JP2002000270A - ミトコンドリアクレアチンキナーゼ抗体 - Google Patents
ミトコンドリアクレアチンキナーゼ抗体Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 抗ヒトＣＫ−Ｍ阻害抗体を用いて免疫阻害法
によりＣＫ‐ＭＢを測定する方法において、この方法で
は同時に測定されてしまうｍＣＫを選択的に排除し、正
確にＣＫ−ＭＢを測定できる方法を提供すること。 【解決手段】 ｍＣＫ蛋白質を特異的に認識し、且つそ
の酵素活性を特異的に阻害する抗体、具体的にはヒトｍ
ＣＫを特異的に認識しうる、マウス由来かつＩｇＧクラ
スのモノクローナル抗体であって、ｍＣＫＩ−５７８と
命名されたものであり、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７１
３３で特定されるハイブリドーマにより産生されるモノ
クローナル抗体を提供し、さらに該抗体と、抗ヒトＣＫ
−Ｍ阻害抗体とを用いたＣＫ‐ＭＢ測定方法を提供す
る。
によりＣＫ‐ＭＢを測定する方法において、この方法で
は同時に測定されてしまうｍＣＫを選択的に排除し、正
確にＣＫ−ＭＢを測定できる方法を提供すること。 【解決手段】 ｍＣＫ蛋白質を特異的に認識し、且つそ
の酵素活性を特異的に阻害する抗体、具体的にはヒトｍ
ＣＫを特異的に認識しうる、マウス由来かつＩｇＧクラ
スのモノクローナル抗体であって、ｍＣＫＩ−５７８と
命名されたものであり、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７１
３３で特定されるハイブリドーマにより産生されるモノ
クローナル抗体を提供し、さらに該抗体と、抗ヒトＣＫ
−Ｍ阻害抗体とを用いたＣＫ‐ＭＢ測定方法を提供す
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はミトコンドリアクレ
アチンキナーゼ（ｍＣＫ）の活性を特異的に阻害するモ
ノクローナル抗体に関するものであり、本発明で得られ
た抗体を用いたクレアチンキナーゼアイソザイムの分別
定量法、すなわちクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム
（ＣＫ−ＭＢ）、クレアチンキナーゼＭＭアイソザイム
（ＣＫ−ＭＭ）、クレアチンキナーゼＢＢアイソザイム
（ＣＫ−ＢＢ）、ミトコンドリア局在クレアチンキナー
ゼアイソザイム（ｍＣＫ）の測定法に関する。
アチンキナーゼ（ｍＣＫ）の活性を特異的に阻害するモ
ノクローナル抗体に関するものであり、本発明で得られ
た抗体を用いたクレアチンキナーゼアイソザイムの分別
定量法、すなわちクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム
（ＣＫ−ＭＢ）、クレアチンキナーゼＭＭアイソザイム
（ＣＫ−ＭＭ）、クレアチンキナーゼＢＢアイソザイム
（ＣＫ−ＢＢ）、ミトコンドリア局在クレアチンキナー
ゼアイソザイム（ｍＣＫ）の測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒトのクレアチンキナーゼ（ＣＫ）は遺
伝子を異にする３つの蛋白が存在する。細胞質に由来す
る２種類の蛋白（局在により筋肉型（Ｍ型）と脳型（Ｂ
型））ともう一つはミトコンドリアに由来する蛋白であ
る。細胞質由来のＣＫアイソザイムはＭ型とＢ型との組
み合わせによりなる２量体で構成され、ＣＫ−ＭＭ、Ｃ
Ｋ−ＭＢ、ＣＫ−ＢＢの３種類に分類される。ミトコン
ドリアＣＫ（ｍＣＫ）は、偏在型のユビキタス（ｕｂｉ
ｑｕｉｔｏｕｓ）Ｍｉａ−ＣＫとサルコメリック（ｓａ
ｒｃｏｍｅｒｉｃ）Ｍｉｂ−ＣＫのアイソフォームが組
織特異的に合成される。
伝子を異にする３つの蛋白が存在する。細胞質に由来す
る２種類の蛋白（局在により筋肉型（Ｍ型）と脳型（Ｂ
型））ともう一つはミトコンドリアに由来する蛋白であ
る。細胞質由来のＣＫアイソザイムはＭ型とＢ型との組
み合わせによりなる２量体で構成され、ＣＫ−ＭＭ、Ｃ
Ｋ−ＭＢ、ＣＫ−ＢＢの３種類に分類される。ミトコン
ドリアＣＫ（ｍＣＫ）は、偏在型のユビキタス（ｕｂｉ
ｑｕｉｔｏｕｓ）Ｍｉａ−ＣＫとサルコメリック（ｓａ
ｒｃｏｍｅｒｉｃ）Ｍｉｂ−ＣＫのアイソフォームが組
織特異的に合成される。
【０００３】また、ｍＣＫは８量体で極めて安定的に存
在するが、クレアチン、ＭｇＡＤＰおよび硝酸塩の遷移
状態類似物質複合体の存在下では、数分のうちに２量体
に加速的に解離する。また、血液中では時間と共に徐々
に２量体になると言われている（Ｋａｒｉｎ Ｆｒｉｔ
ｚ−Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ，３８１，
３４１−３４５，１９９６）。
在するが、クレアチン、ＭｇＡＤＰおよび硝酸塩の遷移
状態類似物質複合体の存在下では、数分のうちに２量体
に加速的に解離する。また、血液中では時間と共に徐々
に２量体になると言われている（Ｋａｒｉｎ Ｆｒｉｔ
ｚ−Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ，３８１，
３４１−３４５，１９９６）。
【０００４】これらアイソザイムの電気泳動の移動度は
陰極側からｍＣＫ（８量体）、ｍＣＫ（２量体）＝ＣＫ
−ＭＭ、ＣＫ−ＭＢ、ＣＫ−ＢＢの順になる。ｍＣＫ
（２量体）はＣＫ−ＭＭと同じ移動度を示すため保存血
液では電気泳動的にＣＫ−ＭＭとして測定されてしま
う。その他にアイソザイムではないが、免疫グロブリン
が結合したマクロＣＫも存在する。これらは移動度、免
疫向流法などによりザイモグラムから確認することがで
きる。
陰極側からｍＣＫ（８量体）、ｍＣＫ（２量体）＝ＣＫ
−ＭＭ、ＣＫ−ＭＢ、ＣＫ−ＢＢの順になる。ｍＣＫ
（２量体）はＣＫ−ＭＭと同じ移動度を示すため保存血
液では電気泳動的にＣＫ−ＭＭとして測定されてしま
う。その他にアイソザイムではないが、免疫グロブリン
が結合したマクロＣＫも存在する。これらは移動度、免
疫向流法などによりザイモグラムから確認することがで
きる。
【０００５】臨床検査においてはＣＫ、ＣＫアイソザイ
ムの定量が広く行われている。中でもＣＫ−ＭＢは心筋
梗塞のマーカーとして重要である。ＣＫ−ＭＢの定量は
ＥＩＡ法、免疫阻害法、電気泳動法などにより行われて
いる。ＥＩＡ法はＣＫ−ＭＢだけを特異性高く測定でき
る反面、専用の機器が必要で迅速性に欠ける。電気泳動
法は操作が煩雑で熟練を要する上に、結果を出すまでに
デンシトメーターでＣＫ−ＭＢの存在比率を出す必要が
あり迅速性に欠ける。免疫阻害法は自動分析装置により
迅速簡便に測定ができる利点があるが特異性に欠ける欠
点を有していた。
ムの定量が広く行われている。中でもＣＫ−ＭＢは心筋
梗塞のマーカーとして重要である。ＣＫ−ＭＢの定量は
ＥＩＡ法、免疫阻害法、電気泳動法などにより行われて
いる。ＥＩＡ法はＣＫ−ＭＢだけを特異性高く測定でき
る反面、専用の機器が必要で迅速性に欠ける。電気泳動
法は操作が煩雑で熟練を要する上に、結果を出すまでに
デンシトメーターでＣＫ−ＭＢの存在比率を出す必要が
あり迅速性に欠ける。免疫阻害法は自動分析装置により
迅速簡便に測定ができる利点があるが特異性に欠ける欠
点を有していた。
【０００６】しかし現状では、急性心筋梗塞の早期診断
が求められる為、迅速簡便に測定ができる免疫阻害法が
広く使用されている。この方法は、ＣＫ−Ｍサブユニッ
トに対する特異抗体（以下、抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体という
こともある）を用いてＭサブユニットを失活させ、残存
するＢサブユニット活性を測定するものである。この方
法だと、ＣＫ−ＭＢの他にＣＫ−ＢＢ、ｍＣＫ（２量体
＋８量体）を測定してしまう。この内ＣＫ−ＢＢは、血
中にほとんど存在しないため無視できるし、ＣＫ−ＢＢ
が逸脱する疾患も少ない。しかし、ｍＣＫは健常者の血
清中でもＣＫ−ＭＢとほぼ同じ活性量含まれており（豊
田陽子 他：生物物理化学，４１，２４４，１９９７、
星野忠 他：小児を対象としたＣＫアイソザイム分画の
年齢別推移に関する検討．生物物理化学，４２補冊２，
２１，１９９８）、さらに肝疾患などの細胞壊死、悪性
腫瘍などでｍＣＫの逸脱が起こり結果の判定を混乱させ
る。 最近では、ロタウイルスによる腸炎、新生児仮死
などでもｍＣＫの逸脱が起こることが報告されている
（星野忠 他：臨床病理，４６，総会号，５７，１９９
８、金光房江 他：臨床病理，４６，総会号，５６，１
９９８）。
が求められる為、迅速簡便に測定ができる免疫阻害法が
広く使用されている。この方法は、ＣＫ−Ｍサブユニッ
トに対する特異抗体（以下、抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体という
こともある）を用いてＭサブユニットを失活させ、残存
するＢサブユニット活性を測定するものである。この方
法だと、ＣＫ−ＭＢの他にＣＫ−ＢＢ、ｍＣＫ（２量体
＋８量体）を測定してしまう。この内ＣＫ−ＢＢは、血
中にほとんど存在しないため無視できるし、ＣＫ−ＢＢ
が逸脱する疾患も少ない。しかし、ｍＣＫは健常者の血
清中でもＣＫ−ＭＢとほぼ同じ活性量含まれており（豊
田陽子 他：生物物理化学，４１，２４４，１９９７、
星野忠 他：小児を対象としたＣＫアイソザイム分画の
年齢別推移に関する検討．生物物理化学，４２補冊２，
２１，１９９８）、さらに肝疾患などの細胞壊死、悪性
腫瘍などでｍＣＫの逸脱が起こり結果の判定を混乱させ
る。 最近では、ロタウイルスによる腸炎、新生児仮死
などでもｍＣＫの逸脱が起こることが報告されている
（星野忠 他：臨床病理，４６，総会号，５７，１９９
８、金光房江 他：臨床病理，４６，総会号，５６，１
９９８）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】従来の免疫阻害法は、
抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体を用いてＣＫ‐ＭＢを測定するもの
であり、簡便で迅速に測定できるが、この方法だとｍＣ
Ｋも同時に測定してしまい、正確なＣＫ−ＭＢの測定は
期待できない。しかし、ｍＣＫを阻害する抗体および抗
ＣＫ‐Ｍ阻害抗体を添加することにより、ｍＣＫの影響
を回避して正確で特異性の高い簡便なＣＫ‐ＭＢ測定が
可能となる。そこで本発明の目的は、ｍＣＫを特異的に
阻害する抗体を提供することであり、さらにこの抗体を
用いたＣＫアイソザイムの測定法を提供することであ
る。
抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体を用いてＣＫ‐ＭＢを測定するもの
であり、簡便で迅速に測定できるが、この方法だとｍＣ
Ｋも同時に測定してしまい、正確なＣＫ−ＭＢの測定は
期待できない。しかし、ｍＣＫを阻害する抗体および抗
ＣＫ‐Ｍ阻害抗体を添加することにより、ｍＣＫの影響
を回避して正確で特異性の高い簡便なＣＫ‐ＭＢ測定が
可能となる。そこで本発明の目的は、ｍＣＫを特異的に
阻害する抗体を提供することであり、さらにこの抗体を
用いたＣＫアイソザイムの測定法を提供することであ
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】上記の課題を達成するた
めに鋭意研究を重ねた結果、たとえば哺乳動物をｍＣＫ
で免疫して得られた抗血清や、免疫した各種動物由来の
Ｂリンパ球と各種骨髄腫細胞との細胞融合により作製し
たモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから、前記目
的を達成せしめる抗体を得て本発明を完成した。
めに鋭意研究を重ねた結果、たとえば哺乳動物をｍＣＫ
で免疫して得られた抗血清や、免疫した各種動物由来の
Ｂリンパ球と各種骨髄腫細胞との細胞融合により作製し
たモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから、前記目
的を達成せしめる抗体を得て本発明を完成した。
【０００９】すなわち、本発明は、（１）ミトコンドリ
ア局在クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）を阻
害するモノクローナル抗体、（２）ミトコンドリア局在
クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）を阻害する
能力が、ＣＫアイソザイムの分別定量において実質的に
ｍＣＫ以外のＣＫアイソザイムの測定に影響が無い程度
にまでｍＣＫを阻害する能力である前記（１）のモノク
ローナル抗体、（３）ミトコンドリア局在クレアチンキ
ナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）を６０％以上阻害する抗
体、（４）ミトコンドリア局在クレアチンキナーゼアイ
ソザイム（ｍＣＫ）を８０％以上阻害する前記（３）の
抗体、（４）少なくともサルコメラｍＣＫを９０％以上
阻害する抗体、（５）抗体がモノクローナル抗体である
前記（３）から（５）のいずれかの抗体、（６）受託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−７１３３号により寄託されているハ
イブリドーマが産生するモノクローナル抗体、（８）受
託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７１３３号により寄託されてい
るハイブリドーマ、（９）少なくとも前記（１）〜
（７）のいずれかの抗体またはモノクローナル抗体で処
理することにより、ミトコンドリア局在クレアチンキナ
ーゼアイソザイム（ｍＣＫ）を排除することを特徴とす
るクレアチンキナーゼ（ＣＫ）アイソザイムの分別定量
法、（１０）分別定量される前記クレアチンキナーゼ
（ＣＫ）アイソザイムが、ＣＫ−ＭＢ、ＣＫ−ＭＭ、Ｃ
Ｋ−ＢＢ、またはｍＣＫである前記（９）のＣＫアイソ
ザイムの分別定量法、（１１）前記（９）のクレアチン
キナーゼ（ＣＫ）アイソザイム分別定量法であって、ク
レアチンキナーゼＭ（ＣＫ−Ｍ）サブユニットおよびミ
トコンドリア局在クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍ
ＣＫ）の酵素活性を、ＣＫ−Ｍサブユニットに対する阻
害抗体およびｍＣＫに対する阻害抗体で試料を処理する
ことにより選択的に排除する処理をした後、残存するＣ
Ｋ活性を測定するクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム
（ＣＫ−ＭＢ）測定法、（１２）クレアチンキナーゼＭ
（ＣＫ−Ｍ）サブユニットに対する阻害抗体およびミト
コンドリア局在クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍＣ
Ｋ）に対する阻害抗体とを一つの工程中で同時に作用さ
せることを特徴とする前記（１１）のクレアチンキナー
ゼＭＢアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）測定法、（１３）ク
レアチンキナーゼＭ（ＣＫ−Ｍ）サブユニットに対する
阻害抗体およびミトコンドリア局在クレアチンキナーゼ
アイソザイム（ｍＣＫ）に対する阻害抗体とを別々の工
程で作用させることを特徴とする前記（１１）のクレア
チンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）測定法、
（１４）前記（９）のクレアチンキナーゼ（ＣＫ）アイ
ソザイム分別定量法であって、ミトコンドリア局在クレ
アチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）の酵素活性をｍ
ＣＫに対する阻害抗体で試料を処理することにより選択
的に排除することを特徴とするｍＣＫ測定法、前記（１
４）のミトコンドリア局在クレアチンキナーゼアイソザ
イム（ｍＣＫ）測定法であって、まず試料中のｍＣＫを
含むクレアチンキナーゼ（ＣＫ）活性を測定し、ついで
少なくとも前記（１）〜（７）のいずれかの抗体または
モノクローナル抗体を加えて処理することによりｍＣＫ
の酵素活性を阻害してｍＣＫ以外のＣＫ活性を再度測定
し、測定値の差からｍＣＫ活性を得ることを特徴とする
ｍＣＫ測定法、前記（１４）のミトコンドリア局在クレ
アチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）測定法であっ
て、試料中のｍＣＫを含むクレアチンキナーゼ（ＣＫ）
の測定と、試料中のｍＣＫ以外のＣＫ活性とを別々に測
定し、測定値の差からｍＣＫ活性を得ることを特徴とす
るｍＣＫ測定法、（１７）前記（９）のクレアチンキナ
ーゼ（ＣＫ）アイソザイム分別定量法において、クレア
チンキナーゼＭ（ＣＫ−Ｍ）サブユニットに対する阻害
抗体で試料を処理してＣＫ活性の測定を行う工程と、Ｃ
Ｋ−Ｍサブユニットに対する阻害抗体とミトコンドリア
局在クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）に対す
る阻害抗体とを同時に作用させて測定する工程を含む、
クレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）の
測定とｍＣＫの測定とを同時に達成するＣＫアイソザイ
ム分別定量法、（１８）クレアチンキナーゼＭ（ＣＫ−
Ｍ）サブユニットに対する阻害抗体で試料を処理してク
レアチンキナーゼ（ＣＫ）活性の測定を行う工程に引き
続いて、該測定後の試料にミトコンドリア局在クレアチ
ンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）に対する阻害抗体を
加えることで、ＣＫ−Ｍサブユニットに対する阻害抗体
とｍＣＫに対する阻害抗体とを同時に作用させて測定す
る工程を行うことを特徴とする前記（１７）のＣＫアイ
ソザイム分別定量法、（１９）クレアチンキナーゼＭ
（ＣＫ−Ｍ）サブユニットに対する阻害抗体で試料を処
理してクレアチンキナーゼ（ＣＫ）活性の測定を行う工
程と、ＣＫ−Ｍサブユニットに対する阻害抗体とｍＣＫ
に対する阻害抗体とを同時に作用させて測定する工程
を、別々の試薬を用いて行うことを特徴とする前記１７
のＣＫアイソザイム分別定量法、（２０）前記（９）、
（１０）、（１７）、（１８）もしくは（１９）のクレ
アチンキナーゼ（ＣＫ）アイソザイム分別定量法、前記
（１１）〜（１３）のいずれかのクレアチンキナーゼＭ
Ｂアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）測定法、または前記（１
４）〜（１６）のいずれかのミトコンドリア局在クレア
チンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）測定法に必要な試
薬をキット化または単品で構成されてなるＣＫアイソザ
イム測定用試薬、を提供する。
ア局在クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）を阻
害するモノクローナル抗体、（２）ミトコンドリア局在
クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）を阻害する
能力が、ＣＫアイソザイムの分別定量において実質的に
ｍＣＫ以外のＣＫアイソザイムの測定に影響が無い程度
にまでｍＣＫを阻害する能力である前記（１）のモノク
ローナル抗体、（３）ミトコンドリア局在クレアチンキ
ナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）を６０％以上阻害する抗
体、（４）ミトコンドリア局在クレアチンキナーゼアイ
ソザイム（ｍＣＫ）を８０％以上阻害する前記（３）の
抗体、（４）少なくともサルコメラｍＣＫを９０％以上
阻害する抗体、（５）抗体がモノクローナル抗体である
前記（３）から（５）のいずれかの抗体、（６）受託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−７１３３号により寄託されているハ
イブリドーマが産生するモノクローナル抗体、（８）受
託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７１３３号により寄託されてい
るハイブリドーマ、（９）少なくとも前記（１）〜
（７）のいずれかの抗体またはモノクローナル抗体で処
理することにより、ミトコンドリア局在クレアチンキナ
ーゼアイソザイム（ｍＣＫ）を排除することを特徴とす
るクレアチンキナーゼ（ＣＫ）アイソザイムの分別定量
法、（１０）分別定量される前記クレアチンキナーゼ
（ＣＫ）アイソザイムが、ＣＫ−ＭＢ、ＣＫ−ＭＭ、Ｃ
Ｋ−ＢＢ、またはｍＣＫである前記（９）のＣＫアイソ
ザイムの分別定量法、（１１）前記（９）のクレアチン
キナーゼ（ＣＫ）アイソザイム分別定量法であって、ク
レアチンキナーゼＭ（ＣＫ−Ｍ）サブユニットおよびミ
トコンドリア局在クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍ
ＣＫ）の酵素活性を、ＣＫ−Ｍサブユニットに対する阻
害抗体およびｍＣＫに対する阻害抗体で試料を処理する
ことにより選択的に排除する処理をした後、残存するＣ
Ｋ活性を測定するクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム
（ＣＫ−ＭＢ）測定法、（１２）クレアチンキナーゼＭ
（ＣＫ−Ｍ）サブユニットに対する阻害抗体およびミト
コンドリア局在クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍＣ
Ｋ）に対する阻害抗体とを一つの工程中で同時に作用さ
せることを特徴とする前記（１１）のクレアチンキナー
ゼＭＢアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）測定法、（１３）ク
レアチンキナーゼＭ（ＣＫ−Ｍ）サブユニットに対する
阻害抗体およびミトコンドリア局在クレアチンキナーゼ
アイソザイム（ｍＣＫ）に対する阻害抗体とを別々の工
程で作用させることを特徴とする前記（１１）のクレア
チンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）測定法、
（１４）前記（９）のクレアチンキナーゼ（ＣＫ）アイ
ソザイム分別定量法であって、ミトコンドリア局在クレ
アチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）の酵素活性をｍ
ＣＫに対する阻害抗体で試料を処理することにより選択
的に排除することを特徴とするｍＣＫ測定法、前記（１
４）のミトコンドリア局在クレアチンキナーゼアイソザ
イム（ｍＣＫ）測定法であって、まず試料中のｍＣＫを
含むクレアチンキナーゼ（ＣＫ）活性を測定し、ついで
少なくとも前記（１）〜（７）のいずれかの抗体または
モノクローナル抗体を加えて処理することによりｍＣＫ
の酵素活性を阻害してｍＣＫ以外のＣＫ活性を再度測定
し、測定値の差からｍＣＫ活性を得ることを特徴とする
ｍＣＫ測定法、前記（１４）のミトコンドリア局在クレ
アチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）測定法であっ
て、試料中のｍＣＫを含むクレアチンキナーゼ（ＣＫ）
の測定と、試料中のｍＣＫ以外のＣＫ活性とを別々に測
定し、測定値の差からｍＣＫ活性を得ることを特徴とす
るｍＣＫ測定法、（１７）前記（９）のクレアチンキナ
ーゼ（ＣＫ）アイソザイム分別定量法において、クレア
チンキナーゼＭ（ＣＫ−Ｍ）サブユニットに対する阻害
抗体で試料を処理してＣＫ活性の測定を行う工程と、Ｃ
Ｋ−Ｍサブユニットに対する阻害抗体とミトコンドリア
局在クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）に対す
る阻害抗体とを同時に作用させて測定する工程を含む、
クレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）の
測定とｍＣＫの測定とを同時に達成するＣＫアイソザイ
ム分別定量法、（１８）クレアチンキナーゼＭ（ＣＫ−
Ｍ）サブユニットに対する阻害抗体で試料を処理してク
レアチンキナーゼ（ＣＫ）活性の測定を行う工程に引き
続いて、該測定後の試料にミトコンドリア局在クレアチ
ンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）に対する阻害抗体を
加えることで、ＣＫ−Ｍサブユニットに対する阻害抗体
とｍＣＫに対する阻害抗体とを同時に作用させて測定す
る工程を行うことを特徴とする前記（１７）のＣＫアイ
ソザイム分別定量法、（１９）クレアチンキナーゼＭ
（ＣＫ−Ｍ）サブユニットに対する阻害抗体で試料を処
理してクレアチンキナーゼ（ＣＫ）活性の測定を行う工
程と、ＣＫ−Ｍサブユニットに対する阻害抗体とｍＣＫ
に対する阻害抗体とを同時に作用させて測定する工程
を、別々の試薬を用いて行うことを特徴とする前記１７
のＣＫアイソザイム分別定量法、（２０）前記（９）、
（１０）、（１７）、（１８）もしくは（１９）のクレ
アチンキナーゼ（ＣＫ）アイソザイム分別定量法、前記
（１１）〜（１３）のいずれかのクレアチンキナーゼＭ
Ｂアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）測定法、または前記（１
４）〜（１６）のいずれかのミトコンドリア局在クレア
チンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）測定法に必要な試
薬をキット化または単品で構成されてなるＣＫアイソザ
イム測定用試薬、を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明の抗ｍＣＫ酵素活性阻害抗
体（抗ｍＣＫ阻害抗体とよぶこともある）は、ｍＣＫ蛋
白質を特異的に認識し、且つその酵素活性を特異的に阻
害する抗体である。本発明の抗体は、後述する本発明の
ＣＫアイソザイムの分別定量法に使用できるが、このＣ
Ｋアイソザイムの分別定量法において実質的にｍＣＫ以
外のＣＫアイソザイムの測定に影響が無い程度にまでｍ
ＣＫを阻害できれる抗体であればよく、ｍＣＫを６０％
以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以
上阻害する抗体であり得る。ｍＣＫは多くの場合、試料
中に５〜２０Ｕ／Ｌ含まれており、８０％以上のｍＣＫ
阻害能を有すれば臨床上問題なく使用可能である。ｍＣ
Ｋ阻害能の低い抗体であっても、複数の抗体を組み合わ
せて使用する、またはｍＣＫを阻害しうる化合物と共に
使用することにより、実質的に８０％以上の阻害効果を
得ることができるので、本発明の範囲に含まれる。ま
た、本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であってもモ
ノクローナル抗体であってもよいが、好ましくはモノク
ローナル抗体である。
体（抗ｍＣＫ阻害抗体とよぶこともある）は、ｍＣＫ蛋
白質を特異的に認識し、且つその酵素活性を特異的に阻
害する抗体である。本発明の抗体は、後述する本発明の
ＣＫアイソザイムの分別定量法に使用できるが、このＣ
Ｋアイソザイムの分別定量法において実質的にｍＣＫ以
外のＣＫアイソザイムの測定に影響が無い程度にまでｍ
ＣＫを阻害できれる抗体であればよく、ｍＣＫを６０％
以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以
上阻害する抗体であり得る。ｍＣＫは多くの場合、試料
中に５〜２０Ｕ／Ｌ含まれており、８０％以上のｍＣＫ
阻害能を有すれば臨床上問題なく使用可能である。ｍＣ
Ｋ阻害能の低い抗体であっても、複数の抗体を組み合わ
せて使用する、またはｍＣＫを阻害しうる化合物と共に
使用することにより、実質的に８０％以上の阻害効果を
得ることができるので、本発明の範囲に含まれる。ま
た、本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であってもモ
ノクローナル抗体であってもよいが、好ましくはモノク
ローナル抗体である。
【００１１】具体的には例えば、本発明の抗体は、ヒト
ｍＣＫを特異的に認識して阻害しうるモノクローナル抗
体であって、マウス由来かつイムノグロブリンＧ（Ｉｇ
Ｇ）クラスのｍＣＫＩ−５７８と命名された抗体であ
り、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７１３３号により平成１
２年４月１３日付けで通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所に寄託されているハイブリドーマにより産
生される抗体である。ｍＣＫＩ−５７８は、試料中のｍ
ＣＫ酵素活性を特異的に８０％以上阻害することができ
る。また、ｍＣＫＩ−５７８は、少なくともサルコメラ
ｍＣＫを９０％以上阻害する。本発明の抗体は、この具
体例に限定されるものではなく、ヒトｍＣＫを特異的に
認識し、且つその酵素活性を特異的に阻害しうる抗体で
あればよい。また、本発明の抗ｍＣＫ阻害抗体は、ｍＣ
Ｋ酵素活性を阻害する目的で使用する時、単独で用いて
もよいし、複数の抗ｍＣＫ阻害抗体、例えば認識部位が
異なる抗体を適宜組み合わせて用いることも可能であ
る。
ｍＣＫを特異的に認識して阻害しうるモノクローナル抗
体であって、マウス由来かつイムノグロブリンＧ（Ｉｇ
Ｇ）クラスのｍＣＫＩ−５７８と命名された抗体であ
り、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７１３３号により平成１
２年４月１３日付けで通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所に寄託されているハイブリドーマにより産
生される抗体である。ｍＣＫＩ−５７８は、試料中のｍ
ＣＫ酵素活性を特異的に８０％以上阻害することができ
る。また、ｍＣＫＩ−５７８は、少なくともサルコメラ
ｍＣＫを９０％以上阻害する。本発明の抗体は、この具
体例に限定されるものではなく、ヒトｍＣＫを特異的に
認識し、且つその酵素活性を特異的に阻害しうる抗体で
あればよい。また、本発明の抗ｍＣＫ阻害抗体は、ｍＣ
Ｋ酵素活性を阻害する目的で使用する時、単独で用いて
もよいし、複数の抗ｍＣＫ阻害抗体、例えば認識部位が
異なる抗体を適宜組み合わせて用いることも可能であ
る。
【００１２】本発明の抗体の由来である動物種はマウス
に限るものではなく、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤ
ギ、ウマなどが例示されるが、好ましくはマウスであ
る。抗体のサブクラスはＩｇＧに限定されるものではな
く、ＩｇＭなどでもよい。
に限るものではなく、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤ
ギ、ウマなどが例示されるが、好ましくはマウスであ
る。抗体のサブクラスはＩｇＧに限定されるものではな
く、ＩｇＭなどでもよい。
【００１３】本発明の抗体は、従来公知の免疫学的手法
を用いて、例えば抗原としてｍＣＫを用い、好ましくは
アジュバントと共に哺乳類に免疫し、免疫した動物の血
清などから得ることができる。モノクローナル抗体およ
び該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、
免疫した動物由来のＢリンパ球と各種骨髄腫細胞とを融
合することにより、具体的には以下に記載する方法で作
製することができる。
を用いて、例えば抗原としてｍＣＫを用い、好ましくは
アジュバントと共に哺乳類に免疫し、免疫した動物の血
清などから得ることができる。モノクローナル抗体およ
び該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、
免疫した動物由来のＢリンパ球と各種骨髄腫細胞とを融
合することにより、具体的には以下に記載する方法で作
製することができる。
【００１４】抗原としては、目的とする特異性によって
も異なるが、ｍＣＫに対して特異的に親和性を有し且つ
その酵素活性を阻害する抗体を得る場合には、ヒトまた
は哺乳類のｍＣＫが用いられるが、特異性を高めるため
には種特異的な抗原を用いることが好ましい。ヒトｍＣ
Ｋに対して特異的に親和性を有し且つその酵素活性を特
異的に阻害する抗体を得る場合には、抗原として好まし
くはヒトｍＣＫを用いる。当該抗原は、ｍＣＫを心筋組
織や血液などから精製することにより調製できるし、ま
た遺伝子工学的手法によっても得ることができる。
も異なるが、ｍＣＫに対して特異的に親和性を有し且つ
その酵素活性を阻害する抗体を得る場合には、ヒトまた
は哺乳類のｍＣＫが用いられるが、特異性を高めるため
には種特異的な抗原を用いることが好ましい。ヒトｍＣ
Ｋに対して特異的に親和性を有し且つその酵素活性を特
異的に阻害する抗体を得る場合には、抗原として好まし
くはヒトｍＣＫを用いる。当該抗原は、ｍＣＫを心筋組
織や血液などから精製することにより調製できるし、ま
た遺伝子工学的手法によっても得ることができる。
【００１５】感作抗原としては、精製したｍＣＫ蛋白
質、またはそのアミノ酸配列に基づき遺伝子工学的手法
により発現させたｍＣＫ蛋白質やその部分ペプチドをリ
ン酸緩衝液（ＰＢＳ）などの適当な緩衝液中に溶解、あ
るいは懸濁したものが用いられる。抗原液は通常抗原物
質を５０〜５００μｇ／ｍＬ程度含む濃度に調製すれば
よい。また、ペプチド抗原など、それだけでは抗原性が
低い場合は、アルブミンやキーホールリンペットヘモシ
アニン（ＫＬＨ）などの適当なキャリアータンパク質に
架橋して用いることが好ましい。当該抗原で免疫感作す
る動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウマ、
ヤギ、ウサギなどが例示される。好ましくはマウス、よ
り好ましくはＢＡＬＢ／ｃマウスである。
質、またはそのアミノ酸配列に基づき遺伝子工学的手法
により発現させたｍＣＫ蛋白質やその部分ペプチドをリ
ン酸緩衝液（ＰＢＳ）などの適当な緩衝液中に溶解、あ
るいは懸濁したものが用いられる。抗原液は通常抗原物
質を５０〜５００μｇ／ｍＬ程度含む濃度に調製すれば
よい。また、ペプチド抗原など、それだけでは抗原性が
低い場合は、アルブミンやキーホールリンペットヘモシ
アニン（ＫＬＨ）などの適当なキャリアータンパク質に
架橋して用いることが好ましい。当該抗原で免疫感作す
る動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウマ、
ヤギ、ウサギなどが例示される。好ましくはマウス、よ
り好ましくはＢＡＬＢ／ｃマウスである。
【００１６】このとき、被免疫動物の抗原への応答性を
高めるため、当該抗原溶液をアジュバントと混合して投
与することが好ましい。ここで用いられるアジュバント
としては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フ
ロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、Ｒｉｂｉ（Ｍ
ＰＬ）、Ｒｉｂｉ（ＴＤＭ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ＋ＴＤ
Ｍ）。百日咳ワクチン（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒ
ｔｕｓｓｉｓ ｖａｃｃｉｎｅ）、ムラミルジペプチド
（ＭＤＰ）、アルミニウムアジュバント（ＡＬＵＭ）、
およびこれらの組合せが例示されるが、初回免疫時にＦ
ＣＡ、追加免疫時にＦＩＡやＲｉｂｉアジュバントを使
用する組合せが特に好ましい。
高めるため、当該抗原溶液をアジュバントと混合して投
与することが好ましい。ここで用いられるアジュバント
としては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フ
ロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、Ｒｉｂｉ（Ｍ
ＰＬ）、Ｒｉｂｉ（ＴＤＭ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ＋ＴＤ
Ｍ）。百日咳ワクチン（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒ
ｔｕｓｓｉｓ ｖａｃｃｉｎｅ）、ムラミルジペプチド
（ＭＤＰ）、アルミニウムアジュバント（ＡＬＵＭ）、
およびこれらの組合せが例示されるが、初回免疫時にＦ
ＣＡ、追加免疫時にＦＩＡやＲｉｂｉアジュバントを使
用する組合せが特に好ましい。
【００１７】免疫方法は、使用する抗原の種類やアジュ
バント混合の有無などにより、注射部位、スケジュール
などを適宜変化させることができるが、例えば、被免疫
動物としてマウスを用いる場合は、アジュバント混合抗
原液０．０５〜１ｍＬ（抗原物質１０〜２００μｇ）を
腹腔内、皮下、筋肉内または（尾）静脈内に注射し、初
回免疫から約４〜２１日毎に１〜４回追加免疫を行い、
さらに約１〜４週間後に最終免疫を行う。当該抗原溶液
をアジュバントを使用せずに投与する場合には、抗原量
を多くして、腹腔内注射してもよい。抗体価は追加免疫
の約５〜６日後に採血して調べる。抗体価の測定は、後
述の抗体価アッセイに準じ、通常行われる方法で行うこ
とができる。最終免疫より約３〜５日後、該免疫動物か
ら脾細胞を分離して抗体産生細胞を得る。
バント混合の有無などにより、注射部位、スケジュール
などを適宜変化させることができるが、例えば、被免疫
動物としてマウスを用いる場合は、アジュバント混合抗
原液０．０５〜１ｍＬ（抗原物質１０〜２００μｇ）を
腹腔内、皮下、筋肉内または（尾）静脈内に注射し、初
回免疫から約４〜２１日毎に１〜４回追加免疫を行い、
さらに約１〜４週間後に最終免疫を行う。当該抗原溶液
をアジュバントを使用せずに投与する場合には、抗原量
を多くして、腹腔内注射してもよい。抗体価は追加免疫
の約５〜６日後に採血して調べる。抗体価の測定は、後
述の抗体価アッセイに準じ、通常行われる方法で行うこ
とができる。最終免疫より約３〜５日後、該免疫動物か
ら脾細胞を分離して抗体産生細胞を得る。
【００１８】骨髄腫細胞としては、マウス、ラット、ヒ
トなど由来のものが使用される。例えばマウスミエロー
マＰ３Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１、Ｐ
３ＮＳ１−Ａｇ４、ＳＰ２／ｏ−Ａｇ１４、Ｐ３Ｘ６３
−Ａｇ８・６５３などの株化骨髄腫細胞が例示される。
骨髄腫細胞には免疫グロブリン軽鎖を産生しているもの
があり、これを融合対象として用いると、抗体産生細胞
が産生する免疫グロブリン重鎖とこの軽鎖とがランダム
に結合することがあるので、好ましくは免疫グロブリン
軽鎖を産生しない骨髄腫細胞、例えばＰ３Ｘ６３−Ａｇ
８・６５３やＳＰ２／ｏ−Ａｇ１４などを用いることが
好ましい。抗体産生細胞と骨髄腫細胞とは、同種動物、
特に同系統の動物由来であることが好ましい。骨髄腫細
胞の維持は、凍結保存するか、またはウマ、ウサギもし
くはウシ胎児血清を添加した一般的な培地で継代培養す
ることにより行われる。また細胞融合には対数増殖期の
細胞を用いるのが好ましい。
トなど由来のものが使用される。例えばマウスミエロー
マＰ３Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１、Ｐ
３ＮＳ１−Ａｇ４、ＳＰ２／ｏ−Ａｇ１４、Ｐ３Ｘ６３
−Ａｇ８・６５３などの株化骨髄腫細胞が例示される。
骨髄腫細胞には免疫グロブリン軽鎖を産生しているもの
があり、これを融合対象として用いると、抗体産生細胞
が産生する免疫グロブリン重鎖とこの軽鎖とがランダム
に結合することがあるので、好ましくは免疫グロブリン
軽鎖を産生しない骨髄腫細胞、例えばＰ３Ｘ６３−Ａｇ
８・６５３やＳＰ２／ｏ−Ａｇ１４などを用いることが
好ましい。抗体産生細胞と骨髄腫細胞とは、同種動物、
特に同系統の動物由来であることが好ましい。骨髄腫細
胞の維持は、凍結保存するか、またはウマ、ウサギもし
くはウシ胎児血清を添加した一般的な培地で継代培養す
ることにより行われる。また細胞融合には対数増殖期の
細胞を用いるのが好ましい。
【００１９】抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させて
ハイブリドーマを作製する方法としては、ポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）を用いる方法、センダイウイルス
を用いる方法、電気融合装置を用いる方法などが例示さ
れる。例えばＰＥＧ法の場合、約３０〜６０％のＰＥＧ
（平均分子量１，０００〜６，０００）を含む適当な培
地または緩衝液中に脾細胞と骨髄腫細胞を１〜１０：
１、好ましくは５〜１０：１の混合比で懸濁し、温度約
２５〜３７℃、ｐＨ６〜８の条件下で、約３０秒〜３分
間程度反応させればよい。反応終了後、細胞を洗浄しＰ
ＥＧ溶液を除いて培地に再懸濁し、マイクロタイタープ
レート中に播種して培養を続ける。
ハイブリドーマを作製する方法としては、ポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）を用いる方法、センダイウイルス
を用いる方法、電気融合装置を用いる方法などが例示さ
れる。例えばＰＥＧ法の場合、約３０〜６０％のＰＥＧ
（平均分子量１，０００〜６，０００）を含む適当な培
地または緩衝液中に脾細胞と骨髄腫細胞を１〜１０：
１、好ましくは５〜１０：１の混合比で懸濁し、温度約
２５〜３７℃、ｐＨ６〜８の条件下で、約３０秒〜３分
間程度反応させればよい。反応終了後、細胞を洗浄しＰ
ＥＧ溶液を除いて培地に再懸濁し、マイクロタイタープ
レート中に播種して培養を続ける。
【００２０】融合操作後の細胞は選択培地で培養して、
ハイブリドーマの選択を行う。選択培地は、親細胞株が
死滅し、融合細胞のみが増殖しえる培地であり、通常ヒ
ポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培
地が使用される。ハイブリドーマの選択は、通常融合操
作の１〜７日後に、培地の一部、好ましくは約半量を選
択培地と交換することによって開始し、さらに２、３日
毎に同様の培地交換を繰り返しながら培養することによ
り行う。顕微鏡観察によりハイブリドーマのコロニーが
生育しているウエルを確認する。
ハイブリドーマの選択を行う。選択培地は、親細胞株が
死滅し、融合細胞のみが増殖しえる培地であり、通常ヒ
ポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培
地が使用される。ハイブリドーマの選択は、通常融合操
作の１〜７日後に、培地の一部、好ましくは約半量を選
択培地と交換することによって開始し、さらに２、３日
毎に同様の培地交換を繰り返しながら培養することによ
り行う。顕微鏡観察によりハイブリドーマのコロニーが
生育しているウエルを確認する。
【００２１】生育しているハイブリドーマが所望の抗体
を産生しているかどうかを知るには、培養上清を採取し
て抗体価アッセイを自体公知の方法により行えばよい。
例えば固相化した抗原タンパク質に段階希釈した該上清
を加えて反応させ、さらに蛍光物質、酵素、もしくは放
射性同位体（ＲＩ）などで標識した二次抗体（抗グロブ
リン抗体、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体など）を反応さ
せれば、該上清中に産生されている抗体を検出すること
ができ、また抗体価を測定することができる。抗原が酵
素などの場合は、その酵素と該上清とを反応させた後、
適当な基質を反応させて酵素阻害活性の有無により、抗
体の検出および抗体価の測定を行うことができる。この
ように各ウエルの培養上清をスクリーニングし、適切な
抗体を産生しているハイブリドーマを得る。
を産生しているかどうかを知るには、培養上清を採取し
て抗体価アッセイを自体公知の方法により行えばよい。
例えば固相化した抗原タンパク質に段階希釈した該上清
を加えて反応させ、さらに蛍光物質、酵素、もしくは放
射性同位体（ＲＩ）などで標識した二次抗体（抗グロブ
リン抗体、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体など）を反応さ
せれば、該上清中に産生されている抗体を検出すること
ができ、また抗体価を測定することができる。抗原が酵
素などの場合は、その酵素と該上清とを反応させた後、
適当な基質を反応させて酵素阻害活性の有無により、抗
体の検出および抗体価の測定を行うことができる。この
ように各ウエルの培養上清をスクリーニングし、適切な
抗体を産生しているハイブリドーマを得る。
【００２２】さらに限界希釈法、軟寒天法、蛍光励起セ
ルソーターを用いた方法などにより単一クローンを分離
する。例えば限界希釈法の場合、ハイブリドーマのコロ
ニーを１細胞／ウエル前後となるように培地で段階希釈
して培養することにより目的とするモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマ クローンを単離することが
できる。得られた抗体産生ハイブリドーマ クローン
は、約１０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳ
Ｏ）あるいはグリセリンなどの凍結保護剤の共存下に凍
結させて−７０〜−１９６℃で保存すると、約半年〜半
永久的に保存可能である。細胞は用時３７℃前後の恒温
槽中で急速に融解して使用する。凍結保護剤の細胞毒性
が残存しないようによく洗浄してから使用するのが望ま
しい。
ルソーターを用いた方法などにより単一クローンを分離
する。例えば限界希釈法の場合、ハイブリドーマのコロ
ニーを１細胞／ウエル前後となるように培地で段階希釈
して培養することにより目的とするモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマ クローンを単離することが
できる。得られた抗体産生ハイブリドーマ クローン
は、約１０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳ
Ｏ）あるいはグリセリンなどの凍結保護剤の共存下に凍
結させて−７０〜−１９６℃で保存すると、約半年〜半
永久的に保存可能である。細胞は用時３７℃前後の恒温
槽中で急速に融解して使用する。凍結保護剤の細胞毒性
が残存しないようによく洗浄してから使用するのが望ま
しい。
【００２３】ハイブリドーマが産生する抗体の免疫グロ
ブリンサブクラスを調べるためには、該ハイブリドーマ
を一般的な条件で培養し、その培養上清中に分泌された
抗体を市販の抗体クラス・サブクラス判定用キットなど
を用いて分析することにより知ることができる。
ブリンサブクラスを調べるためには、該ハイブリドーマ
を一般的な条件で培養し、その培養上清中に分泌された
抗体を市販の抗体クラス・サブクラス判定用キットなど
を用いて分析することにより知ることができる。
【００２４】ハイブリドーマからのモノクローナル抗体
の取得方法は、必要量やハイブリドーマの性状などによ
って適宜選択して用いる。例えば、該ハイブリドーマを
移植したマウス腹水から取得する方法、細胞培養により
培養上清から取得する方法などが例示される。マウス腹
腔内で増殖可能なハイブリドーマであれば、腹水から数
ｍｇ／ｍＬの高濃度のモノクローナル抗体を得ることが
できる。インビボで増殖できないハイブリドーマは細胞
培養の培養上清から取得する。細胞培養によるモノクロ
ーナル抗体の取得は、抗体産生量はインビボより低い
が、マウス腹腔内に含まれる免疫グロブリンや他の夾雑
物質の混入が少なく、精製が容易であるという利点があ
る。
の取得方法は、必要量やハイブリドーマの性状などによ
って適宜選択して用いる。例えば、該ハイブリドーマを
移植したマウス腹水から取得する方法、細胞培養により
培養上清から取得する方法などが例示される。マウス腹
腔内で増殖可能なハイブリドーマであれば、腹水から数
ｍｇ／ｍＬの高濃度のモノクローナル抗体を得ることが
できる。インビボで増殖できないハイブリドーマは細胞
培養の培養上清から取得する。細胞培養によるモノクロ
ーナル抗体の取得は、抗体産生量はインビボより低い
が、マウス腹腔内に含まれる免疫グロブリンや他の夾雑
物質の混入が少なく、精製が容易であるという利点があ
る。
【００２５】抗体をハイブリドーマを移植したマウス腹
腔内から取得する場合、例えば、予めプリスタン（２、
６、１０、１４−テトラメチルペンタデカン）などの免
疫抑制作用を有する物質を投与したＢＡＬＢ／ｃマウス
の腹腔内へハイブリドーマ（約１０６個以上）を移植
し、約１〜３週間後に貯留した腹水を採取する。異種ハ
イブリドーマ（例えばマウスとラット）の場合には、ヌ
ードマウス、放射線処理マウスを使用することが好まし
い。
腔内から取得する場合、例えば、予めプリスタン（２、
６、１０、１４−テトラメチルペンタデカン）などの免
疫抑制作用を有する物質を投与したＢＡＬＢ／ｃマウス
の腹腔内へハイブリドーマ（約１０６個以上）を移植
し、約１〜３週間後に貯留した腹水を採取する。異種ハ
イブリドーマ（例えばマウスとラット）の場合には、ヌ
ードマウス、放射線処理マウスを使用することが好まし
い。
【００２６】一方、細胞培養上清から抗体を取得する場
合、例えば、細胞維持に用いられる静置培養法の他に、
高密度培養方法あるいはスピンナーフラスコ培養方法な
どの培養法を用い、当該ハイブリドーマを培養し抗体を
含有する培養上清を得る。培養液に含まれる血清は、他
の抗体やアルブミンなどの夾雑物が含まれ、抗体精製が
煩雑になることが多いので、培養液への添加は少なくす
ることが望ましい。または、ハイブリドーマを常法によ
り無血清培地に馴化し、無血清培地を用いて培養すれ
ば、抗体精製が容易になるので、より好ましい。
合、例えば、細胞維持に用いられる静置培養法の他に、
高密度培養方法あるいはスピンナーフラスコ培養方法な
どの培養法を用い、当該ハイブリドーマを培養し抗体を
含有する培養上清を得る。培養液に含まれる血清は、他
の抗体やアルブミンなどの夾雑物が含まれ、抗体精製が
煩雑になることが多いので、培養液への添加は少なくす
ることが望ましい。または、ハイブリドーマを常法によ
り無血清培地に馴化し、無血清培地を用いて培養すれ
ば、抗体精製が容易になるので、より好ましい。
【００２７】腹水や培養上清からのモノクローナル抗体
の精製は、免疫グロブリンの精製法として従来既知の硫
酸アンモニウムや硫酸ナトリウムを用いた塩析による分
画法、ポリエチレングリコール分画法、エタノール分画
法、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー法、ゲル濾
過法などを応用することで、容易に達成される。
の精製は、免疫グロブリンの精製法として従来既知の硫
酸アンモニウムや硫酸ナトリウムを用いた塩析による分
画法、ポリエチレングリコール分画法、エタノール分画
法、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー法、ゲル濾
過法などを応用することで、容易に達成される。
【００２８】さらに、モノクローナル抗体が、マウスＩ
ｇＧである場合には、プロテインＡ結合単体あるいは抗
マウスイムノグロブリン結合単体を用いたアフィニティ
ークロマトグラフィー法により精製することが可能であ
り、簡便である。
ｇＧである場合には、プロテインＡ結合単体あるいは抗
マウスイムノグロブリン結合単体を用いたアフィニティ
ークロマトグラフィー法により精製することが可能であ
り、簡便である。
【００２９】かくして得られた本発明のモノクローナル
抗体は試料中のｍＣＫ酵素活性を特異的に阻害できる。
従って、本抗体を用いることにより、試料中のｍＣＫを
選択的に排除することができ、ＣＫ−Ｍサブユニットを
選択的に排除せしめる抗体と共に使用することで、クレ
アチンキナーゼ（ＣＫ）アイソザイムであるＣＫ−Ｍ
Ｂ、ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＢＢおよびｍＣＫを分別定量す
ることが可能となる。本発明は、本発明のモノクローナ
ル抗体で処理することにより、ｍＣＫを排除することを
特徴とするクレアチンキナーゼ（ＣＫ）アイソザイムの
分別定量法を提供する。本発明の抗ｍＣＫ酵素活性阻害
モノクローナル抗体は、単独で用いてもよいし、複数の
抗ｍＣＫ阻害抗体、例えば認識部位が異なる抗体を適宜
組み合わせて用いることも可能である。
抗体は試料中のｍＣＫ酵素活性を特異的に阻害できる。
従って、本抗体を用いることにより、試料中のｍＣＫを
選択的に排除することができ、ＣＫ−Ｍサブユニットを
選択的に排除せしめる抗体と共に使用することで、クレ
アチンキナーゼ（ＣＫ）アイソザイムであるＣＫ−Ｍ
Ｂ、ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＢＢおよびｍＣＫを分別定量す
ることが可能となる。本発明は、本発明のモノクローナ
ル抗体で処理することにより、ｍＣＫを排除することを
特徴とするクレアチンキナーゼ（ＣＫ）アイソザイムの
分別定量法を提供する。本発明の抗ｍＣＫ酵素活性阻害
モノクローナル抗体は、単独で用いてもよいし、複数の
抗ｍＣＫ阻害抗体、例えば認識部位が異なる抗体を適宜
組み合わせて用いることも可能である。
【００３０】ＣＫアイソザイム測定法の基本原理は、免
疫阻害法によるＣＫアイソザイムの酵素活性を選択的に
測定する方法を利用する。一般に、例えばこの方法によ
るＣＫ−ＭＢの活性測定は次のようにして行われてい
る。すなわち、ヒトＣＫ−Ｍサブユニットに特異的な活
性阻害抗体を使用し、試料中のＣＫ−ＭＭおよびＭＢ中
のＭサブユニット活性（ＭＢは約半分の活性が阻害され
る）を阻害したのち、残存するＢサブユニット活性を２
倍することによりＣＫ−ＭＢ活性を測定する。ＣＫ−Ｍ
Ｂ活性の測定は、下述の反応式（化１）の左行反応によ
って生成するＡＴＰを、さらにヘキソキナーゼ（ＨＫ）
とグルコース６リン酸脱水素酵素（Ｇ−６−ＰＤＨ）か
らなる共役反応によりＮＡＤＰＨを生成させ、ＮＡＤＰ
Ｈの量的変化を定量することにより行う（化２）。
疫阻害法によるＣＫアイソザイムの酵素活性を選択的に
測定する方法を利用する。一般に、例えばこの方法によ
るＣＫ−ＭＢの活性測定は次のようにして行われてい
る。すなわち、ヒトＣＫ−Ｍサブユニットに特異的な活
性阻害抗体を使用し、試料中のＣＫ−ＭＭおよびＭＢ中
のＭサブユニット活性（ＭＢは約半分の活性が阻害され
る）を阻害したのち、残存するＢサブユニット活性を２
倍することによりＣＫ−ＭＢ活性を測定する。ＣＫ−Ｍ
Ｂ活性の測定は、下述の反応式（化１）の左行反応によ
って生成するＡＴＰを、さらにヘキソキナーゼ（ＨＫ）
とグルコース６リン酸脱水素酵素（Ｇ−６−ＰＤＨ）か
らなる共役反応によりＮＡＤＰＨを生成させ、ＮＡＤＰ
Ｈの量的変化を定量することにより行う（化２）。
【００３１】
【化１】
【００３２】
【化２】
【００３３】従来法では、抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体のみを用
いてＣＫ−ＭＢの測定を行っていたため、ｍＣＫも同時
に測定され正確なＣＫ−ＭＢ活性の測定が期待できなか
ったが、本発明のＣＫアイソザイムの分別定量法におい
て、クレアチンキナーゼＭ（ＣＫ−Ｍ）サブユニットお
よびミトコンドリア局在クレアチンキナーゼアイソザイ
ム（ｍＣＫ）の酵素活性を、ＣＫ−Ｍサブユニットに対
する阻害抗体およびｍＣＫに対する阻害抗体で試料を処
理することにより選択的に排除する処理をした後、残存
するＣＫ活性を測定すれば、実用上十分に正確なＣＫ−
ＭＢ測定を簡便迅速に実施できる。
いてＣＫ−ＭＢの測定を行っていたため、ｍＣＫも同時
に測定され正確なＣＫ−ＭＢ活性の測定が期待できなか
ったが、本発明のＣＫアイソザイムの分別定量法におい
て、クレアチンキナーゼＭ（ＣＫ−Ｍ）サブユニットお
よびミトコンドリア局在クレアチンキナーゼアイソザイ
ム（ｍＣＫ）の酵素活性を、ＣＫ−Ｍサブユニットに対
する阻害抗体およびｍＣＫに対する阻害抗体で試料を処
理することにより選択的に排除する処理をした後、残存
するＣＫ活性を測定すれば、実用上十分に正確なＣＫ−
ＭＢ測定を簡便迅速に実施できる。
【００３４】上記本発明のＣＫ−ＭＢ測定法では、抗Ｃ
Ｋ−Ｍ阻害抗体および本発明の抗ｍＣＫ阻害抗体とを同
一の工程中、例えば測定用酵素液中、で作用させてもよ
いし、別々の工程で、例えば本発明の抗ｍＣＫ阻害抗体
を基質液に添加し、抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体は測定用酵素液
中で、作用させてもよい。活性測定を目的とするアイソ
ザイムがＣＫ−ＭＢの場合は、好ましくは同時に、抗Ｃ
Ｋ−Ｍ阻害抗体および本発明で得た抗ｍＣＫ阻害抗体で
試料を処理して測定を行うのが簡便でよい
Ｋ−Ｍ阻害抗体および本発明の抗ｍＣＫ阻害抗体とを同
一の工程中、例えば測定用酵素液中、で作用させてもよ
いし、別々の工程で、例えば本発明の抗ｍＣＫ阻害抗体
を基質液に添加し、抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体は測定用酵素液
中で、作用させてもよい。活性測定を目的とするアイソ
ザイムがＣＫ−ＭＢの場合は、好ましくは同時に、抗Ｃ
Ｋ−Ｍ阻害抗体および本発明で得た抗ｍＣＫ阻害抗体で
試料を処理して測定を行うのが簡便でよい
【００３５】さらに本発明は、抗ｍＣＫ阻害抗体で試料
を処理することによりｍＣＫの酵素活性を選択的に排除
することを特徴とするｍＣＫ測定法を提供する。すなわ
ち、本発明のｍＣＫ測定法においては、試料中のｍＣＫ
を含むクレアチンキナーゼ活性の測定と、上記本発明の
抗ｍＣＫ阻害抗体を用いてｍＣＫ以外のクレアチンキナ
ーゼ活性の測定とを行い、得られた２つの測定値の差か
らｍＣＫ活性のみを求めることができる。この時、試料
中のｍＣＫを含むクレアチンキナーゼ活性の測定と、上
記本発明の抗ｍＣＫ阻害抗体を用いてｍＣＫ以外のクレ
アチンキナーゼ活性の測定とは、抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体な
どを含んでいる測定用試薬を使用して行ってもよいし、
含んでいない測定用試薬を使用して行ってもよい。２つ
の測定において使用する測定用試薬が抗ＣＫ−Ｍ阻害抗
体の含有に関して同条件であれば問題はない。
を処理することによりｍＣＫの酵素活性を選択的に排除
することを特徴とするｍＣＫ測定法を提供する。すなわ
ち、本発明のｍＣＫ測定法においては、試料中のｍＣＫ
を含むクレアチンキナーゼ活性の測定と、上記本発明の
抗ｍＣＫ阻害抗体を用いてｍＣＫ以外のクレアチンキナ
ーゼ活性の測定とを行い、得られた２つの測定値の差か
らｍＣＫ活性のみを求めることができる。この時、試料
中のｍＣＫを含むクレアチンキナーゼ活性の測定と、上
記本発明の抗ｍＣＫ阻害抗体を用いてｍＣＫ以外のクレ
アチンキナーゼ活性の測定とは、抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体な
どを含んでいる測定用試薬を使用して行ってもよいし、
含んでいない測定用試薬を使用して行ってもよい。２つ
の測定において使用する測定用試薬が抗ＣＫ−Ｍ阻害抗
体の含有に関して同条件であれば問題はない。
【００３６】例えば、試料中の全ＣＫ活性を測定し、測
定後さらに本発明の抗ｍＣＫ阻害抗体を加えて再度測定
を行い、得られた２つの測定値の差によりｍＣＫ活性を
求めることができる。この時、試料をまず抗ＣＫ−Ｍ阻
害抗体を用いて処理しＣＫ−ＭＭ活性とＣＫ−ＭＢの約
半分の活性とを阻害したのちに一旦測定を行って、１／
２ＣＫ−ＭＢ＋ｍＣＫ酵素活性を測定し（測定値Ａ）、
測定後さらに本発明の抗ｍＣＫ阻害抗体を加えて再度測
定を行い、１／２ＣＫ−ＭＢ酵素活性（測定値Ｂ）を測
定することにより、ｍＣＫ活性のみならずＣＫ−ＭＢ活
性を同一試料を用いて同時に簡便迅速に測定できる。す
なわち、ＣＫ−ＭＢ活性は測定値Ｂを２倍することによ
り求めることができるし、ｍＣＫ活性は測定値Ａと測定
値Ｂとの差により求めることができる。
定後さらに本発明の抗ｍＣＫ阻害抗体を加えて再度測定
を行い、得られた２つの測定値の差によりｍＣＫ活性を
求めることができる。この時、試料をまず抗ＣＫ−Ｍ阻
害抗体を用いて処理しＣＫ−ＭＭ活性とＣＫ−ＭＢの約
半分の活性とを阻害したのちに一旦測定を行って、１／
２ＣＫ−ＭＢ＋ｍＣＫ酵素活性を測定し（測定値Ａ）、
測定後さらに本発明の抗ｍＣＫ阻害抗体を加えて再度測
定を行い、１／２ＣＫ−ＭＢ酵素活性（測定値Ｂ）を測
定することにより、ｍＣＫ活性のみならずＣＫ−ＭＢ活
性を同一試料を用いて同時に簡便迅速に測定できる。す
なわち、ＣＫ−ＭＢ活性は測定値Ｂを２倍することによ
り求めることができるし、ｍＣＫ活性は測定値Ａと測定
値Ｂとの差により求めることができる。
【００３７】また例えば、試料中のｍＣＫを含むクレア
チンキナーゼ活性の測定と、試料中のｍＣＫ以外のクレ
アチンキナーゼ活性の測定とを別々に行い、得られた２
つの測定値の差からｍＣＫ活性を得ることもできる。す
なわち、試料中のｍＣＫを含むクレアチンキナーゼ活性
を例えば全ＣＫ活性測定試薬（キットＡ）を用いて測定
し、試料中のｍＣＫ以外のクレアチンキナーゼ活性を別
に調製した抗ｍＣＫ阻害抗体をキットＡに添加したキッ
トＢを用いて測定を行い、得られた２つの測定値の差か
らｍＣＫ活性を得ることができる。この時、キットＡと
して抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体を添加したＣＫ−ＭＢ活性測定
試薬を使用すれば、ｍＣＫ活性のみならず、ＣＫ−ＭＢ
活性をも求めることができる。
チンキナーゼ活性の測定と、試料中のｍＣＫ以外のクレ
アチンキナーゼ活性の測定とを別々に行い、得られた２
つの測定値の差からｍＣＫ活性を得ることもできる。す
なわち、試料中のｍＣＫを含むクレアチンキナーゼ活性
を例えば全ＣＫ活性測定試薬（キットＡ）を用いて測定
し、試料中のｍＣＫ以外のクレアチンキナーゼ活性を別
に調製した抗ｍＣＫ阻害抗体をキットＡに添加したキッ
トＢを用いて測定を行い、得られた２つの測定値の差か
らｍＣＫ活性を得ることができる。この時、キットＡと
して抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体を添加したＣＫ−ＭＢ活性測定
試薬を使用すれば、ｍＣＫ活性のみならず、ＣＫ−ＭＢ
活性をも求めることができる。
【００３８】さらに、本発明のＣＫアイソザイムの分別
定量法において、抗ｍＣＫ阻害抗体を用いて試料中のｍ
ＣＫ以外のクレアチンキナーゼ活性の測定を行い（測定
値Ｃ）、抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体と抗ｍＣＫ阻害抗体とを用
いてｍＣＫ、ＣＫ−ＭＭ、および１／２ＣＫ−ＭＢ以外
のＣＫ活性の測定を行い（測定値Ｄ）、測定値Ｃと測定
値Ｄの２倍の値との差により、ＣＫ−ＭＭ活性を求める
ことができる。
定量法において、抗ｍＣＫ阻害抗体を用いて試料中のｍ
ＣＫ以外のクレアチンキナーゼ活性の測定を行い（測定
値Ｃ）、抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体と抗ｍＣＫ阻害抗体とを用
いてｍＣＫ、ＣＫ−ＭＭ、および１／２ＣＫ−ＭＢ以外
のＣＫ活性の測定を行い（測定値Ｄ）、測定値Ｃと測定
値Ｄの２倍の値との差により、ＣＫ−ＭＭ活性を求める
ことができる。
【００３９】本発明の方法により測定される試料は特に
制限はないが、通常臨床検査の分野で行われているＣＫ
アイソザイムが測定されている方法や試料に適用しう
る。
制限はないが、通常臨床検査の分野で行われているＣＫ
アイソザイムが測定されている方法や試料に適用しう
る。
【００４０】また本発明は、本発明のＣＫアイソザイム
測定法、ＣＫ−ＭＢ測定法、ｍＣＫ測定法に必要な試薬
をキット化または単品で構成してなるＣＫアイソザイム
活性測定用試薬を提供する。本発明のＣＫアイソザイム
活性測定用試薬は、本発明の抗ｍＣＫ酵素活性阻害モノ
クローナル抗体を試薬中に含むかまたは単品として構成
してなる。ここでいう試薬には、全ＣＫ活性測定試薬
や、急性心筋梗塞の生化学的診断に用いられているＣＫ
−ＭＢ測定用試薬を、その一部として利用できるがこれ
に限定されるものではない。
測定法、ＣＫ−ＭＢ測定法、ｍＣＫ測定法に必要な試薬
をキット化または単品で構成してなるＣＫアイソザイム
活性測定用試薬を提供する。本発明のＣＫアイソザイム
活性測定用試薬は、本発明の抗ｍＣＫ酵素活性阻害モノ
クローナル抗体を試薬中に含むかまたは単品として構成
してなる。ここでいう試薬には、全ＣＫ活性測定試薬
や、急性心筋梗塞の生化学的診断に用いられているＣＫ
−ＭＢ測定用試薬を、その一部として利用できるがこれ
に限定されるものではない。
【００４１】
【実施例】以下の実施例は本発明を具体的に説明するも
のであるが、これによって本発明の範囲を制限するもの
ではない。
のであるが、これによって本発明の範囲を制限するもの
ではない。
【実施例１】モノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマの作製 （１）免疫原（抗原）の調製 ヒトｍＣＫはヒト心筋組織を用い、Ｒｏｂｅｒｔ Ｒｏ
ｂｅｒｔｓら、ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２５５巻、２８
７０〜２８７７項、１９８０、およびＡｎｎ Ｍｅｒｚ
Ｇｒａｃｅら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２５８巻、
１５３４６〜１５３５４項、１９８３に記載されている
方法により精製した。４００ｇのヒト心筋より約１０ｍ
ｇの精製ヒトｍＣＫが得られた。これを使用するまで凍
結保存した。
ーマの作製 （１）免疫原（抗原）の調製 ヒトｍＣＫはヒト心筋組織を用い、Ｒｏｂｅｒｔ Ｒｏ
ｂｅｒｔｓら、ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２５５巻、２８
７０〜２８７７項、１９８０、およびＡｎｎ Ｍｅｒｚ
Ｇｒａｃｅら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２５８巻、
１５３４６〜１５３５４項、１９８３に記載されている
方法により精製した。４００ｇのヒト心筋より約１０ｍ
ｇの精製ヒトｍＣＫが得られた。これを使用するまで凍
結保存した。
【００４２】（２）被免疫動物 ５〜８週令の近交系ＢＡＬＢ／ｃ系マウス雌を、動物飼
育チェンバー内（２３±１℃、湿度７０％）で、標準ペ
レットを使用して飼育し、任意に給水して飼育した。
育チェンバー内（２３±１℃、湿度７０％）で、標準ペ
レットを使用して飼育し、任意に給水して飼育した。
【００４３】（３）免疫方法 上記（１）で調製した精製ヒトｍＣＫを抗原として用
い、１００μｇ／０．５ｍＬとなる様にＰＢＳで調製
し、同量（０．５ｍＬ）のフロイント完全アジュバント
（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａ
ｎｔ）（Ｄｉｆｃｏ社製）を混合して乳化した。この乳
化状の抗原を、５週令の４匹の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス
の腹腔に１匹あたり２００μＬ投与した。さらに２週間
毎に、Ｒｉｂｉアジュバントにて１００μｇ／ｍＬとな
るように調製した上記抗原をマウス当たり２０μｇずつ
４回投与した。さらに１ヶ月の後Ｒｉｂｉアジュバント
で１００μｇ／ｍＬとなるように調製した上記抗原を同
様に追加免疫した後、マウスの抗体価を測定した。抗体
価の高いマウスはさらに２週間後、抗原である精製ヒト
ｍＣＫをＰＢＳで１００μｇ／ｍＬに調製し、マウス尾
静脈より注射して最終免疫した。
い、１００μｇ／０．５ｍＬとなる様にＰＢＳで調製
し、同量（０．５ｍＬ）のフロイント完全アジュバント
（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａ
ｎｔ）（Ｄｉｆｃｏ社製）を混合して乳化した。この乳
化状の抗原を、５週令の４匹の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス
の腹腔に１匹あたり２００μＬ投与した。さらに２週間
毎に、Ｒｉｂｉアジュバントにて１００μｇ／ｍＬとな
るように調製した上記抗原をマウス当たり２０μｇずつ
４回投与した。さらに１ヶ月の後Ｒｉｂｉアジュバント
で１００μｇ／ｍＬとなるように調製した上記抗原を同
様に追加免疫した後、マウスの抗体価を測定した。抗体
価の高いマウスはさらに２週間後、抗原である精製ヒト
ｍＣＫをＰＢＳで１００μｇ／ｍＬに調製し、マウス尾
静脈より注射して最終免疫した。
【００４４】（４） 抗体価測定（抗体価アッセイ） 抗体価の測定に当たっては、定期的にマウス眼底網膜よ
り少量の全血を採取し、血清を分離した後使用直前まで
凍結保存した。免疫開始時より、ヒトｍＣＫに対する抗
体価をｍＣＫ酵素活性阻害抗体法により調べた。
り少量の全血を採取し、血清を分離した後使用直前まで
凍結保存した。免疫開始時より、ヒトｍＣＫに対する抗
体価をｍＣＫ酵素活性阻害抗体法により調べた。
【００４５】すなわち、各マウスの抗血清をＰＢＳで１
０〜１，０００倍希釈して調製した抗体液２５μＬと２
５μＬのｍＣＫ酵素液（２００Ｕ／Ｌ）とを９６穴マイ
クロタイタープレートに加え室温で１０分間反応した
後、１００μＬの酵素試薬〔１００ｍＭ イミダゾー
ル、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、２
ｍＭ アデノシン−５’−ニリン酸（ＡＤＰ）、５ｍＭ
アデノシン−５’−一リン酸（ＡＭＰ）、４０μＭ
Ｐ１，Ｐ５−ジ（アデノシン−５’）五リン酸（ＡＰ５
Ａ）、３０ｍＭ １−チオグリセロール、２８ｍＭ Ｄ
−グルコース、２ｍＭ ＮＡＤＰ、３Ｕ／ｍＬ ＨＫ、
２Ｕ／ｍＬ グルコース−６−リン酸脱水素酵素、３０
ｍＭ クレアチンリン酸二ナトリウム、０．３ｍｇ／ｍ
Ｌ ニトロブルーテトラゾリウムクロライド、０．６Ｕ
／ｍＬ ダイアフォラーゼ、ｐＨ６．６〕を９６穴マイ
クロタイタープレートに加え、３７℃で１０分間反応さ
せた。ついで、波長５７０ｎｍにおける吸光度を試薬盲
検を対照に測定した。なお、抗体陰性コントロールとし
て抗血清の代わりに非免疫マウス血清を添加し、陰性コ
ントロールとした。
０〜１，０００倍希釈して調製した抗体液２５μＬと２
５μＬのｍＣＫ酵素液（２００Ｕ／Ｌ）とを９６穴マイ
クロタイタープレートに加え室温で１０分間反応した
後、１００μＬの酵素試薬〔１００ｍＭ イミダゾー
ル、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、２
ｍＭ アデノシン−５’−ニリン酸（ＡＤＰ）、５ｍＭ
アデノシン−５’−一リン酸（ＡＭＰ）、４０μＭ
Ｐ１，Ｐ５−ジ（アデノシン−５’）五リン酸（ＡＰ５
Ａ）、３０ｍＭ １−チオグリセロール、２８ｍＭ Ｄ
−グルコース、２ｍＭ ＮＡＤＰ、３Ｕ／ｍＬ ＨＫ、
２Ｕ／ｍＬ グルコース−６−リン酸脱水素酵素、３０
ｍＭ クレアチンリン酸二ナトリウム、０．３ｍｇ／ｍ
Ｌ ニトロブルーテトラゾリウムクロライド、０．６Ｕ
／ｍＬ ダイアフォラーゼ、ｐＨ６．６〕を９６穴マイ
クロタイタープレートに加え、３７℃で１０分間反応さ
せた。ついで、波長５７０ｎｍにおける吸光度を試薬盲
検を対照に測定した。なお、抗体陰性コントロールとし
て抗血清の代わりに非免疫マウス血清を添加し、陰性コ
ントロールとした。
【００４６】得られた吸光度から、ｍＣＫ酵素活性阻害
特異抗体が血液中に産生されていればｍＣＫの酵素活性
が阻害され基質反応が抑制されて吸光度の変化量が低く
なるため、ｍＣＫ酵素活性阻害特異抗体の存在を特定す
ることができた。
特異抗体が血液中に産生されていればｍＣＫの酵素活性
が阻害され基質反応が抑制されて吸光度の変化量が低く
なるため、ｍＣＫ酵素活性阻害特異抗体の存在を特定す
ることができた。
【００４７】（５） 反応特異性の検討 得られた抗ｍＣＫ酵素活性阻害ポリクローナル抗体はさ
らに、ヒトｍＣＫの代りにヒトＣＫ−ＭＢまたはヒトＣ
Ｋ−ＭＭを至適濃度に加えた酵素液をそれぞれ調製し、
上記（４）と同様の方法により各ＣＫアイソザイムに対
する酵素活性阻害を確認した。
らに、ヒトｍＣＫの代りにヒトＣＫ−ＭＢまたはヒトＣ
Ｋ−ＭＭを至適濃度に加えた酵素液をそれぞれ調製し、
上記（４）と同様の方法により各ＣＫアイソザイムに対
する酵素活性阻害を確認した。
【００４８】（６）細胞融合 最終免疫から３日後にＢＡＬＢ／ｃマウスの摘脾を行
い、ＥＭＥＭ培養液中で脾細胞を浮遊させて、脾細胞の
浮遊液を作製した。ついで、脾細胞をＥＭＥＭ培養液で
４回洗浄した後、細胞数を算定し、７．０×１０８個の
脾細胞を得た。
い、ＥＭＥＭ培養液中で脾細胞を浮遊させて、脾細胞の
浮遊液を作製した。ついで、脾細胞をＥＭＥＭ培養液で
４回洗浄した後、細胞数を算定し、７．０×１０８個の
脾細胞を得た。
【００４９】細胞融合は、８−アザグアニン（２−ａｍ
ｉｎｏ−６−ｏｘｙ−８ａｚａｐｕｒｉｎｅ） 耐性の
ＢＡＬＢ／ｃマウス由来骨髄腫培養細胞株（Ｐ３Ｘ６３
−Ａｇ８・６５３、以下、Ｘ６３細胞という）を親細胞
株として用いた。
ｉｎｏ−６−ｏｘｙ−８ａｚａｐｕｒｉｎｅ） 耐性の
ＢＡＬＢ／ｃマウス由来骨髄腫培養細胞株（Ｐ３Ｘ６３
−Ａｇ８・６５３、以下、Ｘ６３細胞という）を親細胞
株として用いた。
【００５０】Ｘ６３細胞は、非働化した牛胎児血清（ｆ
ｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ：ＦＣＳ）１０％を含
むＲＰＭＩ−１６４０培養液（２０μｇ／ｍＬ，８−ア
ザグアニン含有）で継代培養した。細胞融合の３日前よ
り８−アザグアニンを含有しない１０％ＦＣＳ含有ＲＰ
ＭＩ−１６４０培養液でさらに培養し、対数増殖期の細
胞を用いた。Ｘ６３細胞はＲＰＭＩ−１６４０培養液で
３回洗浄した後、細胞数を算定し、７×１０７個の生細
胞を得た。
ｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ：ＦＣＳ）１０％を含
むＲＰＭＩ−１６４０培養液（２０μｇ／ｍＬ，８−ア
ザグアニン含有）で継代培養した。細胞融合の３日前よ
り８−アザグアニンを含有しない１０％ＦＣＳ含有ＲＰ
ＭＩ−１６４０培養液でさらに培養し、対数増殖期の細
胞を用いた。Ｘ６３細胞はＲＰＭＩ−１６４０培養液で
３回洗浄した後、細胞数を算定し、７×１０７個の生細
胞を得た。
【００５１】ＲＰＭＩ−１６４０培養液で、ポリエチレ
ングリコール−４０００が５０（Ｗ／Ｖ）％濃度となる
ように溶解し、上記の脾細胞とＸ６３細胞との比が１
０：１となるように混合し、ケーラーおよびミルシュタ
イン共著：ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ 第２５６巻，４
９５−４９７，１９７５）およびヨーロピアン ジャー
ナル オブ イムノロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．第６巻，５１１−５１９，１９７６年）の方法に準
じて細胞融合を行った。
ングリコール−４０００が５０（Ｗ／Ｖ）％濃度となる
ように溶解し、上記の脾細胞とＸ６３細胞との比が１
０：１となるように混合し、ケーラーおよびミルシュタ
イン共著：ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ 第２５６巻，４
９５−４９７，１９７５）およびヨーロピアン ジャー
ナル オブ イムノロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．第６巻，５１１−５１９，１９７６年）の方法に準
じて細胞融合を行った。
【００５２】その後、１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ
−１６４０培養液に、１×１０−４Ｍ のヒポキサンチ
ン、４×１０−７Ｍのアミノプテリンおよび１．６×１
０− ５Ｍ のチミジン（ＨＡＴ）を含有するＨＡＴ選択
培地に、脾細胞が２．０×１０６個／ｍＬとなるように
浮遊させた。ついで、この細胞浮遊液を５０μＬずつ、
９６穴マイクロタイタープレートの各ウエルに分注した
後、ＣＯ２無菌培養器において温度３７℃、湿度９５
％、８％のＣＯ２ 雰囲気で培養を行なった。培養開始
後、１日目と２日目にＨＡＴ選択培地を各ウエルに１滴
ずつ、また培養開始後７日目と９日目にＨＡＴ選択培地
を、各ウエルに２滴ずつ添加してさらに培養を行った。
その後、ＨＡＴを含まない培養液で育成させ、約１０日
〜２週間後に、目的のモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマを下記に記載したスクリーニング方法によ
って選別した。
−１６４０培養液に、１×１０−４Ｍ のヒポキサンチ
ン、４×１０−７Ｍのアミノプテリンおよび１．６×１
０− ５Ｍ のチミジン（ＨＡＴ）を含有するＨＡＴ選択
培地に、脾細胞が２．０×１０６個／ｍＬとなるように
浮遊させた。ついで、この細胞浮遊液を５０μＬずつ、
９６穴マイクロタイタープレートの各ウエルに分注した
後、ＣＯ２無菌培養器において温度３７℃、湿度９５
％、８％のＣＯ２ 雰囲気で培養を行なった。培養開始
後、１日目と２日目にＨＡＴ選択培地を各ウエルに１滴
ずつ、また培養開始後７日目と９日目にＨＡＴ選択培地
を、各ウエルに２滴ずつ添加してさらに培養を行った。
その後、ＨＡＴを含まない培養液で育成させ、約１０日
〜２週間後に、目的のモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマを下記に記載したスクリーニング方法によ
って選別した。
【００５３】（７）スクリーニング 上記ハイブリドーマの培養上清を用いて、ｍＣＫ酵素活
性阻害による方法により実施した。
性阻害による方法により実施した。
【００５４】すなわち、２５μＬのハイブリドーマ培養
上清と２５μＬのｍＣＫ酵素液（２００Ｕ／Ｌ）とを９
６穴マイクロタイタープレートに加え室温で１０分間反
応した後、１００μＬの酵素試薬〔１００ｍＭ イミダ
ゾール、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ酢酸マグネシウ
ム、２ｍＭ アデノシン−５’−ニリン酸（ＡＤＰ）、
５ｍＭ アデノシン−５’−一リン酸（ＡＭＰ）、４０
μＭ Ｐ１，Ｐ５−ジ（アデノシン−５’）五リン酸
（ＡＰ５Ａ）、３０ｍＭ １−チオグリセロール、２８
ｍＭ Ｄ−グルコース、２ｍＭ ＮＡＤＰ、３Ｕ／ｍＬ
ＨＫ、２Ｕ／ｍＬグルコース−６−リン酸脱水素酵
素、３０ｍＭ クレアチンリン酸二ナトリウム、０．３
ｍｇ／ｍＬ ニトロブルーテトラゾリウムクロライド、
０．６Ｕ／ｍＬ ダイアフォラーゼ、ｐＨ６．６〕を９
６穴マイクロタイタープレートに加え、３７℃で１０分
間反応させた。ついで、波長５７０ｎｍにおける吸光度
を試薬盲検を対照に測定した。なお、抗体陰性コントロ
ールとしてハイブリドーマ培養上清の代わりに培養液の
みを添加し、陰性コントロールとした。
上清と２５μＬのｍＣＫ酵素液（２００Ｕ／Ｌ）とを９
６穴マイクロタイタープレートに加え室温で１０分間反
応した後、１００μＬの酵素試薬〔１００ｍＭ イミダ
ゾール、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ酢酸マグネシウ
ム、２ｍＭ アデノシン−５’−ニリン酸（ＡＤＰ）、
５ｍＭ アデノシン−５’−一リン酸（ＡＭＰ）、４０
μＭ Ｐ１，Ｐ５−ジ（アデノシン−５’）五リン酸
（ＡＰ５Ａ）、３０ｍＭ １−チオグリセロール、２８
ｍＭ Ｄ−グルコース、２ｍＭ ＮＡＤＰ、３Ｕ／ｍＬ
ＨＫ、２Ｕ／ｍＬグルコース−６−リン酸脱水素酵
素、３０ｍＭ クレアチンリン酸二ナトリウム、０．３
ｍｇ／ｍＬ ニトロブルーテトラゾリウムクロライド、
０．６Ｕ／ｍＬ ダイアフォラーゼ、ｐＨ６．６〕を９
６穴マイクロタイタープレートに加え、３７℃で１０分
間反応させた。ついで、波長５７０ｎｍにおける吸光度
を試薬盲検を対照に測定した。なお、抗体陰性コントロ
ールとしてハイブリドーマ培養上清の代わりに培養液の
みを添加し、陰性コントロールとした。
【００５５】得られた吸光度から、ｍＣＫの酵素活性を
阻害する抗体が存在した場合には基質反応が抑制される
ため吸光度の変化量が低くなるので、ｍＣＫに対する阻
害抗体を産生しているハイブリドーマを特定することが
できた。
阻害する抗体が存在した場合には基質反応が抑制される
ため吸光度の変化量が低くなるので、ｍＣＫに対する阻
害抗体を産生しているハイブリドーマを特定することが
できた。
【００５６】得られた抗ヒトｍＣＫ酵素活性阻害モノク
ローナル抗体はさらに、ヒトｍＣＫの代りにヒトＣＫ−
ＭＢまたはヒトＣＫ−ＭＭを用い、上記と同様の方法に
より各酵素に対する酵素活性阻害を確認した。上記
（７）のスクリーニング方法により、ハイブリドーマの
増殖が認められた９６穴マイクロタイタープレートの２
４９６穴についてスクリーニングを実施し、１０穴につ
いてｍＣＫ酵素活性を阻害するモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマの存在が認められた。
ローナル抗体はさらに、ヒトｍＣＫの代りにヒトＣＫ−
ＭＢまたはヒトＣＫ−ＭＭを用い、上記と同様の方法に
より各酵素に対する酵素活性阻害を確認した。上記
（７）のスクリーニング方法により、ハイブリドーマの
増殖が認められた９６穴マイクロタイタープレートの２
４９６穴についてスクリーニングを実施し、１０穴につ
いてｍＣＫ酵素活性を阻害するモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマの存在が認められた。
【００５７】（８）モノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマ株の樹立（クローニング） 上記（７）のスクリーニングにより得られた１０穴中の
ハイブリドーマを限界希釈法によりクローニングした。
その結果、上記１０穴中のハイブリドーマの内、安定に
ｍＣＫ酵素活性阻害を示すモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマ細胞を１クロ−ン選択した。このハイ
ブリドーマを樹立株とし、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７
１３３号として通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所に寄託した。
ーマ株の樹立（クローニング） 上記（７）のスクリーニングにより得られた１０穴中の
ハイブリドーマを限界希釈法によりクローニングした。
その結果、上記１０穴中のハイブリドーマの内、安定に
ｍＣＫ酵素活性阻害を示すモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマ細胞を１クロ−ン選択した。このハイ
ブリドーマを樹立株とし、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７
１３３号として通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所に寄託した。
【００５８】（９）マウスイムノグロブリンサブクラス
の同定 上記、クローニングにより単一クローンとして得られた
ハイブリドーマ クローン（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１３
３）の産生するモノクローナル抗体のマウスイムノグロ
ブリンサブクラスを、ザイメッド（Ｚｙｍｅｄ）社製
モノアブタイピングキット（ＭＯＮＯＡｂ ｔｙｐｉｎ
ｇ ｋｉｔ）を使用して同定した。その結果ＦＥＲＭ
ＢＰ−７１３３が産生するモノクローナル抗体（ ｍＣ
ＫＩ−５７８）はイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ１，κ）
であることが判明した。
の同定 上記、クローニングにより単一クローンとして得られた
ハイブリドーマ クローン（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１３
３）の産生するモノクローナル抗体のマウスイムノグロ
ブリンサブクラスを、ザイメッド（Ｚｙｍｅｄ）社製
モノアブタイピングキット（ＭＯＮＯＡｂ ｔｙｐｉｎ
ｇ ｋｉｔ）を使用して同定した。その結果ＦＥＲＭ
ＢＰ−７１３３が産生するモノクローナル抗体（ ｍＣ
ＫＩ−５７８）はイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ１，κ）
であることが判明した。
【００５９】（１０） ｍＣＫＩ−５７８のヒトＣＫア
イソザイムに対する特異性 得られた抗体ｍＣＫＩ−５７８の、ヒトＣＫアイソザイ
ムに対する特異性を確認するため、ヒトｍＣＫ、ヒトＣ
Ｋ−ＭＭ、ヒトＣＫ−ＢＢまたはヒトＣＫ−ＭＢを用
い、上記（７）と同様の方法により各アイソザイムに対
する酵素活性阻害を確認した。その結果を表１に示し
た。ｍＣＫＩ−５７８は、ｍＣＫの酵素活性を約９０％
阻害したが、ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＢＢ、およびＣＫ−Ｍ
Ｂの酵素活性は阻害しなかった。従って、ｍＣＫＩ−５
７８は、ｍＣＫのみを特異的に認識し、ｍＣＫ酵素活性
を選択的に阻害する抗体であることが確認された。一
方、ＦＥＲＭ ＢＰ−７１３３と同様に作製された別の
ハイブリドーマ クローンから産生されたＣＫ−１７７
３はいずれのＣＫアイソザイムも阻害しなかった。
イソザイムに対する特異性 得られた抗体ｍＣＫＩ−５７８の、ヒトＣＫアイソザイ
ムに対する特異性を確認するため、ヒトｍＣＫ、ヒトＣ
Ｋ−ＭＭ、ヒトＣＫ−ＢＢまたはヒトＣＫ−ＭＢを用
い、上記（７）と同様の方法により各アイソザイムに対
する酵素活性阻害を確認した。その結果を表１に示し
た。ｍＣＫＩ−５７８は、ｍＣＫの酵素活性を約９０％
阻害したが、ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＢＢ、およびＣＫ−Ｍ
Ｂの酵素活性は阻害しなかった。従って、ｍＣＫＩ−５
７８は、ｍＣＫのみを特異的に認識し、ｍＣＫ酵素活性
を選択的に阻害する抗体であることが確認された。一
方、ＦＥＲＭ ＢＰ−７１３３と同様に作製された別の
ハイブリドーマ クローンから産生されたＣＫ−１７７
３はいずれのＣＫアイソザイムも阻害しなかった。
【００６０】
【表１】モノクローナル抗体ｍＣＫＩ−５７８の特異性
【００６１】（１１）ｍＣＫＩ−５７８のサルコメラｍ
ＣＫに対する阻害活性 ｍＣＫＩ−５７８のサルコメラｍＣＫに対する阻害能を
上記（７）と同様の方法で検討したところ、図１に示す
ように約９８％の阻害が認められた。
ＣＫに対する阻害活性 ｍＣＫＩ−５７８のサルコメラｍＣＫに対する阻害能を
上記（７）と同様の方法で検討したところ、図１に示す
ように約９８％の阻害が認められた。
【００６２】
【実施例２】実施例１で得られたｍＣＫＩ−５７８を用
いたＣＫ−ＭＢ測定 ヒト健常人検体またはヒトｍＣＫ陽性検体１００μｌに
生理食塩水、抗ヒトＣＫ−Ｍ阻害抗体（ヤギ）、抗ヒト
ｍＣＫ阻害抗体（実施例１）または２つの抗体を混合し
たものを各々１０μｌ加えて電気泳動を行った。電気泳
動はポルＥフィルムシステム（アガロース電気泳動）を
使用し、４０分間泳動した。泳動後、ＣＫ発色試薬〔１
００ｍＭイミダゾール、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ酢
酸マグネシウム、２ｍＭアデノシン−５’−二リン酸
（ＡＤＰ）、５ｍＭアデノシン−５’−一リン酸（ＡＭ
Ｐ）、４０μＭ Ｐ１，Ｐ５−ジ（アデノシン−５’−
五リン酸（ＡＰ５Ａ）、３０ｍＭ １−チオグリセロー
ル、２０ｍＭ Ｄ−グルコース、２ｍＭ ＮＡＤＰ、３
Ｕ／ｍｌヘキソキナーゼ、２Ｕ／ｍｌグルコース−６−
リン酸脱水素酵素、３０ｍＭクレアチンリン酸、１ｍｇ
／ｍｌのニトロブルーテトラゾリウム、３Ｕ／ｍｌのダ
イアフォラーゼ、ＰＨ６．６〕を泳動したゲルに染み込
ませて３７℃で３０分間インキュベートした。５％酢酸
水溶液で反応を停止し、精製水で洗浄後、ゲルを乾燥さ
せてコピーした。抗ヒトＣＫ−Ｍ阻害抗体だけではｍＣ
Ｋを阻害できないため、ｍＣＫもＣＫ−ＭＢとして測定
されてしまうが、抗ヒトＣＫ−Ｍ阻害抗体と抗ヒトｍＣ
Ｋ阻害抗体（実施例１）を併用して使用することにより
ＣＫ−ＭＢが特異的に測定されることが示唆された。
いたＣＫ−ＭＢ測定 ヒト健常人検体またはヒトｍＣＫ陽性検体１００μｌに
生理食塩水、抗ヒトＣＫ−Ｍ阻害抗体（ヤギ）、抗ヒト
ｍＣＫ阻害抗体（実施例１）または２つの抗体を混合し
たものを各々１０μｌ加えて電気泳動を行った。電気泳
動はポルＥフィルムシステム（アガロース電気泳動）を
使用し、４０分間泳動した。泳動後、ＣＫ発色試薬〔１
００ｍＭイミダゾール、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ酢
酸マグネシウム、２ｍＭアデノシン−５’−二リン酸
（ＡＤＰ）、５ｍＭアデノシン−５’−一リン酸（ＡＭ
Ｐ）、４０μＭ Ｐ１，Ｐ５−ジ（アデノシン−５’−
五リン酸（ＡＰ５Ａ）、３０ｍＭ １−チオグリセロー
ル、２０ｍＭ Ｄ−グルコース、２ｍＭ ＮＡＤＰ、３
Ｕ／ｍｌヘキソキナーゼ、２Ｕ／ｍｌグルコース−６−
リン酸脱水素酵素、３０ｍＭクレアチンリン酸、１ｍｇ
／ｍｌのニトロブルーテトラゾリウム、３Ｕ／ｍｌのダ
イアフォラーゼ、ＰＨ６．６〕を泳動したゲルに染み込
ませて３７℃で３０分間インキュベートした。５％酢酸
水溶液で反応を停止し、精製水で洗浄後、ゲルを乾燥さ
せてコピーした。抗ヒトＣＫ−Ｍ阻害抗体だけではｍＣ
Ｋを阻害できないため、ｍＣＫもＣＫ−ＭＢとして測定
されてしまうが、抗ヒトＣＫ−Ｍ阻害抗体と抗ヒトｍＣ
Ｋ阻害抗体（実施例１）を併用して使用することにより
ＣＫ−ＭＢが特異的に測定されることが示唆された。
【００６３】
【実施例３】ｍＣＫＩ−５７８を用いた筋肉疾患患者検
体のＣＫ−ＭＢ測定 測定用酵素液（１４０ｍＭイミダゾール、２．８ｍＭ
ＥＤＴＡ、１４ｍＭ酢酸マグネシウム、２．８ｍＭアデ
ノシン−５’−ニリン酸（ＡＤＰ）、７ｍＭアデノシン
−５’−一リン酸（ＡＭＰ）、１４μＭ Ｐ１，Ｐ５−
ジ（アデノシン−５’）五リン酸（ＡＰ５Ａ）、４２ｍ
Ｍ １−チオグリセロール、２８ｍＭＤ−グルコース、
２ｍＭ ＮＡＤＰ、４．２Ｕ／ｍｌ ヘキソキナーゼ、
２．１Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ、ｐＨ６．６）に抗ヒトＣ
Ｋ−Ｍ阻害抗体（ヤギ）１．０Ｕ／ｍｌ添加したもの
（対照法）とさらに１Ｕ／ｍｌの抗ヒトｍＣＫ阻害抗体
（実施例１）を添加したもの（本発明）を調製した。Ｃ
Ｋ活性が３００Ｕ／Ｌ以上の筋肉疾患検体１５例につい
て、血清２０μｌに、本発明の抗体を添加していない上
記測定用酵素液を２５０μｌ加えて３７℃で恒温とした
後、波長３４０ｎｍにおける吸光度を測定した（Ａ）。
さらに、これに基質液として１５０ｍＭクレアチンリン
酸二ナトリウム１００μｌを添加し２〜３分後より吸光
度変化を測定した（Ｂ）。ＣＫ−ＭＢ活性は以下の計算
式（数１）により算出した。次に、同一検体について、
本発明の抗体を添加した測定用酵素液を用いて同様に操
作し、ＣＫ活性を測定した。
体のＣＫ−ＭＢ測定 測定用酵素液（１４０ｍＭイミダゾール、２．８ｍＭ
ＥＤＴＡ、１４ｍＭ酢酸マグネシウム、２．８ｍＭアデ
ノシン−５’−ニリン酸（ＡＤＰ）、７ｍＭアデノシン
−５’−一リン酸（ＡＭＰ）、１４μＭ Ｐ１，Ｐ５−
ジ（アデノシン−５’）五リン酸（ＡＰ５Ａ）、４２ｍ
Ｍ １−チオグリセロール、２８ｍＭＤ−グルコース、
２ｍＭ ＮＡＤＰ、４．２Ｕ／ｍｌ ヘキソキナーゼ、
２．１Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ、ｐＨ６．６）に抗ヒトＣ
Ｋ−Ｍ阻害抗体（ヤギ）１．０Ｕ／ｍｌ添加したもの
（対照法）とさらに１Ｕ／ｍｌの抗ヒトｍＣＫ阻害抗体
（実施例１）を添加したもの（本発明）を調製した。Ｃ
Ｋ活性が３００Ｕ／Ｌ以上の筋肉疾患検体１５例につい
て、血清２０μｌに、本発明の抗体を添加していない上
記測定用酵素液を２５０μｌ加えて３７℃で恒温とした
後、波長３４０ｎｍにおける吸光度を測定した（Ａ）。
さらに、これに基質液として１５０ｍＭクレアチンリン
酸二ナトリウム１００μｌを添加し２〜３分後より吸光
度変化を測定した（Ｂ）。ＣＫ−ＭＢ活性は以下の計算
式（数１）により算出した。次に、同一検体について、
本発明の抗体を添加した測定用酵素液を用いて同様に操
作し、ＣＫ活性を測定した。
【００６４】
【数１】 ２※： ＣＫ−Ｂ活性をＣＫ−ＭＢ活性に変換するファ
クター
クター
【００６５】この結果、筋肉疾患患者検体は従来行われ
ていた対照法では急性心筋梗塞患者検体でないにもかか
わらず１０検体が２５Ｕ／Ｌ以上の活性を示した。しか
しながら、本発明においてはすべての検体が２５Ｕ／Ｌ
以下となった（表２）。
ていた対照法では急性心筋梗塞患者検体でないにもかか
わらず１０検体が２５Ｕ／Ｌ以上の活性を示した。しか
しながら、本発明においてはすべての検体が２５Ｕ／Ｌ
以下となった（表２）。
【００６６】
【表２】
【００６７】以上の結果より、本発明はＣＫ−ＭＢの非
特異反応を減少させることにより急性心筋梗塞に対する
早期マーカーとして従来よりも感度が高くなることが期
待される。
特異反応を減少させることにより急性心筋梗塞に対する
早期マーカーとして従来よりも感度が高くなることが期
待される。
【００６８】
【発明の効果】本発明の抗ヒトｍＣＫ阻害モノクローナ
ル抗体を用いたＣＫアイソザイム分別定量法により、従
来の測定方法では不可能であった、ＣＫ−ＭＢ、ｍＣ
Ｋ、ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＢＢの選択的かつ正確な定量が
可能となった。特にＣＫ−ＭＢは心筋梗塞のマーカーで
あり、本発明のＣＫ−ＭＢ測定法により急性心筋梗塞の
重篤度や病態の把握が確度高く迅速に行えるので、急性
心筋梗塞における早期診断のみならずその治療のモニタ
ーなどの臨床検査上、本発明は大きな意義を持つ。ま
た、ｍＣＫは肝疾患、悪性腫瘍、ロタウイルス腸炎など
で増加することが知られており、本発明はこれら疾患の
診断に有用である。
ル抗体を用いたＣＫアイソザイム分別定量法により、従
来の測定方法では不可能であった、ＣＫ−ＭＢ、ｍＣ
Ｋ、ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＢＢの選択的かつ正確な定量が
可能となった。特にＣＫ−ＭＢは心筋梗塞のマーカーで
あり、本発明のＣＫ−ＭＢ測定法により急性心筋梗塞の
重篤度や病態の把握が確度高く迅速に行えるので、急性
心筋梗塞における早期診断のみならずその治療のモニタ
ーなどの臨床検査上、本発明は大きな意義を持つ。ま
た、ｍＣＫは肝疾患、悪性腫瘍、ロタウイルス腸炎など
で増加することが知られており、本発明はこれら疾患の
診断に有用である。
【００６９】
【図１】 モノクローナル抗体ｍＣＫＩ−５７８の、サ
ルコメラｍＣＫに対する阻害能を示す図面である。
ルコメラｍＣＫに対する阻害能を示す図面である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/577 (Ｃ１２Ｐ 21/08 //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA44 DA02 GA03 HA15 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13 4B065 AA92X AB05 AC20 BA08 CA25 4H045 AA11 CA40 DA86 EA55 FA74
Claims (20)
- 【請求項１】 ミトコンドリア局在クレアチンキナーゼ
アイソザイム（ｍＣＫ）を阻害するモノクローナル抗
体。 - 【請求項２】 ミトコンドリア局在クレアチンキナーゼ
アイソザイム（ｍＣＫ）を阻害する能力が、ＣＫアイソ
ザイムの分別定量において実質的にｍＣＫ以外のＣＫア
イソザイムの測定に影響が無い程度にまでｍＣＫを阻害
する能力である請求項１に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 ミトコンドリア局在クレアチンキナーゼ
アイソザイム（ｍＣＫ）を６０％以上阻害する抗体。 - 【請求項４】 ミトコンドリア局在クレアチンキナーゼ
アイソザイム（ｍＣＫ）を８０％以上阻害する請求項３
に記載の抗体。 - 【請求項５】 少なくともサルコメラｍＣＫを９０％以
上阻害する抗体。 - 【請求項６】 抗体がモノクローナル抗体である請求項
３から５のいずれか１項に記載の抗体。 - 【請求項７】 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７１３３号に
より寄託されているハイブリドーマが産生するモノクロ
ーナル抗体。 - 【請求項８】 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７１３３号に
より寄託されているハイブリドーマ。 - 【請求項９】 少なくとも請求項１〜７のいずれか１項
に記載の抗体またはモノクローナル抗体で処理すること
により、ミトコンドリア局在クレアチンキナーゼアイソ
ザイム（ｍＣＫ）を排除することを特徴とするクレアチ
ンキナーゼ（ＣＫ）アイソザイムの分別定量法。 - 【請求項１０】 分別定量される前記クレアチンキナー
ゼ（ＣＫ）アイソザイムが、ＣＫ−ＭＢ、ＣＫ−ＭＭ、
ＣＫ−ＢＢ、またはｍＣＫである請求項９に記載のＣＫ
アイソザイムの分別定量法。 - 【請求項１１】 請求項９に記載のクレアチンキナーゼ
（ＣＫ）アイソザイム分別定量法であって、クレアチン
キナーゼＭ（ＣＫ−Ｍ）サブユニットおよびミトコンド
リア局在クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）の
酵素活性を、ＣＫ−Ｍサブユニットに対する阻害抗体お
よびｍＣＫに対する阻害抗体で試料を処理することによ
り選択的に排除する処理をした後、残存するＣＫ活性を
測定するクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫ−
ＭＢ）測定法。 - 【請求項１２】 クレアチンキナーゼＭ（ＣＫ−Ｍ）サ
ブユニットに対する阻害抗体およびミトコンドリア局在
クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）に対する阻
害抗体とを一つの工程中で同時に作用させることを特徴
とする請求項１１に記載のクレアチンキナーゼＭＢアイ
ソザイム（ＣＫ−ＭＢ）測定法。 - 【請求項１３】 クレアチンキナーゼＭ（ＣＫ−Ｍ）サ
ブユニットに対する阻害抗体およびミトコンドリア局在
クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）に対する阻
害抗体とを別々の工程で作用させることを特徴とする請
求項１１に記載のクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム
（ＣＫ−ＭＢ）測定法。 - 【請求項１４】 請求項９に記載のクレアチンキナーゼ
（ＣＫ）アイソザイム分別定量法であって、ミトコンド
リア局在クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）の
酵素活性をｍＣＫに対する阻害抗体で試料を処理するこ
とにより選択的に排除することを特徴とするｍＣＫ測定
法。 - 【請求項１５】 請求項１４に記載のミトコンドリア局
在クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）測定法で
あって、まず試料中のｍＣＫを含むクレアチンキナーゼ
（ＣＫ）活性を測定し、ついで少なくとも請求項１〜７
のいずれか１項に記載の抗体またはモノクローナル抗体
を加えて処理することによりｍＣＫの酵素活性を阻害し
てｍＣＫ以外のＣＫ活性を再度測定し、測定値の差から
ｍＣＫ活性を得ることを特徴とするｍＣＫ測定法。 - 【請求項１６】 請求項１４に記載のミトコンドリア局
在クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）測定法で
あって、試料中のｍＣＫを含むクレアチンキナーゼ（Ｃ
Ｋ）の測定と、試料中のｍＣＫ以外のＣＫ活性とを別々
に測定し、測定値の差からｍＣＫ活性を得ることを特徴
とするｍＣＫ測定法。 - 【請求項１７】 請求項９に記載のクレアチンキナーゼ
（ＣＫ）アイソザイム分別定量法において、クレアチン
キナーゼＭ（ＣＫ−Ｍ）サブユニットに対する阻害抗体
で試料を処理してＣＫ活性の測定を行う工程と、ＣＫ−
Ｍサブユニットに対する阻害抗体とミトコンドリア局在
クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）に対する阻
害抗体とを同時に作用させて測定する工程を含む、クレ
アチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）の測定
とｍＣＫの測定とを同時に達成するＣＫアイソザイム分
別定量法。 - 【請求項１８】 クレアチンキナーゼＭ（ＣＫ−Ｍ）サ
ブユニットに対する阻害抗体で試料を処理してクレアチ
ンキナーゼ（ＣＫ）活性の測定を行う工程に引き続い
て、該測定後の試料にミトコンドリア局在クレアチンキ
ナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）に対する阻害抗体を加え
ることで、ＣＫ−Ｍサブユニットに対する阻害抗体とｍ
ＣＫに対する阻害抗体とを同時に作用させて測定する工
程を行うことを特徴とする請求項１７に記載のＣＫアイ
ソザイム分別定量法。 - 【請求項１９】 クレアチンキナーゼＭ（ＣＫ−Ｍ）サ
ブユニットに対する阻害抗体で試料を処理してクレアチ
ンキナーゼ（ＣＫ）活性の測定を行う工程と、ＣＫ−Ｍ
サブユニットに対する阻害抗体とｍＣＫに対する阻害抗
体とを同時に作用させて測定する工程を、別々の試薬を
用いて行うことを特徴とする請求項１７に記載のＣＫア
イソザイム分別定量法。 - 【請求項２０】 請求項９、１０、１７、１８もしくは
１９に記載のクレアチンキナーゼ（ＣＫ）アイソザイム
分別定量法、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の
クレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）測
定法、または請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の
ミトコンドリア局在クレアチンキナーゼアイソザイム
（ｍＣＫ）測定法に必要な試薬をキット化または単品で
構成されてなるＣＫアイソザイム測定用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000193500A JP5058403B2 (ja) | 2000-06-27 | 2000-06-27 | Ｃｋ−ｍｂ活性測定法およびｃｋ−ｍｂ活性測定試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000193500A JP5058403B2 (ja) | 2000-06-27 | 2000-06-27 | Ｃｋ−ｍｂ活性測定法およびｃｋ−ｍｂ活性測定試薬 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002000270A true JP2002000270A (ja) | 2002-01-08 |
| JP2002000270A5 JP2002000270A5 (ja) | 2007-07-19 |
| JP5058403B2 JP5058403B2 (ja) | 2012-10-24 |
Family
ID=18692483
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000193500A Expired - Lifetime JP5058403B2 (ja) | 2000-06-27 | 2000-06-27 | Ｃｋ−ｍｂ活性測定法およびｃｋ−ｍｂ活性測定試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5058403B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1359162A2 (en) * | 2002-04-30 | 2003-11-05 | International Reagents Corporation | Mitochondrial creatine kinase antibody |
| JP2006524983A (ja) * | 2002-12-09 | 2006-11-09 | カマルゴ、アントニオ | ヒト組み換えエンドオリゴペプチダーゼＡ（ｈＥＯＰＡ）をコードするメッセンジャーＲＮＡの１次構造［ＡＦ２１７７９８］およびそのたんぱく質配列［ＡＡＦ２４５１６］の決定方法；ヒトＥＯＰＡ遺伝子の決定方法およびヒト組み換えＥＯＰＡの生成方法；マウスで多クローン性抗−ＥＯＰＡ抗体類の生成方法；ｈＥＯＰＡの生化学的およびたんぱく分解特性を決定するための合成基質類の標準化および使用方法；ＥＯＰＡ触媒活性または“溶解性受容体”として作用するオリゴペプチド類と相互作用できるＥＯＰＡの能力に対して、阻害活性を表す阻害薬類および抗体類の同定および生成方法；中枢神経系の先天性、感染性および退行性病状におけるこのたんぱく質の同定方法、および免疫学的プロセスでＥＯＰＡの役割の決定方法；中枢神経系の先天性、感染性および／または退行性疾病の診断または治療、病状の好転を伴う予防のために用いられる免疫化学的および／または酵素診断方法；酵素作用の阻害薬として、および／または神経学的、精神医科学的および退行性病状の治療において有用な他の細胞内たんぱく質類との結合を妨げる阻害薬類として作用する、ＥＯＰＡの活性中心とリガンド類との相互作用性の使用 |
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2000
- 2000-06-27 JP JP2000193500A patent/JP5058403B2/ja not_active Expired - Lifetime
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