RU1808872C - Штамм гибридных культивируемых клеток MUS мUSсULUS L., используемый дл получени моноклональных антител к М @ зависимой ДНКазе хроматина печени крыс - Google Patents

Abstract

Использование: биотехнологи , молекул рна  энзимологи . Сущность изобретени : получение штамма гибридных культивируемых клеток Mus musculus L., продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к Мп -зависимой ДНКазе хроматина печени крысы. Штамм получают гидридиза- цией спленоцитов мышей линии Balb/c и клеток миеломы NS/1 - Ад 4.1. Титр МКА в культуральной жидкости, определенный с помощью иммуноферментного анализа, составл ет 1:8, в асцитной - 1:10 .МКА св зывают Мп2+-зависимую ДНКазу, при этом они способны ингибировать нуклеазную активность данного фермента. 2 табл.

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии и может быть использовано в молекул рной энзимологии, а также дл  получени  гомогенных препаратов Мп2 зависимой ДНКазы, хроматина печени крыс методом аффинной хроматографии.

Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L. получают следующим образом.

В качестве доноров иммунных селезенок используют 8-12-недельных мышей линии Balb/c. Мышей им.мунизируют внутрибрюшинно и подкожно нейтральной Мп2+-зависимой ДНКазой хроматина печени крыс с удельной активностью 600 ед/мг. За три дн  до гибридизации животным ввод т высокоочищенный препарат фермента с удельной активностью 2358 ед/мг. Культуру клеток миеломы мыши NS/1-Ag.4.1., у.которой потер на способность к синтезу собственных иммуноглобулинов, получают из

коллекции института Цитологии А СССР. Клетки культивируют на полноценной среде следующего состава: 1 литр исходной среды RPNI - 1640, 2 г МаНСОз, 110 мг пирувата натри , 15% нативной эмбриональной тел чьей сыворотки, 2 мМ L-глуга- мина, 10 мМ HEPES, 50 мг гентамицина, 10 мМуЗ-меркаптоэтанола, 5 103 ед/мл инсулина . Клетки в течение трех недель выращивают на полноценной среде в присутствии 20 мкг/мл 8-азагуанина дл  освобождени  от предшествующих ревертантов. За три дн  до гибридизации клетки перевод т на полноценную среду без 8-азагуанина. Дл  гибридизации монослой миеломных клеток, наход щихс  в логарифмической фазе роста , смывают полноценной средой без сыворотки. Подсчет клеток ведут в камере Гор ева. Количество жизнеспособных клеток определ ют при окрашивании 0,5%-ным раствором трипанового синего. Сли ние

00 О 00 00 VJ Ю

клеток миеломы с иммунными спленоцита- ми провод т по методу Келера и Милстейна с помощью полиэтиленгликол , Селезенку иммунизированного животного промывают 2-3 раза полноценной средой без сыворотки и перенос т в стекл нный гомогенизатор , Трем  осторожными давительными движени ми получают суспензию клеток. После оседани  крупных частиц собирают полученную суспензию клеток и смешивают с миеломными в соотношении 2 10 спле- ноцитов и 1 107 миеломных. Клетки осаждают центрифугированием в течение 10 минут при 800 д. Затем по капл м добавл ют 2 мл 50%-ного раствора полиэтиленгликол  (молекул рна  масса 1540). приготовленного на полноценной среде, но без сыворотки и HEPES. После м гкого перемешивани  в течение минуты, приливают полноценную среду (50 мл) и центрифу- . гируют 10 минут при 800 д. Полученный осадок заливают полноценной средой. Суспензию клеток оставл ют на 12 часов в термостате. Затем полноценную среду замен ют на селективную среду HAT - полноценную среду, содержащую10 мол/л гипоксантина, 1,6-10 мол/л ти- мидина, 4- .10 мол/л аминоптерина - и раскапывают в 96-луночные панели с питающим слоем, из перитонеальных макрофагов мыши. Клетки выращивают в 5%-ной атмосфере С02 при 37°С. На 14-ый день по вл ютс  первые колонии гибридом, су- пернатант этих лунок исследуют на присутствие моноклональных антител путем иммуноферментного анализа.

Далее путем клонировани  осуществл ют выделение стабильных клонов гибридных кле ток. Клетки из тех лунок, супернатант которых дает положительный результат в ИФА, используют дл  клонировани  и реклонировани . Дл  этого клетки, наход щиес  в середине логарифмической фазы роста, развод т свежей полноценной средой и рассевают в новую панель из расчета 1 клетка на лунку. Предварительно в эти панели рассевают питающие клетки. Клонирование провод т трехкратно, так, чо 60% клонов дают положительный ответ при исследовании методом ИФА. Клоны, дающие положительный результат в ИФА и ингибирующие активность ДНКазы в системе In vitro, выращивают в сосудах Каррел .

Полученный штамм обозначают 4Е, он хранитс  в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

номером 530Д и характеризуетс  следующими признаками.

Культуральные признаки.

Среда RPMI - 1640с 10% тел чьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 50 г/л гентамицина, 10 мМ 2-меркаптоэта- нола, 5 ед/мл инсулина. Клетки выращивают при 37°С в 5%-иой атмосфере на стекл нной или пластиковой культураль- ной посуде. Посевна  доза 5- 104 кл/мл. Пассажи провод т каждые 2-3 дн  с кратностью рассева 1:5. Дл  получени  асцитной жидкости 5-7 -10 клеток ввод т перитони- ально мышам Balb/c, сенсибилизированным пристанем. Опухоль развиваетс  через 7-10 дней.

Криоконсервирование.

Клетки штамма ресуспендируют вереде RPNI с 45% эмбриональной тел чьей сыворотки в присутствий 10% ДМСО, разливают в пластиковые ампулы по 4-6 -10 клеток в 1 мл.

Размораживание.

Быстро при 37°С клетки развод т в 10 мл полноценной среды и осаждают, ресуспендируют в 5 мл той же среды и перенос т в культуральный флакон. Выживамость после размораживани  более составл ет более 30%.

Контаминаци .

Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды.

Характеристика полезного продукта.

Моноклональные антитела св зывают

О 1

Мп -зависимую ДНКазу, при этом они способны ингибировать нуклеазную активность данного фермента. Титр. МКА в культуральной жидкости, определенный с помощью ИФА, составл ет 1:8, в асцитной жидкости - 1:10 .

Пример 1, Дл  определени  специфического взаимодействи  моноклональных антител с Мп -зависимой ДНКазой провод т определение нуклеазной активности Мп +-зависимой ДНКазы в присутствии антител. Нуклеазную активность определ ют спектрофотометрически. В работе используют реакционную смесь следующего состава (общий обьем 200 мкл):100 мкг денатурированной нагреванием ДНК из тиму- са теленка, 20 мМ трис HCI буфера рН 7,2, 25 мМ Мп2+. Во все пробы добавл ют по 20 мкл препарата ДНКазы, инкубированной в течение 30 минут при 37°С с моноклональ- ными антителами. Контролем служат пробы, где фермент инкубируют без антител. Затем реакционную смесь с ферментом инкубируют при 37°С в течение часа. Реакцию останавливают добавлением 3,8 мл 3% HCI04 на холоду. Осадок кислотнонерастворимых продуктов удал ют через 15 мин центрифугированием при 7000 g в течение 15 мин. В надосадочной жидкости прирост кислотора- створимых продуктов определ ют на спектрофотометре по поглощению при 260 нм. За единицу активности . фермента принимают изменение оптической плотности /Е260/ реакционной смеси за 1 ч инкубации в пересчете на 1 мл ферментного препарата (ед/мл). Удельную активность определ ют как отношение числа единиц активности ферментного препарата на количество мг белка (ед/мг). Активность фермента, инкубированного без антител, принимают за 100%, а активность фермента, инкубированного в присутствии антител, пересчитывают в пропорции:

100% - активность фермента без антител (Е260)

Х% - активность фермента с антителами (Е260)

Полученные результаты представлены в табл.1.

Дл  того, чтобы исключить возможность ошибки эксперимента при разведении фермента вследствие внесени  в реакционную смесь дополнительного объема жидкости в виде антител, став т следующие опыты: вместо исследуемых антител в реакционную смесь внос т антитела клонов 5А и 1В, которые дают положительный ответ в ИФА при взаимодействии с ферментатом. Полученные данные тоже представлены в табл.1.

Таким образом, результаты полученных исследований показывают, что только клон 4Е  вл етс  продуцентом антител, которые способны ингибировать активность фермента на 80%. Клоны 5А и 1В, которые дают высокий положительный ответе ИФА, не способны ингибировать активность изучаемого фермента на 80%, даже при увеличении количества вносимых антител. По литературным данным большего процента ингибировани  активности ферментов иммуноглобулинами достигнуть невозможно. Таким образом, из полученных гибридом только клон 4Е ртвеча-. ет поставленным требовани м - максимальной способностью ингибировать активность Мп2+-зависимой ДНКазы. Пример 2. Полученные моноклональ- .ные антитела используют дл  изучени  им- мунохимических свойств нуклеаз (эволюционна  биохими  ферментов). В работе используют ферменты различных эволюционных труп: Мп2+-зависимую ДНКазу хроматина печени крыс с удельной активностью 2358 ед/мг; Са, Mg-зависимую ДНКазу  дер эмбрионов морского ежа с удельной активностью 1278 ед/мг; ДНКазу из  дер

эмбрионов вьна с удельной активностью 416 ед/мг; панкреатическую ДНКазу с удельной активностью 4200 ед/мг по Кунит- цу; панкреатическую РНКазу с удельной активностью 40 ед/мг по Кунитцу, а также бактериальные нуклеазы. РНКазу Bac.intermedlus с удельной активностью 12000 ед/мг, и нуклеазу Ser.marcescens с удельной активностью 1,5-2,0 -106 ед/мг.

0 Дл  изучени  взаимодействи  монокло- нальных антител с различными ферментами примен ют метод твердофазного ИФА, т.к.. он обладает высокой чувствительностью и позвол ет в одинаковых услови х провести

5 анализ сотни проб. В качестве антигена, в панель внос т ферменты в различных разве- дени х, а в качестве антител используют фракции моноклональных антител клона 4Е в разведении 1:2000 (концентраци  антител

0 1,1 мкг/мл).

Моноклональные антитела развод т на 1%-ном БСА в буфере, содержащем 0,01 М трис-HCI, 0,15 М NaCI. М ЭДТА, поскольку при разведении без БСА активность.

5 антител резко снижаетс .

Результаты исследований представле- 1 ны в табл.2.

Как видно из таблицы, моноклональные

О I

антитела к Мп -зависимой ДНКазе хрома0 тина печени крыс св зываютс  с этим ферментом; Са, Mg-зависимой ДНКазой  дер эмбрионов морского ежа, нуклеазой эмбрионов вьюна и РНКазой Bacillus intermedius, но не св зываютс  с панкреатической

5 ДНКазой, нуклеазой Ser.marcescens и панкреатической РНКазой, На основании полученных данных можно сделать вывод о наличии сходных антигенных детерминант у трех из семи исследованных ферментов.

0 Способность моноклональных антител распознавать ферменты с высокой степенью специфичности используетс  дл  ре- шени  р да проблем молекул рной генетики и эволюционной, биохимии. Инте5 ресно отметить, что в 60% случаев детальное изучение ферментов с помощью моноклональных антител показало, что последние существуют в мультимолекул рной форме. Можно предположить, что изучае0 мый авторами фермент Мп -зависима  ДНКаза хроматина печени крыс существует в такой форме. Но этот вопрос еще подлежит дальнейшему изучению. Использу  моноклональные антитела, можно проводить

5 исследовани  в эволюционном плане, след  за по влением и изменением содержани  изучаемого антигена в клетке при развитии организма или клеточном цикле, наблюда  за миграцией антигена в-пределах клетки и всего организма.

Claims (1)

1. Формула из об р е т е н и   Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L. ВСКК (П) № 530 Д,

   используемый дл  получени  моноклональ- ных антител к М независимой ДНКазе хроматина печени крыс.

   Таблица 1

   Таблица 2