KR101086245B1 - 수포성구내염바이러스 뉴저지형의 당단백질에 결합하는 단일클론항체 및 그의 용도 - Google Patents
수포성구내염바이러스 뉴저지형의 당단백질에 결합하는 단일클론항체 및 그의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 수포성구내염바이러스 뉴저지형 당단백질에 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 자세하게는 수포성구내염바이러스 뉴저지형의 당단백질에 결합하는 단일클론항체, 이를 생산하는 융합세포주 및 상기 단일클론항체와 수포성구내염바이러스 뉴저지형의 당단백질을 이용하여 수포성구내염바이러스 뉴저지형에 특이적인 중화항체를 검출할 수 있는 수포성구내염 진단방법에 관한 것이다.
수포성구내염바이러스 뉴저지형, 단일클론항체
Description
본 발명은 수포성구내염바이러스 뉴저지형 당단백질에 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 자세하게는 수포성구내염바이러스 뉴저지형의 당단백질에 결합하는 단일클론항체, 이를 생산하는 융합세포주 및 상기 단일클론항체와 수포성구내염바이러스 뉴저지형의 당단백질을 이용하여 수포성구내염바이러스 뉴저지형에 특이적인 중화항체를 검출할 수 있는 수포성구내염 진단방법에 관한 것이다.
수포성구내염바이러스(Vesicular Stomatitis Virus: VSV)는 수포성구내염(Vesicular Stomatitis)을 일으키는 바이러스 병원체로서, 두 가지 혈청형(인디아나형과 뉴저지형)으로 대별되는데 뉴저지형에 감염되었을 경우에 더욱 뚜렷한 병변을 나타내는 등 병원성이 인디아나형 보다 강한 것으로 알려져 있다. 주로 아메리카 대륙에서만 발생하고 있어서 신대륙 질병이라고도 하는데 미국에서는 간헐적 으로 발생하다가 2004년부터는 매년 발생하고 있으며, 멕시코 남부, 중앙아메리카 국가, 남아메리카 북부, 브라질 등은 수포성구내염이 빈번하게 발생하는 대표적인 지역이다.
수포성구내염은 수포가 형성되는 임상증상만으로 보면 구제역과 감별이 불가능하기 때문에 실험실에서의 신속한 정밀진단이 필수적이다. 뚜렷한 임상증상이 있는 경우에는 원인체에 대한 바이러스 분리 혹은 역전사중합효소연쇄반응법 등의 진단법으로 판정하나, 임상증상이 없는 경우에는 원인체 분리가 곤란하기 때문에 혈청학적인 검사방법으로 진단한다. 수포성구내염바이러스에 감염되면 숙주동물에서는 보통 5-8일이 경과하면 혈액내에 특이항체가 생성되는데 이를 검출하는 방법으로는 보체결합법, 중화시험법, 효소결합면역측정법 등이 있다.
보체결합법은 진단효율성이 낮은 단점이 있고, 표준진단법인 중화시험법은 생바이러스를 취급해야하기 때문에 특수 밀폐실험실에서 작업을 해야 하고, 검사시간이 2-3일 소요되는 등의 단점이 있기 때문에 다량의 혈청을 신속하게 검사하는 데에는 부적합한 방법이다. 효소결합면역측정법으로서는 유전자재조합 뉴클레오캡시드 단백질을 이용한 경쟁방식의 진단법이 개발되었으나, 중화시험법에 비해서 민감도가 낮기 때문에 양성개체를 음성으로 판정할 수 있는 개연성이 문제점으로 제기되었다. 이러한 문제점을 극복하기 위한 방법으로서는 중화시험법과 마찬가지로 중화항체를 검출하는 진단법이 필요하였고, 수포성구내염바이러스의 중화항체는 바이러스 외피를 구성하는 당단백질에 의해서 대부분 생성되기 때문에 이러한 당단백질을 이용한 진단법의 개발이 절실하였다. 이전에 뉴저지형 수포성구내염바이러스 혹은 당단백질을 이용한 진단법이 소개되어지기는 했으나, 단일클론항체가 아닌 다클론항체를 이용한 진단법이기 때문에 실험동물을 사용하여 항혈청을 지속적으로 생산해야 하고, 여러 가지 에피톱이 반응에 관여하기 때문에 비특이 반응성의 개연성을 배제할 수 없으며 또한, 다클론항체 생산시에는 로트간의 품질편차발생 가능성이 상존하는 단점이 있었다. 최근에는 인디아나형 수포성구내염바이러스에 대해서 당단백질과 단일클론항체를 이용한 효소결합면역측정법이 개발되어졌는데 수포성구내염의 두 가지 혈청형 중 피해가 보다 심한 뉴저지형에 대해서는 아직까지 중화시험법을 대체할 수 있는 진단법으로서의 당단백질을 이용한 효소결합면역측정법이 개발되지 않았다.
이에, 본 발명은 표준진단법인 중화시험법을 대체할 수 있는 진단법으로서 단일클론항체를 이용하여 수포성구내염바이러스 중화항체를 신속히 검사할 수 있는 진단법을 제공하고자 한다. 수포성구내염은 말, 소, 돼지를 비롯하여 염소, 양, 야생동물을 포함한 대부분의 동물에 감염이 이루어지고 사람에도 감염이 되기 때문에 수포성구내염 항체진단법은 다양한 축종의 혈청을 검사할 수 있는 원리를 내포해야 한다. 이를 위하여 단일클론항체를 제작하여 동물혈액내의 항체와 경쟁반응 방식의 효소결합면역측정법을 개발하고자 하였다. 따라서 본 발명에서는 수포성구내염바이러스 뉴저지형을 중화할 수 있는 단일클론항체 VSVNJ 1G11을 분비하는 융 합세포주를 제조하였다. 본 발명에서는 단일클론항체 VSVNJ 1G11이 수포성구내염바이러스 뉴저지형의 당단백질에 결합하여 수포성구내염바이러스 뉴저지형만을 선택적으로 중화시키는 것을 확인하였고, 수포성구내염바이러스의 감수성 동물인 소, 돼지, 말 혈청과도 뚜렷한 경쟁반응성을 나타내었기 때문에 축종에 상관없이 동일한 방식으로 혈청을 검사할 수 있는 진단법에 적용할 신규의 단일클론항체를 제공하는 것이다.
본 발명은 효소결합면역측정법 원리를 적용하여 단일클론항체 VSVNJ 1G11을 검사혈청 시료내의 수포성구내염바이러스 중화항체와 경합반응을 실시하여 축종에 관계없이 수포성구내염바이러스 뉴저지형 중화항체를 수시간만에 검출하는 진단방법을 제공하는데 목적이 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은
수포성구내염바이러스 뉴저지형 외피를 구성하는 당단백질에 결합하여 수포성구내염바이러스 뉴저지형을 중화시키는 단일클론항체 VSVNJ 1G11을 제공한다.
본원에서 사용된 용어'단일클론항체'는 당해분야에 공지된 용어로서 단일 항원성 부위에 대해서 특이적인 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 통상적으로, 상이한 에피톱에 대해 특이적인 상이한 항체들을 포함하는 다클론항체와는 단일클론 항체는 항원상의 단일 에피톱에 대해 특이적으로 결합한다. 단일클론 항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석 방법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 융합 배양에 의해 합성되기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 또 다른 장점을 갖는다.
또한, 본 발명은 상기 단일클론항체 VSVNJ 1G11을 생산하는 융합세포주를 제공한다. 즉, 뉴저지형 수포성구내염바이러스 당단백질을 마우스에 면역시키고, 이로부터 분리한 면역 B 세포와 마우스 골수종유래세포간의 세포융합에 의해서 생산되어 수포성구내염바이러스 뉴저지형을 중화시키는 특이 단일클론항체 VSVNJ 1G11을 생산하는 융합세포주를 제공한다.
한 양태로서, 본 발명의 융합세포주는 수포성구내염바이러스 뉴저지형(미국 농무부산하 국립수의검사소)에서 추출한 당단백질을 면역원으로 발브씨 마우스에 면역시킨 후 채취한 B 림프구와 SP2/0 골수종유래 세포간의 세포융합에 의하여 작성된 것으로, 단일클론항체 VSVNJ 1G11을 분비함을 특징으로 한다. 본 발명에서는 상기 융합세포주를 한국세포주은행에 2009년 1월 23일자로 기탁하고, 기탁번호 KCLRF-BP-00199를 부여받았다.
또한 상기 수포성구내염바이러스 뉴저지형 중화단일클론항체 VSVNJ 1G11을 이용한 효소결합면역측정법으로, 검사혈청과 단일클론항체 VSVNJ 1G11간의 경합반응에 의하여 수포성구내염바이러스 뉴저지형 특이 중화항체를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 검출방법에 있어서, '검사혈청'은 각종 가축류와 사람을 비롯한 모든 동물로부터 분리된 것일 수 있으며, 바람직하게는 소, 돼지, 말, 양, 염소로부터 분리된 것이다.
본 발명의 검출 방법은 한 양태로서,
(1) 효소결합면역측정법 플레이트에 수포성구내염바이러스 뉴저지형 유래 당단백질 항원을 부착시키는 단계;
(2) 상기 플레이트에 부착되지 않은 당단백질 항원을 제거하는 단계;
(3) 상기 검사혈청시료를 반응시키는 단계;
(4) 상기 플레이트에 부착되지 않은 검사혈청시료를 제거하는 단계;
(5) 단일클론항체 VSVNJ 1G11을 경합적으로 반응시키는 단계;
(6) 상기 플레이트에 부착되지 않은 단일클론항체를 제거하는 단계;
(7) 표지물질이 결합된 단일클론항체 VSVNJ 1G11에 대한 이차항체(예, 항마우스 이차항체)를 반응시키는 단계;
(8) 상기 플레이트에 부착되지 않은 이차항체들을 제거하는 단계;
(9) 검사혈청 중의 수포성구내염바이러스 뉴저지형 중화항체 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
여기서, 표지물질은 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하며, 이의 예로는 효소, 형광물질, 방사선 물질 등이 예시될 수 있다. 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글리코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을 사용할 수 있다. 형광물로는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다. 방사성 동위원소로는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있은 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.
단계 (9)에서 중화항체 수준의 측정법은 표지물질에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 표지물질이 효소인 경우에는 효소와 기질의 반응을 통한 발색반응의 흡광도를 측정하여, 형광물질인 경우에는 형광강도를 측정하여, 방사선 물질인 경우에는 방사선 방출량을 측정함으로써 중화항체의 수준을 측정할 수 있다.
본 발명에서는 한 양태로서, 표지물질로 호스라디쉬 퍼옥시다제를 이용하고, 단계 (9)에서 효소반응에 의한 발색반응의 흡광도를 측정하여 검사혈청 중의 수포성구내염바이러스 뉴저지형 중화항체 수준을 측정하는 것이 바람직하다.
한편, 본 발명의 단일클론 항체 VSVNJ 1G11은 수포성구내염바이러스 뉴저지형에 결합하여 세포내 수포성구내염 바이러스 감염을 방어하는 중화항체이다. 따라서, 본 발명의 단일클론 항체 VSVNJ 1G11은 수포성구내염을 치료하는 데에도 이용될 수 있다.
본 발명은, 단일클론 항체 VSVNJ 1G11을 함유하는 수포성구내염 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하고, 인체 또는 수의용으로 제형화되어 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 경로는 경구, 복강, 정맥, 근육, 피하, 피내 등의 경로로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 주사제로 제형화하여 투여할 수 있다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성용 제, 식물유, 고급 지방산 에스테르(예, 올레인산에틸 등), 알코올류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 성장을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 담체를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 도면을 참조하여 보다 구체적으로 설명한다.
도 1은 간접형광항체법을 통하여 본 발명의 단일클론항체 VSVNJ 1G11이 수포성구내염바이러스 뉴저지형에 결합한 결과의 도면이다.
가. 뉴저지형 수포성구내염바이러스 접종세포; 나. 정상세포.
도면에서 보는 바와 같이, 본 발명의 단일클론항체 VSVNJ 1G11은 수포성구내염바이러스 뉴저지형에 뚜렷하게 반응하였다. 이때 사용한 단일클론항체 VSVNJ 1G11은 수포성구내염바이러스 뉴저지형 당단백질을 마우스에 면역시키고, 이로부터 분리한 면역 B세포와 마우스 골수종유래 세포간의 세포융합에 의해서 생산된 융합세포주로서, 대한민국 서울시에 위치한 한국세포주은행(Korean Cell Line Research)에 2009년 1월 23일자로 기탁된 기탁번호 KCLRF-BP-001999의 융합세포주를 이용할 수 있다.
도 2는 국내에서 사육중인 소 1,040두, 돼지 1,120두, 말 845두를 대상으로 본 발명의 단일클론항체 VSVNJ 1G11를 이용한 경합방식의 효소결합면역측정법으로 측정한 결과의 도면이다. 양음성판정기준을 반응억제도 40%를 기준으로 했을 때 총 3,005두의 동물 혈청에 대해서 본 발명의 효소결합면역측정법은 특이도 99.6%를 나타내었다.
도 3은 소 양성혈청(가)와 돼지 양성혈청(나)를 각각의 음성혈청으로 단계 희석하여 본 발명의 효소결합면역측정법과 중화시험법으로 측정한 결과의 도면이다. 이 때 (가)는 1점의 소 양성혈청을 소 음성혈청으로 2진희석한 혈청에 대해서 본 발명의 효소결합면역측정법과 중화시험법으로 측정하여 최종 양성으로 판정되는 혈청희석배수를 비교한 그래프이고, (나)는 불활화한 뉴저지형 수포성구내염바이러스를 접종하여 채혈한 두 마리의 돼지유래 양성혈청을 돼지 음성혈청으로 2진희석한 혈청에 대해서 본 발명의 효소결합면역측정법과 중화시험법으로 측정하여 최종 양성으로 판정되는 혈청희석배수를 비교한 그래프이다.
도 4는 수포성구내염 뉴저지형 중화시험법에서 모두 양성인 표준혈청패널(19점)을 대상으로 뉴클레오캡시드 단백질을 이용한 기존의 진단법과 본 발명의 효소결합면역측정법으로 측정한 결과를 비교한 도면이다. 구체적으로, (가)는 바이러스 중화시험법으로서 미국 NVSL에서의 결과를 입수한 것이고, (나)는 본 발명의 당단백질 효소결합면역측정법으로 측정한 결과 그래프이며, (다)는 뉴클레오캡시드 효소결합면역측정법으로 측정한 결과로서 미국 NVSL에서의 결과를 입수한 것이다.
본 발명에 의하면, 단일클론항체 VSVNJ 1G11은 축종에 관계없이 수포성구내 염바이러스 뉴저지형 중화항체를 단시간에 정확하게 진단할 수 있다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1>
수포성구내염바이러스 뉴저지형 특이 단일클론항체를 생산하는 융합세포주 제작
단일클론항체를 작성하기 위하여 농축 정제한 수포성구내염바이러스 뉴저지형 (미국 농무부산하 국립수의검사소)을 이용하였다. 수포성구내염바이러스 뉴저지형을 BHK-21 세포(미국 American Tissue Culture Collection 사)에 0.001 MOI(multiplicity of infection) 농도로 감염시킨 후 약 3일 후에 배양 상층액만을 수확하여 10,000 x g에서 30분간 원심분리하여 세포성분을 제거하였다. 상기의 바이러스 배양 상층액에 1mM 바이너리에틸이민(Binaryethylenimine)을 첨가하여 37℃에서 24시간 동안 바이러스를 불활화시킨 다음 10 mM 치오황산나트륨을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켜서 바이너리에틸이민의 독성을 중화하였다. 불활화바이러스 배양액에 7.5% 폴리에틸렌글리콜 8000(Polyethylene glycol 8000)을 첨가 하여 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 상기의 배양액을 10,000 x g에서 30분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 침전물을 TEN 완충용액(50mM Tris, 1mM EDTA, 0.1M NaCl, pH7.8)으로 부유한 후 다시 3,500 x g에서 20분간 원심분리하여 상층액만을 수거하였다. 여기에 0.03M 옥틸글루코피라노사이드(octylglucopyranoside)를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후에 85,000 x g에서 2시간 동안 원심분리하여 최종적으로 수포성구내염바이러스 뉴저지형 당단백질 항원으로 사용하였다.
수포성구내염바이러스 뉴저지형 당단백질 100 ㎍을 불완전프룬드어쥬반트(Incomplete Freund Adjuvant)와 동량의 부피로 균질하게 혼합한 다음, 혼합액 100 ㎕를 발브씨 마우스(Balb/c mouse)의 발바닥(Footpad)에 접종하였다. 면역 후, 2주후에 추가로 재접종하였다. 이후 2주후에 슬와임파절(Popliteal lymph node)을 채취하여 세포융합에 사용하였다.
세포융합은 폴리에틸렌글리콜을 사용하는 일반적인 방법으로 다음과 같이 실시하였다. 상기 채취한 림프구를 무혈청 배지(Serum Free Medium)로 세척한 후, 마우스 골수종 유래세포주(SP2/0-Ag14 mouse myeloma cell line)와 5:1 비율로 혼합한 후 폴리에틸렌글리콜 1500을 첨가하여 융합하였다. 융합이 완료된 세포는 증식배지[D-MEM, HAT(Hypoxanthine Aminopterin Thymidine), 10% 우태아혈청]에 적당히 희석한 후 미리 마우스 복강세포가 배양되어 있는 96웰 마이크로플레이트에 100 ㎕씩 분주하여 37℃, 5% 이산화탄소 배양기 내에서 배양하였다.
수포성구내염바이러스 뉴저지형에 대한 단일클론항체를 생산하는 융합세포주의 선발은 다음과 같이 실시하였다. 상기 세포융합의 결과로 융합세포가 증식한 웰의 배양 상층액을 수거하여 당단백질 항원을 이용한 간접 효소결합면역측정법과 수포성구내염바이러스 뉴저지형을 이용한 간접형광항체법으로 양성반응을 보이는 웰의 융합세포들을 마우스 복강세포가 배양된 96웰 플레이트에 웰당 0.5개의 세포가 포함되도록 첨가하고 단일클론(clone)이 형성될 때까지 배양하였다. 뉴저지형 수포성구내염바이러스에 대한 항체를 생산하면서 단 하나의 클론만이 증식하는 웰을 선발하였다. 이렇게 선발된 융합세포주를 발브씨 마우스의 복강에 접종하여 생성시킨 복수를 채취하여 실험에 사용하였다. 작성한 6종의 단일클론항체들의 특성은 아래 표 1과 같다.
| 단일클론항체 | VSVNJ 1G11 | A186 | A13 | B18 | B24 | A38 |
| 이소타입 | IgG2b,κ | IgG2a,κ | IgG1, κ | IgG1, κ | IgG1, κ | IgG1, κ |
<시험예 1> 단일클론항체의 뉴저지형 특이 중화역가 보유여부 조사
상기 실시예 1의 단일클론항체들이 수포성구내염바이러스 뉴저지형에 대한 중화역가 보유여부를 확인하기 위하여 중화시험법을 실시하였다. 세포배양 배지(알파-MEM)에 1,000 TCID50/50 ㎕ 희석한 뉴저지형 수포성구내염바이러스를 동일 배양액으로 2진희석한 단일클론항체와 혼합하여 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 그 후, 미리 준비한 베로(Vero) 세포주를 1.0 x 106/ml 농도로 준비하여 50 ㎕ 씩 첨가하여 2-3일간 37℃, 5% 이산화탄소 배양기 내에서 배양하였다. 이때 전체 웰중 50%의 세포변성효과를 나타내는 최종 혈청희석배수의 역수를 중화역가로 판정하였다.
표 2는 상기 6종의 단일클론항체를 1 ㎍/ml 농도에서 평가한 중화시험법 결과를 나타낸 표이다.
| 단일클론항체 | VSVNJ 1G11 | A186 | A13 | B18 | B24 | A38 |
| 중화역가 | 32 | 64 | <8 | 32 | 128 | 512 |
<실시예 2> 효소결합면역측정법에 적용할 최적의 단일클론항체 선발
상기 6종의 단일클론항체 중에서 효소결합면역측정법에 적용할 최적의 단일클론항체를 선발하기 위하여 돼지에 실험접종한 혈청들[불활화 수포성구내염바이러스 뉴저지형 : NJ34와 NJ61; 수포성구내염바이러스 뉴저지형 당단백질: GP45와 GP54; 불활화 수포성구내염바이러스 인디아나형: IND27과 IND69를 각각 IMS1313(SEPPIC사)어쥬번트와 동량으로 혼합하여 2주 간격으로 2회 접종한 후에 20일째 채혈한 혈청들]을 대상으로 반응성을 비교평가한 결과 아래 표 3과 같이 VSVNJ 1G11 단일클론항체가 수포성구내염 뉴저지형 접종혈청에 대해서 가장 우수한 반응억제도를 나타내었고 수포성구내염 인디아나형 돼지혈청에서는 음성결과를 나타내었기 때문에 VSVNJ 1G11을 최종적으로 선발하여 본 발명의 효소결합면역측정법에 사용하였다.
* 회색으로 표시한 결과는 본 발명의 효소결합면역측정법 양음성판정기준인 반응억제도 40%를 기준으로 했을 때의 양성판정 결과임.
<실시예 3> 단일클론항체 VSVNJ 1G11을 이용한 수포성구내염바이러스 뉴저지형 중화항체검출 위한 효소결합면역측정법
단일클론항체 VSVNJ 1G11을 이용하여 수포성구내염바이러스 뉴저지형 중화항체를 검출하기 위한 효소결합면역측정법은 검사혈청내 항체와 경합반응하는 단일클론항체 VSVNJ 1G11을 사용하는 방법으로서 그 상세한 방법은 다음과 같다.
불활화 수포성구내염바이러스 뉴저지형 당단백질을 탄산완충용액(Carbonate buffer, pH 9.6)에 1 ㎍/㎖ 농도로 Nunc사에서 제공하는 96웰 마이크로플레이트(Maxisorp)에 50 ㎕/웰씩 분주하여 4℃에서 16시간 정치하였다. 이튿날, 코팅한 마이크로플레이트를 세척액[0.05% 트윈 20(Tween 20)이 함유된 10 mM 인산완충용액(phosphate buffered buffer)]으로 3회 세척하여 부착되지 않은 단백질 항원들을 세척하여 제거하고 나서 검사혈청을 블로킹용액(10 mM 인산완충용액에 0.05% 트윈 20 및 5% 탈지유 첨가한 용액)으로 5배 희석하여 50 ㎕/웰씩 분주한 다음 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기의 세척액으로 다시 3회 세척하여 항원에 결합하지 않은 혈청내 항체를 제거한 후, VSVNJ 1G11 단일클론항체를 상기 블로킹용액으로 30 ng/ml 농도로 희석하여 50 ㎕/웰씩 분주한 다음 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 세척액으로 3회 세척하고 나서, 페록시다제가 결합된 항마우스 이차항체를 상기 블로킹용액으로 160 ng/ml 농도로 희석하여 50 ㎕/웰씩 분주한 다음 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 세척액으로 5회 세척한 후에 발색제로서 오피디용액(O-Phenylenediamine)을 첨가하여 15분 내외로 반응시켜서 혈청이 배제된 대조군의 흡광도가 1.2 내외의 값을 보일 것으로 추정되는 시점에서 1.25N 황산용액을 50 ㎕/웰로 첨가하여 발색반응을 정지시킨 다음, 492 nm에서 흡광도를 측정하였다. 최종 결과는 검사혈청 없이 단일클론항체만을 첨가한 대조웰의 흡광도 대비 검사혈청웰의 흡광도를 억제도로 환산하여 분석하였다. 즉,
반응억제도(%) = 100 × [1 - (검사혈청웰 흡광도/대조웰 흡광도)]
상기 반응의 결과판정에서 단일클론항체 30 ng/ml 농도만 포함된 대조웰의 흡광도보다 50% 이상 흡광도 수치가 낮아진 웰, 즉 반응저해도(Percentage Inhibition, %)가 40 이상인 경우 수포성구내염바이러스 뉴저지형 중화항체 양성반응으로 판정하였다.
<시험예 1> 음성혈청을 이용한 특이도 평가 및 양음성 판정기준 설정
국내에서 사육중인 말 845두, 소 1,040두, 돼지 1,120두 (총 1,005두)를 대상으로 본 발명의 효소결합면역측정법을 적용해본 결과, 평균 반응저해도는 8%를 나타내었고 표준편차는 9.8이었다. 정규분포를 가정하여 99% 신뢰구간에서의 양음성 판정 기준으로서 평균값 + 3 x 표준편차를 산출하여 축종에 상관없이 높은 특이도를 유지하기 위하여 평균저해도 40%으로 설정하였다. 이를 기준으로 총 3,005두 중 12두가 양성으로 판정되어 최종적으로 99.6%의 특이도를 나타내었다.
도 2는 국내에서 사육중인 총 3,005두를 대상으로 본 발명의 효소결합면역측정법으로 측정한 결과로서 반응 저해도에 따른 혈청갯수 분포도를 보여준다.
<시험예 2> 수포성구내염 뉴저지형 양성혈청을 이용한 검출한계 측정
도 3은 소 양성혈청(A)과 돼지 양성혈청(B)을 각각의 음성혈청으로 단계적으로 2진희석하여 본 발명의 효소결합면역측정법과 중화시험법으로 측정한 결과 도면이다.
가. 미국 농무부산하 국립수의검사소에서 입수한 소 양성혈청 1점을 소 음성혈청으로 단계적으로 2진희석한 혈청에 대해서 본 발명의 효소결합면역측정법과 중화시험법으로 측정하여 최종 양성으로 판정되는 혈청희석배수를 비교한 그래프이다. 중화시험법 양성판정기준인 32배와 본 발명의 효소결합면역측정법의 양성판정기준인 40%를 기초로 했을 때, 두 가지 검사법의 최종 양성판정 시점의 혈청희석배수가 소 양성혈청을 64배 단계 희석한 혈청으로서 동일하였다. 즉, 상기 시험예 1에서 설정한 반응억제도 40의 판정기준의 적합성을 확인한 결과이다.
나. 불활화한 수포성구내염바이러스 뉴저지형을 접종하여 채혈한 두 마리의 돼지 유래 양성혈청을 돼지 음성혈청으로 2진희석한 혈청에 대해서 본 발명의 효소결합면역측정법과 중화시험법으로 측정하여 최종 양성으로 판정되는 혈청희석배수를 비교한 그래프이다. 중화시험법 양성판정기준인 32배와 본 발명의 효소결합면역측정법의 양성판정기준인 40%를 기초로 했을 때, 두 가지 검사법의 최종 양성판정 시점의 혈청희석배수가 돼지 양성혈청을 400배 단계 희석한 혈청으로서 동일하였다. 즉, 상기 나와 마찬가지로 시험예 1에서 설정한 반응억제도 40이라는 판정기준의 적합성을 재확인한 결과이다.
<시험예 3> 수포성구내염 뉴저지형 중화시험법 양성혈청(19점) 검사
미국 농무부산하 국립수의검사소에서 입수한 수포성구내염 뉴저지형 중화시험법 양성혈청 19점에 대해서 이미 알려진 중화시험법 및 뉴클레오캡시드 효소결합면역측정법 결과와 본 발명의 당단백질 효소결합면역측정법 결과와 비교하였다. 그 결과는 도 4에 표시하였다. 수포성구내염 뉴저지형 중화시험법에서 모두 양성인 19점의 혈청에 대해서 기존의 뉴클레오캡시드 단백질을 이용한 진단법에서는 5개의 음성판정이 나온 반면에 본 발명의 효소결합면역측정법에서는 중화시험법과 마찬가지로 모든 혈청을 양성으로 판정하였다. 이는 본 발명의 진단법이 기존의 뉴클레오캡시드 이용한 진단법보다 중화시험법 결과와 높은 상관성이 있음을 보여주는 것이다.
<시험예 4> 수포성구내염 중화시험법 표준혈청패널(20점) 검사
시험예 3에서는 수포성구내염바이러스 뉴저지형 중화역가가 높은 혈청을 중심으로 평가를 했기 때문에 정확한 중화시험법과의 상관성을 평가하기가 곤란하였다. 따라서 중화시험법의 양음성판정기준인 32배 부근의 중화역가를 나타내는 혈청들을 대상으로 본 발명의 효소결합면역측정법을 평가하고자 시험예 3과 마찬가지로 미국 농무부산하 국립수의검사소에서 수포성구내염 중화시험법 표준혈청패널을 입수하였다. 혈청패널은 뉴저지형 약양성혈청, 인디아나형 약양성혈청 및 음성혈청으로 구성되어있다. 아래 표4에서 알 수 있듯이, 뉴저지형 중화시험법 양성혈청 6점 중 중화역가 32배에 해당하는 1점에 대해서만 본 발명의 진단법 양음성 판정기준에 약간 못 미치는 음성결과를 나타내었을 뿐 나머지 모든 5종의 중화시험법 약양성혈청에 대해서는 양성판정을 보여주었다. 음성판정된 혈청은 뉴저지형 중화역가가 32배였는데 동일한 중화역가를 가진 다른 혈청들(표 4의 4번과 13번 혈청)에서는 양성판정을 나타내었다. 즉, 음성으로 나타난 것은 개체 차이에 의한 것으로 추정된다. 특히, 뉴저지형 중화역가의 양음성판정기준인 중화역가 32배의 혈청(표 3의 16번 혈청)에서도 양성으로 판정되었고 특히, 표 3의 6번 혈청(뉴저지형 중화역가 16배)에서는 음성으로 나타났기 때문에 시험예 1과 시험예 2에서의 결과에서와 마찬가지로 본 발명의 효소결합면역측정법에 대한 양음성판정기준인 반응저해도 40%가 중화시험법 판정기준과 상관성이 높음을 보여주는 증거이다. 반대로, 인디아나형 중화시험법 양성혈청 6점에 대해서는 뚜렷한 음성결과를 나타내었으며 반응저해도 수치가 시험예 1에서 보여준 음성혈청의 평균 반응저해도 수치와 유사한 것으로 보아서 본 발명의 당단백질 효소결합면역측정법은 VSVNJ 1G11 단일클론항체의 특성상 뉴저지형 중화항체들과만 특이적인 경쟁반응성을 나타내고 또 다른 혈청형인 인디아나형 항체와는 경쟁반응성이 없음을 보여주었다.
* 회색으로 표시한 결과는 각각의 진단법에 대한 양성판정 결과임.
도 1은 간접형광항체법을 통하여 본 발명의 단일클론항체 VSVNJ 1G11이 수포성구내염바이러스 뉴저지형에 결합한 결과의 도면이다(가: 뉴저지형 수포성구내염바이러스 접종세포, 나: 정상세포).
도 2는 국내에서 사육중인 소 1,040두, 돼지 1,120두, 말 845두를 대상으로 본발명의 단일클론항체 VSVNJ 1G11를 이용한 효소결합면역측정법으로 측정한 결과도면이다.
도 3은 소 양성혈청(가)과 돼지양성혈청(나)를 각각의 음성혈청으로 단계희석하여 본 발명의 효소결합면역측정법과 중화시험법으로 측정한 결과의 도면이다.
도 4는 수포성구내염 뉴저지형 중화시험법 양성혈청 19점을 대상으로 뉴클레오캡시드 단백질을 이용한 기존의 진단법과 본 발명의 효소결합면역측정법으로 측정한 결과를 비교한 도면이다.
Claims (7)
- 수포성구내염바이러스 뉴저지형 외피를 구성하는 당단백질에 결합하여 수포성구내염바이러스 뉴저지형 을 중화시키는 단일클론항체 VSVNJ (Vesticular Stomatitis Virus New Jersey) 1G11.
- 제 1항에 있어서,KCLRF-BP-00199에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 VSVNJ 1G11.
- 수포성구내염바이러스 뉴저지형 당단백질을 마우스에 면역시켜서 분리한 면역 B 세포와 마우스 골수종유래세포간의 세포융합으로 생산되어 수포성구내염바이러스 뉴저지형을 선택적으로 중화시키는 단일클론항체 VSVNJ 1G11을 생산함을 특징으로 하는 융합세포주(기탁번호 KCLRF-BP-00199).
- 제 1항 또는 제 2항의 수포성구내염바이러스 뉴저지형 중화단일클론항체 VSVNJ 1G11를 이용한 효소결합면역측정법으로,검사혈청과 단일클론항체 VSVNJ 1G11 간의 경합반응에 의하여 수포성구내염바이러스 뉴저지형 중화항체를 검출하는 것을 특징으로 하는 수포성구내염바이러스 뉴저지형 중화항체 검출방법.
- 제 4항에 있어서,(1) 효소결합면역측정법 플레이트에 수포성구내염바이러스 뉴저지형 유래 당단백질 항원을 부착시키는 단계;(2) 상기 플레이트에 부착되지 않은 당단백질 항원을 제거하는 단계;(3) 상기 검사혈청시료를 반응시키는 단계;(4) 상기 플레이트에 부착되지 않은 검사혈청시료를 제거하는 단계;(5) 단일클론항체 VSVNJ 1G11을 경합적으로 반응시키는 단계;(6) 상기 플레이트에 부착되지 않은 단일클론항체를 제거하는 단계;(7) 표지물질이 결합된 단일클론항체 VSVNJ 1G11에 대한 이차항체를 반응시키는 단계;(8) 상기 플레이트에 부착되지 않은 이차항체들을 제거하는 단계;(9) 검사혈청 중의 수포성구내염바이러스 뉴저지형 중화항체 수준을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 수포성구내염바이러스 뉴저지형 중화항체 검출방법.
- 제 4항에 있어서,상기 검사혈청은 소, 돼지, 말, 양 또는 염소로부터 분리된 것을 특징으로 하는 검출방법.
- 제 1항 또는 제 2항에 따른 단일클론항체 VSVNJ 1G11을 함유하는 뉴저지형 수포성구내염 치료용 조성물.
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