CN113583112A

CN113583112A - Aav特异性抗体及其应用

Info

Publication number: CN113583112A
Application number: CN202110872063.6A
Authority: CN
Inventors: 王慧; 蒋威; 郑静; 肖啸; 吴侠; 杜增民; 王利群; 赵阳; 陈晨; 郑浩
Original assignee: Faith Pharmaceutical Technology Suzhou Co ltd
Current assignee: Shanghai Mianyi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-07-30
Filing date: 2021-07-30
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2041-07-30
Also published as: CN113583112B

Abstract

本公开涉及结合AAV蛋白衣壳的单克隆抗体、其制备方法及其应用、编码该单克隆抗体的核酸分子、包含该核酸分子的载体、包含该载体的宿主细胞、包含该单克隆抗体的偶联物以及试剂盒。本公开的单克隆抗体可以特异性结合AAV蛋白衣壳，可以用于该AAV蛋白衣壳的检测以及纯化。

Description

AAV特异性抗体及其应用

技术领域

本公开涉及结合AAV蛋白衣壳的单克隆抗体、其制备方法及其应用、编码该单克隆抗体的核酸分子、包含该核酸分子的载体、包含该载体的宿主细胞、包含该单克隆抗体的偶联物以及试剂盒。

背景技术

腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的病毒。病毒颗粒的直径在20-26nm之间，含有大小在4.7kb左右的线性单链DNA基因组。AAV最初是在纯化的腺病毒液中发现的一种污染成分所以得名。大多数成年人都感染过AAV病毒，但尚未发现该病毒是任何疾病的致病因素。

重组腺相关病毒(rAAV)是在非致病的野生型AAV基础上进一步改造而成的新型基因载体，由于其安全性好、宿主细胞范围广、免疫原性低、在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗研究中得到了广泛的应用。目前一些新的AAV血清型的特征是通过全身性基因递送大大改善了心脏，肌肉和CNS的转导效率。其他一些在小型动物的肝基因转移中有效。

这些发现为许多遗传和代谢疾病的基因治疗提供了启示。除了鉴定新的血清型外，基因修饰还可以进一步改善AAV载体的临床应用。利用AAV载体的一个问题是其广泛的组织趋向性，其通常导致基因在不需要的组织中转移，并引起异位基因表达的潜在安全隐患。为了提高AAV病毒颗粒的组织特异性和组织靶向能力，衣壳基因的随机诱变除进行合理的工程设计外，是增强衣壳多样性和改变衣壳向目标组织的向性的最有效方法之一。定向进化(例如DNA改组)是AAV衣壳基因遗传工程的最新开发方法之一。

国际专利申请WO 2019241324 A1涉及通过定向进化获得的靶向肝的合成腺相关病毒蛋白衣壳，命名为AAVXL32.1。然而，由于该蛋白衣壳是通过DNA改组获得的，目前尚未存在特异性识别该蛋白衣壳(AAVXL32.1)的单克隆抗体，无法对其进行准确定量检测。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述缺陷，本公开提供了一种单克隆抗体，其可以特异性结合AAVXL32.1蛋白衣壳(其氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示)。因此，本公开的单克隆抗体可以用于AAVXL32.1蛋白衣壳的检测(包括定性检测和定量检测)以及纯化。

在第一方面，本公开提供一种结合AAV蛋白衣壳的单克隆抗体，其包含重链可变区的VH CDR1-3和轻链可变区的VL CDR1-3，所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3具有至少80％、85％、90％、95％的同一性，所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6具有至少80％、85％、90％、95％的同一性。

在一个实施方式中，上述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列分别包含SEQID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3，上述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

在一个实施方式中，上述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示，上述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。

在第二方面，本公开提供一种结合AAV蛋白衣壳的单克隆抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：7具有至少80％、85％、90％、95％的同一性，所述轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：8具有至少80％、85％、90％、95％的同一性。

在一个实施方式中，上述重链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO：7，上述轻链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO：8。

在一个实施方式中，上述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，上述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

在一个实施方式中，上述单克隆抗体为嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体。

在一个实施方式中，上述AAV蛋白衣壳的氨基酸序列与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％的同一性。在一个优选实施方式中，上述AAV蛋白衣壳的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。

在一个实施方式中，上述单克隆抗体以小于1.0E-12M的K_D结合上述AAV蛋白衣壳。

在第三方面，本公开提供一种核酸分子，其编码上述单克隆抗体。

在第四方面，本公开提供一种载体，其包含上述核酸分子。

在第五方面，本公开提供一种宿主细胞，其包含上述载体。

在第六方面，本公开提供一种制备单克隆抗体的方法，包括：培养上述宿主细胞，获得细胞培养物；以及，从细胞培养物中回收单克隆抗体。

在第七方面，本公开提供一种偶联物，其包含上述单克隆抗体以及偶联部分，所述偶联部分为可检测标记。

在一个实施方式中，上述偶联部分为生物素、放射性同位素、发光物质、有色物质或酶，优选为生物素。

在第八方面，本公开提供上述单克隆抗体或上述偶联物在检测AAV蛋白衣壳中的应用。

在一个实施方式中，上述检测为定性检测或定量检测，优选定量检测。

在一个实施方式中，上述检测利用ELISA法、斑点印迹法或蛋白质印迹法进行。

在第九方面，本公开提供一种试剂盒，其包括：上述单克隆抗体和/或上述偶联物；可选的标记探针，所述标记探针结合至酶；以及，可选的显色底物，所述显色底物能够与所述酶发生反应。

在一个实施方式中，上述标记探针为生物素或亲和素化标记探针。

在一个实施方式中，上述酶为辣根过氧化物酶。

在一个实施方式中，上述显色底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)或二氨基联苯胺(DAB)。

附图说明

图1示出了mAb002抗体的SDS-PAGE测定。

图2示出了mAb002抗体的SEC-HPLC测定。

图3示出了mAb002抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。

图4示出了夹心法ELISA原理图。

图5示出了夹心法ELISA测定的标准曲线。

图6示出了mAb002抗体的动力学特征参数的检测结果。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。

在本文中，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即意味着“包括但不限于”)。

在本文中，术语“抗体”指完整抗体或者与该完整抗体竞争结合抗原的抗体片段。抗体片段包括但不限于：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、Fd、双抗体和保留完整抗体的可变区的至少一部分的其他抗体片段。在一些实施方案中，抗体片段通过完整抗体的酶促反应或者化学裂解产生。在一些实施方案中，抗体片段通过重组DNA技术产生。

在本文中，术语“单克隆抗体(monoclonal antibody，MAb)”是指由单个克隆的淋巴细胞分泌的针对抗原分子上特定抗原决定簇的同质性免疫球蛋白分子，简称单抗。在一些实施方案中，单克隆抗体由杂交瘤分泌。在一些实施方案中，杂交瘤根据本领域技术人员已知的方法产生，例如，Kohler and Milstein(1975)Nature,256:495-499。在一些实施方案中，使用重组DNA方法(如美国专利号4,816,567所述)产生单克隆抗体。

在本文中，术语“嵌合抗体”指由来自至少两种不同来源的组分组成的抗体。在一些实施方案中，嵌合抗体包含来自第一种物种的抗体部分，其与另一分子，例如，来自第二种物种的抗体部分融合。在一些实施方案中，嵌合抗体包含来自非人动物的抗体部分，其与来自人的抗体部分融合。在一些实施方案中，嵌合抗体包含来自非人动物的抗体的可变区的全部或者部分，其与来自人的抗体的恒定区融合。

在本文中，术语“人源化抗体”指用基因克隆及DNA重组技术对非人(例如鼠)源单克隆抗体改造、重新表达产生的抗体。人源化抗体的大部分氨基酸序列被人源序列取代，基本保留亲本非人(例如鼠)源单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了其异源性，有利应用于人体。相对于非人源化抗体，人源化抗体通常对人类的免疫原性较低。

在本文中，术语“全人源抗体”是指既包含人骨架区又包含人CDR的免疫球蛋白。恒定区不必完整地存在，但如果存在，则它们与人免疫球蛋白恒定区基本相同，即至少约85-90％，优选约95％或更高程度的相同。

当抗体优先识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的某一抗原时，该抗体与该抗原“特异性结合”。在一些实施方案中，抗体包含特异性结合特定表位的抗原结合位点。在一些实施方案中，当解离常数(KD)小于1μM、小于100nM、小于10nM或小于1nM时，认为抗体与抗原特异性结合。

在一些实施方案中，对抗体进行修饰以改变它的一种或多种性质。在一些实施方案中，经修饰的抗体可以相对于未经修饰的抗体具有优点，如增加的稳定性。在一些实施方案中，通过改变抗体的糖基化状态，如通过改变抗体上糖链的数目、类型、连接和/或位置对抗体进行修饰。

在本文中，术语“百分比同一性”或者“％同一性”指使用基础局部对比搜索工具(BLAST)引擎比对的至少两个多肽序列之间相同氨基酸的百分比。

抗体和制备抗体的方法在本领域是公知的。

在一些实施方案中，通过标准技术产生单克隆抗体。在一些实施方案中，通过基于杂交瘤的方法产生单克隆抗体。在一些实施方案中，用免疫原免疫合适的动物，如小鼠、大鼠、仓鼠、猴或者其他哺乳动物以产生分泌抗体的细胞。在一些实施方案中，分泌抗体的细胞是B细胞，如淋巴细胞或脾细胞。在一些实施方案中，在体外免疫淋巴细胞(例如，人淋巴细胞)以产生分泌抗体的细胞。

在一些实施方案中，将分泌抗体的细胞与“永生化”细胞系，如骨髓型细胞系融合以产生杂交瘤细胞。在一些实施方案中，利用HAT选择性培养基筛选成功融合的杂交瘤细胞，该HAT选择性培养基含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)三种成分。在一些实施方案中，例如，通过ELISA筛选分泌所需抗体的杂交瘤细胞，然后使用标准方法亚克隆此类细胞并培养。在一些实施方案中，所需抗体是对目的抗原具有特异性的抗体。在一些实施方案中，还可以在合适的动物宿主中在体内作为腹水肿瘤培养此类细胞。在一些实施方案中，使用标准分离步骤(如亲和层析)从杂交瘤培养基、血清或者腹水分离单克隆抗体。

在一些实施方案中，使用基于展示的方法产生人单克隆抗体。在一些实施方案中，使用噬菌体展示技术产生人单克隆抗体。一些示例性抗体噬菌体展示方法是本领域技术人员已知的，例如Hoogenboom,Overview of Antibody Phage-Display Technology and ItsApplications,Methods in Molecular Biology:Antibody PhageDisplay:Methods andProtocols,(2002)178:1-37(O’Brien and Aitken,Human Press,Totowa,NJ).

在一些实施方案中，通过在体外将抗体进行亲和力成熟(或者“定向进化”)来增加抗体对特定抗原的亲和性。

在一些实施方案中，通过重组技术产生单克隆抗体，如美国专利号4,816,567所述。在一些实施方案中，克隆编码单克隆抗体链的核酸并在合适的宿主细胞中表达。在一些实施方案中，使用标准方法从表达所需抗体的细胞(如成熟B细胞或杂交瘤细胞)制备RNA，然后使用标准方法，用RNA制备cDNA。在一些实施方案中，使用寡核苷酸引物，通过PCR扩增编码重链或者轻链多肽的cDNA。在一些实施方案中，将cDNA克隆到合适的表达载体中，然后将表达载体转化或者转染到合适的宿主细胞。一些示例性宿主细胞包括：大肠杆菌、COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞以及骨髓瘤细胞。

在一些实施方案中，使用检测抗体与抗原结合的常规方法，测定抗体对抗原(如AAV蛋白衣壳)的结合能力。

例如，在一些实施方案中，通过标准免疫印迹方法，如蛋白质印迹，测定单克隆抗体结合AAV蛋白衣壳的能力。在一些实施方案中，使用竞争结合测定法测定单克隆抗体结合AAV蛋白衣壳的能力。在一些实施方案中，使用ELISA进行竞争性结合测定。在一些实施方案中，用结合测定法测定抗体的结合动力学(例如，速率常数)或者结合亲和性(例如，缔合或者解离常数)。

本公开的单克隆抗体可以进行氨基酸的“保守性替换”。氨基酸的“保守性替换”指将多肽中的氨基酸用具有相似性质(如大小或电荷)的另一种氨基酸替代。氨基酸的保守性替换是本领域已知的。在一些实施方案中，包含氨基酸保守性替换的多肽保持未替换的多肽的至少一种活性。在一个实施方式中，本公开的单克隆抗体在以下同一组中的氨基酸可进行保守性替换：a)甘氨酸和丙氨酸；b)缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和脯氨酸；c)天冬氨酸和谷氨酸；d)天冬酰胺和谷氨酰胺；e)丝氨酸、苏氨酸赖氨酸、精氨酸和组氨酸；f)苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；g)蛋氨酸和半胱氨酸。

在一个实施方式中，使用本公开的单克隆抗体对AAV蛋白衣壳进行定性或定量检测。在一个实施方式中，使用本公开的单克隆抗体，利用双抗夹心ELISA法，对AAV蛋白衣壳进行定性或定量检测。在一个实施方式中，利用双抗夹心ELISA法检测抗原浓度的方法包括如下步骤：1)将抗体与固相载体联结，形成固相抗体；2)加入抗原，使所述抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物；3)加入生物素化的抗体，使所述生物素化的抗体与固相免疫复合物上的抗原结合，形成夹心；4)加入结合至酶的标记探针，使所述标记探针与生物素化的抗体结合；5)加入底物显色，其中底物在酶的催化下发生颜色变化；6)根据底物的颜色变化，确定待测抗原的浓度。在一个优选实施方式中，AAV蛋白外壳的氨基酸序列与SEQ IDNO：9所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％(例如，96％、97％、98％、99％或100％)的同一性。在一个优选实施方式中，抗体以小于1.0E-12M的K_D结合所述AAV蛋白衣壳。在一个实施方式中，显色底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)或二氨基联苯胺(DAB)。在一个实施方式中，标记探针为生物素或亲和素化标记探针。在一个实施方式中，上述酶为辣根过氧化物酶。在一个实施方式中，固相载体选自：聚氯乙烯、聚苯乙烯、尼龙、聚丙烯、聚丙烯酰胺和纤维素。

下面结合附图和实施例对本公开作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本公开而不用于限制本公开的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，系按照本领域已知的常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行操作。

实施例

实施例1：抗原的生产

通过两质粒转染HEK293细胞，来生产完整的空心AAV蛋白衣壳(AAVXL32.1)作为抗原。使用AAV rep/cap质粒：phelper：聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine，PEI)＝1:1:2，在Opti-MEM中混合后静置12min后，将转染液加入悬浮HEK293细胞中。在二氧化碳培养箱培养24h后，弃掉旧的培养基并加入新的培养基。继续培养24h后，收集上清与细胞。加入2mMMgCl₂，进行超声破碎。在300W破碎4min后，细胞被破碎。加入50U/mL的Benzonase酶，在37℃孵育1h后，8000×g离心15min去除细胞碎片。将上清液使用0.8μm和0.45μm过滤器依次过滤。

使用肝素-琼脂糖凝胶HP(Heparin-Sepharose HP)进行捕获，先用平衡液(20mMTris，20mM NaCl，Pluronic F-68(0.001％(w/v)，pH7.5)对肝素柱进行平衡，平衡后将过滤后的上清液进行上样结合，结合完成后使用平衡液后平衡，使用洗脱液(20mM Tris，1MNaCl，Pluronic F-68(0.001％(w/v)，pH7.5)进行洗脱。将洗脱液使用超滤管(100KD)进行浓缩换液，最终换液的溶液体系为PBS+Pluronic F-68(0.001％(w/v)，得到抗原(AAVXL32.1蛋白衣壳)。通过Nanodrop(Thermofisher，Nanodrop 2000C分光光度计)在A280nm下测定抗原的浓度，为1mg/ml。

实施例2：杂交瘤细胞的获得

免疫动物

用实施例1获得的抗原免疫6-8周龄雌性Balb/c小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞。采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。

杂交瘤细胞的产生

将同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按1：1混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，B淋巴细胞与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后，产生如下五种细胞类型：未融合脾细胞、未融合骨髓瘤细胞、脾细胞-脾细胞融合体、骨髓瘤细胞-骨髓瘤细胞融合体、脾细胞-骨髓瘤细胞杂合体(杂交瘤细胞)。然后，利用杂交瘤细胞筛选技术，使用含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)的HAT选择性培养基(购自Solarbio，货号H0262)，分离得到杂交瘤细胞。

杂交瘤阳性克隆的筛选

将包含杂交瘤细胞的培养基稀释到多孔板中，使得每个孔仅含有一个杂交瘤细胞。采用ELISA方法筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。采用10％胎牛血清与1×HAT添加至DMEM中作为基础的培养液，在24孔板用1mL培养基培养杂交瘤细胞，然后转移到T-75培养瓶中。当细胞数达到1×10⁴至2×10⁴时，将杂交瘤细胞接种到装有DMEM+10％FBS+1×HT的25ml培养瓶中，并在37℃，5％CO₂条件下培养。每两天用倒置显微镜监测细胞状况，达到75％的融合度或5×10⁵细胞/ml且细胞活力超过85％时，进行下一步操作。

实施例3：单克隆抗体的生产和纯化

从培养瓶中收获细胞，并测定存活细胞数。如果活力高于80％，则将细胞接种到预先装有200mL抗体生产培养基(Hybridoma-SFM+2.5％FBS(低IgG))的滚瓶中，初始细胞密度为0.25×10⁵细胞/mL至0.5×10⁵细胞/mL。接种后在滚瓶培养仪中以300r/h的速度孵育，在无CO₂的条件下于37℃培养14-16天，收集细胞培养上清液。然后，将细胞悬液转移至350ml离心瓶中，并在4℃下3220×g离心15分钟，然后用0.45μm滤膜过滤，以除去细胞和细胞碎片。

将细胞培养上清液加载到预先平衡的Protein A亲和柱上，然后用10CV的平衡缓冲液(1x PBS，pH 7.2)洗涤该柱，直到流通样品的OD变为零。用5CV洗脱缓冲液(0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH 3.0)从色谱柱上洗脱抗体，仅进行一种洗脱而无需梯度洗脱。将洗脱的溶液收集在干净的管中，并用中和缓冲液(1M Trizma base，pH 9.0)中和至最终pH 7.0。在2-8℃下用3次缓冲液交换将收集到的抗体用100倍洗脱体积的PBS(pH 7.4)透析过夜，以确保完全交换缓冲液。将透析后的抗体转移到干净的试管中，并在生物安全柜中用0.22μm注射器过滤器进行无菌过滤，得到纯化的mAb002抗体。将纯化的mAb002抗体等分，并在-20℃下保存直至使用。

实施例4：单克隆抗体的浓度和纯度测定

通过Nanodrop(Thermofisher，Nanodrop 2000C分光光度计)，在A280nm下测定mAb002抗体的浓度。表1列出了抗体相关信息及其浓度。

表1

抗体	同种型	浓度(mg/ml)	免疫原*	动物#
					mAb002	IgG2b,κ	0.6	蛋白质复合物B	SJL#7516,7517

通过SDS-PAGE和SEC-HPLC检测mAb002抗体的纯度，结果分别如图1和图2所示。

测试方法如下：

SDS-PAGE：将10μg抗体与5μL DTT(终浓度50mM)、12.5μL 4x上样缓冲液混合，然后用PBS调节至50μL。在95℃下加热5分钟，用移液管将准备好的样品加到NuPAGE凝胶中。电泳在Surelock Xcell上进行，在100V下进行2小时。电泳后，将凝胶用i-Run快速染色溶液染色，并用CCD相机拍照。Marker为购自Bio-rad的161-0373。

SEC-HPLC：将20μg抗体注入色谱柱(内径7.8mm×30cm的TSK gel G3000SWXL)，并将1×PBS缓冲液用作流动相。柱温为30℃，流速设定为0.8ml/min。基于对应于抗体的峰面积确定抗体制剂的纯度。

结果显示，制得的mAb002抗体具有较高的浓度和纯度。

实施例5：单克隆抗体的测序

提取mAb002抗体的基因组并进行测序，以DNA形式保存，用于后续外源表达及生产单克隆抗体。mAb002抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列如下所示(下划线部分依次为VH CDR1-3和VL CDR1-3)：

mAb002-VH(SEQ ID NO：7)：

QVQLQQPGAELVRPGTSVKLSCKASGYTFISYWMHWVKQRPGQGLEWIGVIDPSDSYTNYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYYGSSRYFDVWGTGTTVTVSS

mAb002-VL(SEQ ID NO：8)：

YIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKVLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQSYTLPWTFGGGTKLEIK

实施例6：动力学参数测定

根据生物膜干涉技术(BLI)，利用Fortebio

检测仪器对抗体的动力学参数进行测定。

通过protein G生物传感器，偶联2μg/ml的mAb002，再结合如表2所示的不同浓度的抗原(AAVXL32.1蛋白衣壳)，其中抗原用PBS稀释，后续在PBS中解离。mAb002抗体的动力学参数如表2所示，动力学特征参数的检测结果如图6所示。

表2.mAb002抗体的动力学参数

浓度(nM)	响应	K<sub>D</sub>(M)	kon(1/Ms)	kdis(1/s)
					2.25	5.9147	<1.0E-12	3.26E+06	<1.0E-07
1.13	4.8269	<1.0E-12	3.26E+06	<1.0E-07
					0.5625	2.6765	<1.0E-12	3.26E+06	<1.0E-07
0.2813	1.401	<1.0E-12	3.26E+06	<1.0E-07
					0.1406	0.7013	<1.0E-12	3.26E+06	<1.0E-07
0.0703	0.3383	<1.0E-12	3.26E+06	<1.0E-07

K_D为解离常数；kon为抗原抗体结合速率；kdis为抗原抗体解离速率；K_D＝kdis/kon。

结果显示，抗体与抗原的解离常数很低，表明两者具有优异的亲和力。

实施例7：夹心法ELISA检测AAV蛋白衣壳

抗体偶联生物素

使用20倍摩尔过量的磺基-NHS-LC-生物素试剂(Thermofisher，货号20217)标记1-10mg/mL的mAb002抗体(IgG)，每个抗体分子产生4-6个生物素基团。调节磺基-NHS-LC-生物素与蛋白质的摩尔比不低于20：1，混合后室温反应1h。用脱盐柱置换缓冲液，得到生物素(biotin)偶联的抗体，记为mAb002-biotin。通过Nanodrop(Thermofisher，Nanodrop2000C分光光度计)在A280nm下测定抗体的浓度。

夹心法ELISA

利用ELISA法检测AAVXL32.1蛋白衣壳。图4示出了双抗夹心ELISA法的流程图。将mAb002抗体包被于96孔微孔板中，制成固相载体。然后，加入待测抗原AAVXL32.1蛋白衣壳，使其与mAb002结合。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。接着，加入mAb002-biotin，通过反应使其也结合在抗原上形成夹心。将未结合的mAb002-biotin洗净后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记链霉亲和素(Thermofisher，货号N100)，识别biotin基团。再次彻底洗涤后，加入TMB底物(Thermofisher，货号002023)显色。TMB在HRP的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

由此，根据颜色的变化以及深浅程度对抗原AAVXL32.1蛋白衣壳进行定性或定量分析。如图5所示，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(O.D.值)，利用标准曲线获得待测抗原的浓度。结果显示，利用本公开mAb002抗体的上述检测方法的检测最低浓度(检测限)可达到0.4ng/ml(4E7vg/ml)，灵敏度高；相关系数R²为0.9984，准确性好。

虽然通过参照本公开的某些优选实施方式，已经对本公开进行了图示和描述，但本领域的普通技术人员应该明白，以上内容是结合具体的实施方式对本公开所作的进一步详细说明，不能认定本公开的具体实施只局限于这些说明。本领域技术人员可以在形式上和细节上对其作各种改变，包括做出若干简单推演或替换，而不偏离本公开的精神和范围。

序列表

<110> 信念医药科技（苏州）有限公司

<120> AAV特异性抗体及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> VH CDR1

<400> 1

Ser Tyr Trp Met His

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> VH CDR2

<400> 2

Val Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> VH CDR3

<400> 3

Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Arg Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> VL CDR1

<400> 4

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> VL CDR2

<400> 5

Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> VL CDR3

<400> 6

Gln Gln Ser Tyr Thr Leu Pro Trp Thr

1 5

<210> 7

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> mAb002-VH

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> mAb002-VL

<400> 8

Tyr Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Val Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 737

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> AAVXL32.1的氨基酸序列

<400> 9

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile

145 150 155 160

Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln

165 170 175

Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro

180 185 190

Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly

195 200 205

Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn

210 215 220

Ala Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val

225 230 235 240

Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His

245 250 255

Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Ala Ser Thr Gly Ala Ser Asn Asp Asn

260 265 270

His Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg

275 280 285

Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn

290 295 300

Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile

305 310 315 320

Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn

325 330 335

Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu

340 345 350

Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro

355 360 365

Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn

370 375 380

Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe

385 390 395 400

Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr

405 410 415

Phe Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu

420 425 430

Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn

435 440 445

Arg Thr Gln Asn Gln Ser Gly Ser Ala Gln Asn Lys Asp Leu Leu Phe

450 455 460

Ser Arg Gly Ser Pro Ala Gly Met Ser Val Gln Pro Lys Asn Trp Leu

465 470 475 480

Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Lys Thr Asp

485 490 495

Asn Asn Asn Ser Asn Phe Thr Trp Thr Gly Ala Ser Lys Tyr Asn Leu

500 505 510

Asn Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Pro Gly Thr Ala Met Ala Ser His

515 520 525

Lys Asp Asp Lys Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Met Ile Phe

530 535 540

Gly Lys Glu Ser Ala Gly Ala Ser Asn Thr Ala Leu Asp Asn Val Met

545 550 555 560

Ile Thr Asp Glu Glu Glu Ile Lys Ala Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu

565 570 575

Arg Phe Gly Thr Val Ala Val Asn Leu Gln Ser Ser Ser Thr Asp Pro

580 585 590

Ala Thr Gly Asp Val His Val Met Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp

595 600 605

Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro

610 615 620

His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly

625 630 635 640

Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro

645 650 655

Ala Asn Pro Pro Ala Glu Phe Ser Ala Thr Lys Phe Ala Ser Phe Ile

660 665 670

Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu

675 680 685

Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Tyr Thr Ser

690 695 700

Asn Tyr Ala Arg Ser Ala Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Asn Asn Gly

705 710 715 720

Leu Tyr Thr Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro

725 730 735

Leu

Claims

1.一种结合AAV蛋白衣壳的单克隆抗体，其包含重链可变区的VH CDR1-3和轻链可变区的VL CDR1-3，所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3具有至少80％、85％、90％、95％的同一性，所述VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6具有至少80％、85％、90％、95％的同一性。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中，所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3，所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体，其中，所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示，所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。

4.一种结合AAV蛋白衣壳的单克隆抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：7具有至少80％、85％、90％、95％的同一性，所述轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：8具有至少80％、85％、90％、95％的同一性。

5.根据权利要求4所述的单克隆抗体，其中，所述重链可变区的氨基酸序列包含SEQ IDNO：7，所述轻链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO：8。

6.根据权利要求4或5所述的单克隆抗体，其中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO：7所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体为嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的单克隆抗体，其中，所述AAV蛋白衣壳的氨基酸序列与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％的同一性；优选地，所述单克隆抗体以小于1.0E-12M的K_D结合所述AAV蛋白衣壳。

9.核酸分子，其编码权利要求1至8中任一项所述的单克隆抗体。

10.载体，其包含权利要求9所述的核酸分子。

11.宿主细胞，其包含权利要求10所述的载体。

12.制备单克隆抗体的方法，包括：

培养权利要求11所述的宿主细胞，获得细胞培养物；以及

从细胞培养物中回收单克隆抗体。

13.偶联物，其包含权利要求1至8中任一项所述的单克隆抗体以及偶联部分，所述偶联部分为可检测标记。

14.根据权利要求13所述的偶联物，其中，所述偶联部分为生物素、放射性同位素、发光物质、有色物质或酶，优选为生物素。

15.权利要求1至8中任一项所述的单克隆抗体或权利要求13或14所述的偶联物在检测AAV蛋白衣壳中的应用。

16.根据权利要求15所述的应用，其中，所述检测为定性检测或定量检测，优选定量检测。

17.根据权利要求15或16所述的应用，其中，所述检测利用ELISA法、斑点印迹法或蛋白质印迹法进行。

18.试剂盒，其包括：权利要求1至8中任一项所述的单克隆抗体和/或权利要求13或14所述的偶联物；可选的标记探针，所述标记探针结合至辣根过氧化物酶分子；以及，可选的显色底物，所述显色底物能够与所述辣根过氧化物酶分子反应。