CN114755409A - 一种定量检测MxA蛋白的免疫荧光层析试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种定量检测MxA蛋白的免疫荧光层析试剂盒及其制备方法，由以下步骤组成，荧光微球活化；偶联：抗MxA单克隆抗体或鸡IgY抗体与荧光微球质量比0.1~0.2：1混合偶联，封闭处理、离心，重悬，得到荧光微球标记后的抗MxA单克隆抗体；标记垫喷荧光微球；硝酸纤维素膜喷涂划线；将样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜和吸水纸在PVC底板上顺次相互搭接粘贴。本发明制备的定量检测MxA蛋白的免疫荧光层析试剂盒检测灵敏度高，线性范围宽，检测稳定性和重复性优异。
Description
技术领域
本发明属于医学免疫诊断试剂技术领域，具体涉及一种定量检测MxA蛋白的免疫荧光层析试剂盒及其制备方法。
背景技术
MxA是由Ⅰ型干扰素(IFNα/β)诱导人细胞所产生的78kd的抗病毒蛋白，其具有生物活性稳定，抗病毒作用直接、半衰期较长，特异性好，检测方便等优点。人的MxA蛋白分布于细胞的胞浆内，大量研究资料表明，MxA蛋白与病毒的感染密切相关，对病毒反应非常敏感甚至极少的病毒量即可诱导细胞表达MxA蛋白，因此MxA蛋白可用于病毒感染的早期诊断，也可用于临床病毒感染与细菌或者其他微生物感染的鉴别诊断。
目前MxA的临床检测方法有：酶联免疫吸附实验(ELISA)、荧光层析法、胶乳增强免疫比浊法。但是当前检测灵敏度仍然不足，线性范围较窄，开发一种灵敏度高、线性范围广的检测试剂盒是有待解决的技术问题。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
本发明提供一种定量检测MxA蛋白的免疫荧光层析试剂盒的制备方法，其由以下步骤组成，
荧光微球活化；
偶联：抗MxA单克隆抗体或鸡IgY抗体与荧光微球质量比0.1～0.2：1混合偶联，封闭处理、离心，重悬，得到荧光微球标记后的抗MxA单克隆抗体；
标记垫喷荧光微球：将浓度为2mg/ml的荧光微球标记后的抗MxA单克隆抗体以2μl/cm喷涂于标记垫，干燥；
硝酸纤维素膜喷涂划线：羊抗鸡二抗划涂为NC膜的质控线，将抗MxA多克隆抗体划涂为NC膜的检测线，干燥；
将样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜和吸水纸在PVC底板上顺次相互搭接粘贴。
作为本发明所述的定量检测MxA蛋白的免疫荧光层析试剂盒的制备方法的一种优选方案：所述偶联，抗MxA单克隆抗体与荧光微球质量比为0.125：1，所述抗MxA单克隆抗体，货号为orb167030。
作为本发明所述的定量检测MxA蛋白的免疫荧光层析试剂盒的制备方法的一种优选方案：所述抗MxA多克隆抗体，货号为K107664P。
作为本发明所述的定量检测MxA蛋白的免疫荧光层析试剂盒的制备方法的一种优选方案：所述硝酸纤维素膜喷涂划线，为将浓度为0.5mg/ml的羊抗鸡二抗以1uL/cm的包被量划涂为NC膜的质控线，将浓度为1mg/ml的抗MxA多克隆抗体以1uL/cm的包被量划涂为NC膜的检测线，45℃干燥12小时。
作为本发明所述的定量检测MxA蛋白的免疫荧光层析试剂盒的制备方法的一种优选方案：所述荧光微球活化，为在清洗后的14.7mg荧光微球中加入735ul 50mM MES活化缓冲液，水浴超声处理5min；用蒸馏水配制EDC溶液，EDC溶液浓度为1mg/ml，加入367.5ul的EDC溶液，水浴超声5min，全部混匀，室温放置25min。
作为本发明所述的定量检测MxA蛋白的免疫荧光层析试剂盒的制备方法的一种优选方案：所述偶联，为吸取抗MxA单克隆抗体或者鸡IgY抗体，边振荡边加入到活化后的溶液中；振荡混匀，超声5min，混匀；放入37℃恒温振荡器中，于200r/min反应3h，超声5min。
作为本发明所述的定量检测MxA蛋白的免疫荧光层析试剂盒的制备方法的一种优选方案：所述封闭处理，为取恢复至室温的20％BSA，加入到偶联后的溶液中，混匀，超声5min，于37℃恒温振荡器中，200r/min反应30min；所述离心，为于4℃高速冷冻离心机16000r/min离心30min去上清；所述重悬，为加入保存液重悬；所述保存液，为含有10％BSA和1％TWEEN 20的10mM Tris-HCL缓冲液，pH 7.4。
作为本发明所述的定量检测MxA蛋白的免疫荧光层析试剂盒的制备方法的一种优选方案：所述标记垫，其制备方法为，将玻璃纤维素膜浸入含有10％BSA、4％PVA-10、2％曲拉通100、0.02％Proclin-300的10mM的Tris-HCl缓冲液，pH值为8.0，浸泡时间30min，进行干燥，湿度≤20％，温度37-45℃，干燥10小时。
作为本发明所述的定量检测MxA蛋白的免疫荧光层析试剂盒的制备方法的一种优选方案：所述样品垫，其制备方法为，将玻璃纤维素膜浸入含有10％BSA、5％蔗糖、2％曲拉通100、10mg/mLRBC抗体、0.02％Proclin-300的10mM的PBS缓冲液，pH值为7.2，浸泡时间30min，进行干燥，湿度≤20％，温度37-45℃，干燥10小时。
本发明的有益效果：本发明制备的定量检测MxA蛋白的免疫荧光层析试剂盒，检测灵敏度高，线性范围宽，检测稳定性和重复性优异。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1：
1、荧光微球标记：
清洗：
(1)检查荧光微球，确保无凝聚、无漂浮物等变质情况，用移液器将荧光微球吹打混匀，于干净的离心管中；荧光微球范围选为0.19-0.21μm，平均粒径为0.2μm，BangsLaboratories,Inc，货号为FCEU002，荧光微球的激发波长为365nm，发射波长为615nm；
(2)加入50mM MES活化缓冲液,于4℃的高速冷冻离心机16000r/min离心、10min，移液器轻轻吸取上清液；
(3)重复步骤(2)。
活化：
(1)在清洗后的14.7mg荧光微球中加入735ul 50mM MES活化缓冲液，水浴超声处理5min。
(2)用蒸馏水配制EDC溶液，EDC溶液浓度为1mg/ml，加入367.5ul的EDC溶液，水浴超声5min，全部混匀，室温放置25min。
偶联：
(1)吸取抗MxA单克隆抗体(购自biorbyt，货号为：orb167030)或者鸡IgY抗体，MxA单克隆抗体或者鸡IgY抗体与荧光微球的质量比为0.125：1，边振荡边加入到上述活化后的离心管中；振荡混匀，超声5min，全部混匀。
(2)放入37℃恒温振荡器中，于200r/min反应3h，超声5min。
封闭：取1.617ml恢复至室温的20％BSA，加入到上述步骤中的离心管中，吹打混匀，超声5min，确保全部混匀。然后于37℃恒温振荡器中，200r/min反应30min。
保存：将上一步处理后的的中间品，于4℃的高速冷冻离心机16000r/min、30min，去上清；加入保存液(10mM Tris-HCL缓冲液，pH 7.4，+10％BSA+1％TWEEN 20)，重悬荧光微球。
2、NC膜喷涂划线：
将浓度为0.5mg/ml的羊抗鸡二抗以1uL/cm的包被量划涂为NC膜的质控线，将浓度为1mg/ml的抗MxA多克隆抗体(Beijing Solarbio Science&Technology，货号K107664P)以1uL/cm的包被量划涂为NC膜的检测线，45℃干燥12小时。
3、标记垫的制备：
将标记垫处理液摇匀，标记垫为玻璃纤维素膜，货号为Ahlstrom 8964，标记垫处理液的配方为10mM的Tris-HCl缓冲液(BSA10％，PVA-104％，曲拉通1002％，Proclin-3000.02％)，pH值为8.0。
取出标记垫，使用裁纸刀将标记垫裁剪成宽7.8cm，长30cm的尺寸。
将标记垫浸泡在标记垫处理液中，浸泡时间30min，放入干燥间进行干燥10小时，湿度16％，温度40℃。
4、标记垫喷荧光微球：
将荧光微球标记后的MxA单克隆抗体溶液(溶液中MxA单克隆抗体浓度2mg/ml)喷涂于标记垫，使用喷金仪设置喷量：2μl/cm*1次，每条喷金长度30cm，喷金间隔13mm；将已喷金结合垫放到指定网架上，放入干燥间进行干燥，要求至少10小时，湿度≤20％，温度37-45℃。
5、样品垫处理：
样品垫为玻璃纤维素膜，厂家货号为Ahlstrom 8951，裁剪成平整成18mm*300mm尺寸样品垫处理液配方为10mM的PBS缓冲液(BSA10％，蔗糖5％，曲拉通1002％，RBC抗体10mg/mL，Proclin-3000.02％)，pH值为7.2，浸泡时间30min，放入干燥间进行干燥10小时，湿度≤20％，温度37-45℃。
试剂盒组装：将样品垫、标记垫、NC膜和吸水纸在PVC底板上顺次相互搭接粘贴，然后裁切成3-4mm宽度的试纸条，压入塑料卡壳，得MxA免疫荧光层析试剂盒。
定量检测MxA蛋白的免疫荧光层析试剂盒检测全血、血清或血浆中MxA的浓度：取50ul全血、血清或者血浆从样品加入区滴加，进行层析反应。15分钟后，使用干式荧光免疫分析仪，测定试纸条检测线和质控线的荧光强度，经过一定的数据拟合计算得到全血、血清或者血浆中MxA的浓度。
针对荧光微球标记检测抗体MxA单克隆抗体和NC膜划线抗体MxA多克隆抗体进行筛选，各抗体信息如下：
测试采用不同抗体组合的MxA检出限和线性范围，结果表明采用单克隆抗体1与多克隆抗体5组合的线性范围最佳，检出限最低，单克隆抗体1与多克隆抗体5组合检出限为0.1ng/mL，线性范围0.1-260ng/mL，单克隆抗体2与多克隆抗体4组合检出限为0.7ng/mL，线性范围1-200ng/mL。
参考区间统计分析：经正态性检验后，如参考值数据近似正态分布或监测数据经变量转换后呈正态分布，采用正态分布法确定参考区间，取单侧上限95％置信区间(平均值x(-)+1.64标准差s)来计算参考区间。
测试240例血清样本：
按照95％置信区间计算参考区间上限(cut off值)：
| 项目 | 例数 | 第95百分位数(第228位数) | 参考区间 |
| MxA | 240 | 39.7ng/mL | ≤39.7ng/mL |
实施例1检测试剂盒的重复性测试：
重复性：
分别检测重复性参考品1(MxA蛋白浓度为60±10ng/mL)和重复性参考品2(MxA蛋白浓度为180±40ng/mL)，重复检测10次，分别计算检测结果的平均值(
)、标准差(SD)，根据公式得出变异系数(CV)根据式(3)得出变异系数(CV)。
式中：
CV——变异系数；
SD——标准偏差；
批间差：
用3个不同批号试剂盒，分别检测分别检测重复性参考品1(MxA蛋白浓度为60±10ng/mL)和重复性参考品2(MxA蛋白浓度为180±40ng/mL)，每个批号分别检测10次，计算检测30次结果的平均值
、标准差(SD)，根据公式(6)得出变异系数(CV)。
式中：
CV——变异系数；
SD——标准偏差；
重复性结果：
批间差结果：
本发明中，标记垫处理液的配方及pH值、荧光微球的粒径与选择、抗体的选择及抗体与荧光微球的配比均会对检测灵敏度和重复性造成影响，本发明技术方案检测灵敏度高，线性范围宽，检测稳定性和重复性优异。
对照例：
抗体组合采用单克隆抗体3与多克隆抗体4组合的重复性测试结果如下：
抗体组合采用单克隆抗体2与多克隆抗体6组合的重复性测试结果如下：
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种定量检测MxA蛋白的免疫荧光层析试剂盒的制备方法，其特征在于：由以下步骤组成，
荧光微球活化；
偶联：抗MxA单克隆抗体或鸡IgY抗体与荧光微球质量比0.1~0.2：1混合偶联，封闭处理、离心，重悬，得到荧光微球标记后的抗MxA单克隆抗体；
标记垫喷荧光微球：将浓度为2mg/ml的荧光微球标记后的抗MxA单克隆抗体以2μl/cm喷涂于标记垫，干燥；
硝酸纤维素膜喷涂划线：羊抗鸡二抗划涂为NC膜的质控线，将抗MxA多克隆抗体划涂为NC膜的检测线，干燥；
将样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜和吸水纸在PVC底板上顺次相互搭接粘贴。
2.根据权利要求1所述的定量检测MxA蛋白的免疫荧光层析试剂盒的制备方法，其特征在于：所述偶联，抗MxA单克隆抗体与荧光微球质量比为0.125：1，所述抗MxA单克隆抗体，货号为orb167030；所述荧光微球，货号为FCEU002。
3.根据权利要求1或2所述的定量检测MxA蛋白的免疫荧光层析试剂盒的制备方法，其特征在于：所述抗MxA多克隆抗体，货号为K107664P。
4.根据权利要求1或2所述的定量检测MxA蛋白的免疫荧光层析试剂盒的制备方法，其特征在于：所述硝酸纤维素膜喷涂划线，为将浓度为0.5mg/ml的羊抗鸡二抗以1uL/cm的包被量划涂为NC膜的质控线，将浓度为1mg/ml的抗MxA多克隆抗体以1uL/cm的包被量划涂为NC膜的检测线，45℃干燥12小时。
5.根据权利要求1或2所述的定量检测MxA蛋白的免疫荧光层析试剂盒的制备方法，其特征在于：所述荧光微球活化，为在清洗后的14.7mg荧光微球中加入735ul 50 mM MES活化缓冲液，水浴超声处理5min；用蒸馏水配制EDC溶液，EDC溶液浓度为1mg/ml，加入367.5ul的EDC溶液，水浴超声5min，全部混匀，室温放置25min。
6.根据权利要求5所述的定量检测MxA蛋白的免疫荧光层析试剂盒的制备方法，其特征在于：所述偶联，为吸取抗MxA单克隆抗体或者鸡IgY抗体，边振荡边加入到活化后的溶液中；振荡混匀，超声5min，混匀；放入 37 ℃恒温振荡器中，于 200 r/min 反应3h，超声5min。
7.根据权利要求6所述的定量检测MxA蛋白的免疫荧光层析试剂盒的制备方法，其特征在于：所述封闭处理，为取恢复至室温的20% BSA，加入到偶联后的溶液中，混匀，超声5min，于 37 ℃恒温振荡器中，200 r/min反应30 min；所述离心，为于4 ℃高速冷冻离心机16000 r/min离心30 min去上清；所述重悬，为加入保存液重悬；所述保存液，为含有10%BSA和1%TWEEN 20的10mM Tris-HCL缓冲液，pH 7.4。
8.根据权利要求1所述的定量检测MxA蛋白的免疫荧光层析试剂盒的制备方法，其特征在于：所述标记垫，其制备方法为，将玻璃纤维素膜浸入含有10% BSA、4% PVA-10、2%曲拉通100、0.02% Proclin-300的10mM的Tris-HCl缓冲液，pH值为8.0，浸泡时间30min，进行干燥，湿度≤20%，温度37-45℃，干燥10小时。
9.根据权利要求1所述的定量检测MxA蛋白的免疫荧光层析试剂盒的制备方法，其特征在于：所述样品垫，其制备方法为，将玻璃纤维素膜浸入含有10% BSA、5%蔗糖、2%曲拉通100、10mg/mLRBC抗体、0.02% Proclin-300的10mM的PBS缓冲液，pH值为7.2，浸泡时间30min，进行干燥，湿度≤20%，温度37-45℃，干燥10小时。
10.权利要求1所述的定量检测MxA蛋白的免疫荧光层析试剂盒的制备方法得到的免疫荧光层析试剂盒，其特征在于：所述免疫荧光层析试剂盒检测样本为人血液样本。
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|---|---|---|---|
| CN202210456537.3A CN114755409A (zh) | 2022-04-27 | 2022-04-27 | 一种定量检测MxA蛋白的免疫荧光层析试剂盒及其制备方法 |
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|---|---|---|---|---|
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