Ser Leu Gly Tyr Leu Gly Ala Val Glu Ser 340 345 350 Lys Val Ser Tyr Pro Ala Pro Pro Gln Val Pro Pro Thr Arg Tyr Ser 355 360 365 Pro Ile Pro Arg His Met Leu Ala Glu Glu Asp Phe Thr Arg Glu Pro 370 375 380 Arg Lys Ile Ile Leu His Lys Gly Ser Thr Gly Leu Gly Phe Asn Ile 385 390 395 400 Val Gly Gly Glu Asp Gly Glu Gly Ile Phe Val Ser Phe Ile Leu Ala 405 410 415 Gly Gly Pro Ala Asp Leu Ser Gly Glu Leu Arg Arg Gly Asp Arg Ile 420 425 430 Leu Ser Val Asn Gly Val Asn Leu Arg Asn Ala Thr His Glu Gln Ala 435 440 445 Ala Ala Ala Leu Lys Arg Ala Gly Gln Ser Val Thr Ile Val Ala Gln 450 455 460 Tyr Arg Pro Glu Glu Tyr Ser Arg Phe Glu Ser Lys Ile His Asp Leu 465 470 475 480 Arg Glu Gln Met Met Asn Ser Ser Met Ser Ser Gly Ser Gly Ser Leu 485 490 495 Arg Thr Ser Glu Lys Arg Ser Leu Tyr Val Arg Ala Leu Phe Asp Tyr 500 505 510 Asp Arg Thr Arg Asp Ser Cys Leu Pro Ser Gln Gly Leu Ser Phe Ser 515 520 525 Tyr Gly Asp Ile Leu His Val Ile Asn Ala Ser Asp Asp Glu Trp Trp 530 535 540 Gln Ala Arg Leu Val Thr Pro His Gly Glu Ser Glu Gln Ile Gly Val 545 550 555 560 Ile Pro Ser Lys Lys Arg Val Glu Lys Lys Glu Arg Ala Arg Leu Lys 565 570 575 Thr Val Lys Phe His Ala Arg Thr Gly Met Ile Glu Ser Asn Arg Asp 580 585 590 Phe Pro Gly Leu Ser Asp Asp Tyr Tyr Gly Ala Lys Asn Leu Lys Gly 595 600 605 Gln Glu Asp Ala Ile Leu Ser Tyr Glu Pro Val Thr Arg Gln Glu Ile 610 615 620 His Tyr Ala Arg Pro Val Ile Ile Leu Gly Pro Met Lys Asp Arg Val 625 630 635 640 Asn Asp Asp Leu Ile Ser Glu Phe Pro His Lys Phe Gly Ser Cys Val 645 650 655 Pro His Thr Thr Arg Pro Arg Arg Asp Asn Glu Val Asp Gly Gln Asp 660 665 670 Tyr His Phe Val Val Ser Arg Glu Gln Met Glu Lys Asp Ile Gln Asp 675 680 685 Asn Lys Phe Ile Glu Ala Gly Gln Phe Asn Asp Asn Leu Tyr Gly Thr 690 695 700 Ser Ile Gln Ser Val Arg Ala Val Ala Glu Arg Gly Lys His Cys Ile 705 710 715 720 Leu Asp Val Ser Gly Asn Ala Ile Lys Arg Leu Gln Gln Ala Gln Leu 725 730 735 Tyr Pro Ile Ala Ile Phe Ile Lys Pro Lys Ser Ile Glu Ala Leu Met 740 745 750 Glu Met Asn Arg Arg Gln Thr Tyr Glu Gln Ala Asn Lys Ile Tyr Asp 755 760 765 Lys Ala Met Lys Leu Glu Gln Glu Phe Gly Glu Tyr Phe Thr Ala Ile 770 775 780 Val Gln Gly Asp Ser Leu Glu Glu Ile Tyr Asn Lys Ile Lys Gln Ile 785 790 795 800 Ile Glu Asp Gln Ser Gly His Tyr Ile Trp Val Pro Ser Pro Glu Lys 805 810 815 Leu 配列番号：２配列の長さ：３１００配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列 TGCTGGAGGG GGAGCCGTGG GTGCGGGGCA CCGTGGGGGC CGAGGCCCCG GGACGCCCGC 60 CCGGCCCCAG GCCCCGCTCA GCCCGGGCGC CCCCACGGGT GCCCCCCCCT TCTTGGTCCG 120 AGCAGTGTGA GTGTGCCAGG GAGCCCGGCG GCGGCGGCGG CGGTGGTGGC GGCGGTGGCG 180 GCGGCGTGGA ATCCGGCGTG GGCTGGGGGG TCCGAGCCGC GGGGGGCAGT GCC 233 ATG CAC AAG CAC CAG CAC TGC TGT AAG TGC CCT GAG TGC TAT GAG GTG 281 ACC CGC CTG GCC GCC CTG CGG CGC CTC GAG CCT CCG GGG TAC GGC GAC 329 TGG CAA GTC CCC GAC CCT TAC GGG CCA GGT GGG GGC AAC GGC GCC AGC 377 GCG GGT TAT GGG GGC TAC AGC TCG CAG ACC TTG CCC TCG CAG GCG GGG 425 GCC ACC CCC ACC CCT CGC ACC AAG GCC AAG CTC ATC CCC ACC GGC CGG 473 GAT GTG GGG CCG GTG CCT CTT AAG CCA GTC CCG GGC AAG AGC ACC CCC 521 AAA CTC AAC GGC AGC GGC CCC AGC TGG TGG CCA GAG TGC ACC TGT ACC 569 AAC CGG GAC TGG TAT GAG CAG GTG AAT GGC AGT GAT GGC ATG TTC AAA 617 TAT GAG GAA ATC GTA CTT GAG AGG GGC AAC TCT GGC CTG GGC TTC AGT 665 ATC GCA GGT GGC ATC GAC AAT CCC CAT GTC CCT GAT GAC CCT GGC ATT 713 TTT ATT ACC AAG ATT ATC CCT GGT GGA GCA GCT GCC ATG GAT GGG AGG 761 CTG GGG GTG AAT GAC TGT GTG CTG CGG GTG AAT GAG GTG GAA GTG TCG 809 GAG GTG GTA CAC AGC CGG GCG GTG GAG GCG CTG AAA GAG GCA GGC CCT 857 GTG GTG CGA TTG GTG GTG CGG AGG CGA CAG CCT CCA CCC GAG ACC ATC 905 ATG GAG GTC AAC CTG CTC AAA GGG CCC AAA GGC CTG GGT TTC AGC ATT 953 GCT GGG GGT ATT GGC AAC CAG CAC ATC CCA GGA GAC AAC AGC ATC TAC 1001 ATC ACC AAG ATC ATT GAG GGG GGT GCT GCT CAG AAG GAT GGA CGC CTA 1049 CAG ATT GGG GAC CGG CTG CTG GCG GTG AAC AAC ACC AAT CTG CAG GAT 1097 GTG AGG CAC GAG GAA GCT GTG GCC TCA CTG AAG AAC ACA TCT GAT ATG 1145 GTG TAT TTG AAG GTG GCC AAG CCA GGC AGC CTC CAC CTC AAC GAC ATG 1193 TAC GCT CCC CCT GAC TAC GCC AGC ACT TTT ACT GCC TTG GCT GAC AAC 1241 CAC ATA AGC CAT AAT TCC AGC CTG GGT TAT CTC GGG GCT GTG GAG AGC 1289 AAG GTC AGC TAC CCT GCT CCT CCT CAG GTT CCC CCC ACC CGC TAC TCT 1337 CCT ATT CCC AGG CAC ATG CTG GCT GAG GAG GAC TTC ACC AGA GAG CCT 1385 CGC AAG ATC ATC CTG CAC AAA GGC TCC ACA GGC CTG GGC TTC AAC ATC 1433 GTA GGA GGA GAG GAT GGA GAA GGC ATT TTT GTC TCC TTC ATC CTG GCA 1481 GGA GGC CCA GCT GAC CTG AGT GGG GAG CTG CGC AGG GGA GAC CGG ATC 1529 TTA TCG GTG AAT GGA GTG AAT CTG AGG AAT GCA ACT CAT GAG CAG GCT 1577 GCA GCT GCT CTG AAA CGG GCC GGC CAG TCA GTC ACC ATT GTG GCC CAG 1625 TAC AGA CCT GAA GAA TAC AGT CGC TTT GAA TCG AAG ATA CAT GAC TTA 1673 CGA GAA CAA ATG ATG AAC AGC AGC ATG AGC TCT GGG TCT GGG TCC CTC 1721 CGA ACA AGT GAA AAG AGG TCC TTG TAT GTC AGG GCC CTG TTT GAT TAT 1769 GAT CGG ACT CGG GAC AGC TGC CTG CCA AGC CAG GGG CTC AGC TTC TCT 1817 TAT GGT GAC ATT CTG CAT GTC ATT AAT GCC TCT GAT GAT GAG TGG TGG 1865 CAG GCA AGG CTG GTG ACC CCA CAC GGA GAA AGT GAG CAG ATC GGT GTG 1913 ATC CCC AGT AAG AAG AGG GTG GAA AAG AAA GAA AGA GCT CGA TTG AAA 1961 ACT GTG AAG TTC CAT GCC AGG ACG GGG ATG ATT GAG TCT AAC AGG GAC 2009 TTC CCG GGG TTA AGT GAC GAT TAT TAT GGA GCA AAG AAC CTG AAA GGA 2057 CAA GAG GAT GCT ATT TTG TCA TAT GAG CCA GTG ACA CGG CAA GAA ATT 2105 CAC TAT GCA AGG CCT GTG ATC ATC CTG GGC CCA ATG AAG GAC CGA GTC 2153 AAT GAT GAC CTG ATC TCC GAA TTT CCA CAT AAA TTT GGA TCC TGT GTG 2201 CCA CAT ACT ACC CGG CCT CGA CGT GAT AAT GAG GTG GAT GGA CAA GAC 2249 TAC CAC TTT GTG GTG TCC CGA GAA CAA ATG GAG AAA GAT ATT CAG GAC 2297 AAC AAG TTC ATC GAG GCG GGC CAA TTT AAT GAT AAC CTC TAT GGG ACC 2345 AGC ATC CAG TCA GTG CGG GCA GTT GCA GAG AGG GGC AAG CAC TGC ATC 2393 TTA GAT GTT TCC GGC AAT GCT ATC AAG AGA CTG CAG CAA GCA CAA CTT 2441 TAC CCC ATT GCC ATT TTC ATC AAG CCC AAG TCC ATT GAA GCC CTT ATG 2489 GAA ATG AAC CGA AGG CAG ACA TAT GAA CAA GCA AAT AAG ATC TAT GAC 2537 AAA GCC ATG AAA CTG GAG CAG GAA TTT GGA GAG TAC TTT ACA GCC ATT 2585 GTA CAG GGT GAC TCA CTG GAA GAG ATT TAT AAC AAA ATC AAA CAA ATC 2633 ATT GAG GAC CAG TCT GGG CAC TAC ATT TGG GTC CCA TCC CCT GAA AAA 2681 CTC TGA AGAATCCCCT CCAACCATTC TCTTGTGAAC AGAAGAAATC AAGTCCCTCT 2737 TCCCTCCTCC CTCTTCATTC CTGTCCCCAT GGGGAGAACA AATGCTACTG TTCTTGTCCC 2797 CTTTTTTAGA TATGTCAAAA AAAATTAAGT TTTCTAGTCC TGTTCTTTTT TTTTTTTAAG 2857 TTTTTGTTTG TTTCAGTTTA TTTTTTGGGA TGATGCCATC TCATTCATCA TGTGACTGTG 2917 CCCATTCCTG CATGGACCTT TCCCAAGCGC TAGCATAGGT GCAAAATCCA TCAGAGCCAT 2977 TGTTTTCATA AAAACCAAGC AGAAGTGAAG AGAAAAGAGG AGGACTGATG GAAAGACAGA 3037 CTCTGGACAG CTGCACGGCT TGTGAAGTGA GCTAAATGCA CCACATGATG AGATGCTCCT 3097 GGG 3100 配列番号：３配列の長さ：８４９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met His Lys His Gln His Cys Cys Lys Cys Pro Glu Cys Tyr Glu Val 1 5 10 15 Thr Arg Leu Ala Ala Leu Arg Arg Leu Glu Pro Pro Gly Tyr Gly Asp 20 25 30 Trp Gln Val Pro Asp Pro Tyr Gly Pro Gly Gly Gly Asn Gly Ala Ser 35 40 45 Ala Gly Tyr Gly Gly Tyr Ser Ser Gln Thr Leu Pro Ser Gln Ala Gly 50 55 60 Ala Thr Pro Thr Pro Arg Thr Lys Ala Lys Leu Ile Pro Thr Gly Arg 65 70 75 80 Asp Val Gly Pro Val Pro Leu Lys Pro Val Pro Gly Lys Ser Thr Pro 85 90 95 Lys Leu Asn Gly Ser Gly Pro Ser Trp Trp Pro Glu Cys Thr Cys Thr 100 105 110 Asn Arg Asp Trp Tyr Glu Gln Val Asn Gly Ser Asp Gly Met Phe Lys 115 120 125 Tyr Glu Glu Ile Val Leu Glu Arg Gly Asn Ser Gly Leu Gly Phe Ser 130 135 140 Ile Ala Gly Gly Ile Asp Asn Pro His Val Pro Asp Asp Pro Gly Ile 145 150 155 160 Phe Ile Thr Lys Ile Ile Pro Gly Gly Ala Ala Ala Met Asp Gly Arg 165 170 175 Leu Gly Val Asn Asp Cys Val Leu Arg Val Asn Glu Val Glu Val Ser 180 185 190 Glu Val Val His Ser Arg Ala Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Gly Pro 195 200 205 Val Val Arg Leu Val Val Arg Arg Arg Gln Pro Pro Pro Glu Thr Ile 210 215 220 Met Glu Val Asn Leu Leu Lys Gly Pro Lys Gly Leu Gly Phe Ser Ile 225 230 235 240 Ala Gly Gly Ile Gly Asn Gln His Ile Pro Gly Asp Asn Ser Ile Tyr 245 250 255 Ile Thr Lys Ile Ile Glu Gly Gly Ala Ala Gln Lys Asp Gly Arg Leu 260 265 270 Gln Ile Gly Asp Arg Leu Leu Ala Val Asn Asn Thr Asn Leu Gln Asp 275 280 285 Val Arg His Glu Glu Ala Val Ala Ser Leu Lys Asn Thr Ser Asp Met 290 295 300 Val Tyr Leu Lys Val Ala Lys Pro Gly Ser Leu His Leu Asn Asp Met 305 310 315 320 Tyr Ala Pro Pro Asp Tyr Ala Ser Thr Phe Thr Ala Leu Ala Asp Asn 325 330 335 His Ile Ser His Asn Ser Ser Leu Gly Tyr Leu Gly Ala Val Glu Ser 340 345 350 Lys Val Ser Tyr Pro Ala Pro Pro Gln Val Pro Pro Thr Arg Tyr Ser 355 360 365 Pro Ile Pro Arg His Met Leu Ala Glu Glu Asp Phe Thr Arg Glu Pro 370 375 380 Arg Lys Ile Ile Leu His Lys Gly Ser Thr Gly Leu Gly Phe Asn Ile 385 390 395 400 Val Gly Gly Glu Asp Gly Glu Gly Ile Phe Val Ser Phe Ile Leu Ala 405 410 415 Gly Gly Pro Ala Asp Leu Ser Gly Glu Leu Arg Arg Gly Asp Arg Ile 420 425 430 Leu Ser Val Asn Gly Val Asn Leu Arg Asn Ala Thr His Glu Gln Ala 435 440 445 Ala Ala Ala Leu Lys Arg Ala Gly Gln Ser Val Thr Ile Val Ala Gln 450 455 460 Tyr Arg Pro Glu Glu Tyr Ser Arg Phe Glu Ser Lys Ile His Asp Leu 465 470 475 480 Arg Glu Gln Met Met Asn Ser Ser Met Ser Ser Gly Ser Gly Ser Leu 485 490 495 Arg Thr Ser Glu Lys Arg Ser Leu Tyr Val Arg Ala Leu Phe Asp Tyr 500 505 510 Asp Arg Thr Arg Asp Ser Cys Leu Pro Ser Gln Gly Leu Ser Phe Ser 515 520 525 Tyr Gly Asp Ile Leu His Val Ile Asn Ala Ser Asp Asp Glu Trp Trp 530 535 540 Gln Ala Arg Leu Val Thr Pro His Gly Glu Ser Glu Gln Ile Gly Val 545 550 555 560 Ile Pro Ser Lys Lys Arg Val Glu Lys Lys Glu Arg Ala Arg Leu Lys 565 570 575 Thr Val Lys Phe His Ala Arg Thr Gly Met Ile Glu Ser Asn Arg Ser 580 585 590 Ile Lys Thr Lys Arg Lys Lys Ser Phe Arg Leu Ser Arg Lys Phe Pro 595 600 605 Phe Tyr Lys Ser Lys Glu Asn Met Ala Gln Glu Ser Ser Ile Gln Glu 610 615 620 Gln Gly Val Thr Ser Asn Thr Ser Asp Ser Glu Ser Ser Ser Lys Gly 625 630 635 640 Gln Glu Asp Ala Ile Leu Ser Tyr Glu Pro Val Thr Arg Gln Glu Ile 645 650 655 His Tyr Ala Arg Pro Val Ile Ile Leu Gly Pro Met Lys Asp Arg Val 660 665 670 Asn Asp Asp Leu Ile Ser Glu Phe Pro His Lys Phe Gly Ser Cys Val 675 680 685 Pro His Thr Thr Arg Pro Arg Arg Asp Asn Glu Val Asp Gly Gln Asp 690 695 700 Tyr His Phe Val Val Ser Arg Glu Gln Met Glu Lys Asp Ile Gln Asp 705 710 715 720 Asn Lys Phe Ile Glu Ala Gly Gln Phe Asn Asp Asn Leu Tyr Gly Thr 725 730 735 Ser Ile Gln Ser Val Arg Ala Val Ala Glu Arg Gly Lys His Cys Ile 740 745 750 Leu Asp Val Ser Gly Asn Ala Ile Lys Arg Leu Gln Gln Ala Gln Leu 755 760 765 Tyr Pro Ile Ala Ile Phe Ile Lys Pro Lys Ser Ile Glu Ala Leu Met 770 775 780 Glu Met Asn Arg Arg Gln Thr Tyr Glu Gln Ala Asn Lys Ile Tyr Asp 785 790 795 800 Lys Ala Met Lys Leu Glu Gln Glu Phe Gly Glu Tyr Phe Thr Ala Ile 805 810 815 Val Gln Gly Asp Ser Leu Glu Glu Ile Tyr Asn Lys Ile Lys Gln Ile 820 825 830 Ile Glu Asp Gln Ser Gly His Tyr Ile Trp Val Pro Ser Pro Glu Lys 835 840 845 Leu 配列番号：４配列の長さ：３２１３配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列 TGCTGGAGGG GGAGCCGTGG GTGCGGGGCA CCGTGGGGGC CGAGGCCCCG GGACGCCCGC 60 CCGGCCCCAG GCCCCGCTCA GCCCGGGCGC CCCCACGGGT GCCCCCCCCT TCTTGGTCCG 120 AGCAGTGTGA GTGTGCCAGG GAGCCCGGCG GCGGCGGCGG CGGTGGTGGC GGCGGTGGCG 180 GCGGCGTGGA ATCCGGCGTG GGCTGGGGGG TCCGAGCCGC GGGGGGCAGT GCC 233 ATG CAC AAG CAC CAG CAC TGC TGT AAG TGC CCT GAG TGC TAT GAG GTG 281 ACC CGC CTG GCC GCC CTG CGG CGC CTC GAG CCT CCG GGG TAC GGC GAC 329 TGG CAA GTC CCC GAC CCT TAC GGG CCA GGT GGG GGC AAC GGC GCC AGC 377 GCG GGT TAT GGG GGC TAC AGC TCG CAG ACC TTG CCC TCG CAG GCG GGG 425 GCC ACC CCC ACC CCT CGC ACC AAG GCC AAG CTC ATC CCC ACC GGC CGG 473 GAT GTG GGG CCG GTG CCT CTT AAG CCA GTC CCG GGC AAG AGC ACC CCC 521 AAA CTC AAC GGC AGC GGC CCC AGC TGG TGG CCA GAG TGC ACC TGT ACC 569 AAC CGG GAC TGG TAT GAG CAG GTG AAT GGC AGT GAT GGC ATG TTC AAA 617 TAT GAG GAA ATC GTA CTT GAG AGG GGC AAC TCT GGC CTG GGC TTC AGT 665 ATC GCA GGT GGC ATC GAC AAT CCC CAT GTC CCT GAT GAC CCT GGC ATT 713 TTT ATT ACC AAG ATT ATC CCT GGT GGA GCA GCT GCC ATG GAT GGG AGG 761 CTG GGG GTG AAT GAC TGT GTG CTG CGG GTG AAT GAG GTG GAA GTG TCG 809 GAG GTG GTA CAC AGC CGG GCG GTG GAG GCG CTG AAA GAG GCA GGC CCT 857 GTG GTG CGA TTG GTG GTG CGG AGG CGA CAG CCT CCA CCC GAG ACC ATC 905 ATG GAG GTC AAC CTG CTC AAA GGG CCC AAA GGC CTG GGT TTC AGC ATT 953 GCT GGG GGT ATT GGC AAC CAG CAC ATC CCA GGA GAC AAC AGC ATC TAC 1001 ATC ACC AAG ATC ATT GAG GGG GGT GCT GCT CAG AAG GAT GGA CGC CTA 1049 CAG ATT GGG GAC CGG CTG CTG GCG GTG AAC AAC ACC AAT CTG CAG GAT 1097 GTG AGG CAC GAG GAA GCT GTG GCC TCA CTG AAG AAC ACA TCT GAT ATG 1145 GTG TAT TTG AAG GTG GCC AAG CCA GGC AGC CTC CAC CTC AAC GAC ATG 1193 TAC GCT CCC CCT GAC TAC GCC AGC ACT TTT ACT GCC TTG GCT GAC AAC 1241 CAC ATA AGC CAT AAT TCC AGC CTG GGT TAT CTC GGG GCT GTG GAG AGC 1289 AAG GTC AGC TAC CCT GCT CCT CCT CAG GTT CCC CCC ACC CGC TAC TCT 1337 CCT ATT CCC AGG CAC ATG CTG GCT GAG GAG GAC TTC ACC AGA GAG CCT 1385 CGC AAG ATC ATC CTG CAC AAA GGC TCC ACA GGC CTG GGC TTC AAC ATC 1433 GTA GGA GGA GAG GAT GGA GAA GGC ATT TTT GTC TCC TTC ATC CTG GCA 1481 GGA GGC CCA GCT GAC CTG AGT GGG GAG CTG CGC AGG GGA GAC CGG ATC 1529 TTA TCG GTG AAT GGA GTG AAT CTG AGG AAT GCA ACT CAT GAG CAG GCT 1577 GCA GCT GCT CTG AAA CGG GCC GGC CAG TCA GTC ACC ATT GTG GCC CAG 1625 TAC AGA CCT GAA GAA TAC AGT CGC TTT GAA TCG AAG ATA CAT GAC TTA 1673 CGA GAA CAA ATG ATG AAC AGC AGC ATG AGC TCT GGG TCT GGG TCC CTC 1721 CGA ACA AGT GAA AAG AGG TCC TTG TAT GTC AGG GCC CTG TTT GAT TAT 1769 GAT CGG ACT CGG GAC AGC TGC CTG CCA AGC CAG GGG CTC AGC TTC TCT 1817 TAT GGT GAC ATT CTG CAT GTC ATT AAT GCC TCT GAT GAT GAG TGG TGG 1865 CAG GCA AGG CTG GTG ACC CCA CAC GGA GAA AGT GAG CAG ATC GGT GTG 1913 ATC CCC AGT AAG AAG AGG GTG GAA AAG AAA GAA AGA GCT CGA TTG AAA 1961 ACT GTG AAG TTC CAT GCC AGG ACG GGG ATG ATT GAG TCT AAC AGG TCG 2009 ATC AAA ACG AAA CGT AAA AAG AGT TTC CGC CTC TCT CGA AAG TTT CCA 2057 TTT TAC AAG AGC AAA GAA AAC ATG GCC CAG GAG AGC AGC ATA CAG GAA 2105 CAG GGA GTG ACA TCC AAC ACC AGT GAC AGC GAA AGC AGT TCC AAA GGA 2153 CAA GAG GAT GCT ATT TTG TCA TAT GAG CCA GTG ACA CGG CAA GAA ATT 2201 CAC TAT GCA AGG CCT GTG ATC ATC CTG GGC CCA ATG AAG GAC CGA GTC 2249 AAT GAT GAC CTG ATC TCC GAA TTT CCA CAT AAA TTT GGA TCC TGT GTG 2297 CCA CAT ACT ACC CGG CCT CGA CGT GAT AAT GAG GTG GAT GGA CAA GAC 2345 TAC CAC TTT GTG GTG TCC CGA GAA CAA ATG GAG AAA GAT ATT CAG GAC 2393 AAC AAG TTC ATC GAG GCG GGC CAA TTT AAT GAT AAC CTC TAT GGG ACC 2441 AGC ATC CAG TCA GTG CGG GCA GTT GCA GAG AGG GGC AAG CAC TGC ATC 2489 TTA GAT GTT TCC GGC AAT GCT ATC AAG AGA CTG CAG CAA GCA CAA CTT 2537 TAC CCC ATT GCC ATT TTC ATC AAG CCC AAG TCC ATT GAA GCC CTT ATG 2585 GAA ATG AAC CGA AGG CAG ACA TAT GAA CAA GCA AAT AAG ATC TAT GAC 2633 AAA GCC ATG AAA CTG GAG CAG GAA TTT GGA GAG TAC TTT ACA GCC ATT 2681 GTA CAG GGT GAC TCA CTG GAA GAG ATT TAT AAC AAA ATC AAA CAA ATC 2737 ATT GAG GAC CAG TCT GGG CAC TAC ATT TGG GTC CCA TCC CCT GAA AAA 2797 CTC TGA AGAATCCCCT CCAACCATTC TCTTGTGAAC AGAAGAAATC AAGTCCCTCT 2857 TCCCTCCTCC CTCTTCATTC CTGTCCCCAT GGGGAGAACA AATGCTACTG TTCTTGTCCC 2917 CTTTTTTAGA TATGTCAAAA AAAATTAAGT TTTCTAGTCC TGTTCTTTTT TTTTTTTAAG 2977 TTTTTGTTTG TTTCAGTTTA TTTTTTGGGA TGATGCCATC TCATTCATCA TGTGACTGTG 3037 CCCATTCCTG CATGGACCTT TCCCAAGCGC TAGCATAGGT GCAAAATCCA TCAGAGCCAT 3097 TGTTTTCATA AAAACCAAGC AGAAGTGAAG AGAAAAGAGG AGGACTGATG GAAAGACAGA 3157 CTCTGGACAG CTGCACGGCT TGTGAAGTGA GCTAAATGCA CCACATGATG AGATGCTCCT 3210 GGG 3213 配列番号：５配列の長さ：１９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Gly Met lle Glu Ser Asn Arg Asp Phe Pro Gly Leu Ser Asp Asp Tyr Tyr Gly 1 5 10 15 Ala 配列番号：６配列の長さ：２０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Ser Ile Lys Thr Lys Arg Lys Lys Ser Phe Arg Leu Ser Arg Lys Phe Pro Phe 1 5 10 15 Tyr Lys 20

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で得られたＮＥ−ｄｌｇのｃＤＮＡの
断片の位置関係を表す図である。

【図２】ＮＥ−ｄｌｇ、ｈｄｌｇ１及びｈｄｌｇ２間の
アミノ酸配列の相同性を検討した結果を表す図である。
ＮＥ−ｄｌｇは、オリジナルフォーム（配列表の配列番
号１のアミノ酸配列）を示す。

【図３】ヒトの各組織のｍＲＮＡに対して、ＮＥ−ｄｌ
ｇのｃＤＮＡ断片をハイブリダイズさせたノーザンブロ
ットの結果を表す電気泳動写真である。

【図４】ヒトの各種細胞株のｍＲＮＡについて、ＮＥ−
ｄｌｇのｃＤＮＡ断片をハイブリダイズさせたノーザン
ブロットの結果を表す電気泳動写真である。

【図５】ＮＥ−ｄｌｇのオリジナルフォームのペプチド
に対する抗体の力価をＥＬＩＳＡで測定した結果を表す
図である。

【図６】ＮＥ−ｄｌｇのスプライスフォームのペプチド
に対する抗体の力価をＥＬＩＳＡで測定した結果を表す
図である。

【図７】ＮＥ−ｄｌｇを導入した細胞、導入しなかった
細胞、脳組織からの抽出液について、抗ＮＥ−ｄｌｇ抗
体を用いたウェスタンブロットの結果を表す電気泳動写
真である。レーン１は、ＮＥ−ｄｌｇ遺伝子を導入した
ＶＡ−１３細胞を溶解液で溶解させ遠心分離した後の上
清をローディングした結果である。レーン２は、ＮＥ−
ｄｌｇ遺伝子を導入したＶＡ−１３細胞を溶解液で溶解
させ遠心分離した後のペレットを再度溶解液に懸濁した
後、遠心分離し、その上清をローディングした結果であ
る。レーン３は、ＮＥ−ｄｌｇ遺伝子を導入したＶＡ−
１３細胞を溶解液で溶解させ遠心分離した後のペレット
を再度溶解液に懸濁した後、遠心分離し、そのペレット
をローディングした結果である。レーン４は、ＮＥ−ｄ
ｌｇ遺伝子を導入ていないＶＡ−１３細胞を溶解液で溶
解させ遠心分離した後の上清をローディングした結果で
ある。レーン５は、ＮＥ−ｄｌｇ遺伝子を導入していな
いＶＡ−１３細胞を溶解液で溶解させ遠心分離した後の
ペレットを再度溶解液に懸濁した後、遠心分離し、その
上清をローディングした結果である。レーン６は、ＮＥ
−ｄｌｇ遺伝子を導入していないＶＡ−１３細胞を溶解
液で溶解させ遠心分離した後のペレットを再度溶解液に
懸濁した後、遠心分離し、そのペレットをローディング
した結果である。レーン７は、脳組織を溶解液で溶解さ
せ遠心分離した後の上清をローディングした結果であ
る。レーン８は、脳組織を溶解液で溶解させ遠心分離し
た後のペレットを再度溶解液に懸濁した後、遠心分離
し、その上清をローディングした結果である。レーン９
は、脳組織を溶解液で溶解させ遠心分離した後のペレッ
トを再度溶解液に懸濁した後、遠心分離し、そのペレッ
トをローディングした結果である。

【図８】脳の組織を抗ＮＥ−ｄｌｇ抗体で染色した結果
を表す顕微鏡写真である。

【図９】膵臓の組織を抗ＮＥ−ｄｌｇ抗体で染色した結
果を表す顕微鏡写真である。

【図１０】膵臓の組織を抗インシュリン抗体で染色した
結果を表す顕微鏡写真である。

【図１１】膵臓の組織を抗ＮＥ−ｄｌｇ抗体及び抗イン
シュリン抗体で染色した結果を表す顕微鏡写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＧ０１Ｎ 33/574 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ // Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】神経内分泌組織で発現が見られるヒトｄ
ｌｇファミリー分子。
【請求項２】脳、膵臓、気管支、前立腺及び甲状腺で
発現が見られる請求項１に記載のヒトｄｌｇファミリー
分子。
【請求項３】脳、膵臓、気管支、前立腺及び甲状腺で
発現が見られかつ心臓、肺、肝臓及び腎臓で発現が見ら
れない請求項２に記載のヒトｄｌｇファミリー分子。
【請求項４】膵臓での発現がランゲルハンス島での発
現である請求項２又は３に記載のヒトｄｌｇファミリー
分子。
【請求項５】配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配
列を有する請求項１〜４のいずれか一つに記載のヒトｄ
ｌｇファミリー分子。
【請求項６】配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配
列を有する請求項１〜４のいずれか一つに記載のヒトｄ
ｌｇファミリー分子。
【請求項７】配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
列を有する請求項１〜５のいずれか一つに記載のヒトｄ
ｌｇファミリー分子。
【請求項８】配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配
列を有する請求項１、２、３、４又は６のいずれか一つ
に記載のヒトｄｌｇファミリー分子。
【請求項９】配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
列を有するｄｌｇファミリー分子。
【請求項１０】配列表の配列番号３に記載のアミノ酸
配列を有するｄｌｇファミリー分子。
【請求項１１】配列表の配列番号１に記載のアミノ酸
配列の１又は２以上のアミノ酸を置換、欠失又は付加さ
せた請求項７又は９に記載のｄｌｇファミリー分子。
【請求項１２】配列表の配列番号３に記載のアミノ酸
配列の１又は２以上のアミノ酸を置換、欠失又は付加さ
せた請求項８又は１０に記載のｄｌｇファミリー分子。
【請求項１３】配列表の配列番号５に記載のアミノ酸
配列からなるポリペプチドに特異的な抗体により認識さ
れる請求項１、２、３、４、５、７、９又は１１のいず
れか一つに記載のｄｌｇファミリー分子。
【請求項１４】配列表の配列番号６に記載のアミノ酸
配列からなるポリペプチドに特異的な抗体により認識さ
れる請求項１、２、３、４、６、８、１０又は１２のい
ずれか一つに記載のｄｌｇファミリー分子。
【請求項１５】請求項１〜１４のいずれか一つに記載
のｄｌｇファミリー分子をコードするポリヌクレオチ
ド。
【請求項１６】配列表の配列番号の２に記載の塩基配
列からなるポリヌクレオチド。
【請求項１７】配列表の配列番号の４に記載の塩基配
列からなるポリヌクレオチド。
【請求項１８】請求項１５〜１７のいずれか一つに記
載のポリヌクレオチドのうちの、１２塩基以上でありか
つＧＣ含有率が３０〜７０％である部分を含むポリヌク
レオチド。
【請求項１９】請求項１５〜１７のいずれか一つに記
載のポリヌクレオチドのうちの、１６塩基以上でありか
つＧＣ含有率が３０〜７０％である部分を含むポリヌク
レオチド。
【請求項２０】配列表の配列番号２又は４に記載の塩
基配列からなるポリヌクレオチドに対応するＲＮＡ。
【請求項２１】請求項１〜１４のいずれか一つに記載
の分子に翻訳される塩基配列を有するＲＮＡ。
【請求項２２】請求項１５〜２１のいずれか一つに記
載のポリヌクレオチド又はＲＮＡを用いて、ｄｌｇ遺伝
子を検出するｄｌｇの検出方法。
【請求項２３】請求項１５〜１７のいずれか一つに記
載のポリヌクレオチドのうちの、塩基配列の長さが１５
塩基以上である部分のポリヌクレオチドのアンチセンス
ポリヌクレオチド
【請求項２４】請求項１５〜１７のいずれか一つに記
載のポリヌクレオチドのうちの、塩基配列の長さが１５
塩基〜３０塩基である部分のポリヌクレオチドのアンチ
センスポリヌクレオチド。
【請求項２５】請求項２３又は２４に記載のアンチセ
ンスポリヌクレオチドの誘導体。
【請求項２６】請求項１〜１４のいずれか一つに記載
の分子を特異的に認識する抗体。
【請求項２７】配列表の配列番号１に記載のアミノ酸
配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体。
【請求項２８】エピトープが配列表の配列番号５に記
載のアミノ酸配列である請求項２７に記載の抗体。
【請求項２９】配列表の配列番号３に記載のアミノ酸
配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体。
【請求項３０】エピトープが配列表の配列番号６に記
載のアミノ酸配列である請求項２９に記載の抗体。
【請求項３１】請求項２６〜３０のいずれか一つに記
載の抗体を用いて、ｄｌｇ分子を検出する方法。