CN112175070A - 一种制备单克隆抗体快速免疫的方法 - Google Patents

一种制备单克隆抗体快速免疫的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种制备单克隆抗体快速免疫的方法，属于诊断技术领域，包括以下步骤：S1、在养殖的动物中，取不低于7周龄的动物进行分笼，S2、以4%水合氯醛按0.1ml/10g的量，对动物进行麻醉，S3、用1ml一次性无菌注射器抽取稀释好的抗原溶液,S4、在洁净环境中把麻醉的动物固定在手术台上，暴露腹部，除去腹部的毛发,S5、用手术弯剪剪开腹部外表皮，拨开脂肪组织，再用镊子轻轻拉出脾脏，将抗原注射入脾脏内,S6、用缝合针缝合伤口,S7、每间隔3‑14天进行第二和第三次免疫，第三次免疫后2‑5天采血进行验证致敏的B淋巴细胞分泌抗体的情况;本发明设计合理实用，抗原使用量低，降低成本，可以提高抗体效价，在一定程度上消除假阳性。免疫操作简单，无需担心出现免疫到皮下而导致免疫不成功的情况。

Description

一种制备单克隆抗体快速免疫的方法
技术领域
本发明涉及IVD诊断技术领域，具体为一种制备单克隆抗体快速免疫的方法。
背景技术
现阶段杂交瘤单克隆抗体的制备主要为在细胞融合技术基础上将分泌特异性抗体的B淋巴细胞与具有无限增殖能力的骨髓里细胞融合，形成针对一种抗原表位的特异性抗体，而这过程均需要进行免疫，目前常用的免疫方法有腹腔注射，肌肉注射及皮下注射，这三者的免疫常为间隔14天重复3-4次免疫，免疫达到融合条件预计需要49-63天，免疫周期较长，且需加佐剂乳化，操作繁琐耗时；该方法存在一定缺陷，如：1，抗原注射后未能完全刺激脾脏就被分解掉一部分，影响抗体效价；2，现有技术在乳化过程无论是使用手动推还是超声乳化均存在在操作过程发热过高导致抗原变性。为此，急需一种制备单克隆抗体快速免疫的方法来解决这些问题。
发明内容
本发明提供的发明目的在于提供一种制备单克隆抗体快速免疫的方法，能缩短免疫周期，刺激产生特异性抗体的B淋巴细胞效果更好。
为了实现上述效果，本发明提供如下技术方案：一种制备单克隆抗体快速免疫的方法，包括以下步骤：
S1、在养殖的动物中，在养殖的动物中，取不低于7周龄的动物，分区域饲养；
S2、对动物进行麻醉，可使用但不限于4%水合氯醛按0.1ml/10g的量；
S3、用1ml一次性无菌注射器抽取稀释好的抗原溶液。
S4、在洁净环境中把麻醉的动物固定在手术台上，暴露其腹部，除出腹部的毛发。
S5、用手术弯剪剪开腹部外表皮，拨开脂肪组织，再用镊子轻轻拉出脾脏，将抗原注射入脾脏内。
S6、用缝合针缝合伤口。
S7、每间隔7天进行第二和第三次加强免疫，第三次加强免疫后第3天采血进行验证致敏的B淋巴细胞分泌抗体的情况。
进一步的，根据S1中的操作步骤，在对雌性小鼠进行脾免前2-5天，对雌性小鼠进行分笼。
进一步的，根据S2中的操作步骤，在对雌性小鼠进行脾免前，前半小时对雌性小鼠进行麻醉。
进一步的，根据S3中的操作步骤，所述抗原溶液为生理盐水稀释制成，在稀释时，按照每只小鼠20-30ug/50ul的量进行稀释。
进一步的，根据S4中的操作步骤，在除出麻醉的雌性小鼠腹部的毛发后，对除出毛发的雌性小鼠腹部采用酒精棉和消毒液进行擦拭消毒。
进一步的，所述消毒液为碘酊或者乙醇中的任意一种。
进一步的，根据S5中的操作步骤，在使用手术弯剪和镊子前，采用高压对手术弯剪和镊子进行灭菌。
进一步的，根据S6中的操作步骤，在缝合雌性小鼠的伤口后，用碘酊溶液对雌性小鼠的伤口进行消毒。
进一步的，所述碘酊溶液为30%浓度的超纯水。
进一步的，根据S6中的操作步骤，所述缝合针采用11x24的医用缝合针。
本发明提供了一种制备单克隆抗体快速免疫的方法，具备以下有益效果：
（1）本发明中，脾免前把啮齿动物按1-2只/笼，分笼能够使啮齿动物得到更大的活动空间，避免因免疫后出现烦躁而相互残杀的情况，同时获得更大的活动空间充足的食物，更高效的使免疫原刺激产生抗体。
（2）本发明中，将脾脏拉出来注射抗原，避免抗原被机体分解，同时能使抗原直接可刺激到脾脏，更快更高效的刺激B淋巴细胞产生特异性抗体。
（3）本发明中，抗原使用量较低，降低成本。
（4）本发明中，可以提高抗体效价，在一定程度上消除假阳性。
（5）本发明中，免疫操作简单，无需担心出现免疫到皮下而导致免疫不成功的情况。
附图说明
图1为一种制备单克隆抗体快速免疫的方法的流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：请参阅图1，一种制备单克隆抗体快速免疫的方法，包括以下步骤：
步骤一、在养殖的雌性小鼠中，取7-9周龄的雌性小鼠进行分笼，每笼1-2只。
步骤二、以4%水合氯醛按0.1ml/10g的量，对分笼后的雌性小鼠进行麻醉。
步骤三、用1ml一次性无菌注射器抽取稀释好的抗原溶液。
步骤四、在生物安全柜中把麻醉的雌性小鼠固定在手术台上，暴露麻醉的雌性小鼠的腹部，除出麻醉的雌性小鼠腹部的毛发。
步骤五、用手术弯剪剪开麻醉的雌性小鼠的腹部外表皮，拨开脂肪组织，再用镊子轻轻拉出脾脏，将抗原注射入脾脏内。
步骤六、用缝合针缝合雌性小鼠的伤口。
步骤七、每间隔7天进行第二和第三次加强免疫，第三次加强免疫后第3天采血进行验证致敏的B淋巴细胞分泌抗体的情况。
具体的，根据步骤一中的操作步骤，在对雌性小鼠进行脾免前2-5天，对雌性小鼠进行分笼。
具体的，根据步骤二中的操作步骤，在对雌性小鼠进行脾免前，前半小时对雌性小鼠进行麻醉。
具体的，根据步骤三中的操作步骤，所述抗原溶液为生理盐水稀释制成，在稀释时，按照每只小鼠20-30ug/50ul的量进行稀释。
具体的，根据步骤四中的操作步骤，在除出麻醉的雌性小鼠腹部的毛发后，对除出毛发的雌性小鼠腹部采用酒精棉和消毒液进行擦拭消毒。
具体的，消毒液为碘酊或者乙醇中的任意一种。
具体的，根据步骤五中的操作步骤，在使用手术弯剪和镊子前，采用高压对手术弯剪和镊子进行灭菌。
具体的，根据步骤六中的操作步骤，在缝合雌性小鼠的伤口后，用碘酊溶液对雌性小鼠的伤口进行消毒。
具体的，碘酊溶液为30%浓度的超纯水。
具体的，根据步骤六中的操作步骤，缝合针采用11x24的医用缝合针。
对传统方法和本申请的方法对比，得到如下数据，详见表1所示：
表1 实验数据表
特异性抗体产生效果 抗原使用量 免疫成功情况
传统方法 低效 较高 不易成功
本实施例 高效 较低 易成功
由上述实验数据得出，实施例一，该制备单克隆抗体快速免疫的方法，在使用时，具有特异性抗体产生高效、抗原使用量较低及免疫易成功的效果。
一种制备单克隆抗体快速免疫的方法，包括以下步骤：
步骤一、在养殖的雌性小鼠中，取7-9周龄的雌性小鼠进行分笼，每笼1-2只，在对雌性小鼠进行脾免前2-5天，对雌性小鼠进行分笼，分笼能够使啮齿动物得到更大的活动空间，避免因免疫后出现烦躁而相互残杀的情况，同时获得更大的活动空间充足的食物，更高效的使免疫原刺激产生抗体。
步骤二、以4%水合氯醛按0.1ml/10g的量，对分笼后的雌性小鼠进行麻醉，在对雌性小鼠进行脾免前，前半小时对雌性小鼠进行麻醉。
步骤三、用1ml一次性无菌注射器抽取稀释好的抗原溶液，抗原溶液为生理盐水稀释制成，在稀释时，按照每只小鼠20-30ug/50ul的量进行稀释。
步骤四、在生物安全柜中把麻醉的雌性小鼠固定在手术台上，暴露麻醉的雌性小鼠的腹部，除出麻醉的雌性小鼠腹部的毛发，在除出麻醉的雌性小鼠腹部的毛发后，对除出毛发的雌性小鼠腹部采用酒精棉和消毒液进行擦拭消毒，消毒液为碘酊或者乙醇中的任意一种。
步骤五、用手术弯剪剪开麻醉的雌性小鼠的腹部外表皮，拨开脂肪组织，再用镊子轻轻拉出脾脏，将抗原注射入脾脏内，在使用手术弯剪和镊子前，采用高压对手术弯剪和镊子进行灭菌，将脾脏拉出来注射抗原，避免抗原被机体分解，同时能使抗原直接可刺激到脾脏，更快更高效的刺激B淋巴细胞产生特异性抗体。
步骤六、用缝合针缝合雌性小鼠的伤口，在缝合雌性小鼠的伤口后，用碘酊溶液对雌性小鼠的伤口进行消毒，碘酊溶液为30%浓度的超纯水，缝合针采用医用缝合针。
步骤七、每间隔7天进行第二和第三次加强免疫，第三次加强免疫后第3天采血进行验证致敏的B淋巴细胞分泌抗体的情况，通过上述的免疫方式，可在较短时间内获得高表达量的B淋巴细胞，较传统模式缩短1个多月的时间，且无需添加佐剂。
该免疫方法是把小鼠的脾脏拉出来，把抗原全部注射到里面，过程包括解刨、免疫、缝合和采血。根据不同的免疫原选择不同的抗原注射量，以能达到最佳的免疫效果。
为了对本方法更好的进行说明，以CD14单克隆抗体制备的免疫处理过程为例：
1）准备免疫需用的7-9周龄的小鼠。
2）准备所需量0.5ml的纯化水，震荡至完全溶解抗原。
3）准备1ml无菌一次性注射器，把溶解稀释好的抗原抽取其中；
4）把待免疫的小鼠固定在手术架上，暴露腹部，去毛，75%消毒。
5）使用灭菌后的弯剪剪开脾脏位置的外表皮，用医用镊子轻轻夹出脾脏。
6）按20-30ug/只注射50ul进入脾脏。
7）缝合伤口，碘酊消毒。
8）间隔7天，重复以上步骤后3天采血进行效价检测，即可。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (11)

1.一种制备单克隆抗体快速免疫的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、在养殖的动物中，取不低于7周龄的动物，分区域饲养；
S2、对动物进行麻醉，可使用但不限于4%水合氯醛按0.1ml/10g的量；
S3、用1ml一次性无菌注射器抽取稀释好的抗原溶液；
S4、在洁净环境中把麻醉的动物固定在手术台上，暴露腹部，除去腹部的毛发；
S5、用手术弯剪剪开腹部外表皮，拨开脂肪组织，再用镊子轻轻拉出脾脏，将抗原注射入脾脏内；
S6、用缝合针缝合伤口；
S7、每间隔3-14天进行第二和第三次免疫，第三次免疫后2-5天采血进行验证致敏的B淋巴细胞分泌抗体的情况。
2.根据权利要求1所述的一种制备单克隆抗体快速免疫的方法，其特征在于，根据S1中的操作步骤，在对动物进行脾免前2-5天，进行分区饲养。
3.根据权利要求1所述的一种制备单克隆抗体快速免疫的方法，其特征在于，根据S2中的操作步骤，在进行脾免前不少于10分钟前，对动物进行麻醉。
4.根据权利要求1所述的一种制备单克隆抗体快速免疫的方法，其特征在于，根据S3中的操作步骤，所述抗原溶液为生理盐水稀释制成。
5.根据权利要求4所述的一种制备单克隆抗体快速免疫的方法，其特征在于，所述的抗原稀释液可为生理盐水或磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1所述的一种制备单克隆抗体快速免疫的方法，其特征在于，根据S4中的操作步骤，在除出麻醉动物腹部的毛发后，对腹部采用消毒液进行擦拭消毒。
7.根据权利要求5所述的一种制备单克隆抗体快速免疫的方法，其特征在于，所述消毒液为碘酊或者乙醇中的任意一种。
8.根据权利要求1所述的一种制备单克隆抗体快速免疫的方法，其特征在于，根据S5中的操作步骤，在使用手术弯剪和镊子前，采用高压对手术弯剪和镊子进行灭菌。
9.根据权利要求1所述的一种制备单克隆抗体快速免疫的方法，其特征在于，根据S6中的操作步骤，在缝合伤口后，用消毒液对伤口进行再次消毒。
10.根据权利要求6所述的一种制备单克隆抗体快速免疫的方法，其特征在于，所述碘酊溶液为30%浓度的超纯水。
11.根据权利要求1所述的一种制备单克隆抗体快速免疫的方法，其特征在于，根据S6中的操作步骤，所述缝合针采用医用缝合针。
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