JPH10259200A - アデニレートキナーゼを認識するモノクローナル抗体及び該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ - Google Patents

アデニレートキナーゼを認識するモノクローナル抗体及び該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ

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JPH10259200A
JPH10259200A JP9082448A JP8244897A JPH10259200A JP H10259200 A JPH10259200 A JP H10259200A JP 9082448 A JP9082448 A JP 9082448A JP 8244897 A JP8244897 A JP 8244897A JP H10259200 A JPH10259200 A JP H10259200A
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JP
Japan
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monoclonal antibody
adenylate kinase
hybridoma
antibody
protein
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Application number
JP9082448A
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English (en)
Inventor
Akemi Yoshiki
あけみ 吉識
Hidekazu Ueno
英一 上野
Nobuyuki Fujii
信之 藤井
Takeya Hori
剛也 堀
Satoru Ito
哲 伊藤
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Fujirebio Inc
Original Assignee
Fujirebio Inc
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 アデニールキナーゼを特異的に認識するモノ
クローナル抗体及び該抗体を産生するハイブリドーマ。 【効果】 本発明により、アデニールキナーゼを特異的
に認識する抗体及び該抗体を産生する手段を提供し、ア
デニールキナーゼを誘導蛋白とした融合抗原の精製等に
広く用いることが可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、アデニレートキナ
ーゼを特異的に認識するモノクローナル抗体及び該モノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマに関するもの
である。
【0002】
【従来の技術】遺伝子工学の進歩は、これまで天然物か
ら精製していた蛋白質を遺伝子レベルで解析し、目的蛋
白質を人工的に増幅させることを可能にした(Itakura
et.al,Science, 198 1056 (1977))。その後発明され
たチオレドキシン(以下本明細書中ではTRXと記載す
る)(特表平5−507209)や、グルタチオン−S
−トランスフェラーゼ(以下本明細書中ではGSTと記
載する)(特表平1−503441)等を融合させたD
NA配列の応用によって、本来発現しにくいような蛋白
質をも発現させることができるようになり、融合蛋白質
を発現させる技術は広く用いられるようになった。
【0003】しかしながら、TRXやGSTは、発現蛋
白質の可溶性やTRXまたはGSTに由来する非特異反
応が問題となることがあるため、本発明者等は、先に、
TRX及びGSTに代わる発現誘導蛋白質としてアデニ
レートキナーゼ(以下本明細書中ではAKと記載する)
(特願平8−356739)が有用であることを見出し
た。該発明によれば、耐熱性のAKを発現誘導蛋白質と
して用いると、発現する融合蛋白質も耐熱性を維持する
ため、発現物質の精製過程において熱変性手段を用いる
ことができ便利である。しかし、産業的に利用しやすい
ような多量の蛋白質精製を行う場合には、熱変性手段に
よる精製方法以外にも、アフィニティークロマトグラフ
ィーの適用や、発現させたAK融合蛋白質の確認を行う
ための統一的手法の提供が望まれ、AKを特異的に認識
する抗体が必要とされた。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、AKを特異的に認識するモノクローナル抗体を提供
することである。
【0005】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、AKを特
異的に認識する抗体に関して鋭意研究した結果、AKを
特異的に認識するモノクローナル抗体及び該モノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマを確立して、本発明
を完成した。
【0006】すなわち、本発明は、AKを特異的に認識
するモノクローナル抗体及び該モノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマに関するものである。
【0007】本発明のモノクローナル抗体及び該モノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマを用いれば、A
K及びAK融合蛋白質を直接検出することができ、AK
及びAK融合蛋白質の精製、免疫測定等に広く応用する
ことができる。
【0008】以下、本発明を詳細に説明する。
【0009】本願発明の抗体はAKを特異的に認識する
モノクローナル抗体であるので、該抗体の免疫原として
は、AK全体またはAKの一部を用いるのが好ましい
が、その由来に関しては、特に定めるものではない。好
ましくは好熱菌由来のAK、更に好ましくはサルフォロ
ボスアシドカルダリウス由来のAKが望ましいが、AK
と目的物質とを融合させた融合蛋白質中のAKを認識で
きるモノクローナル抗体であれば、これらに限定される
ものではない。
【0010】本発明のモノクローナル抗体を作成するに
は、AK全体またはその一部のペプチドを精製するか合
成し、これを抗体作製の免疫原とする。AK及びAK融
合蛋白質への特異性は、ハイブリドーマのスクリーニン
グの際に選択することができるので、手法の簡便さから
もAK全体を免疫原として用いるのが好ましい。
【0011】上記のようにして作製した抗原を、ウサ
ギ、モルモット、マウス等の免疫動物に免疫する。免疫
は常法に従って行うことができ、抗原は単独でまたはア
ジュバンドと共に免疫動物に投与する。免疫後は、抗体
価の上昇を確認して血清を採取するが、必要に応じて追
加免疫を行うとよい。抗体価の上昇を確認後、脾臓細胞
等のような抗体産生細胞と、ミエローマ細胞のような腫
瘍細胞とを、ポリエチレングリコール等のような融合剤
で融合してハイブリドーマを作製する。次いでハイブリ
ドーマをHAT培地のような選択培地を用いて選択し、
限界希釈法等の適当な方法でモノクローナル化して培養
する。この培養上清を酵素免疫測定法のような適当な免
疫測定法で分析し、目的とする抗AK抗体を産生してい
るクローンを選択する。これらのモノクローナル抗体作
製の手法は、公知の方法、例えば、ケーラーとミルシュ
タイン(Nature 256 495 1975 )、シェーラー(Nature
285446 1980 )等の方法により行うことができる。ま
た上述の手法により作製したモノクローナル抗体は、プ
リスタン処理したマウスに該モノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマを投与して得られた腹水、あるいは
該モノクロナール抗体を産生するハイブリドーマの培養
上清から、塩折、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル
ろ過クロマトグラフィー等の分析・精製手段により回収
することができる。
【0012】AK及びAK融合蛋白質の免疫測定、アフ
ィニティークロマトグラフィーによる精製等には、本発
明が特に有用である。
【0013】
【実施例】本発明を以下参考例及び実施例により更に詳
細に説明する。
【0014】参考例1 AKの調製 特願平8−356739に記載の実施例1及び実施例2
と同様にして、リコンビナントAKを調製した。すなわ
ち、サルファロボス菌由来AKの既知のDNA配列をも
とにDNA合成装置(パーキンエルマー社製)を用いて
作製した53merのプライマーを16個使用し、アセ
ンブルPCR法により、サルファロボスアシドカルダリ
ウスAKの遺伝子を合成した。アセンブルPCR法には
Taqポリメラーゼ(東洋紡社製)を使用し、94℃−
1分、55℃−1分、72℃−1分、30サイクルの条
件で、総塩基数630bpを増幅した。5’末に制限酵
素NdeI部位を、3’末に制限酵素EcoRI部位
を、C末にはトロンビン切断部位を付加した。この断片
をpGEMEX−1(プロメガ社製)とpGEX−2T
(ファルマシアバイオテック社製)より作製した4.6
KbのpW6AベクターのNdeI、EcoRI部位に
組込み、AKを発現するベクターとしてpW6AKを作
製した。
【0015】pW6AKはNdeI及びEcoRI部位
に、AK由来の194アミノ酸、トロンビン開裂部位由
来の10アミノ酸及びpW6Aマルチクローニングサイ
ト由来の19アミノ酸を含む223アミノ酸からなる融
合蛋白質の遺伝子を含んでいる。挿入断片はDNAシー
ケンスキット(シーケナーゼキットVer.2.0 、アマーシ
ャム ユナイテッド ステイツ バイオケミカル社製)
によりDNA配列を確認した。
【0016】pW6Aを宿主大腸菌に導入後、LB培地
で2時間培養後、1mMIPTGを添加し2時間培養し
て、発現を誘導した。大腸菌の沈渣にTE緩衝液を加え
超音波破砕し、レムリー法による15%SDS−PAG
Eを行った。CBB染色で約40Kda付近にバンドを
確認した。
【0017】作製したpW6AKを宿主大腸菌に導入
後、LB培地37℃の条件下で培養した。培養液の大腸
菌濃度を予備培養にて波長600nmで吸光度約1.0
の濁度とした後、1mM IPTGを添加し発現誘導を
行った。3時間培養後、遠心を行い大腸菌を回収した。
回収した大腸菌にトリス緩衝液を200ml加え、氷冷
下で超音波破砕処理を行った。発現した融合蛋白質は、
遠心後可溶性成分として上清に回収された。この上清に
ついて65℃10分間熱処理を行い、熱処理後の遠心上
清に80%以上のAKを回収した。
【0018】この上清を、トリス緩衝液で平衡化したハ
イドロキシアパタイトカラム(バイオラド社製)で精製
した。リン酸ナトリウム緩衝液で溶出したところ、約
0.2Mリン酸ナトリウム濃度溶出画分にAKを回収し
た。次いでこのAK画分を、6M尿素0.5M塩化ナト
リウム20mMトリス−塩酸緩衝液pH9.4で平衡化
したスーパーデックス200 26/60カラムでゲル
ろ過精製した。分子量約2万の画分に精製AKを回収し
た。
【0019】参考例2 TRXの調製及び精製 参考例1で作製したpWF6A同様にTRXを発現する
ベクターとして作製したpWT8Aを宿主大腸菌に導入
後、LB培地37℃の条件下で培養した。参考例1と同
様の発現誘導を行った後、遠心で大腸菌を回収した。回
収した大腸菌にオスモテックショックを与え、ペリプラ
ズム画分にあるTRXを抽出した。抽出TRXは20m
M水酸化ナトリウムで平衡化したリソースRPC逆相カ
ラム(ファルマシア社製)で一回目の精製を行った。ア
セトニトリルで溶出したところ、約10%〜20%アセ
トニトリル溶出画分にTRXを回収した。回収したTR
Xを4Mグアニジン塩酸に透析後、同条件下での逆相カ
ラムで二回目の精製を行った。一回目同様、約10%〜
20%アセトニトリル溶出画分に精製TRXを回収し
た。
【0020】実施例1 モノクローナル抗体の作成 参考例1で精製したリコンビナントAKを次のような方
法で免疫した。すなわちアジュバントとしてフロイント
・コンプリート・アジュバント(ディフコ社製)を用
い、BALB/cマウスに一匹当たり100μgを腹腔
内投与にて3回接種した。マウス尾静脈より採血し、免
疫原を固相化した96ウェルアッセイプレートを用いた
ELISAにより血清抗体価の上昇を確認した。腹腔内
投与により最終免疫を行い3日後に脾臓を摘出し、ケー
ラーとミルシュタインの常法(Nature 256,495,1975) に
従い細胞融合を行った。親細胞には、マウス骨髄腫細胞
株P3−X 63−Ag8−U1(P3U1)を用い、
融合剤としてポリエチレングリコールを用いた。融合し
た細胞はHAT培地にて培養し、約14日後に培養上清
をELISAによる一次スクリーニングに供した。すな
わち、参考例1及び参考例2で調製したリコンビナント
AK及びリコンビナントTRXをそれぞれ濃度2μg/
mlで96ウエルプレートに固相化し、次にこの培養上
清を反応させ、抗マウスIg−POD(ダコ社製)によ
りその反応性を比較した。AKにのみ特異的に反応する
ウェルを選択し、その細胞を限界希釈法によりクローニ
ングし、ハイブリドーマAdk1を確立した。尚、この
ハイブリドーマは生命工学工業技術研究所に寄託され、
その受託番号はFERM P−16045である。
【0021】このようにして確立したハイブリドーマ
を、あらかじめプリスタン0.5mlを腹腔に投与した
マウスの腹腔内に、1匹当たり1x107 個接種した。
1週間から10日後に貯留した腹水を採取し、プロテイ
ンAカラム(バイオラッド社製)−MAPS−IIキッ
ト緩衝液を用いてモノクローナル抗体を精製した。ハイ
ブリドーマAdk1が産生するモノクローナル抗体を、
Adk1抗体と命名した。
【0022】モノクローナル抗体のアイソタイピングを
アマシャム社製キットを用いたウェスタンブロッテイン
グ法により行ったところ、IgG1 ・κであった。
【0023】実施例3 モノクローナル抗体の反応性試
験 実施例1及び参考例1で調製したAK及びTRXを用い
て、モノクローナル抗体の特異性をELISA及びウエ
スタンブロットにより確認した。
【0024】すなわち、ELISAは、前記AK及びT
RXを、96穴マイクロプレート(ファルコン社製)に
50μl加え、4℃一晩放置して感作した。感作プレー
トを、リン酸生理緩衝液(以下、本明細書中ではPBS
と記載する)に0.05%ツィーン20(非イオン性界
面活性剤シグマ社製)を含む溶液(以下、本明細書中で
は洗浄液と記載する)にて洗浄し、2%ウシ血清アルブ
ミン(以下、本明細書中ではBSAと記載する)を含む
PBSを150μl加え 37℃、2時間放置して、プ
レート表面をBSAコートした。
【0025】その後、感作プレートを洗浄し、ハイブリ
ドーマAdk1の培養液上清50μlを加え、37℃、
2時間の条件にて、精製AK及びTRXと反応させた。
その後、感作プレートを洗浄し、2000倍洗浄液にて
希釈した抗−マウスIg−POD(ダコ社製)を100
μl加え、37℃、2時間の条件にて反応させた。洗浄
液にて十分洗浄後、0.1%2,2’−アゾビス(3−
エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸(ABTS)
を含む0.005%過酸化水素溶液を200μl添加し
室温で20分間反応後、405nmにおける発色を測定
した。Adk1抗体は、AKとのみ、特異的に反応し
た。
【0026】一方、ウエスタンブロットは、前記AK及
びTRXをレムリー法による12.5%ポリアクリルア
ミドゲルにてSDS−PAGEを行い、電気泳動を行っ
たゲルをニトロセルロース膜に転写し、2%BSAを含
むPBSを加え、室温2時間の条件でニトロセルロース
膜部分をBSAコートした。その後、転写膜を洗浄、細
断し、ハイブリドーマAdk1培養液上清と室温2時間
反応させ、次いで、細断化転写膜を洗浄し、洗浄液にて
2000倍希釈した抗−マウスIg−POD(ダコ社
製)と室温2時間反応させた。洗浄液にて十分洗浄後
室温で0.005%過酸化水素溶液を含む4−クロロナ
フトールにて発色させた。 結果を図1に示す。Adk
1抗体は、AKとのみ、特異的に反応した。
【0027】
【発明の効果】本発明により、AKに対するモノクロー
ナル抗体及び該モノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】AdK1とFDX及びAKとのウエスタンブロ
ットの図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI C12R 1:91) (C12P 21/08 C12R 1:91) (72)発明者 堀 剛也 東京都新宿区西新宿2丁目7番1号 富士 レビオ株式会社内 (72)発明者 伊藤 哲 東京都新宿区西新宿2丁目7番1号 富士 レビオ株式会社内

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 アデニレートキナーゼを特異的に認識す
    るモノクローナル抗体。
  2. 【請求項2】 アデニレートキナーゼが耐熱性蛋白質で
    ある請求項1に記載のモノクローナル抗体。
  3. 【請求項3】 アデニレートキナーゼがサーモフィラス
    菌、サルフォロボス菌、フィロコッカス菌、サーモトガ
    菌、フィロバクラム菌、フィロディクチウム菌、サーモ
    コッカス菌、サーモディスカス菌、メタノサーマス菌、
    メタノコッカス菌のいずれかから選ばれる菌由来のアデ
    ニレートキナーゼである請求項1に記載のモノクローナ
    ル抗体。
  4. 【請求項4】 アデニレートキナーゼがサルフォロボス
    アシドカルダリウス由来のアデニレートキナーゼである
    請求項1に記載のモノクローナル抗体。
  5. 【請求項5】 モノクローナル抗体がAdk1である請
    求項1に記載のモノクローナル抗体。
  6. 【請求項6】 請求項1ないし5のいずれかに記載のモ
    ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
  7. 【請求項7】 ハイブリドーマがAdk1である請求項
    6に記載のハイブリドーマ。
  8. 【請求項8】 請求項1ないし5のいずれかに記載のモ
    ノクローナル抗体を用いたアデニレートキナーゼ融合蛋
    白質を精製する方法。
JP9082448A 1997-03-17 1997-03-17 アデニレートキナーゼを認識するモノクローナル抗体及び該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ Pending JPH10259200A (ja)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011512151A (ja) * 2008-02-20 2011-04-21 ヘルス プロテクション エージェンシー 汚染除去プロセス検証のための共有結合熱安定性キナーゼ

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011512151A (ja) * 2008-02-20 2011-04-21 ヘルス プロテクション エージェンシー 汚染除去プロセス検証のための共有結合熱安定性キナーゼ

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